UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINRIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA PSDOUTORADO EM HIGIENE VETERINRIA E PROCESSAMENTO TECNOLGICO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL

MTODOS MOLECULARES PARA ANLISE DE PROTENAS

DANUZA PINHEIRO BASTOS GARCIA DE MATTOS JORGE LUIZ FORTUNA
Disciplina: BIOLOGIA MOLECULAR Prof. Dr. Elmiro Rosendo do Nascimento

NITERI-RJ 2010

INTRODUO
PROTENA
Composto orgnico de alto peso molecular Formado pelo encadeamento de aminocidos Representa cerca de 50-80% do peso seco da clula Sendo o mais abundante de matria viva

INTRODUO
MAPEAMENTO GENTICO
GENOMA conjunto de todos os GENES Sequenciamento do Cdigo Gentico

GENMICA FUNCIONAL
Nova rea nas Cincias Biolgicas Determina funo para os diversos genes sequenciados No seria necessrio estudar nveis de protenas Determinava apenas os nveis de RNA-m
GENE DNA RNARNA-m RNARNA-r + RNA-t RNAPROTENA

INTRODUO
GENMICA FUNCIONAL
Comparando abundncia de RNA-m e PTN Concluso anlise das PTN mais apropriada para entender funo dos GENES, pois analisa o produto final do GENOMA TRANSCRIPTOMA PROTEOMA conjunto de todos os RNA-m conjunto de todas as PTN

METABOLOMA conjunto de todos os metablitos que so produzidos e/ou modificados por um organismo

INTRODUO
A PROTEMICA, portanto, parece ser a ferramenta mais apropriada para se entender o funcionamento dos GENES, pois analisa o produto final do GENOMA, isto , as PROTENAS e, consequentemente, os seus METABLITOS. O estudo PROTEMICO exige a separao (isolamento) das PROTENAS atravs de tcnicas com alta resoluo, como as da BIOLOGIA MOLECULAR.

ANLISE DE PROTENAS
PRINCIPAIS TCNICAS Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Eletroforese Bidimensional Radioautografia (Autorradiografia) Western Blotting Cromatografia Fracionamento Celular Espectrometria de Massa

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE
Separa misturas de PTN livres em soluo aquosa colocadas em gel submetido a uma diferena de potencial eltrico Migrao ocorre do plo negativo para o plo positivo PTN so separadas ao migrarem a uma velocidade que depende:
Carga eltrica Tamanho Forma Massa

PTN maiores migram mais lentamente do que as menores

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis Empregada para anlises proteicas a partir da dissoluo das PTN em soluo de SDS SDS Dodecil Sulfato de Sdio (Sodium Dodecyl Sulfate) (CH2)11OSO3Na Utiliza gel de Poliacrilamida:
Ligaes altamente cruzadas Matriz inerte Ocorre migrao das PTN

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
PTN so colocadas em uma soluo de SDS SDS:
Detergente forte Extensa cauda apolar e cabea polar (Sulfato) Carregado negativamente

Poro apolar interage com regies hidrofbicas das PTN poro polar fica exposta MICELA Excesso de molculas negativas de SDS PTN tornam-se negativas

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
SDS provoca desdobramento das PTN em cadeias polipeptdicas estendidas Dissociao das PTN Adio de -Mercaptoetanol:
Agente redutor Quebra ligaes dissulfeto (S-S) Separa PTN OLIGOMTRICAS

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
PTN do mesmo tamanho tendem a migrar com velocidades similares Formao de uma srie de diferentes bandas de PTN nica banda pode corresponder a vrias PTN Visualizadas utilizando marcadores:
Azul de Cromassie Prata Ouro

Tcnica mais importante de anlise de PTN, podendo ser utilizada para separar todos os tipos de PTN

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE EM GEL BIDIMENSIONAL DE POLIACRILAMIDA (2D-PAGE)
Bandas (ou picos) de PTN muito prximos sobreposio resolvem apenas um nmero pequeno de PTN (<50) 2D-PAGE combina dois procedimentos de separao, podendo resolver de 2.000 at 8.000 PTN Nmero total de diferentes PTN em bactrias (2.000) Forma um mapa bidimensional de PTN Duas etapas duas dimenses

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2DPAGE)
1 ETAPA (1 DIMENSO):
PTN so separadas pela sua carga intrnseca Amostra dissolvida em um volume pequeno de uma soluo:
Detergente no inico (sem carga) -Mercaptoetanol Reagente desnaturante ureia

Soluo
Solubiliza / Desnatura / Dissocia

Cadeias polipeptdicas inalteradas

mantm

cargas

intrnsecas

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2DPAGE)
1 ETAPA (1 DIMENSO):
Separao ocorre devido a FOCALIZAO ISOELTRICA Carga lquida de uma molcula proteica varia com o pH da soluo em que se encontra Cada PTN tem um Ponto Isoeltrico (PI) caracterstico pH no qual PTN no apresenta carga lquida PTN no migra em um campo eltrico Focalizao Isoeltrica PTN so separadas por eletroforese em pequeno tubo de gel de poliacrilamida gradiente de pH estabelecido por mistura de tampes Cada PTN migra para uma posio no gradiente que corresponde ao seu PI, permanecendo l

ANLISE DE PROTENAS
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2DPAGE)
2 ETAPA (2 DIMENSO):
Pequeno gel com PTN separadas submetido a eletroforese em direo de um ngulo reto em relao 1 Etapa Adiciona-se SDS PTN separadas de acordo com tamanho, forma, massa, como no SDS-PAGE Pequeno gel submerso em SDS e colocado na borda de um gel de poliacrilamida nicas PTN que no se separam tamanho e PI idnticos Mesmo traos de cada cadeia polipeptdica podem ser detectados no gel colorao ou autorradiografia Poder de resoluo distingue entre duas PTN que se diferem em apenas um nico aminocido

ANLISE DE PROTENAS
AUTORRADIOGRAFIA (RADIOAUTOGRAFIA)
Tcnica que utiliza istopos radioativos papel de nitrocelulose clulas;

Sntese de PTN pode ser estudada pela injeo de aminocidos marcados precursor radioativo Baseia-se na sensibilidade das emulses fotogrficas s radiaes ionizantes suspenso de microcristais de Brometo de Prata em gelatina GRNULOS NEGROS Incorporao e migrao de compostos radioativos introduzidos nas amostras Principais istopos H3; C14; S35; I131; I125; P32

ANLISE DE PROTENAS
WESTERN BLOTTING
Tcnica de imunoensaio PTN especfica pode ser identificada aps eletroforese, atravs da exposio das PTN presentes no gel a um anticorpo PTN do gel so transferidas (blotting) para uma folha de papel de nitrocelulose Anticorpo especfico para PTN de interesse Complexo antgeno+anticorpo na folha detectado com um segundo anticorpo especfico para o primeiro anticorpo

ANLISE DE PROTENAS
WESTERN BLOTTING
Anticorpo acoplado a marcadores:
Enzima detectvel Corante fluorescente Istopo radioativo (autorradiografia)

Torna possvel encontrar uma PTN especfica em uma mistura complexa de PTN

CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA
FUNDAMENTO
Passagem de protenas em meio lquido atravs de uma coluna constituda de uma matriz slida e porosa. Fluxo contnuo e velocidades diferentes = separao

CROMATOGRAFIA

GRAU E TIPO DE INTERAO

Interao de troca inica: separao por carga eltrica Interao hidrofbica: matriz retarda ptns hidrofbicas Filtrao em gel: separao por tamanho e forma Interao por afinidade: p. ex. relaes Ag-Ac

CROMATOGRAFIA

Cromatografia de troca inica

Cargas opostas nas fases (mvel e estacionria) Salting out para separar ptn fixada
Soluo [sal]: afinidade pelo sal > ptn Dilise para retirar sais da soluo de ptn

CROMATOGRAFIA
Cromatografia de filtrao em gel
Discrimina melhor com base no tamanho Coluna (fase estacionria) constituda de gros porosos de polmero insolvel altamente hidratado (ex. dextran, agarose ou poliacrilamida) Molculas maiores fluem mais rapidamente (volume menor acessvel a elas) = ordem inversa eletroforese Pode-se separar quantidades maiores

CROMATOGRAFIA
Cromatografia de filtrao em gel

CROMATOGRAFIA
Cromatografia de afinidade

FRACIONAMENTO CELULAR

FRACIONAMENTO CELULAR
Ruptura da membrana plasmtica
Pistilo; Ultra-som;...

Homogeneizado em soluo de sacarose Separao por centrifugao fracionada ou diferencial (diferenas no coeficiente de sedimentao)
Sucessivas e com velocidades crescentes

FRACIONAMENTO CELULAR

FRACIONAMENTO CELULAR

CLIVAGEM SELETIVA
Clivagem de protenas em fragmentos menores (Fingerprinting) Enzimas proteolticas e reagentes qumicos clivagem entre resduos especficos de aminocidos
Tripsina: extremidade carboxila dos resduos de lisina ou arginina Brometo de cianognio: prximo aos resduos de metionina

ESPECTROMETRIA DE MASSA
Tcnica analtica que permite: Medir massa molecular de compostos Identificar compostos desconhecidos Quantificar compostos Revelar a estrutura de molculas Determinar modificaes ps traducionais em protenas (fosforilao, glicosilao e pontes de sulfeto)

ESPECTROMETRIA DE MASSA
Exemplo de aplicaes
Detectar e identificar substncias proibidas em atletas; Monitorar pacientes durante uma cirurgia; Determinar a composio de espcies encontradas no espao; Localizar depsitos de petrleo; Monitorar processos de fermentao; Deteco de dioxinas em peixes; Determinar danos em genes; Estabelecer composio elementar de material semi condutor

ESPECTROMETRIA DE MASSA
Uma pequena quantidade de amostra vaporizada e injetada no espectrmetro de massa; A amostra ento ionizada; Os ons formados podem ser positivos ou negativos; Fragmentos neutros no so detectados; Os ons so ento separados de acordo com sua razo m/z; onde m = massa; z = carga Os ons so ento detectados

ESPECTROMETRIA DE MASSA

ESPECTROMETRIA DE MASSA
Cromatografia Lquida LC/MS - termicamente instveis, compostos de alto PM LC/MS adequado para protenas e peptdeos Sondas de insero direta Amostras colocadas em uma sonda e inseridas Amostras podem misturadas a uma matriz Cromatografia Gasosa Amostras precisam ser volteis

ESPECTROMETRIA DE MASSA
MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desroption Ionization-Time-Of-Flight Spectometry)
Amostra misturada a matriz que absorva UV Matriz absorve energia do laser causando sua volatilizao junto com a volatilizao da amostra As molculas da matriz ionizada transferem prtons para a amostra

ESPECTROMETRIA DE MASSA

ESPECTROMETRIA DE MASSA

Enquanto isso...

danuzamattos@vm.uff.br prof.magoo@uol.com.br