DIVISIN: BIOTECNOLOGA MATERIA: MICROBIOLOGIA APLICADA

SALMONELLA,CLOSTRIDIUM PERFRINGENS,LISTERIA MONOCYTOGENES

SALMONELLA El gnero Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros del gnero Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5 m, generalmente mviles por flagelos pertricos (excepto S. Gallinarum), son anaerobios facultativos, no esporulados. No fermentan la lactosa (excepto S. enterica subep. arizonae y S. enterica subesp. diarizonae), fermentan glucosa con produccin de gas (excepto S. Typhi); no producen indol; no degradan urea; decarboxilan lisina y ornitina. El gnero Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a travs de los aos, en lo que respecta a su nomenclatura y taxonoma. Sin embargo, todava se siguen usando muchos de los mtodos descriptos y desarrollados por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la dcada del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del gnero Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros del gnero Salmonella estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, se los encuentra como comensales y como patgenos en el tracto gastrointestinal de mamferos domsticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades en el hombre y los animales. Desde el punto de vista epidemiolgico Salmonella spp. se puede clasificar en tres grupos: a) Las que no tienen preferencia por algn husped en especial, por lo que infectan tanto al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayora de las serovariedades responsables de las salmonelosis. b) Las que infectan slo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Partyphi A y Salmonella Partyphi C y que se transmiten en forma directa indirecta de una persona a otra c) Las que estn adaptadas a un husped en especies animales: S. Abortusovis, a los ovinos; S. Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves. RECOLECCIN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS Para el diagnstico de una infeccin por Salmonella se pueden usar muestras de: materia fecal, sangre, orina, rganos, bilis y pus de abscesos. Materia fecal: La muestra debe obtenerse en el perodo agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estril, se recoge una pequea cantidad de una evacuacin espontnea reciente, seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Las muestras que no se pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte refrigerado. Como medio de transporte se usa Cary Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses

despus de su preparacin, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 das. EXAMEN MICROSCPICO DE MATERIA FECAL Leucocitos en materia fecal Se deposita con el hisopo una porcin de la muestra de materia fecal sobre un portaobjeto, se agregan dos gotas de azul de metileno, se coloca un cubreobjeto, se espra 2 a 3 minutos, para que los leucocitos adquieran una buena tincin nuclear y se observa al microscopio. Se cuentan las clulas identificadas como mononucleares o polimorfonucleares. Los leucocitos y las clulas epiteliales se anotan por separado y no se tienen en cuenta las que no se pueden identificar. Los leucocitos fecales aparecen en grandes cantidades (ms de 30 por campo) en los casos de shigelosis y en menor nmero en los de salmonelosis. En estas infecciones se observan principalmente polimorfonucleares. IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACION BIOQUMICA Aislamiento Para el aislamiento se utilizan medios diferenciales y selectivos como: agar MacConkey (MC),agar Eosina Azul de Metileno (EMB), agar Salmonella Shigella (SS), agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),agar Hektoen (HE), agar verde brillante (BG). Las placas se incuban a 37C durante 18 a 24 horas y se observan colonias, de 2 mm de dimetro. Identificacin Bioqumica La identificacin requiere la realizacin de pruebas bioqumicas y de serotipificacin, de distinta complejidad, dependiendo de la capacidad del laboratorio. Es conveniente que los laboratorios con menores disponibilidades enven las cepas aisladas a laboratorios de nivel intermedio (provinciales y/o regionales), para completar las pruebas bioqumicas y realizar pruebas de serotipificacin. A su vez el Laboratorio Nacional de Referencia realiza las pruebas bioqumicas de mayor complejidad y pruebas de serotipificacin complementarias. El gnero Salmonella est compuesto por dos especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori. S. enterica a su vez est subdividida en seis subespecies, a cada una de las cuales se las denomina con un nombre y un nmero romano. Por ej. Salmonella enterica subesp. enterica (I). Medios de cultivo - Agar TSA (agar tripticasa de soya) - Agar TSI (agar hierro tres azcares) - Agar LIA (agar lisina hierro) - Discos de ONPG (o-nitrofenil--D-galactopiransido) para la reaccin de la -galactosidasa

- Agar SIM - Medio base de Moeller para decarboxilasas - L-lisina monoclorhidrato - L-ornitina monclorhidrato - L-arginina monoclorhidrato - Medio base para azcares - Solucin de dulcita al 5% - Malonato - Medio RM VP - Reactivo de Erlich, para la prueba de indol - Rojo de metilo - Solucin de KOH, para la prueba de Voges Proskauer - naftol, para la prueba de Voges Proskauer (1) Caldo selenito (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar XLD, o agar BG. (3) Se pican de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioqumicas complementarias (P.bioq.) y se realiza la serotipificacin O (Serotip. O) (5) Pruebas bioqumicas complementarias: SIM, RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato. (6) Serotip: Serotipificacin. Si la serotipificacin somtica O de las colonias obtenidas por ambos procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificacin flagelar H debe hacerse en una sola de ellas. (7) Si la serotipificacin somtica O de las colonias obtenidas por ambos procedimientos diera igual, no es necesario sembrar Pruebas bioqumicas complementarias

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS CARACTERISTICAS y y y y Son bacilos G(+), rectos de 4-8 x 0,5-1,5 micras, familia Bacillaceae. Esporulan en medios definidos, esporas ovaladas subterminales y no abomban la clula, inmoviles y anaerobios estrictos. Producen sulfidrico, lecitinasa, reducen los nitritos, fermentan azucares Producen 4 toxinas y se clasifican en A, B, C, D, E. En el hombre interesa la A que es la que produce la gangrena gaseosa y las toxiinfecciones alimentarias, las cepas A producen la toxina alfa, las del tipo C son las responsables de la enteritis necrosante. Son microorganismos con necesidades complejas en su cultivo necesitan aminoacidos y factores de crecimiento. La temperatura ptima de las toxinas es 43-47, la mxima 50, aunque la temperatura depende de la cepa. Las toxinas necesitan un pH prximo a 7,5 y las especies vegetativas son muy sensibles al oxgeno. Existe antagonismo entre el clostridium y algunas especies de streptococcus y lactobacillus, estas ltimas al crecer dan pH cidos e inhiben al clostridium, las formas vegetativas son sensibles a la refrigeracin y congelacin. Las esporas son bastante resistentes al calor, resisten 100 1 hora, la germinacin se produce a 7080.

HABITAT Y EPIDEMIOLOGIA Es uno de los ms distribuidos, el reservorio es el suelo, polvo, tubo digestivo, piel, las moscas contribuyen al transporte de las esporas. En fro cualquier alimento puede vehiculizarlo, los brotes principales han sido en alimentos crnicos, en comidas preparadas en grandes cantidades o en salsas, incluso contaminacin in situ por manipuladores, el tipo C fue el responsable en Alemania despus de la 2 Guerra Mundial de necrosis entricas por ingestin de conservas de carne. PATOLOGIA Se debe a la produccin de toxinas, muchas de ellas histotxicas, producen una enterotoxina presente en los tipos A, C, D. La toxina alfa (fosfolipasa) es letal, provoca aumento de la permeabilidad de las membranas celulares. La toxina responsable de la toxiinfeccin alimentaria parece ser que es una enterotoxina de las esporas porque solo parece producirse cuando el microorganismo esporula en el intestino, en general no est presente antes de la ingestin. Esta enterotoxina es una protena termolbil, aumenta la permeabilidad de las clulas intestinales y produce un aumento de la motilidad, produce perdida masiva de agua, cloro y sodio e inhibe que se absorba la glucosa, la accin la ejerce en el ileon. La toxina beta, toxina letal para los animales de experimentacin, en ocasiones tambin en humanos, es necrtica y aumenta la permeabilidad vascular. Es una toxina sensible a la tripsina, se inactivara en el estmago y por este motivo una baja ingesta proteica que disminuye la secrecin de tripsina favorecera la acci de ella.

En el caso de la del tipo A la enfermedad aparece al cabo de 8-24 horas tras la ingesta del alimento. CLINICA Dolor abdominal, diarrea acuosa ( no hay sangre ni moco ), nauseas, cuadro benigno que desaparece a las 12-18 horas. La enteritis necrotizante, producida por cepas tipo C, presenta una incubacin de 24 horas, dolor abdominal, diarrea con sangre, vmitos, necrosis intestinal. INVESTIGACION Se aaden a los medios ciertos antibioticos para inhibier a las anaerobios facultativos (neomicina, polimixina), el enriquecimiento se basa en esto inhibir a unos para favorecer a otros, para el aislamiento se emplean medios con yema de huevo o emplear sulfitos ms hierro. 1.- Tecnica en tubos. Suspensin madre 1:10 en solucin Ringer con cisteina y se realizan diluciones seriadas. Se siembra 1 ml de cada dilucin en tubos estriles con tapn de rosca (150x20). Se aaden 15 ml. de agar TSN atemperado a 47, se solidifica y se cubre con 3 ml de parafina estril, incubamos a 46 durante 24-48 horas y se produce sulfuro de hierro de color negro, las colonias se veran negras a lo largo del tubo y se cuentan, de esta forma el nmero de colonias por el factor de dilucin nos indicar el nmero de microorganismos por gramo de alimento. 2.- Mtodo del NMP Se siembran series de 5 tubos con RCM medio para clostridium con neomicina y se incuban a 46 durante 48 horas. De cada tubo se siembran 0,1 ml en agar TSCY (agar triptosa sulfito cicloserina), podemos ver la reaccin de la lecitinasa, por tener el medio sulfito se produce sulfdrico que con el hierro produce sulfuro de hierro, aparece un halo blanco alrededor de las colonias por precipitacin de cidos grasos. Una vez sembradas y secas se cubre con una capa de 10 ml de TSC estril y se coloca en anaerobiosis. De esta forma se calcula el NMP. Prueba de Willis, es una placa de LYL (agar lactosa leche yema de huevo). En mitad de la placa se deposita antitoxina alfa y luego se siembra ese medio en forma rombo PREVENCION Y CONTROL Evitar cocinar los alimentos en grandes cantidades, higiene adecuada en la manipulacin, enfriamiento y refrigeracin adecuadas, evitar cocinar con mucha antelacin.

4013 Agar de Mueller-Hinton

4167 Agar Triptona Glucosa Extracto

Medio para la evaluacin de la sensibilidad de los microorganismos a los agentes antimicrobianos. Mueller-Hinton Agar A medium used to evaluate the sensitivity of microorganisms to antimicrobial agents.

Medio para el recuento total de microorganismos aerobios en aguas y otros materiales Tryptone Glucose Extract Agar A medium used for the total count of aerobic microorganisms in waters and other materials. 4167.A 100 4167.B 500 4167.C A granel / Bulk g g

4013.A 100 4013.B 500 4013.C A granel / Bulk 4009 Agar Nutriente

g g

4019 Agar Triptona Soya

Medio para fines generales que promueve el crecimiento de la mayoria de los microorganismos poco exigentes. Nutrient Agar A general purpose medium used to promote the growth of nontastidious microorganisms. 4009.A 100 4009.B 500 4009.C A granel / Bulk g g

Medio de propsito general para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos. Tryptone Soy Agar A general purpose medium used to cultivate a wide variety of microorganisms. 4019.A 100 4019.B 500 4019.C A granel / Bulk g g

4017Agar Papa y Dextrosa Medio para el cultivo y enumeracin de levaduras y mohos. Potato Dextrose Agar

4103 Agar Verde Brillante

Medio altamente selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella (excepto S. typhi). Brilliant Green Agar

A medium used to cultivate enumerate yeasts and moulds. 4017.A 100 4017.B 500 4017.C A granel / Bulk

and A highly selective medium used to isolate Salmonella, other than S. typhi. g g 4103.A 100 4103.B 500 4103.C A granel / Bulk 4011 Agar Violeta Rojo Bilis g g

4209 Agar S.S. (Modificado)

Medio diferencial y selectivo idneo para el aislamiento de Shigella y Salmonella. S.S. A differential suitable to Salmonella. Agar (Modified)

Medio selectivo para la determinacin de bacterias coliformes en aguas, productos lcteos y otros alimentos. Violet Red Bile Agar

and selective medium isolate Shigella and

A selective medium used to detect coliform bacteria in waters, dairy products and other foodstuffs. 4011.A 100 4011.B 500 4011.C A granel / Bulk g g

4209.A 100 4209.B 500 4209.C A granel / Bulk

g g

4171 Agar Sulfito Bismuto Medio para el aislamiento de Salmonella typhi y otros vacilos entricos. Bismuth Sulphite Agar A medium used to isolate Salmonella typhi and other enteric bacilli. 4171.A 100 4171.B 500 4171.C A granel / Bulk g g

4217Agar X.L.D.

Medio ligeramente selectivo y diferencial para el aislamiento de patgenos entricos Gram-negativos en muestras clnicas y no clnicas. X.L.D. Agar

A slightly selective and differential medium used to isolate Gram-negative enteric pathogens from clinical and nonclinical samples. 4217.A 100 4217.B 500 4217.C A granel / Bulk 4222Agua de Peptona Buferada g g

4004 Agar Tres Azcares y Hierro Medio para la diferenciacin e identificacin de enterobacterias en base a la fermentacin de dextrosa, lactosa y sacarosa, y por la produccin de sulfuro de hidrgeno. Triple Sugar Iron Agar A medium used to differentiate and identify enteric bacteria based on dextrose, lactose and sucrose fermentation, and hydrogen sulphide formation. 4004.A 100 4004.B 500 4004.C A granel / Bulk g g

Medio de pre-enriquecimiento recomendado para su empleo previo al enriquecimiento selectivo y aislamiento de especies daadas de Salmonella en los alimentos. Buffered Peptone Water A preenrichment medium recommended for its use before selective enrichment and isolateof injured species of Salmonella in foods. 4222.A 100 4222.B 500 4222.C A granel / Bulk g g

LISTERIA MONOCYTOGENES Listeria monocytogenes es una bacteria ampliamente difundida en la naturaleza. Su presencia en los alimentos esta determinada por su extensa distribucin en el ambiente tierra, aguas servidas, materia fecal, vegetacin, ensilados y entorno de la produccin de alimentos - lo que confiere una importante oportunidad para contaminarlos. Caracteristicas El gnero Listeria agrupa bastones Gram positivos, no esporulados, aerobios-anaerobios facultativos. Desarrollan entre menos de 0.4 y 45 C; es decir, pueden crecer a temperatura de refrigeracin. Son psicrtrofos, catalasa positiva, oxidasa negativos y hemolticos en agar sangre. El ensayo de Chirstie, Atkins, Munich-Petersen (CAMP) estimula la produccin de hemolisina. Toleran concentraciones elevadas (10 %) de cloruro de sodio y son mviles a 25 pero no a 35 C. Los serotipos mas frecuentes en todo el mundo son 1/2a, 1/2b y 4b. Un laboratorio de servicios usualmente establece la identidad de la bacteria por medio de ensayos bioqumicos sin alcanzar los ensayos serolgicos quedando estas pruebas y las moleculares, ms sofisticadas, para laboratorios de mayor complejidad; estos son de utilidad en estudios epidemiolgicos de brotes. La bacteria tiene habilidad para evitar las defensas usuales e instalarse facultativamente en forma intracelular intraleucocitos en la leche. El gnero Listeria concentra numerosas especies: Listeria innocua, L. welshimeri, L.seeligeri, L. ivanovii, L. grayi y L. monocytogenes; slo esta ltima se ha mostrado patgena al hombre. Parmetros que regulan el desarrollo Parmetros que regulan el desarrollo de Listeria en los alimentos

Toxicidad y Virulencia Hoy se sabe que no todas las cepas de L. monocytogenes son patgenas. Se ha observado variabilidad en la virulencia (grado de patogenicidad de la bacteria) dentro de la especie L. monocytogenes y ste concepto va ganando reconocimiento. Se ha demostrado que hay Listeria monocytogenes avirulentas, hipovirulentas y virulentas. La variabilidad en la virulencia de L. monocytogenes permite comprender el numero bajo de casos a pesar de las frecuente exposicin a alimentos con ste microorganismo. Entre 1994 y 1999, en EE.UU. la prevalencia de la bacteria en fiambres fue entre 4.2 y 7.8 %.