La microalga verde

Chlamydomonas reinhardtii :
nueva alternativa para la produccin de protenas recombinantes de inters mdico
Rodrigo Arturo Rivera Sols, Santy Peraza Echeverra y Virginia Aurora Herrera Valencia

ctualmente, la demanda de productos encaminados a mejorar la calidad de vida de los seres humanos va de la mano con el incremento de la poblacin y la necesidad de tratar enfermedades que afectan su bienestar. Hasta hace algunos aos, los medicamentos empleados para combatir estas enfermedades se obtenan principalmente de fuentes naturales. Sin embargo, con el incremento de la poblacin las fuentes naturales se han visto superadas, por lo que se ha recurrido a la biotecnologa. Un ejemplo es la molcula de taxol, empleada en el tratamiento contra el cncer. Originalmente, este compuesto era extrado de la corteza del rbol del tejo (Taxus brevifolia). Se necesitaban aproximadamente mil toneladas para obtener 130 kilos de taxol, lo que tena el costo ecolgico de talar aproximadamente 500 mil rboles. Existen mtodos menos destructivos para obtener una molcula relacionada al taxol y realizar su conversin qumica; sin embargo, sigue siendo muy costosa. Recientemente, Ajikumar y colaboradores (2010) sintetizaron un precursor del taxol en la bacteria Escherichia coli, lo cual significa un avance importante en la obtencin de esta molcula usando cultivos bacterianos, lo que disminuira tanto su costo econmico como ambiental. La biotecnologa tambin ha tenido un fuerte impacto en la produccin de protenas recombinantes (es decir, obtenidas por la tecnologa de ADN recombinante) de inters mdico, cuya demanda gener tan slo en 2006 ventas por aproximadamente 40 mil millones

de dlares en los Estados Unidos, con una tasa de crecimiento anual del 20 por ciento entre 2001 y 2006. Para finales de 2010 las ventas estimadas de esta clase de productos habran alcanzado los 53 mil millones de dlares. Esta demanda difcilmente se podra satisfacer de no ser por la tecnologa del ADN recombinante, mediante la cual se ha logrado la manipulacin gentica de diversos organismos para producir una mayor cantidad de protenas de inters mdico que la que se podra obtener de las fuentes originales. Entre los organismos modificados que actan como reactores biolgicos capaces de sintetizar protenas recombinantes hay bacterias, levaduras, insectos, plantas y mamferos, as como lneas celulares derivadas de los tres ltimos. Cada sistema de produccin posee diferentes caractersticas en trminos de rendimiento proteico, facilidad de manipulacin y costos de produccin, por lo que cada uno tiene diferentes ventajas y desventajas. Recientemente, las microalgas verdes, y en particular la especie Chlamydomonas reinhardtii, han surgido como una alternativa nueva y atractiva para la produccin de protenas recombinantes, debido principalmente a su cultivo fcil y econmico, su gran capacidad para acumular biomasa y a que son generalmente consideradas como inocuas para el ser humano. En el cuadro 1 se hace una comparacin de las caractersticas que presentan los organismos empleados comnmente como biorreactores para la produccin de protenas recombinantes, incluyendo a las microalgas como una nueva alternativa para este fin.

i-2 ciencia

octubre-diciembre 2011

La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii

Cuadro 1. C o m p a r a c i n d e l a s c a r a c t e r s t i c a s d e l o s s i s t e m a s d e p r o d u c c i n d e p r o t e n a s recombinantes tradicionales con las de las microalgas propuestas como biorreactores

Organismo
Bacterias Levaduras Clulas de insectos Clulas de mamferos Animales Clulas de plantas Plantas Microalgas

Costo de produccin
Bajo Medio Alto Alto Alto Bajo Muy Bajo Muy Bajo

Tiempo de produccin
Corto Medio Medio Largo Muy largo Corto Largo Corto

Caractersticas Capacidad de Calidad del Capacidad de escalamiento producto glucosilacin

Alto Alto Medio Muy bajo Bajo Alto Muy alto Muy alto Bajo Medio Alto Muy alto Muy alto Alto Alto Alto No S S S S S Ncleo: S Cloroplasto: No Ncleo: S Cloroplasto: No

Riesgo de contaminacin
Endotoxinas Bajo Alto Virus-Priones Virus-Priones Bajo Bajo Bajo

Costo de almacenamiento
Moderado Moderado Costoso Costoso Costoso Poco costoso Poco costoso Poco costoso

Como se puede observar en el cuadro 1, las microalgas presentan varias caractersticas ventajosas respecto a los sistemas convencionales de produccin de protenas recombinantes, que las hacen muy atractivas como biorreactores: tiempo corto de produccin, bajo riesgo de patogenicidad (no se conocen patgenos o toxinas que pudieran causar contaminacin en el producto final, como en el caso de bacterias y clulas de mamferos), y se ha demostrado su capacidad para sintetizar protenas complejas de origen humano. A nivel industrial, existe infraestructura desarrollada para explotar a estos organismos con el fin de obtener diversos compuestos de inters biotecnolgico, por ejemplo pigmentos como el beta-caroteno, con utilidad en la industria alimenticia y cosmtica, y los cidos grasos, empleados en la industria alimentaria y de los biocombustibles. Algunas microalgas presentan potencial para ser manipuladas genticamente; sin embargo, en la actualidad la nica microalga para cuya manipulacin gentica se cuenta con una gama completa de herramientas moleculares es C. reinhardtii, lo que incrementa an ms su valor como biorreactor para la produccin de protenas recombinantes de inters mdico.

Chlamydomonas reinhardtii C. reinhardtii es una microalga verde eucarionte (clorofita) que ha sido empleada por casi sesenta aos como modelo en estudios fisiolgicos como la fotosntesis, la biognesis (formacin) del cloroplasto y la funcin de los flagelos. Se ha hecho referencia a esta microalga como la levadura verde debido a su rpida multiplicacin y su fcil manipulacin en cultivos de laboratorio. La cepa silvestre de C. reinhardtii presenta una morfologa ovoide de aproximadamente 10 micrmetros de largo por 3 de ancho, y en su extremo anterior posee dos flagelos que le proporcionan movilidad, adems de estar involucrados en la reproduccin sexual. La mayor parte de su espacio intracelular (40 por ciento) est ocupado por un nico cloroplasto con forma de copa, el cual posee aproximadamente 80 copias de su genoma. C. reinhardtii es capaz de desarrollarse mixotrficamente; es decir, de forma auttrofa (puede producir su propio alimento) o hetertrofa (obtiene su alimento de fuentes externas), segn la disponibilidad de compuestos orgnicos y la intensidad lumnica. Su transformacin gentica (la introduccin de material

octubre-diciembre 2011

ciencia

i-3

Comunicaciones libres

gentico externo a la clula) es relativamente fcil, tanto a nivel nuclear como de cloroplasto, y el tiempo entre la transformacin de la microalga hasta la produccin de una protena recombinante puede ser de slo seis semanas, con el potencial de alcanzar un escalamiento de hasta 64 mil litros en cuatro semanas ms. Recientemente se han explorado aplicaciones de C. reinhardtii enfocadas a resolver diversas necesidades humanas. Por ejemplo, su uso en la produccin de biocombustibles (lpidos para biodiesel), en el rea de la biorremediacin (sustraccin de metales pesados en cuerpos de agua), en la produccin de pigmentos (carotenoides) y, como se mencion anteriormente, como biorreactor de protenas recombinantes de uso mdico. A continuacin se har una revisin ms profunda de esta aplicacin.

Produccin de protenas recombinantes de inters mdico Las protenas recombinantes de uso mdico se pueden dividir en tres clases: anticuerpos monoclonales, antgenos para vacunas y protenas teraputicas. Estas tres clases de protenas han sido producidas de manera exitosa en el cloroplasto de plantas superiores, con rendimientos que van del 6 al 16 por ciento

de protena soluble total en el caso de protenas teraputicas, alrededor del 31 por ciento en antgenos para vacunas y ms del 70 por ciento en el caso de pptidos antimicrobianos. Recientemente ha surgido un inters especial en la produccin de protenas recombinantes de inters mdico en el cloroplasto de C. reinhardtii, en el que ya se han producido varias de estas protenas, como veremos ms adelante. Con respecto a protenas recombinantes de inters mdico a nivel nuclear en esta microalga, slo se conoce la produccin de la protena eritropoyetina humana, con un rendimiento aproximado de 100 microgramos por litro de cultivo. Cabe sealar que el mecanismo de insercin del transgen en el ncleo se da al azar, lo que incrementa la posibilidad de silenciamiento gnico, a diferencia del cloroplasto, donde la insercin se da de manera dirigida en un sitio preciso mediante un proceso de recombinacin homloga. A continuacin se presenta una compilacin de las protenas de inters mdico producidas hasta el momento en el cloroplasto de C. reinhardtii.
Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales tienen aplicacin en el diagnstico y tratamiento de enfermedades como el

La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii en la investigacin cientfica, y el desarrollo de protenas recombinantes de inters mdico.

i-4 ciencia

octubre-diciembre 2011

La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii

cncer, enfermedad de Chron y artritis reumatoide, entre otras, o en la investigacin biomdica para el desarrollo de vacunas para prevenir enfermedades o en la cuantificacin de la expresin gnica. Un anticuerpo monoclonal es una molcula proteica capaz de reconocer un eptope nico (un sitio especfico dentro de otra molcula). Actualmente la forma ms eficiente para la produccin de anticuerpos monoclonales es mediante la creacin de hibridomas, que consisten en la fusin de una clula normal (capaz de producir anticuerpos) con una clula cancergena (capaz de multiplicarse indefinidamente), con lo que se logra producir anticuerpos monoclonales de manera constante. La desventaja de esta metodologa es que es costosa y necesita de personal altamente capacitado. En C. reinhardtii se ha logrado la produccin de anticuerpos monoclonales; como ejemplo de ello tenemos el trabajo realizado por Mayfield y colaboradores (2003), donde se logr exitosamente la produccin del anticuerpo monoclonal denominado HSV8-lsc, el cual presenta actividad contra la glucoprotena D del virus

del herpes simple. En este trabajo se demostr la capacidad del cloroplasto de esta microalga para formar correctamente puentes disulfuro en el interior de la estructura proteica, que son de gran relevancia para la produccin de protenas recombinantes de origen eucarionte. Tran y colaboradores (2009) lograron ensamblar el anticuerpo monoclonal 83K7C (derivado de la IgG1 humana), que tendra aplicacin contra el ntrax, y que demostr una actividad similar a los anticuerpos obtenidos en mamferos. Estos mismos autores produjeron tres anticuerpos monoclonales ms en el cloroplasto de C. reinhardtii, confirmando su capacidad como biorreactor para producir este tipo de anticuerpos, semejantes a aquellos producidos en otros sistemas eucariontes.
Vacunas

Las vacunas originalmente se desarrollaron como suspensiones de microorganismos atenuados o muertos (bacterias, hongos o virus) que eran administradas para prevenir, disminuir o tratar infecciones u otras enfermedades. Actualmente las vacunas pueden consistir en protenas antignicas derivadas de estos microorganismos o de construcciones sintticas que tienen la informacin para fabricar estos antgenos. Desde sus inicios, las vacunas han sido producidas en animales, pero recientemente se ha demostrado que pueden ser obtenidas en sistemas vegetales mediante la tecnologa del ADN recombinante, por ejemplo en tabaco o arroz. Por su parte, se ha demostrado tambin la capacidad de C. reinhardtii para producir vacunas recombinantes. Una vacuna contra la infeccin de la bacteria Staphylococcus aureus fue producida por Dressen y colaboradores (2010) en el cloroplasto de esta microalga, la cual fue capaz de provocar inmunidad por va oral en ratones. Esta vacuna fue estable por un periodo aproximado de ao y medio en condiciones de almacenamiento a temperatura ambiente.
Protenas teraputicas

Productos biotecnolgicos (protenas recombinantes de inters mdico), producidos en la microalga verde Chlamydomonas reinhardtii.

Las protenas teraputicas estn enfocadas a remediar o prevenir alguna enfermedad. Se incluye en esta cate-

octubre-diciembre 2011

ciencia

i-5

Comunicaciones libres

Impacto en la sociedad de los productos biotecnolgicos (protenas recombinantes de inters mdico), producidos en la microalga verde Chlamydomonas reinhardtii .

gora a las protenas empleadas directamente como frmacos, as como aquellas involucradas en la produccin de dichos frmacos. En el cloroplasto de C. reinhardtii se han producido algunas protenas recombinantes teraputicas. Un ejemplo es un suero amiloide asociado a las glndulas mamarias (M-SAA), producido por Manuell y colaboradores (2007); esta protena se encuentra de manera natural en el calostro bovino, y es capaz de estimular las clulas epiteliales humanas para producir mucina intestinal, la cual acta como agente profilctico contra las infecciones virales y bacterianas. Otro ejemplo es la enzima descarboxilasa de cido glutmico (GAD65) producida por Wang y colaboradores (2008); esta enzima puede ser usada como un autoantgeno, ya que muchos de los pacientes que presentan diabetes tipo I de reciente aparicin presentan anticuerpos contra GAD65, los cuales pueden servir para predecir y dar un diagnstico temprano de la diabetes tipo I, enfermedad autoinmune resultante de la destruccin de las clulas productoras de insulina en el pncreas. Rasala y colaboradores (2010) evaluaron la produccin de siete protenas que son o presentan potencial

como agentes teraputicos humanos. Entre las protenas evaluadas, se encuentran la eritropoyetina (regulador de la sntesis de eritrocitos), las protenas 10FN3 y 14FN3 (dominios de la fibronectina que tienen funcin en la adhesin celular), el interfern humano beta-1 (mejora la integridad de la barrera hematoenceflica), la proinsulina humana (hormona que regula los niveles de azcar en la sangre), el factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF; que estimula la angiognesis) y la protena B1 del grupo de alta movilidad (HMGB1; mediadora en la curacin de heridas mediante la activacin de clulas endoteliales). Cuatro de las protenas evaluadas (10FN3, 14FN3, VEGF y HMGB1) fueron producidas con xito, ya que se obtuvieron rendimientos de entre 2 y 3 por ciento de protena soluble total en el cloroplasto de C. reinhardtii. En el cuadro 2 se hace un resumen de las protenas recombinantes que han sido producidas en el cloroplasto de C. reinhardtii, incluyendo sus rendimientos proteicos, as como los elementos reguladores de la expresin gnica (Promotor + 5UTR/3UTR) con los que se ha logrado dicha produccin.

i-6 ciencia

octubre-diciembre 2011

La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii

Cuadro 2. P r o t e n a s r e c o m b i n a n t e s d e u s o m d i c o p r o d u c i d a s e n e l c l o r o p l a s t o d e C . r e i n h a r d t i i

Gen expresado
HSV8-lsc

Tipo de protena
Anticuerpo

Funcin
Actividad contra la glicoprotena D del virus herpes simple

Promotor + 5UTR/3UTR
atpA/rbcL

Rendimiento (protena soluble total, PST)

0.5% PST

Aplicacin
Anticuerpos monoclonales

Referencia
Mayfield et al ., 2003 Tran et al ., 2009 Dressen et al ., 2010

83K7C

Anticuerpo derivado de IgG1

Actividad contra el antgeno PA83 del ntrax Vacuna oral contra S. aureus

LC: psbA/rbcL HC: psbA/psbA

0.1 % de biomasa seca 0.7% PST

Anticuerpos monoclonales Vacuna oral

CTB-D2

Toxina B del clera fusionada con el dominio D2 de la protena de unin a la fibronectina

rbcL/rbcL

hTRAIL M-SAA

Factor de necrosis tumoral Suero bovino amiloide asociado a las glndulas mamarias

Tratamiento del cncer Estimulacin de la produccin de mucina en el intestino para inmunizar a recin nacidos Diagnstico temprano de la diabetes tipo I Smil de anticuerpo Smil de anticuerpo Tratamiento del enfisema pulmonar y de la disfuncin erctil; antidepresivo Curacin de heridas mediante la activacin de clulas endoteliales

atpA/rbcL psbA/psbA

0.43%-0.67% 5.0% PST

Teraputico Teraputico

Yang et al., 2006 Manuell et al ., 2007

hGAD65

Descarboxilasa de cido glutmico humana 65

rbcL/rbcL

0.25-0.3% PST

Teraputico

Wang et al ., 2008

M-SAA10NF3 14NF3 VEGF

10 dominio de la fibronectina III humana 14 dominio de la fibronectina III humana Factor de crecimiento endotelial vascular humano

psbA/psbA psbA/psbA psbA/psbA

~3.0% PST 3% PST 2% PST

Teraputico Teraputico Teraputico

Rasala et al ., 2010 Rasala et al ., 2010 Rasala et al ., 2010

HMGB1

Protena B1 del grupo de alta movilidad

psbA/psbA

2.5% PST

Teraputico

Rasala et al ., 2010

Produccin de protenas recombinantes de inters mdico a nivel mundial Alrededor del mundo existen compaas dedicadas a la produccin de protenas recombinantes empleando diversos hospederos como biorreactores. Las grandes transnacionales ya tienen productos

en el mercado que emplean a E. coli o clulas de ovario de ratn como biorreactores. Por otro lado, existen tambin compaas involucradas en el desarrollo de protenas recombinantes empleando plantas como plataformas de expresin. De estas compaas, dos son las ms avanzadas: Protalix Biotherapeutics, que cuenta con la enzima glucocerebrosidasa para el tratamien-

octubre-diciembre 2011

ciencia

i-7

Comunicaciones libres

to de la enfermedad de Gaucher, que ya ha concluido la fase clnica III, y Biolex therapeutics, que cuenta con un interfern para el tratamiento de la hepatitis C listo para iniciar fase clnica III; ambas se encuentran muy cerca de la comercializacin de sus productos. Hay que mencionar tambin a Icon genetics, adquirido por Bayer en el 2006, y su sistema denominado Magnifection, mediante el cual es posible la transformacin (introduccin de material gentico externo) temporal de plantas de tabaco para producir protenas recombinantes, y que actualmente cuenta con algunas de stas en fase clnica I. En el caso de las microalgas, C. reinhardtii ha recibido mucha atencin para el desarrollo de una plataforma de expresin de protenas recombinantes. Dado que esta atencin comenz recientemente, existen por el momento slo dos compaas involucradas en el desarrollo de protenas recombinantes de inters mdico: una es Phycobiologics compaa estadounidense enfocada principalmente al desarrollo de protenas recombinantes de inters veterinario, usando como biorreactor al cloroplasto de C. reinhardtii, que actualmente est desarrollando un proceso para producir protenas recombinantes de inters mdico.

Protelica es la otra compaa estadounidense dedicada al diseo de protenas recombinantes que recientemente ha mostrado inters en usar al cloroplasto de C. reinhardtii para producir estas protenas en colaboracin con el grupo de Stephen Mayfield, del San Diego Center for Algae Biotechnology, en Estados Unidos. En el caso de Mxico, entre las compaas que se dedican a la produccin y desarrollo de protenas recombinantes de inters mdico podemos mencionar a Probiomed, que utiliza clulas de mamferos como plataforma de expresin para producir protenas como la eritropoyetina y el interfern beta-1a, las cuales se utilizan para el tratamiento de anemia por insuficiencia renal crnica y de la esclerosis mltiple respectivamente. Otro ejemplo es Cryopharma, que utiliza clulas de ovario de hmster chino como sistema de expresin de la eritropoyetina humana enfocada a la terapia hematolgica. Tambin cabe mencionar a Bioclon, que utiliza a E. coli en la produccin de antgenos utilizados en el proceso de elaboracin de faboterpicos (antivenenos). Estas empresas son casos de xito en el rea nacional y empresas reconocidas a nivel mundial. Las ventajas que presenta C. reinhardtii como biorreactor la hacen una alternativa muy atractiva para que empresas como las antes mencionadas adopten a este organismo para producir protenas recombinantes o bien para la creacin de nuevas empresas interesadas en ingresar al mercado de la produccin de protenas recombinantes de inters mdico.

Conclusin Chlamydomonas reinhardtii ha demostrado ser un organismo muy verstil que puede ser usado tanto en estudios de ciencia bsica como en diversas aplicaciones biotecnolgicas, y que es una alternativa muy atractiva para la produccin de protenas recombinantes con aplicacin mdica. Hemos descrito las caractersticas que la hacen apropiada para su uso como biorreactor y que han permitido su uso para la obtencin de anticuerpos monoclonales, vacunas y compuestos teraputicos de inters mdico con resultados satisfactorios. Lo anterior nos permite considerar que C. reinhardtii ha pasado de ser una promesa a ser una realidad como biorreactor de protenas recombi-

i-8 ciencia

octubre-diciembre 2011

La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii

nantes, con el potencial de contribuir a resolver algunos de los problemas mdicos que afectan actualmente a la humanidad e influir en la bioeconoma del siglo XXI.

Lecturas recomendadas
Ajikumar, P., W. Xiao, K. Tyo, Y. Wang, F. Simeon, E. Leonard, O. Mucha, T. Phon, B. Pfeifer y G. Stephanopoulos (2010), Isoprenoid pathway optmimization for taxol precursor overproduction in E. coli, Science, 330 (6000), 70-73. Dressen, I., G. Charpin El-Hamri y M. Fussenegger (2010), Heat-stable oral alga-based vaccine protects mice from Staphylococcus aureus infection, Journal of biotechnology, 145, 273-280. Manuell, A., M. Beligni, J. Elder, D. Siefker, M. Tran, A. Webber, T. McDonald y S. Mayfield (2007), Robust expression of a bioactive mammalian protein in Chlamydomonas chloroplast, Plant biotechnology journal. 5: 402-412. Mayfield, S., S. Franklin y R. Lerner (2003), Expression and assembly of a fully active antibody in algae, PNAS, 100(2), 438-442. Mayfield, S. y S. Franklin (2005), Expression of human antibodies in eukaryotic micro-algae Vaccine, 23, 1828-1832. Rasala, B., M. Muto, P. Lee, M. Jager, R. Cardoso, C. Behnke, P. Kirk, C. A. Hokanson, R. Crea, M. Mendez y S. Mayfiels (2010), Production of therapeutic proteins in algae, analysis of expression of seven human proteins in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii, Plant biotechnology journal, 8, 1-15. Tran, M., B. Zhon, P. Petterson, M. Gonzlez y S. Mayfield (2009), Synthesis and assembly of a full-lenght human monoclonal antibody in algal chloroplasts, Biotechnology and bioengineering 104 (4), 663-673. Wang, X., M. Brandsma, M. Tremblay, D. Maxwell, A. Jevnikar, N. Huner y S. Ma (2008), A novel expression platform for the production of diabetes-associated autoantigen human glutamic acid decarboxylase (hGAD65), BMC biotechnology, 8(87).

Rodrigo Arturo Rivera Sols es qumico bilogo agropecuario por la Universidad Autnoma de Yucatn. Actualmente es becario del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa y se encuentra cursando las etapas finales del programa de Doctorado del Posgrado en Ciencias Biolgicas del Centro de Investigacin Cientfica de Yucatn ( CICY ). Santy Peraza Echeverra es licenciado en biologa por la Universidad Autnoma de Yucatn, maestro en ciencias y biotecnologa de plantas por el de Biotecnologa del
CICY

y doctor por la Queensland University

of Technology (Australia). Es profesor-investigador en la Unidad

CICY .

Virginia Aurora Herrera Valencia es licenciada en biologa por la Universidad Autnoma de Yucatn, maestra en ciencias y biotecnologa de plantas por el
CICY

y doctora por la Queensland

CICY .

University of Technology (Australia). Actualmente es profesorainvestigadora en la Unidad de Biotecnologa del

octubre-diciembre 2011

ciencia

i-9