MINISTRIO DA EDUCAO INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA DO PAR SISTEMA UNIVERSIDADE ABERTA DO BRASIL LICENCIATURA PLENA EM BIOLOGIA

MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA Lorena Arajo da Cunha Jedna Kato Dantas

MTODOS DE ESTUDO DE MICROORGANISMOS 1 BIOSSEGURANA

Os Laboratrios de Microbiologia so ambientes especiais capazes de promover a disseminao de agentes causadores dos mais diversos tipos de doenas infecciosas. Qualquer Microorganismo, por mais incuo que seja, capaz de interagir com o meio e com as outras formas de vida que o cercam. Algumas destas interaes podem ser indesejveis ou perigosas. Os Laboratrios de Microbiologia podem ser considerados rea de risco biolgico pelo fato de nele ocorrer manipulao de grande quantidade de microorganismos (patognicos ou no). As medidas de conteno no Laboratrio de Microbiologia visam reduzir ou eliminar a exposio do operador do Laboratrio, de outras pessoas e do meio ambiente e geral contra agentes potencialmente perigosos. Mas o contato das pessoas com microrganismos no significa obrigatoriamente que desenvolveremos doenas, muito pelo contrrio, o homem, os animais e as plantas no apenas convivem com os microorganismos germes, mas dependem direta ou indiretamente deles. Todas as reas da Terra, que renem condies de vida, so habitadas por microrganismos e ns sempre convivemos com eles; inclusive em nosso corpo, onde eles auxiliam na proteo de nossa pele e mucosas contra a invaso de outros germes mais nocivos. Estes microorganismos so capazes de decompor matria orgnica transformando-a em sais minerais prontos para serem novamente utilizados em substratos nutritivos. O homem (hospedeiro) e os microorganismos (parasitas) convivem em pleno equilbrio. Somente a quebra desta relao harmoniosa poder causar a doena infeco. A doena infecciosa uma manifestao clnica de um desequilbrio no sistema parasito-hospedeiro-ambiente, causado pelo aumento da patogenicidade do parasita em relao aos mecanismos de defesa antiinfecciosa do hospedeiro, ou seja, quebra-se a relao harmoniosa entre as defesas do nosso corpo e o nmero e virulncia dos germes, propiciando a invaso deles nos rgos do corpo. Alguns microrganismos possuem virulncia elevada podendo causar infeco no primeiro contato, independente das nossas defesas. Outros, usualmente encontrados na nossa microbiota normal, no so to virulentos, mas podem infectar o nosso organismo se diminumos a nossa capacidade de defesa. A capacidade de defesa antiinfecciosa multifatorial, pois influenciada pela idade, estado nutricional, doenas e cirurgias, stress, uso de corticides, quimioterapia, radioterapia, doenas imunossupressoras (HIV, leucemia), fatores climticos e precrias condies de higiene e habitao. As regras de comportamento que a biossegurana determina, pretende contribuir para evitar a propagao de contaminaes capazes de perturbar o sucesso das experincias laboratoriais, dos prprios microorganismos e, principalmente, das pessoas.

1.1 Princpios de Biossegurana

A Biosseguana representa um conjunto de prticas que visam controlar ou eliminar os riscos que podem comprometer a sade do homem, dos animais e do meio ambiente. A biossegurana um processo funcional e operacional de fundamental importncia em Laboratrios de Microbiologia no s por abordar medidas de Controle de Infeces para proteo dos usurios, mas por ter um papel fundamental na promoo da conscincia sanitria, da importncia da preservao do meio ambiente na manipulao e no descarte de resduos qumicos, txicos e infectantes e da reduo geral de riscos sade e acidentes operacionais. Na natureza, o estado de esterilidade, definido como ausncia de microrganismo vivo, excepcional e transitoriamente encontrado no feto durante a gestao, excluindo os casos de bebs contaminados via placentria pela me. O contato com os microrganismos comea com o nascimento, durante a passagem pelo canal vaginal do parto, onde a criana se contamina com a flora bacteriana normal da mucosa vaginal e ento se coloniza mantendo-se por toda a sua existncia, at a decomposio total do organismo aps a sua morte. As normas e os cuidados necessrios ao trabalho em Laboratrio de Microbiologia tm a finalidade de melhorar as condies de segurana e higiene, que devem ser observadas por alunos durante as aulas prticas, visando a preveno de acidentes que possam acarretar danos fsicos e/ou funcionais ao operador. - As Barreiras primrias: So representados pelos equipamentos de segurana, e pelos Equipamentos de Proteo Individual (EPI), como cabines de segurana biolgica, recipientes adequados e outros objetos (Luvas, jaleco, culos, gorros, botas, capacete, etc). - As Barreiras secundrias: So representadas pela infra-estrutura das instalaes do Laboratrio, e devem contribuir para a proteo da equipe e dos usurios do laboratrio, bem como do ambiente externo.

1.2 Nveis de Biossegurana

Para manipulao dos microrganismos pertencentes a cada uma das quatro classes de risco biolgico devem ser atendidos alguns requisitos de segurana, conforme o nvel de conteno necessrio. Estes nveis de conteno so denominados de nveis de Biossegurana. Existem quatro nveis de biossegurana: NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4, crescentes no maior grau de conteno e complexidade do nvel de proteo. a) Nvel de Biossegurana 01 (NB-1): Representa o nvel bsico de conteno, que se aplica aos laboratrios da Educao bsica, cujos microorganismos manipulados pertence classe de risco um, ou seja, aqueles microorganismos que apresentam risco muito baixo ou nulo de contaminao individual ou para a comunidade, com baixa probabilidade de provocar infeces no homem ou em animais. Os equipamentos especiais de conteno, como as cabines de segurana biolgica, no so geralmente exigidas para manipulaes de agentes de classe de risco um. Deve-se proceder o uso de jalecos, aventais ou uniformes prprios, para evitarem a contaminao ou sujeira de suas roupas normais. Recomenda-se ainda o

uso de luvas para os casos de rachaduras ou ferimentos na pele das mos. culos protetores devero ser usados na execuo de procedimentos que produzam borrifos ou salpicos. b) Nvel de Biossegurana 02 (NB-2): O nvel de Biossegurana dois diz respeito ao laboratrio em conteno, onde so manipulados microrganismos da classe de risco dois, cujo risco individual moderado e para a comunidade baixo. Estes microrganismos podem provocar infeces, porm, dispe-se de medidas teraputicas e profilticas eficientes, sendo o risco de propagao limitado. Exemplos: Vrus da Febre Amarela e Schistosoma mansoni. O NB-2 se aplica aos laboratrios clnicos ou hospitalares de nveis primrios de diagnstico, sendo necessrio, alm da adoo das boas prticas, o uso de barreiras fsicas primrias (cabine de segurana biolgica e equipamentos de proteo individual) e secundrias (desenho e organizao do laboratrio). semelhante ao NB-1 e adequado ao trabalho que envolva agentes de risco moderado para as pessoas e meio ambiente. O NB-2 exigido em trabalhos que envolvam sangue humano, lquidos corporais, tecidos ou clulas em que a presena de um agente infeccioso pode ser desconhecida. Os maiores riscos em um laboratrio NB-2 so de acidentes percutneos, exposio das membranas mucosas ou ingesto de material infeccioso. No interior do laboratrio, os freqentadores devem utilizar roupas apropriadas, como jalecos, gorros, mscaras etc. Antes de sair do laboratrio para reas externas, a roupa protetora deve ser retirada e deixada no laboratrio. Todos os requisitos para entrada no laboratrio devem estar assinalados na porta de entrada. Usar culos de segurana e os protetores de face (visores), assim como outros dispositivos de proteo sempre que forem indicados para a proteo de olhos e face e contra os salpicos. c) Nvel de Biossegurana 03 (NB-3): O nvel de Biossegurana trs destinado ao trabalho com microrganismos da classe de risco trs ou para manipulao de grandes volumes e altas concentraes de microrganismos da classe de risco dois. O risco individual alto e para a comunidade limitado. O patgeno pode provocar infeces graves no homem e nos animais, podendo se propagar de indivduo para indivduo, porm existem medidas teraputicas e de profilaxia. Exemplos: Vrus da Encefalite Eqina Venezuelana e Mycobacterium tuberculosis. Estes microorganismos podem ser transmitidos por via respiratria e causar infeces srias e potencialmente fatais. A equipe laboratorial deve ter treinamento especfico no manejo de agentes patognicos e potencialmente letais, devendo ser supervisionados por cientistas com vasta experincia com esses agentes. O NB-3 aplicvel para laboratrios clnicos, de diagnstico, ensino e pesquisa ou de produo onde o trabalho com agentes exticos possa causar doenas srias ou potencialmente fatais como resultado de exposio por inalao. Devem ser mantidos controles rgidos quanto operao, inspeo e manuteno das instalaes e equipamentos. Alm das prticas microbiolgicas estabelecidas para o NB-2, o trabalho com agentes de risco trs exige que menores de 18 anos de idade no entrem no laboratrio. Os maiores riscos neste laboratrio de NB-3 so a autoinoculao, a ingesto e a exposio aos aerossis infecciosos. obrigatrio o uso de roupas de proteo

especficas (macaces, uniformes que possuam menor soluo de descontinuidade, no se admitindo roupas abotoadas na frente), uso de mscaras, gorros, luvas, prps ou sapatilhas. Os EPIs devem ser autoclavados antes de serem lavados ou descartados. Toda a equipe deve tomar banho ao deixar essas reas de trabalho. As linhas de vcuo devem estar protegidas com filtro de ar com elevada eficincia e coletores com lquido desinfectante. O ar de exausto no deve, portanto, ser recirculado e dever ser filtrado atravs de filtro HEPA (High Efficiency Particulated Air) antes de ser eliminado para o exterior do laboratrio. d) Nvel de Biossegurana 04 (NB-4): O nvel de Biossegurana 4, ou laboratrio de conteno mxima, destina-se a manipulao de microrganismos da classe de risco 4, onde h o mais alto nvel de conteno, alm de representar uma unidade geogrfica e funcionalmente independente de outras reas. Estes microorganismos podem ser transmitidos por via respiratria que no se tenha registro de vacina ou terapia disponvel, podendo levar morte em poucas horas ou dias. O risco individual e para a comunidade elevado. So microrganismos que representam srio risco para o homem e para os animais, sendo altamente patognicos, de fcil propagao, no existindo medidas profilticas ou teraputicas. Exemplos: Vrus Marburg e Vrus Ebola. Recomenda-se que os laboratrios de nvel de Biossegurana quatro, s funcionem sob o controle direto das autoridades sanitrias, alm disso, dada a grande complexidade do trabalho, a equipe do laboratrio dever ter um treinamento especfico e completo direcionado para a manipulao de agentes infecciosos extremamente perigosos e dever ser capaz de entender as funes da conteno primria e secundria, das prticas padres especficas, do equipamento de conteno e das caractersticas do planejamento do laboratrio. A instalao deste laboratrio deve ser em um edifcio separado ou de uma rea claramente demarcada e isolada dentro do edifcio. necessrio a elaborao de um manual de trabalho pormenorizado, que deve ser testado previamente atravs de exerccios de treinamento. Esses laboratrios requerem, alm dos requisitos fsicos e operacionais dos nveis de conteno um, dois e trs, barreiras de conteno (instalaes, desenho equipamentos de proteo) e procedimentos especiais de segurana. Os maiores riscos relacionados e este nvel de Biossegurana so as exposies respiratrias aos aerossis infecciosos, exposies das mucosas e/ou pele lesionada s gotculas infecciosas e a autoinolculao. O material removido do laboratrio de conteno mxima dever ser autoclavado em autoclave de dupla porta, cmara de fumigao, ou sistema de antecmara pressurizada. Equipamentos ou materiais que no resistem a temperaturas elevadas devem ser descontaminados utilizando-se gases e vapor em cmara especfica. Materiais e equipamentos que no possam ser descontaminados na autoclave devem passar por tanque de imerso com desinfetante ou cmara de fumigao. O supervisor tem por responsabilidade final no controle do acesso ao laboratrio. As pessoas autorizadas devem cumprir com rigor as instrues de procedimento para entrada e sada, havendo portanto, um registro com horrio e assinatura. O acesso ao laboratrio bloqueado por portas hermeticamente fechadas.

Para adentrar ao laboratrio a roupa comum, de rua deve ser trocada por roupa protetora, completa e descartvel. As manipulaes com agentes de classe de risco quatro, conduzidas no laboratrio, devem ser realizadas em cabine de segurana biolgica de classe III, ou cabines de classe I ou II, neste caso usadas em associao com roupas de proteo pessoal com presso positiva, ventiladas por sistemas de suporte de vida.

1.3 Normas de Segurana no Laboratrio de Microbiologia

Em um laboratrio devem ser observadas as regras de segurana, utilizando, obrigatoriamente os equipamentos de proteo individual adequados a cada procedimento. Nunca iniciar uma prtica sem que tenha lido cuidadosamente as instrues e compreendido os objetivos e o modo de execuo das experincias. No permitido trazer para o laboratrio pacotes, sacolas, etc.; alm de ser absolutamente proibido fumar, beber ou comer durante as prticas e/ou no interior do laboratrio. O uso do jaleco obrigatrio. As vidraria utilizada devem ser colocadas nos recipientes a elas destinados de maneira que possam ser facilmente desinfetados ou esterilizados: - As pipetas devem ser colocadas, cuidadosamente, nos recipientes a elas destinados. Com cuidado para no quebrar as pontas das pipetas. - As lminas devem ser colocadas em recipientes com desinfetantes. - Os tubos de cultura, placas de Petri e outros materiais sero colocados em recipientes metlicos adequados. Nunca colocar cultura ou material contaminado em outros recipientes ou locais (lata de lixo ou pias). As placas de Petri devem ser depositadas com a tampa para cima, para que os meios no escorram durante a autoclavao. - A utilizao do Bico de Bunsen essencial pois visa a diminuio de microrganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possvel selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e no forma fuligem. importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, j que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama so (figura 1): Zona Neutra ( uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto, j podem ser usadas para a flambagem). Figura 1: Zonas da Chama

Fonte: bioucp.blogspot.com

- A ala de platina dever ser famblada antes e depois de ser utilizada. Para isso, aquecer at o rubro. Antes de tocar no meio de cultura ou material, esta deve ser resfriada, mantendo-a prximo chama. - Lave sempre as mos. Qualquer acidente deve ser tomado as providncias necessrias. - Manter canetas, dedos e outros longe da boca, no atender telefones. - No realizar movimentos bruscos em qualquer tipo de cultura. - No colocar fsforo riscado, algodo, papel, etc., nas pias. Fazer isso nas latas de lixo que estaro distribuidas no laboratrio. - O microscpio um instrumento valioso e deve ser manipulado e usado cuidadosamente. Ao fim de cada prtica, limpar a lente ocular e todas as objetivas com papel absorvente macio. - Anotar cuidadosamente os resultados dos trabalhos. Essas anotaes servem de base para o aprendizado.

1.4 Equipamentos de Proteo Individual (Epi)

Os EPI so definidos pela legislao como todo meio ou dispositivo de uso pessoal destinado a proteger a integridade fsica do trabalhador durante suas atividades. A funo do EPI neutralizar ou atenuar um possvel agente agressivo contra o corpo do trabalhador que o usa. Os EPIs evitam leses ou minimizam sua gravidade, em casos de acidente ou exposio a riscos, tambm, protegem o corpo contra os efeitos de substncias txicas, alrgicas ou agressivas, que causam as em doenas ocupacionais. Podem ser classificados em 4 grupos: Proteo para a cabea; Proteo para os membros superiores e inferiores; Proteo do tronco; Proteo das vias respiratrias. A lavagem das mos, uma importante medida na preveno de transmisso de infeces. Deve ser realizada entre os cuidados de um cliente e outro, aps o contato com sangue, fluidos corporais, secrees, excrees e equipamentos ou artigos contaminados pelo cliente antes e aps a colocao e retirada dos EPIs. Luvas: Foram desenvolvidas inicialmente pelo cirurgio norte americano, Harlsted visando proteo das mos de sua esposa, durante os procedimentos cirrgicos. As luvas so usadas como barreiras drmicas para reduzir a exposio a sangue, fluidos do corpo, produtos qumicos e outros riscos fsicos, mecnicos, eltricos e de radiao. Botas, sapatos ou sapatilhas: So indicados como proteo dos ps em locais midos ou com quantidade significativa de material infectante. Mscaras cirrgicas: So dispositivos de controle de infeco, pois evitam o fluxo da infeco do usurio da mscara para uma pessoa potencialmente susceptvel. Em 1990, o Guia para Controle da Tuberculose mostrou que a mscara cirrgica no foi eficiente na preveno da inalao de Mycobacyterium tuberculosis. Atualmente existe no mercado, a mscara de proteo respiratria do tipo N95, com 95% de eficincia. Ela semi-descartvel e pode ser reutilizada enquanto no estiver deformada.

Aventais e Jalecos: So indicados para evitar a contaminao da roupa e para proteger a pele contra o sangue fresco. Os aventais devem ser longos e impermeveis.

1.5 Equipamentos de Proteo Coletiva (Epc)

Como o prprio nome sugere, os equipamentos de proteo coletiva (EPC) dizem respeito ao coletivo, devendo proteger todos os trabalhadores expostos a determinado risco. Como exemplo podemos citar o enclausuramento acstico de fontes de rudo, a ventilao dos locais de trabalho, a proteo de partes mveis de mquinas e equipamentos, a sinalizao de segurana, a cabine de segurana biolgica, capelas qumicas, cabine para manipulao de radioistopos, extintores de incndio, dentre outros. Cabine para histologia: construda em ao inox, com exausto por duto, especfica para trabalhos histolgicos. Capela Qumica: dever ser construda de forma aerodinmica, de maneira que o fluxo de ar ambiental no cause turbulncias e correntes, reduzindo, assim, o perigo de inalao e a contaminao do operador e do ambiente. Manta ou cobertor: utilizado para abafar ou envolver a vtima de incndio, devendo ser confeccionado em l ou algodo grosso, no sendo admitido tecidos com fibras sintticas. Vaso de areia ou balde de areia: utilizado sobre o derramamento de lcalis para neutraliz-lo. Mangueira de incndio: O modelo padro, comprimento e localizao so fornecidos pelas normas do Corpo de Bombeiros. Sprinkle: o sistema de segurana que, atravs da elevao de temperatura, produz fortes borrifos de gua no ambiente (borrifador de teto). Ala de transferncia descartvel: So alas de material plstico estril, descartveis aps o uso. Apresentam a vantagem de dispensar a flambagem. Microincinerador de ala de transferncia metlica: So aquecidos a gs ou eletricidade. Possuem anteparos de cermica ou de vidro de silicato de boro para reduzir, ao mnimo possvel, a disperso de aerossis durante a flambagem das alas de transferncia. Luz Ultra Violeta: So lmpadas germicidas, cujo comprimento da onda eficaz de 240 nm. Seu uso em cabine de segurana biolgica no deve exceder a 15 minutos. O tempo mdio de uso de 3000 horas. Dispositivos de pipetagem: So os dispositivos de suco para pipetas. Ex.: pipetador automtico, pra de borracha e outros. Proteo do sistema de vcuo: So filtros do tipo cartucho, que impedem a passagem de aerossis. Tambm usado o frasco de transbordamento, que contm desinfetante. Conteno para homogeneizador, agitador, ultra-som, etc: Devem ser cobertos com anteparo de material autoclavvel e sempre abertos dentro das cabines de segurana biolgica. Anteparo para microscpio de imunofluorescncia: o dispositivo acoplado ao microscpio, que impede a passagem de luz ultravioleta, que poder causar danos aos olhos, at mesmo levando o operador cegueira. Kit para limpeza em caso de derramamento biolgico, qumico ou radioativo: composto de traje de proteo, luvas, mscara, mscara contra gases, culos ou

protetor facial, bota de borracha, touca, ps para recolhimento do material, pina para estilhaos de vidro, panos de esfrego e papel toalha para o cho, baldes, soda custica ou bicarbonato de sdio para neutralizar cidos, areia seca para cobrir lcalis, detergente no inflamvel, vaporizador de formaldedo, desinfetantes e sacos plsticos. Kit de primeiros socorros: composto de material usualmente indicado, inclusive antdoto universal contra cianureto e outros antdotos especiais.

1.6 Limpeza, Desinfeco, Esterilizao

Definies: - LIMPEZA: Remoo de sujeiras que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfeco ou esterilizao. - DESINFECO: Consiste na destruio, remoo ou reduo dos microrganismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfcie ou local. O agente empregado na desinfeco denominado desinfetante. - ANTI-SEPSIA: Desinfeco de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por exemplo, atravs do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal ou lcool iodado para as mos. O agente utilizado na Antisepsia denominado antisptico. - ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminao a um objeto, superfcie ou local. Ou seja, objetiva impedir a penetrao de microorganismos em locais que no os contenha (superfcie, objeto ou meio de cultura) - ESTERILIZAO: Processo que visa a destruio total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, atravs de mtodos fsicos ou qumicos. Um objeto esterilizado, no sentido microbiolgico est completamente livre de qualquer microorganismo vivel. - AGENTE BACTERICIDA: aquele capaz de matar bactrias, ou seja, determinar a perda irreversvel da capacidade de reproduo. Do mesmo modo os agentes fungcidas, viricidas e esporicidas se referem aos agentes que atuam em fungos, vrus e esporos, respectivamente. - AGENTE BACTERIOSTTICO: aquele agente que tem a capacidade de inibir a multiplicao do microorganismo por determinado tempo, isto , realiza o bloqueio da funo fisiolgica do microorganismo.

1.6.1 Procedimentos de Limpeza No Laboratrio

a) Bancadas Bancadas, na superfcie das quais so realizadas as anlises microbiolgicas, so limpas com lcool 70% sempre antes de iniciar a anlise e ao trmino da mesma. Quinzenalmente feito um suabe em plate count agar (PCA) da superticie das bancadas para avaliar o nvel de desinfeco efetuado. A anlise microbiolgica realizada sempre prximo chama do bico de Bunsen, que deve permanecer acesa at o trmino da anlise. A ala da platina ou basto tipo 1-lokey, sempre que for utilizado, deve ser flambado na chama do bico de Bunsen antes da reutilizao. b) Sala de Inoculao

As paredes da sala de microbiologia so desinfetadas semanalmente com soluo de hipoclorito de sdio, 5mL de soluo em um litro de gua; O cho da sala de microbiologia limpo diariamente com soluo de hipoclorito de sdio. (5mL/L de gua); c) Demais dependncias (sala de limpeza, sala de preparao de meios, sala de incubao); O cho limpo diariamente com soluo de hipoclorito de sdio (5mL/L de gua); As bancadas so limpas diariamente com lcool 70%. d) Operadores Os operadores do laboratrio devem usar uniformes (guarda-p, cala, toca e mscara, brancos e limpos); Devem trabalhar com os cabelos presos, no deve utilizar perfumes fortes, as unhas devero estar bem cortadas e limpas e as mulheres no podero utilizar batom; Ao iniciar o trabalho dirio no laboratrio, obrigatrio lavar as mos com detergente apropriado, completando-se a desinfeco com a aplicao de lcool 70%; E proibida a entrada de pessoa estranhas ao setor nas dependncias do laboratrio a menos que estejam acompanhados de um dos analistas ou tcnicos. e) Geladeira A geladeira usada para manter amostras destinadas s anlises microbiolgicas, para incubar bactrias aerbicas psicrotrfilas e para manter meios de cultura preparados; Quando utilizada para incubar bactrias aerbicas psicrotrfilas e necessario o controle da temperatura da geladeira. O compartimento de refrigerao limpo mensalmente com gua e detergente apropriado e desinfetado com lcool 70%; O compartimento de congelamento descongelado a cada trs meses; O material contido na geladeira mantido em caixa de isopor durante a limpeza da mesma. f) Estufas O interior das estufas limpo e desinfetado semanalmente com lcool a 70%.

1.6.2 Esterilizao
A esterilizao o processo que inativa todos os microrganismos presentes em determinado material ou ambiente, portanto o mtodo indicado para uso em itens que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminao, classificados como crticos, ou seja, aqueles que durante o atendimento odontolgico penetraro em pele e mucosa, ou sero introduzidos diretamente na corrente sangnea, sendo portanto de alto risco. A melhor maneira de garantirmos a destruio de microrganismos presentes em instrumentos e equipamentos mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos que causam infeces em seres humanos desenvolvem-se em temperaturas prximas a do corpo, ou seja, 37C. Assim, ao serem expostos a altas

temperaturas, so destrudos; o que no acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o microrganismo fica apenas inibido, e no destrudo. Alguns microrganismos produzem esporos, que so formas de resistncia, podendo permanecer inativos por longos perodos e depois voltar ao estgio inicial de infectividade. Portanto as tcnicas de esterilizao devem destruir tanto a clula bacteriana, como os esporos. Existem diversos mtodos de esterilizao: Fsicos ou Qumicos. Mas definitivamente os mtodos de esterilizao mais empregados em odontologia so os que utilizam o calor, seja este mido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor mido (autoclave) melhor. a) Esterilizao por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) realizada a temperaturas de 140C a 180C, com tempo de exposio de 60 a 120 minutos em estufas eltricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturao e oxidao das protenas, que resultam na morte dos microrganismos. A utilizao do calor seco leva mais tempo que o calor mido, mas como existem materiais que no podem ser esterilizados no calor mido, o calor seco o preferido. indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presena do vapor da autoclave, e materiais impermeveis como ceras, pomadas e leos. Para ser eficiente, este processo depende de: - Aquecimento da estufa at a temperatura desejada antes da colocao do material. - Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados. - A colocao do material deve permitir a circulao do ar, portanto a estufa no pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distncia de 2 cm entre as caixas. - O tempo de esterilizao deve ser contado apenas aps a colocao do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente. b) Esterilizao pelo Calor mido O calor mido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em materiais atravs das formas de: vapor dgua, gua fervente e gua aquecida abaixo de seu ponto de ebulio. - gua fervente a gua levada ao ponto de ebulio: 100C, este procedimento destri os microrganismos vegetativos presentes no meio lquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados no so esterilizados com segurana pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100C por mais de 1 hora. - Vapor dgua O vapor dgua sob presso a mais prtica e segura aplicao do calor mido. O aparelho destinado a este fim a AUTOCLAVE. um processo mais eficiente para destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavao feita a 121 C com tempo de exposio de 15 a 30 minutos. A penetrao do vapor no material garante maior nvel de destruio dos microrganismos, e por este motivo mais rpido.

c) Controle da Esterilizao imprescindvel o controle de qualidade nos processos de esterilizao. Como se trata de um processo que inclui diversas variveis (tempo, temperatura, limpeza prvia, conhecimento da pessoa responsvel pelo processo, etc), se qualquer destas variveis for negligenciada, o processo no ser efetivo e o risco de contaminao eminente. O controle deve ser realizado atravs de mtodos qumicos e bacteriolgicos. Os mtodos qumicos utilizam uma fita especial que mostra, atravs da mudana de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os mtodos bacteriolgicos utilizam a bactria chamada Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, uma eficiente indicadora da qualidade do processo. Este controle deve fazer parte da rotina do laboratrio para garantir a sade dos operadores.

1.6.3 Desinfeco
Este processo pode ser realizado de forma fsica (Pasteurizao) e qumica (Desinfectantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfeco de alto, intermedirio ou de baixo nvel, dependendo da quantidade de microrganismos inativados. Desinfeco de alto nvel: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. Este tipo de desinfeco indicado para itens classificados como semi-crticos, ou seja, que entram em contato com mucosas ntegras e pele no ntegra. Desinfeco de nvel intermedirio: que inativa bactrias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vrus. indicada para uso em itens classificados como no-crticos, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele ntegra. Desinfeco de baixo nvel: inativa a maioria das bactrias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vrus. indicada tambm para itens de uso nocrtico. a) Desinfeco por agentes fsicos: Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulio (100 C). Pasteurizao: o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as clulas vegetativas de microrganismos, mas no os esporos, portanto, um mtodo de desinfeco de alto nvel. indicado o uso de temperatura de 77C por 30 minutos. b) Desinfeco por agentes qumicos: b.1) Mtodo de Desinfeco de alto nvel: Glutaraldedo: indicado qualquer objeto sensvel ao calor, e para rpida desinfeco de itens reutilizados. utilizado em soluo a 2% com pH alcalino (7,58,5) por 30 minutos. Formaldedo: Pode ser encontrado na forma slida (pastilhas formalina) ou como soluo aquosa 37-40% (diludo em lcool ou gua). A soluo deve ser usada por30 minutos sendo a concentrao de 8% em soluo alcolica e 10% em soluo aquosa.

Perxido de Hidrognio: Age em presena de matria orgnica e deve-se fazer a imerso do material em soluo com concentrao de 3-6% por 15-30 minutos. cido Peractico: A concentrao de uso varivel para a desinfeco, sendo que o tempo de exposio deve ser no mnimo de 20 minutos. b.2) Mtodo de Desinfeco de nvel intermedirio: Compostos Clorados: Causam a inibio de reaes enzimticas intracelulares, desnaturao de protenas, e inativao de cidos nuclicos.Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ao rpida, entretanto seu uso limitado, pois irritante, instvel por 24 horas, fotossensvel e voltil, alm de ser corrosivo para metais. Seu uso indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais ( corrosivo). Apresenta-se na forma lquida (ex: Hipoclorito de sdio) e na forma slida (ex: Hipoclorito de Clcio), e o tempo de exposio dos artigos a estes compostos de aproximadamente 10 minutos. lcoois(Etlicos e Isoproplicos): Seu mecanismo de ao atravs da desnaturao de protenas. So usados em concentrao de 70% peso por 10 minutos, para a desinfeco de superfcies. O uso destas substncias contraindicado para materiais mdico-cirrgicos, borracha, plsticos e acrlico. Fenlicos: Seu mecanismo de ao atravs do rompimento da parede celular, precipitando protenas, quando usado em alta concentrao, e alterao dos sistemas enzimticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentrao. Sua concentrao para uso de 0,4-5% sendo que o tempo de exposio deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso indicado para descontaminao de ambiente hospitalar, itens cirrgicos e mdicos no-crticos, sendo que devem ser consideradas as limitaes devido a toxicidade (hiperbilirrubinemia crianas berrios), e ao residual em materiais porosos. Iodforos: Sua ao atravs de seu alto poder de penetrao na parede celular, levando a ruptura de protenas. So utilizados em concentrao de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos. b.3) Mtodo de Desinfeco de baixo nvel lcoois. Compostos Clorados. Fenlicos: em concentrao menor que 5%. Iodforos: em concentrao menor que 30 ppm. Compostos de Amnio Quaternrio: Age atravs da inativao de enzimas, desnaturao de protenas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentrao para uso de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mnimo 10 minutos. indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfcies). Detergentes: So agentes tensoativos, com ao detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catinicos (p. ex. Quaternrios de Amnio), Aninicos (p. ex. sabes, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimticos. Este ltimo tem como princpio ativo enzimas proteinases, amilase e lpases, e,portanto, causam transformaes em protenas, polissacardeos e gorduras.

Principais Compostos Utilizados em Desinfeco e Assepsia

Agente Espectro de ao Grampositivas Gramnegativas BAAR** Grampositivas Gramnegativas BAAR Uso Modo de ao Tempo de exposio Desvantagens

lcoois (7080%)

Antisspticos Desinfectantes

Desnaturao protica Curto (10dissoluo de 15 min) lipdeos

Pouco ativo contra esporos

Fenis

Desinfectantes

Desnaturao Efeito protica imediato

Fenol puro corrosivo e de odor desagradvel No age sobre BAAR e esporos

GramCompostos positivas Quaternrios Gramde amnio negativas Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas

Antisspticos Sanitizantes Desinfectantes (instrumentos cirrgicos) Tratamento da gua

Alterao da membrana celular bacteriana Inativao enzimtica agente oxidante

Curto (1030 min)

Cloro

Efeito imediato

Odor irritante pouco ativo contra esporos

Iodo

Antisspticos Desinfectantes

Inativao enzimtica

Efeito imediato

Odor irritante pouco ativo contra esporos

Iodforos

Antisspticos Desinfectantes

Inativao enzimtica

Efeito imediato

Pouco ativo contra esporos

Aldedos

Curto Desnaturao Desinfectantes (formas Tempo de protica (instrumentos e vegetativas) exposio agente superfcies) Prolongado longo alquilante (esporos) Antisspticos Inativao enzimtica S agem enquanto em contato No atuam sobre BAAR e esporos

Metais pesados

2 TCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO

Os microorganismos, assim como todos os outros seres vivos, necessitam de condies favorveis, para que possam se desenvolver e se reproduzir, para assim originar uma populao (colnia). Microorganismos patognicos encontram nos seres vivos as condies ideiais para aumentar sua populao, desta forma, so capazes de provocar doenas. Para identificar o provvel agente causador de uma doena, ou simplesmente estudar determinada espcie de bactria ou outro microorganismo, necessrio realizar seu cultivo, isolamento e, assim, obter uma cultura pura, que ser utilizada para identificao da espcie atravs de exames microscpicos (anlise da morfologia, caractersticas tintoriais, tipo de arranjo, etc.), provas bioqumicas, provas sorolgicas e de suscetibilidade a drogas antimicrobianas. No ambiente controlado de um laboratrio de Microbiologia, devemos oferecer condies favorveis para que o microorganismo cresa, simulando as condies ideiais que ele encontraria no seu habitat natural. A finalidade do cultivo obter o isolamento da bactria; a finalidade do isolamento obter-se uma cultura pura; e a finalidade da cultura pura realizar a identificao da espcie.

2.1 Definio de Termos

a) Cultivo: Operao que tem por objetivo fazer determinada espcie de microorganismo crescer (multiplicar-se) fora de seu ambiente habitual, para fins de se realizar um estudo detalhado. O cultivo pode ser realizado em mio de cultura (maioria), em animais de Laboratrio (M. leprae, T. pallidum), ou em cultura de tecidos (C. trachomatis, Riketsia). b) Meio de cultura: Associao equilibrada em quantidade e qualidade de substncias nutritivas, necessrias para o desenvolvimento de microorganismos fora de seu habitat ou meio natural. c) Semeadura: Operao que consiste em depositar um microorganismo ou vrios, de modo assptico num meio de cultura. d) Isolamento: Operao que consiste em separar uma espcie microbiana de outra, a partir de um material biolgico ou de uma cultura mista, para obteno de uma cultura pura. e) Cultura pura: formada por uma populao derivada de uma nica espcie ou clula original. f) Repique: Operao que consiste no transporte de parte de uma cultura para um meio esterilizado. g) Inculo: Poro de material biolgico utilizada na semeadura ou transportada no repique.

2.2 Tcnicas de Inoculao

A inoculao dos meios de cultura pode ser realizada com fio ou ala de platina, pipeta, palitos, esptulas ou swabs, dependendo do tipo de meio, finalidade da cultura ou bactria em estudo. Os seguintes procedimentos devem ser seguidos em quaisquer das inoculaes realizadas: Flambar o fio e a ala de platina antes e depois de qualquer inoculao, na chama do bico de bunsen at o rubro; Deix-los esfriar por alguns segundos em rea estril antes de entrarem em contato com o inculo; Os recipientes (no inflamveis: tubos de ensaio, placas de petri, etc.) manipulados devem ser abertos prximo chama do bico de bunsen; As bocas dos tubos de ensaio e bales devem ser aquecidas aps a retirada do material e antes da colocao da tampa, para eliminao de microorganismos que possam existir nessas reas. A tampa nunca deve ser colocada sobre o balco, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mnimo da mo direita durante a semeadura. A utilizao do Bico de Bunsen importante na manuteno das condies de assepsia, pois visa a diminuio de microrganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para trabalhos na Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e no forma fuligem (cinzas). importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, j que certas zonas da chama devem ser evitadas.

2.3 Tcnicas de Semeadura e Isolameto:

a) Semeadura em Meio Lquido: A semeadura de uma cultura bacteriana para um meio lquido pode ser feita utilizando-se ala ou fio de platina, ou pipeta (no caso de solues bacterianas diludas). Deve-se introduzir o material contendo o inculo, agitar levemente o recipiente onde foi inoculado (geralmente tubos de ensaio) e proceder a incubao no ambiente adequado (estufa) (figura 2). 1- Mergulhar a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana. 2- Mergulhar a ala carregada de bactrias no tubo com o meio de cultivo e agite a ala. Figura 2: Semeadura em meio lquido

Fonte: autor

b) Semeadura em Meio Semi-Slido: Em tubos de ensaio: Para semeadura em meio semi-slido, utiliza-se a agulha de platina, coleta-se o inculo a ser semeado, introduzindo-o na profundidade do meio (figura 3). 1- Mergulhar a Agulha de nquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana. 2- Fazer uma injeo com a agulha carregada com bactrias no meio de cultivo semi-slido. Figura 3: Semeadura em meio semi-slido

Fonte: autor

c) Semeadura em Meio Slido: Em tubo de ensaio (gar Inclinado) Utiliza-se a ala de platina, coleta-se o inculo a ser semeado, semeando o inculo na superfcie do meiorealizando uma estria sinuosa ou estria reta (figura 4). Aps estes procedimentos, deve-se incubar em condies apropriadas. 1- Mergulhar a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 2- Encostar levemente a ala na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfcie do gar. Figura 4: Semeadura em meio slido em tubo de ensaio

Fonte: autor

Em Placas de Petri: Semeadura por Esgotamento (estrias mltiplas): Recolher o inculo com ala de platina previamente flambada e resfriada, estender o material biolgico sobre a superfcie do meio em estrias bem prximas, continuar fazendo estrias em dois ou trs setores da placa sem carreg-la novamente, aumentando-se a distncia entre as estrias, com objetivo de se obter quantidades progressivamente menores de material biolgico (figura 5). Incubar com gar invertido em ambiente ideal. Esta tcnica utilizada para a obteno de colnias isoladas (formadas a partir de um

microorganismo). Cada clula bacteriana isolada, aps incubao por 18 a 24 h a 36C, dar origem a uma Unidade Formadora de Colnia (UFC). 1- Dividir a Placa de Petri em trs partes, fazendo linhas com a caneta retroprojetor na parte de baixo da placa. 2- Mergulhar a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 3- Fazer estrias em cada diviso, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possvel toda a superfcie da placa.

Figura 5: Semeadura em meio slido em placa de petri

Fonte: autor

Semeadura por Distenso: Com uma pipeta, colocar no centro da superfcie do meio 0,1 ml da suspenso bacteriana ou do material a ser semeado (diludo em soluo fisiolgica esterilizada) e espalhar uniformemente com auxlio de esptula de Drigalsky ou Swab; incubar em placas invertidas em ambiente adequado.

2.4 Condies de Incubao

a) Temperatura: As bactrias podem ser classificadas de acordo com a temperatura ideal de crescimento em Pscicrfilas (0-20C), Mesfilas (25-40C) e Termfilas (50-60C). A maioria das bactrias de interesse mdico apresentam melhor crescimento em temperaturas que variam entre 20 e 40 C; por isso, na rotina bacteriolgica a temperatura da estufa ajustada para 36C + 1C. b) Atmosfera: Os microorganismos aerbios crescem bem a uma tenso de 20-21% de oxignio (oxignio atmosfrico); por este motivo, muito fcil trabalhar no laboratrio com bactrias aerbias ou facultativas. O cultivo de bactrias anaerbias requer a obteno de uma atmosfera isenta em oxignio, que pode ser obtido com o uso de jarras de anaerobiose (Sistema Gaspak), onde o ar substitudo por uma mistura de gases, ou com o emprego de agentes especiais contendo agentes redutores (tioglicolato de sdio) em ambientes restritos (jarras).

Os microorganismos microaerfilos necessitam de uma tenso menor de oxignio, e maior de CO2 (5 a 10%), que pode ser obtida pelo mtodo da vela ou com estufas de CO2.

2.5 Meios de Cultura:

Os meios de cultivo so complexos que se destinam ao cultivo artificial de microrganismos. O cultivo dos microorganismos, em condies laboratoriais, um prrequisito para seu estudo adequado, para que isso possa ser realizado, necessrio o conhecimento das condies fsicas e suas exigncias nutritivas. Os meios de cultivo devem conter as substncias exigidas pelas bactrias para o seu crescimento e multiplicao. Para que possam fazer a sntese de sua prpria matria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (protenas, acares), fontes de nitrognio (peptonas) e fontes de energia. So tambm necessrios alguns sais inorgnicos, vitaminas e outras substncias favorecedoras do crescimento. A gua o componente bsico de todos os meios de cultura, a qualidade da gua utilizada condio indispensvel para se obter sucesso na cultura bacteriana. Para se manter uma boa qualidade da gua, necessria a aplicao de alguns mtodos para purificao da gua: Desmineralizao ou Deionizao: mtodo atravs do qual ocorre a passagem da gua em uma coluna de resinas de troca catinica e aninica, obtendo-se gua livre de sais minerais. Destilao: processo clssico de purificao da gua que permite eliminar os compostos orgnicos, ainda que no seja 100% eficaz para a remoo dos componentes minerais. Osmose inversa: neste sistema, a gua separada dos microorganismos em suspenso e de molculas com elevado peso molecular, quando forada a passar atravs de uma membrana permevel, devido a um diferencial de gradientes de presso.

2.5.1 Finalidades dos Meios de Cultura:

a) Isolamento: a partir de um material contaminado possvel obter os microorganismos em seu estado de pureza. Ex: agar nutriente, agar sangue... b) Identificao: permite o estudo detalhado do microorganismo, de suas caractersticas culturais, propriedades bioqumicas e outras, permitindo sua classificao em gnero e espcie. Ex: TSI, caldo lactosado... c) Conservao: aps identificao e tipagem, podem ser formadas colees de bactrias (bacterioteca), cujas cepas podem ser mantidas durante longos perodos. Ex: agar nutriente, meio stock... d) Transporte: no caso de no ser possvel realizar a cultura logo aps a colheita de um determinado material biolgico, estes meios mantm estvel a populao microbiana presente neste material. Ex: Meio Cary Blair, etc... e) Obteno de Toxinas:so meios utilizados para deteco de certas exotoxinas liberadas por certas bactrias, so toxinas difusveis no meio de cultura. Ex.: Meio Craig (toxina colrica).

2.5.2 Caractersticas indispensveis aos meios de cultura

a) Conter substncias necessrias ao desenvolvimento de microorganismos: as substncias que compem os meios de cultura so alimentos bacterianos chamados nutrientes. Esses nutrientes devem fornecer bactria: fonte de energia, gua, sais minerais, vitaminas e fatores de crescimento. b) pH adequado: o potencial hidrogeninico deve ser ideal ao crescimento do microorganismo que se quer cultivar; em geral as bactrias exigem para o seu crescimento uma reao neutra ou ligeiramente alcalina (pH = 7.0 7.4) e os fungos exigem pH mais cido (pH = 4.5). c) Deve ser estril: o meio de cultura deve estar isento de formas microbianas vivas; o mtodo utilizado para esterilizao varia de acordo com a constituio do meio, mas em geral, realizada em autoclave com temperatura de 121C a presso de 1,5 KgF/cm3 durante 15 minutos.

2.5.3 Classificao dos meios de Cultura

a) Quanto composio: Naturais: so aqueles que possuem apenas substncias de origem biolgica, cuja composio no pode ser precisamente definida. Ex: Extrato de carne, extrato de levedura, etc. Sintticos: so meio constitudos de substncias qumicas isoladas, em quantidades conhecidas, portanto so quimicamente definidos e de composio determinada. Ex: Citrato de Simmons, etc. b) Quanto ao estado fsico (consistncia): Lquidos: os nutrientes so dissolvidos em gua; o crescimento bacteriano observado pela turvao do meio, pela formao de uma pelcula sobre a superfcie ou formao de sedimento. Ex: Caldo simples, Caldo tetrationato, etc. Slidos: proporcionam um estudo mais detalhado das bactrias em cultura pura atravs de seu crescimento cracterstico, pelo aparecimento de Unidades Formadoras de Colnias (UFC). Utiliza-se uma porcentagem de 1,5 a 2,0% de agar. Ex: gar Simples, Agar Sangue, etc. Semi-slidos: possuem quantidade menor de gar que os meios slidos, apenas 0,4 a 0,5%. Ex. Meio de mobilidade, meio de Fletcher, etc. O Agar um polissacardeo extrado de algas marinhas e serve de base para preparao de meios slidos ou semi-slidos. Funde-se a 98C e solidifica-se a 45C; no possui valor nutriente, serve apenas como base solidificante. Os meios slidos e semi-slidos podem ser chamados de agar e os lquidos de caldo. c) Quanto ao uso prtico ou finalidade: Meios bsicos: apropriados para o cultivo e conservao de bactrias de pouca exigncia nutricional; e podem servir de base para o preparo de outros meios. Ex: Caldo Simples, gar Simples, gua peptonada. Meios de enriquecimento: so obtidos pela adio aos meios bsicos de substncias de maiores valores nutritivos, prprio para microorganismos exigentes, podem ser adicionados sangue, soros, extratos de tecidos animais ou vegetais. Ex. Caldo glicosado, gar Sangue, gar Chocolate. Meios seletivos ou de diagnstico: atravs do uso de suas propriedades

bioqumicas selecionam um grupo de bactrias por conterem substncias inibidoras para outras bactrias, chamadas de substncias bacterioimpedientes. Ex: Agar MacConkey (os sais biliares e o cristal violeta inibem o crescimento de bactrias gram positivas e algumas gram negativas exigentes. As bactrias fermentadoras de lactose formam cido, provocando a viragem do indicador de pH, as colnias fermentadoras aparecem avermelhadas e as no-fermentadoras so amarelas, incolores ou translcidas). Meios diferenciais ou indicadores: proporcionam a distino dos diversos gneros bacterianos de uma famlia atravs do estudo de suas propriedade bioqumicas. Ex: Agar Sangue, TSI, Citrato de Simmons, etc. Meios de Dosagem Bioqumica: so meios quimicamente definidos de composio determinada utilizados para a dosagem de vitaminas, aminocidos ou antibiticos que foram metabolizados ou produzidos pelas bactrias.

2.5.4 Preparo de Meios de Cultura

O preparo dos meios de cultura geralmente segue protocolos determinados previamente, como uma receita que devem ser seguidos rigorosamente a fim de se obter repetibilidade de resultados. Porm alguns cuidados devem ser tomados durante seu preparo: Os ingredientes devem ser dissolvidos completamente em gua destilada ou deionizada; Devem ser utilizados apenas meios de cultura dentro do prazo de validade; Os meios devem ser guardados em frascos bem fechados e longe de umidade; temperatura inferior a 25C, protegidos da luz; Quando especificado no rtulo, manter sob refrigerao ou em frasco escuro. Meios armazenados adequadamente podem ser mantidos durante 3 anos sem perder sua estabilidade Manter os meios em frascos hermeticamente fechados e abri-los somente no momento do uso. Os meios so geralmente higroscpicos. Assim, a absoro de gua por parte do meio ou a liberao de gua do interior deste, motivado por grandes oscilaes de temperatura, provoca o desenvolvimento de microrganismos no material, o que ocasiona consumo de substncia nutritivas, variaes de pH e alterao de cor. Dissolver o meio conforme os procedimentos indicados pelo fabricante, de forma a obter uma soluo homognea. Utilizar quando necessrio, preferencialmente o banho-maria, como fonte de calor para perfeita adsoro. Pesar cuidadosamente a quantidade do meio base desidratado ou as pores corretas dos ingredientes adicionados a estes. Distribuir os meios de cultura em estritas condies de assepsia. A sala de microbiologia e as mos dos analistas so limpas com lcool a 70%. Os operadores vestem guarda-p branco e limpo. Manter registros de materiais ou reagentes utilizados em microbiologia e que devem, preferencialmente, serem adquiridos de um fornecedor especfico. Identificar, quando possvel, o reagente ou material com o fornecedor e o respectivo cdigo de identificao.

Exemplos de preparo de alguns meios de Cultura: a) gar padro para contagem (PCA = Plate Count Agar) Material: Triptona : 5g; Extrato de leveduras: 2,5g; Glicose:1,0 g; gar: 15,0 g; gua destilada: 1,0 L. Mdodos: Suspender os componentes na gua destilada. Ferver at a dissoluo do material. Ajustar o pH em 7,0. Distribuir em frascos apropriados e autoclavar por 15 min a 121C. b) Caldo simples ou caldo nutriente Material: Extrato de carne: 3,0 g; Peptona: 5,0g; gua desilada: 1,0 L. Mtodos: Suspender os componentes na gua destilada. Ferver at a dissoluo do material. Ajustar o pH em 6,7. Distribuir em frascos apropriados e autoclavar por 15 min a 121C. c) gar simples ou gar nutriente Material: Extrato de carne: 3,0 g; Peptona: 5,0g; gar: 15,0 g; gua desilada: 1,0 L. Mtodos: Suspender os componentes na gua destilada. Ferver at a dissoluo do material. Ajustar o pH em 7,3. Distribuir em frascos apropriados e autoclavar por 15 min a 121C. d) Caldo Sabouraud (para bolores e leveduras) Material: Glicose: 40,0 g; Peptona: 10,0g; gua desilada: 1,0 L. Mtodos: Suspender os componentes na gua destilada. Ferver at a dissoluo do material. Distribuir em frascos apropriados e autoclavar por 15 min a 121C. O pH final deve ser 5,8 e) gar Sabouraud (para bolores e leveduras) Material: Glicose:40,0 g; Peptona: 10,0g; gar: 15,0 g; gua desilada: 1,0 L. Mtodos: Suspender os componentes na gua destilada. Ferver at a dissoluo do material. Distribuir em frascos apropriados e autoclavar por 15 min a 121C. O pH final deve ser 5,6.

3 CULTIVO, COLORAO E MICROSCOPIA 3.1 Cultura de microorganismos

Tcnicas de culturas so utilizadas para a propagao de microorganismos, onde sero fornecidos condies ambientais favorveis para o desenvolvimento destes. Fatores como pH (potencial hidrogeninico), temperatura, aerao, concentrao de sal e fora inica do meio precisam ser sempre controlados. Os microorganismos variam quanto s necessidades nutricionais e suas fontes de energia metablica. O meio para o crescimento da cultura de microorganismos deve conter todos os nutrientes necessrios para o desenvolvimento destes e para a sntese biolgica de novos microorganismos. Quanto s fontes de energia metablica, fermentao, respirao e fotossntese so os principais mecanismos para obteno de energia. Alguns microorganismos podem exibir uma extrema dificuldade de crescer em cultura, por exemplo, certos parasitas so difceis de manter em cultivo por estarem fora do hospedeiro; neste caso a contribuio do ambiente vivo importante, podendo

ser utilizado no meio de cultura um extrato do tecido do hospedeiro. Em todo caso, deve-se determinar as necessidades do microorganismo em estudo para o sucesso da cultura.

3.2 Colorao de microorganismos

A anlise microscpica de um microorganismo auxiliada pela colorao. A introduo da colorao no estudo de microorganismos contribuiu para o desenvolvimento da microbiologia, pois permite uma melhor visualizao das clulas, a identificao e caracterizao de algumas estruturas celulares, alm de possibilitar a comparao entre organismos de grupos diferentes. A colorao pode ser uma colorao simples, onde o objetivo tornar mais visvel as estruturas bsicas do microorganismo. Outro tipo de colorao a colorao diferencial, onde os corantes reagem diferente com diferentes tipos de microorganismos; exemplos deste tipo de colorao a colorao pelo mtodo de Gram e a colorao lcool-cido-Resistente. O mtodo de Gram foi desenvolvido pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1884) e sua colorao diferencial est relacionada s diferenas entre as paredes celulares de determinados tipos bacterianos. A partir deste mtodo os microorganismos so classificados em Gram-positivo (Gram+) ou Gram-negativo (Gram -). Inicialmente aplicado um corante bsico, o cristal de violeta, que consiste num ction dotado de cor associado a um nion incolor. Alm do cristal de violeta adicionada uma soluo de iodo que funciona como mordente, aumentando a afinidade do corante com a clula, intensificando a cor. Como os cidos nuclicos apresentam cargas negativas iro se combinar com corantes bsicos, dessa forma as clulas bacterianas ficaram coradas de azul. A etapa seguinte caracterizada pela descolorao das clulas Gram - quando tratadas com lcool, apenas as clulas Gram + retem o complexo formado pelo corante cristal de violeta e a soluo de iodo, permanecendo coradas de azul. Por fim aplica-se um contracorante, um corante vermelho como a safranina ou fucsina, que ir corar de vermelho as clulas Gram anteriormente descoradas (figura 6). Fugura 6: Bactrias coradas pelo mtodo de Gram

Fonte: http://static.infoescola.com/wp-content/uploads/2010/03/bacterias-gram-positivas-negativas.jpg

Existem tambm coloraes especiais que so utilizadas que se objetiva corar e identificar apenas partes especficas do microorganismo, exemplos desse tipo de colorao so a colorao dos flagelos, a colorao da cpsula, a colorao dos

ncleos e a colorao dos esporos. Essas coloraes envolvem corantes e tcnicas especficos a de acordo com o que se quer corar.

3.3 Microscopia
Os microorganismos so seres vivos que no podem ser visualizados sem o auxlio da microscopia. Microscpio ptico, Microscpio eletrnico, Iluminao em campo escuro, Microscopia de fase e Auto-radiografia so alguns exemplos dos mtodos pticos utilizados na analise de microorganismos; O estudo dos microorganismos iniciou com o desenvolvimento da microscopia. O microscpico ptico (microscpio de luz) utiliza ftons para gerar as imagens observadas, o mais usado em analises biolgicas, sendo um aparelho formado por um suporte mecnico e uma parte ptica formada por lentes oculares, que aumentam o material observado e lentes objetivas que aumentam o poder de resoluo e a capacidade de diferenciar dois objetos prximos. O aumento total observado neste tipo de microscpio obtido multiplicando-se do aumento da lente objetiva pelo aumento da lente ocular, em bacteriologia, por exemplo, geralmente utiliza-se objetivas com capacidade de aumento de 90 vezes e ocular com um poder de aumento de 10 vezes, aumentando a amostra 900 vezes (90 x 10). O microscpico eletrnico emprega feixes de eltrons possibilitando uma resoluo superior a do microscpio de luz; aps atravessarem a clula, estes feixes de eltrons chegam a uma tela fluorescente formando uma imagem visvel sobre uma chapa fotogrfica. Esse tipo de microscopia exige uma colorao com metais pesados, como ouro, chumbo, urnio. O primeiro microscpio eletrnico a ser construdo foi o microscpio eletrnico de transmisso, que possui algumas caractersticas em comum com o microscpio ptico, porm a resoluo mxima 40.000 vezes melhor que no microscpio ptico, mas ainda no conseguimos aproveitar toda essa capacidade, obtendo apenas uma resoluo 2.000 vezes melhor. Nesse microscpico podemos observar facilmente vrus com dimetro de 0,01 2m. Outro tipo de microscpio eletrnico o microscpio eletrnico de varredura, este possui um menor poder resoluo que o microscpio eletrnico de transmisso, porm fornece imagens tridimensionais da amostra analisada.

4 CONTROLE DE MICROORGANSMOS
O controle de microorganismos caracterizado por destruir, remover, inibir o crescimento e/ou prevenir a transmisso destes seres vivos. Um microorganismo considerado inativo quando perde permanentemente sua capacidade de multiplicao. Muitas vezes, diferentes microorganismos e em diferentes estgios evolutivos caracterizam o ambiente onde necessrio a descontaminao, e estes podem apresentar diferenas na sua resistncia aos processos de controle. Desse modo importante definir os padres de descontaminao e os procedimentos de controle mais adequados para cada situao. Existem diversos mtodos de controle que podem ser empregados nos alimentos, nas indstrias, nos laboratrios. Esses mtodos de controle podem ser realizados por agentes fsicos (o calor o mais utilizado) ou por agentes qumicos.

Alguns agentes fsicos de controle: - Calor mido: Esterilizao a partir de temperaturas acima da temperatura de fervura da gua, o que conseguido em autoclaves. - Calor seco: Flambagem, incinerao, utilizao de fornos, so formas de esterilizao utilizando calor seco. - Pasteurizao: Aquecer e em seguida resfriar rapidamente o material a ser descontaminado. Mtodo que no assegura esterelizao. - Radiaes: Radiaes ionizantes e radiaes no-ionizantes so utilizadas para o controle de microorganismos, mas seus efeitos dependem do comprimento de onda, da intensidade, do tempo de exposio e da distncia da fonte de radiao. - Filtros: So utilizados filtros que retm microorganismos. Mtodo no eficaz no controle de vrus. Alguns agentes qumicos de controle: - Alcois: Desnaturao de protenas do microorganismo. - Aldedos e derivados: utilizados em solues aquosas em concentraes que podem ser bactericidas. - Fenis e derivados: Atuam em protenas. Primeiro agente qumico a ser utilizado como desinfetante na prtica cirurgica, porm um desinfetante fraco. - Halognicos e derivados: Interagem com os aminocidos aromticos. Um exmplo a tintura de iodo, um dos antispticos mais utilizados em prticas cirrgicas. - Agentes oxidantes: Liberam oxignio nascente, que reage e oxida substncias importantes para a sobrevivncia dos microorganismos. Os agentes antimicrobianos podem ser: (1) bacteriostticos, quando apenas inibem a multiplicao bacteriana, o que pode ser reversvel com a retirada deste agente. Ou (2) bactericidas, que tem a capacidade de destruir o microorganismo, impedindo sua multiplicao de maneira irreversvel. Os efeitos destes agentes de controle de microorganismos podem ser: - Leso do DNA, como por exemplo, os efeitos da radiao ou de algumas substncias qumicas reativas ao DNA. - Desnaturao de protenas (desorganizao da estrutura terciaria de uma protena), como por exemplo, a ao de alcois e outros agentes qumicos e fsicos. - Ruptura da Membrana ou Parede celular.