Crystallographic Studies on

Recombinant Human Stem Cell Factor ­ 141

17 November, 2008

Ogan Gurel
Prof. Wayne A. Hendrickson
Crystallization Experiments

The full­length extra­cellular form of SCF is very soluble and after preliminary 
screening trials, no crystals were obtained.  Screening with the 141 amino acid­
long truncated form was more successful, however crystals that were ultimately 
of the orthorhombic form were quickly obtained.  When these crystals were first 
observed, their complexity and uniqueness were not completely appreciated.  As 
it turns out, the conditions for crystallization are actually quite specific and 
furthermore a number of crystal types may appear within the same droplet.  The 
sensitivity to conditions makes it difficult to systematically evaluate the 
multiplicity of crystal types, while this multiplicity complicates the subsequent 
diffraction analysis.  Tables 1 & 2 summarize these results.

Photo # 1: Orthorhombic crystals (long & block)

Photo # 2: Hexagonal crystals

2
 Table 1.  rhSCF­141 Crystallization Conditions

Crystal Type Initial crystallization  Equilibrium reservoir & 

droplet temperature

ORTHORHOMBIC 14.5 % PEG 400 29% PEG 400

12.5M  CaCl2 0.25 M CaCl2

Types A1, A2, & B 50mM HEPES pH 7.5 100mM HEPES pH 7.5

50mM NaCl

5mM NaAcetate T = 22°C

5mg/ml rhSCF­141

HEXAGONAL 0.29M Na.K phosphate 2.0 M Na/K phosphate

              pH 9.0

0.29% PEG 400 T = 22°C
Type C
57mM NaCl

5.7mM NaAcetate

5.7mg/ml rhSCF­141

3
4
Diffraction Experiments
Table 2.  Crystallization parameters for the 
Orthorhombic form

Parameter Discussion

pH dependence Crystals grow best (single & clean faces) 
when equilibrated to a reservoir at pH 7.5. 
Crystals become poorly formed at pH 7.3 to 
7.4 and do not grow at below pH 7.3. 
However, the crystals are optimally stabilized 
at a slightly lower pH of7.2 to 7.3.

Temperature dependence
The optimum temperature is 22°C.
Experiments that were done at 20 °C yielded 
poorly formed crystals while those done in 
the cold room 4 °C resulted in 
microcrystalline spherulites.

Divalent cation dependence
Calcium seems to be required for the 
orthorhombic (not the hexagonal) crystals. 
Substitution with Mg or Zn resulted in phase 
separation / precipitation and heavy 
precipitation respectively.

β­octyl glucoside (BOG) Strongly inhibited crystallization at all 
concentrations (0.1% ­ 1%).

Different buffers Crystallization with MOPS or TRIS buffers at 
the equivalent or slightly different pH ranges 
resulted in poorly formed crystals.  With TRIS 
the long forms (A1) seemed to predominate.

Growth characteristics The crystals grow in 4 to 5 days in the 
presence of a heavy precipitate.

Crystal morphology See picture 1.  Either a "long form" (mostly 
type A1) or a "block form" (mostly type A2 & 
B).

Birefringence Moderately birefringent (biaxial), which the 
block form being slightly stronger.

Crystal dimensions (average) Long form:  0.3 x 0.15 x 0.15 mm

Block form:  0.35 x 0.25 x 0.25 mm

5
Stabilization
Initial experiments were made difficult by the relative radiation sensitivity of 
these orthorhombic SCF crystals.  The crystals would last less than 48 hours in 
the x­ray beam with a useful life of just one day.  To improve the crystal lifetimes, 
stabilization conditions were screened which substantially increased the useful 
beam time to over 100 hours.  In addition, stabilization and careful drying also 
yielded some improvements in the maximum diffraction limits.  The stabilization 
conditions are outlined below:

Table 3. Stabilization 
conditions

30% PEG 400

0.25M CaCl2

100 mM HEPES pH 7.2

100 mM NaCl

Crystals are placed overnight in stabilization vials and then mounted with the 
stabilization buffer serving as the mother liquor.

Diffraction limits
Initial experiments seemed to present confusing results in that some 
orthorhombic crystals seemed to diffract well, while others diffracted quite 
poorly.  The differences in diffraction quality did not seem to correlate with 
crystal size and it became apparent that we were potentially dealing with a 
number of crystal types.  Although, these types have not been completely 
defined, their putative diffraction limits (AFC5 rotating anode, 50kV,  100mA) are 
listed below:

6
 Table 4: Diffraction limits for 
the orthorhombic crystals
Crystal Type Consistent  Some spots seen to:
diffraction 
limit
A1 3.8 3.7

A2 3.1 2.9

B 2.8 2.7

The hexagonal crystals do not seem to diffract well (only to about 6 Angstroms or 
so).
Diffraction Photographs

Photo # 1: Type B (?) still (relatively wet crystal)
small angle precession, 0.3 mm collim/Ni filter, F=75mm.

Photo # 2:  Type A2 still
0.2 degrees, 2.8 hours, 0.5 mm collim/Ni filter, F=75mm

Photo # 3: Type A1 precession photo
7 degrees, 16 hours, 0.5 mm collim/Ni filter., F=75mm

7
Crystal Parameters

Precession photographs (screened & unscreened) on the orthorhombic crystals 
show the following features:

Table 5: Reciprocal space features of the 
orthorhombic crystals
Symmetry mm symmetry in all major zones (both 
0 level and upper levels)
Systematic absences odd absences along all three axes 
indicative of a 21 screw.
Reciprocal space angles All axes are orthogonal.

8
These features point to space group P212121.  Crystal form B has not been fully 
characterized, but is certainly orthorhombic with at least two screw axes.

Table 6. Crystal Parameters

Crystal  Space  a (Å) b (Å) c (Å) Volume n   (# in  solvent 

type group (Å3) au). content

A1 P212121 (88.2* 84.4* 73.1* ) n=2 73%

89.2** 84.4** 73.7** 554,849 n=4 46%
A2 P212121 88.1* 83.4* 72.7* 534166 n=2 72%
n=4 43%
B P21212? 81.9 62.5 54.0 ? 276412 n=1 73%
n=2 45%
C hexagonal by  N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
external 
morphology
* by precession
** by area detector refinement

Judging from the robustness of the crystals and the quality of diffraction ­­ its 
limits and water background) there are most likely 4 molecules per asymmetric 
unit in the orthorhombic A form.  

9
Native Data Collection

Data were collected on orthorhombic form A1 using the AFC6 rotating anode 
source (50kV, 100mA) and a Hamlin multiwire area detector (one detector 
configured at F = 560 mm).   Data collection began about 1.5 days after initial x­
ray irradation and the total actual data collection time took about 24 hours using 
4 orientations (500 frames each at 45 sec/frame).  Unfortunately, the data 
collection program went into an unexplained loop and the collection had to be 
interrupted and resumed.  The later batches appeared to be affected by radiation 
damage.  A total of 15269 observations were recorded with 5540 independent 

Table 7.  Data collection statistics
by resolution shell.

Dmin Rfac Rcum Intensity 

>3σ

4.37 0.114 0.077 70.4

4.24 0.111 0.079 70.1

4.11 0.134 0.081 63.7

4.00 0.133 0.083 60.0

3.90 0.187 0.085 49.4

3.80 0.197 0.087 40.6

reflections.  A quick analysis of the data shows that it falls off rapidly at around 4 
Angstroms resolution ­­ a conclusion which is supported by the data below:

The data seems to be relatively strong out the 4 Angstroms, and it is hoped that 
crystal form A2 will yield consistent data out to 3.1 Angstroms, especially if data 
collection can be quickly started and count times increased to 60 sec/frame.

10
Conclusions & further work

The basic elements are in place to begin moving towards solving the phase 
problem.  The basic strategy is as follows:

1.  Shift crystallization equilibrium towards A2 through seeding. 
Grow crystals in quantity.
2.  Continue to search through extant crystals for type B.
3.  Collect 3.1 Angstrom native data on A2.

4.  Evaluate improvement in diffraction on A2 with synchrotron 
radiation.
5.  Screen for heavy atom derivatives on A2

6.  Begin Se­methionine crystallizations A2

11