Sunteți pe pagina 1din 26

DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC poate fi mprit n: A. REACII ANTICORP-ANTIGEN B. TESTE PENTRU EVALUAREA IMUNITII MEDIAT CELULAR A.

REACIILE ANTICORP-ANTIGEN Reaciile antigenelor cu anticorpii prezint o mare specificitate. Un antigen va reaciona doar cu anticorpul a crui sintez a fost indus de el sau de un alt antigen cu structur apropiat. Datorit gradului ridicat de specificitate, reaciile dintre antigene i anticorpi pot fi utilizate pentru identificarea unuia dintre componente. Exist dou situaii: 1. Identificarea unui antigen (Ag) necunoscut izolat din proba de cercetat, folosind seruri standard (Ab) (care sunt seruri obinute de la animale imunizate cu antigene purificate cunoscute). Ag + Ac Ag Ac 2. Evidenierea anticorpului specific (Ac) din serul unui pacient, utiliznd antigenele standard (diagnosticul serologic). Ag + Ab Ag - Ac

Antigene i anticorpi: definiii de baz Antigenele sunt substane care pot fi recunoscute i dependente de sistemul imun, n timp ce imunogenii sunt molecule care induc un rspuns imun. n majoritatea cazurilor, antigenele sunt imunogene, astfel nct se utilizeaz ambii termeni. ns, exist cteva excepii cu importan deosebit, cum sunt haptenele. O hapten este o molecul care nu e imunogen prin ea insi, dar poate reaciona cu anticorpul specific. Un epitop (determinantul antigenic) este structur molecular care interacioneaz practic cu o singur molecul de anticorp. Antigenele i imunogenii conin de obicei, mai muli epitopi, fiecare dintre ei fiind capabil s se lege de o molecul de anticorp diferit. Anticorpii sunt imunoglobuline care reacioneaz specific cu antigenul care a stimulat producerea lor. Ei reprezint 20% din proteinele plasmei sanguine. Anticorpii pot fi utilizai ca elemente sensibile i specifice pentru detectarea, identificarea i dozarea antigenelor. Anticorpii specifici pot fi obinui de la pacieni n perioada de convalescen a anumitor afeciuni (de exemplu, anticorpii antivirali) sau pot fi purificai de la animale imunizate cu antigenul care ne intereseaz. Un tip special de anticorpi, utilizai n scopuri diagnostice, sunt anticorpii monoclonali care recunoate un singur epitop, de aceea aceti anticorpi au o mare specificitate Anticorpii monoclonali n special pentru antigenele de suprafa ale limfocitelor, se prepar pentru a fi comercializate. Datorit faptului c anticorpii monoclonali au revoluionat att de profund metodele de detectare a antigenelor, producerea 1

acestor molecule va fi prezentat ulterior. Un alt tip de anticorpi, sunt anticorpii policlonali, care sunt preparate heterogene de anticorpi, capabili s recunoasc mai multe tipuri de epitopi ai unui antigen.

Reacii Ag Ac utilizate n diagnosticul imunologic I. In vitro: 1. Reacia de aglutinare (n care antigenul este particulat) 2. Reacia de precipitare (n care antigenul este solubil) 3. Reacia de fixare a complementului 4. Reacia de neutralizare 5. Imunofluorescena (IF), testul ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Radioimunotestarea (Radioimmunoassay RIA). II. In vivo: Intradermoreacii (teste cutanate) 1. Prick - testul cutanat 2. Patch - testul cutanat

I. In vitro 1. Reacia de aglutinare n aceast reacie, antigenul este particulat (de exemplu, bacterii sau eritrocite) sau este o particul inert (de latex) nvelit cu un antigen. Anticorpul, fiind bivalent sau multivalent, se leag de particulele antigenice multivalente i formeaz o reea, reacia de aglutinare devenind vizibil. Tehnica este sensibil i poate fi aplicat att pentru antigene dar i moleculele de anticorpi. 1.a Aglutinarea direct implic aglutinarea particulelor antigenice (cum sunt bacteriile sau fungi) cu participarea anticorpilor specifici. Determinarea antigenului Bacteriile sunt identificate n mod obinuit, preparnd din cultura pur o suspensie lichidian pe o lam de sticl sau n tuburi i urmrind dac acestea sunt aglutinate sub forma unor agregate vizibile, n urma adugrii de antiseruri specifice care au fost obinute ca rspuns la antigene bacteriene cunoscute. Determinarea anticorpului Suspensia de bacterii de aceast data cunoscute, poate fi utilizat invers, pentru determinarea i dozarea anticorpilor serici. Se efectueaz prin testarea pe o serie de diluii de ser a unei suspensie bacteriane standard i determinarea celei mai mari diluii de ser la care nc este prezent reacia de aglutinare (care reprezint titrul reaciei). Reacia de aglutinare are sensibilitate mai mare dect reacia de precipitare. 1b. Aglutinarea pasiv n ceea ce privete aglutinarea pasiv, pot fi detectate antigenele sau anticorpii, n 2

funcie de reactantul legat de carrier. Antigene cunoscute legate de carrier, pentru determinarea anticorpului n aceast situaie, antigenul este particulat avnd astfel particularitatea de a fi aglutinabil. Legarea de carrier este posibil prin fixarea antigenelor solubile la suprafaa unor particule care din punct de vedere immunologic sunt inerte. De exemplu, numeroase polizaharide ader uor, dar ferm la suprafaa eritrocitelor splate; numeroase antigene proteice ader n mod similar la hematii tratate cu diferii ageni, ori la particulele de polistiren, latex, bentonit, colodiu, crbune. Determinarea anticorpilor antivirus rubeolic prin reacia de aglutinare pe latex este realizat prin amestecarea antigenelor imunodominante de rubella virus fixate pe particulele de latex, cu probe de ser i urmrirea apariiei reaciei de aglutinare (fig. 38).

Fig. 38 - Detectarea anticorpilor de rubella prin aglutinare pe latex

Determinarea antigenului Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici sunt aglutinate n prezena unui antigen omolog (fig. 39). n practic acest test este folosit pentru determinarea: - Factorului reumatoid (FR) care este o protein care apare n mod patologic, avnd proprietile clasei IgM, care apare n serul pacienilor cu artrit reumatoid. Aceast protein mai poate apare i n cazul altor afeciuni: lupus eritematos, sindrom Sjgren, boli hepatice, tuberculoz, sifilis, infarct miocardic chiar i la persoane sntoase (mai ales la vrstnici); - Proteina C reactiv (PCR) n serul persoanelor sntoase este prezent n concentraii minime (foarte dificil de detectat prin tehnici obinuite). Proteina C reactiv este una dintre proteinele de faz acut a crei concentraie crete n decursul proceselor inflamatorii acute, n fazele de reactivare ale inflamaiilor cronice i n procesele necrotice (infarct miocardic, tumori maligne); - Determinarea direct a antigenului streptococului de grup A din tampoanele faringiene este realizat prin tratarea probei fie la pH sczut (cu acid azotic) fie cu diferite enzime; ulterior se pune n contact lichidul extras, cu particule de latex acoperite cu anticorpi anti-streptococ de grup A.

Fig. 39 Detectarea antigenului prin aglutinarea pe latex 3

...

1c. Reacia de coaglutinarea este utilizat, n special n detectarea antigenelor diferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae etc. Anumite tulpini de Staphylococcus aureus (tulpina Cowan, ATCC 12498) prezint un coninut ridicat de protein A de suprafa. Proteina A din peretele celular al stafilococului aureu se leag de fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulin, lsnd liber fragmentul Fab pentru legarea antigenului. Aglutinarea vizibil a stafilococilor reprezint un test pozitiv care indic legtura antigen-anticorp (fig. 40).

Fig. 40 - Coaglutinarea

Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici servesc ca baz pentru multe sisteme disponibile n comer, folosite pentru detectarea direct a antigenelor bacteriene. Una dintre aplicaiile importante este identificarea antigenelor capsulare solubile n cazul mai multor ageni etiologici ai meningitei acute sau cronice, i anume: Haemophylus influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, streptococii de grup B, E.coli i Cryptococcus neoformans. 1d. Hemaglutinarea Testul hemaglutinrii active identific anticorpii pentru antigenele eritrocitare. Anticorpul este diluat succesiv n ser fiziologic i apoi depus n godeurile plcii de hemaglutinare. Sunt utilizai ntotdeauna martori pozitivi i negativi. Se adaug n fiecare godeu o suspensie de eritrocite (care conine o protein ce prevene aglutinareai nespecific a hematiilor). n cazul n care exist suficieni anticorpi pentru a produce aglutinarea vizibil (prin cross-reacii/reacii ncruciate) celulele se vor depune la fundul godeului, sub forma unui covor neomogen. Daca anticorpii sunt insuficieni, celulele se vor rostogoli pe pereii oblici ai plcii, formnd un buton rou pe fundul godeului (fig. 41).

Fig. 41 Reacia de hemaglutinare

Unii anticorpi nu au capacitatea de a aglutina direct hematiile i pot fi detectai numai cu ajutorul testului de aglutinare indirect; aceast reacie are loc prin adugarea unui al doilea anticorp (cu proprieti hem-aglutinante) care se leag de anticorpul neaglutinant, atandu-l astfel (indirect) de eritrocit. Factorul reumatoid (FR) poate fi evideniat n serul pacienilor folosind reacia de hemaglutinare: hematiile sensibilizate de berbec, sunt aglutinate n prezena factorului reumatoid (reacia Waaler-Rose). Reacia de hemaglutinarea cu participarea virusuri: Unele virusuri, de exemplu virusul gripal, paragripal, urlian, adenovirusul i virusul febrei galbene pot produce aglutinarea eritrocitelor umane, precum i a eritrocitelor de coco, por de Guineea, oarece i alte animale. Aceast reacie este utilizat pentru detectarea i titrarea virusurilor hemaglutinante n materialele de cultur. Pe de alt parte, inhibarea reaciei de hemaglutinare poate fi folosit pentru decelarea anticorpilor n probele de ser. Aceasta este cunoscut ca testul inhibrii hemaglutinrii virale (HAI). Prin legarea covalent sau necovalent de diferitele antigene de pe suprafaa hematiei, utilitatea testului poate fi extins i la detectarea anticorpilor pentru alte antigene dect cele aflate pe hematii. 1e. Testul Coombs Testul Coombs mai este cunoscut ca testul antiglobulinic. n multe cazuri de anemie hemolitic (de exemplu n boala hemolitic a nou-nscutului /incompatibilitate de Rh i anemii hemolitice determinate de medicamente) anticorpii sunt legai pe suprafaa eritrocitului. Aceste imunoglobuline pot fi evideniate prin testul Coombs antiglobulinic direct, n care antiserul anti-imunoglobulin uman este folosit pentru aglutinarea hematiilor de la pacient (fig. 42).

Fig. 42 Testul Coombs direct 5

n unele cazuri, cantitatea de anticorpi legai este prea mic pentru a fi detectai prin testul Coombs direct i se recurge la testul antiglobulinic indirect pentru evidenierea anticorpilor n serul pacientului. n acest test, serul de la pacient este amestecat cu eritrocite normale i se adaug antiser anti-imunoglobulin uman. Dac anticorpii sunt prezeni n ser, se produce reacia de aglutinarea (fig. 43).

Fig. 43 Testul Coombs indirect

2. Reacia de precipitare

n aceast reacie, antigenul se afl n soluie. Tehnicile de precipitare sunt bazate pe: - capacitatea majoritii anticorpilor de a interaciona cu mai mult de un epitop al unei proteine sau agent infecios - faptul c fiecare molecul de anticorp interacioneaz cu mai mult de un antigen (de exemplu, imunoglobulina G are dou domenii pentru legarea antigenului). ntre anumite limite ale concentraiei antigenului i anticorpului (zona de echivalen) anticorpul leag ncruciat antigenul ntr-un complex prea mare pentru a sta n soluie (suspensie) i, de aceea precipit, iar supernatantul nu conine n exces nici anticorpi, nici antigene. n zona excesului de anticorpi, exist o cantitate prea mare de anticorpi pentru formarea eficient a unei reele de legturi, iar precipitarea este mai redus fa de intensitatea din zona de echivalen. n zona excesului de antigene, toi anticorpii sunt combinai, dar precipitarea este redus, deoarece complexe antigen-anticorp sunt prea mici pentru a precipita, ele rmn solubile (fig. 44).

Fig. 44 Reacia de precipitare

Reaciile de precipitare pot avea loc n soluie sau n mediu semisolid (agar). A. Precipitarea n soluie a) Reacia de precipitare inelar Antigenul i serul sunt puse n contact n tuburi capilare, astfel nct s nu se amestece, dar s se pstreze interfaa limpede. Rezultatul pozitiv este dat de apariia unui precipitat alb la nivelul interfeei, dup 15-20 minute (Figura 45).

Fig. 45 Reacia de precipitare inelar

Reacia poate fi utilizat n: - industria alimentar la diferenierea originii crnii; - medicina legal la identificarea originii petelor de snge; - diagnosticul microbiologic: pentru gruparea streptococilor; reacia Ascoli folosit n diagnosticul retrospectiv al antraxului; reacia Vincent-Bellot utilizat n diagnosticul infeciilor meningococice.

b) Precipitarea n tub capilar Acest test este efectuat pentru detectarea proteinei C reactive (PCR) (fig. 46). 7

Fig. 46 Reacia de precipitare n tub capilar

B. Precipitarea n gel de agar Poate fi simpl sau dubl difuzie. De asemenea, poate avea loc n prezena unui cmp electric. Difuzia simpl sau imunodifuzia radial (RID) este o metod cantitativ pentru antigene care pot precipita. n aceast tehnic, anticorpul este ncorporat ntr-un strat subire de agaroz, n timp ce antigenul proteic difuzeaz din godeul n care a fost inoculat. Acolo unde concentraia antigenului este optim pentru a produce reacia de precipitare, apar inele albe. Diametre mai mari ale acestora indic o concentraie crescut de antigen. Aceasta este o metod destul de sensibil, putnd detecta 1 10 g de protein i nu necesit antigen pur pentru determinarea concentraiei. Durata tehnicii este de 24 48 ore i indic doar prezena, nu i funcia proteinelor. Imunodifuzia radial este utilizat pentru msurarea IgA, IgM, IgG, componentelor complementului (C3), transferine i altor substane din ser (IgE nu pot fi msurate deoarece concentraia lor este prea sczut) (fig. 47).

Fig. 47 Imunodifuzia radial simpl 8

Dubla difuzie metoda Ouchterlony n aceast metod, antigenul i anticorpul sunt plasate n godeuri diferite efectuate n gelul de agar; cele dou componente pot difuza unul spre cellalt, cu scopul stabilirii gradientului de concentraie a fiecruia. Acolo unde se atinge concentraia optim, apar liniile de precipitare. Pe baza modelului liniilor de precipitare, acest test poate fi utilizat, de asemenea, pentru a determina daca probele sunt identice, dac particip sau nu toi epitopii (identitate parial) sau dac probele sunt diferite (fig. 48). Aceast tehnic se folosete pentru detectarea: proteinei C reactive, antigenului HBs, antigenului carcino-embrionar (care apare n unele tipuri de cancer), produilor de degradare ai fibrinogenului, antigenelor fungice (de exemplu: Histoplasma spp., Blastomyces spp., Coccidioides) etc.

Fig. 48 Imunodifuzia dubl

C. Precipitarea n gel de agar cu ajutorul cmpului electric

Electroforeza reprezint metoda de separare a proteinelor ntr-un cmp electric. Metoda este utilizat n laboratorul clinic pentru detectarea valorilor concentraiei de imunoglobuline i a altor proteine serice. Cteva dintre bolile care pot fi diagnosticate, utiliznd aceast tehnic sunt: mielomul multiplu, macroglobulinemia Waldenstrm i hipergamaglobulinemia. De asemenea, electroforeza poate fi folosit pentru detectarea modificrilor n compoziia lichidului cerebro-spinal al pacienilor cu scleroz multipl. 1. Imunoelectroforeza folosete att separarea electroforetic, ct i precipitarea proteinelor. Se poate utiliza att pentru proteinele specifice (identificare i dozare) din serul sanguin, ct i din urin sau alte lichide. Astfel, o prob de ser este plasat ntr-un godeu realizat n gelul de agar turnat pe o lam de sticl. Un curent electric trece prin agar i proteinele se deplaseaz n cmpul electric, conform sarcinii electrice i dimensiunii lor. Apoi, n gelul de agar se taie un an care se va umple cu anticorp. Deoarece antigenul i anticorpul difuzeaz unul spre cellalt, se vor forma o serie de arcuri de precipitare (fig. 49). 9

Fig. 49 Imunoelectroforeza

Aceste arcuri permit caracterizarea proteinelor serice n funcie de: prezen/absen sau traiectul lor neobinuit (de exemplu, human myeloma protein). Metoda este util pentru identificarea paraproteinelor cu lan greu i uor. Pot fi determinate de asemenea, scderea sau absena imunoglobulinelor n imunodeficiene, iar originea monoclonal a proteinei Bence-Jones din mielom poate fi confirmat. Imunelectroforeza este o metod valoroas n studiul bolilor autoimune i neurologice. 2. Radioimunoelectroforeza este utilizat n primul rnd ca tehnic de cercetare, care combin imunoelectroforeza cu folosirea antigenelor marcate. Metoda folosete culturi de esuturi. Cnd antigenele marcate reacioneaz cu antiserurile antiumane i antiserurle ce conin lanuri grele i uoare, se confirm originea unei proteine specifice (de exemplu protein de: organ, esut sau populaie celular crescut n cultur). 3. Contraimunoelectroforeza (CIE) sau electroimunodifuzia dubl combin caracteristicile imunodifuziei n gel i electroforezei. Probe din lichidele organismului n care se suspicioneaz prezena agenilor microbieni sunt plasate n godeuri separate realizate ntr-un mediu de difuzie tamponat (agaroz). Godeuri similare situate la 3 mm distan sunt umplute cu anticorpi cunoscui. Prin trecerea unui curent electric, antigenele polizaharidice care au tendina de a fi ncrcate negativ la pH neutru migreaz n direcia opus, spre catod. n 30 - 60 de minute antigenul i anticorpul se vor ntlni, se vor cupla n caz de specificitate structural formnd o linie de precipitare distinct. Principiul este acelai ca la imuno-dubla-difuzie, dar sensibilitatea metodei este mai mare (de 1020 de ori). CIE poate fi utilizat pentru identificarea att a antigenelor i a anticorpilor necunoscui, de exemplu Ag HBs, a-feto-proteina, polizaharidul pneumococic (n sngele unui pacient cu pneumonie sau n lichidul cefalorahidian al unuia cu meningit), criptococoz, meningit produs de Haemophylus influenzae, endocardit stafilococic (fig. 50).

10

Fig. 50 Contraimunoelectroforeza

4. Electroforeza n rachet sau electroimunodifuzia unidimensional implic electroforeza antigenelor dintr-un godeu printr-un mediu de gel cu anticorp fixat. pH-ul gelului este ales n aa fel nct anticorpul s fie imobil, iar antigenul s aib sarcina negativ. Liniile de precipitare care rezult au forma de eap sau rachet iar nlimea lor este proporional cu concentraia de antigen. Principala aplicaie a acestei tehnici este determinarea cantitativ a antigenelor n lichidele biologice (fig. 51).

Fig. 51 Electroforeza in racheta

3. Reacia de fixare a Complementului (RFC) Sistemul complement este compus din 20 sau mai multe proteine plasmatice care interacioneaz ntre ele i cu membrana celular. Fiecare component proteic trebuie s fie activat secvenial n condiii potrivite pentru declanarea reaciei. Complexele antigen-anticorp se numr printre activatori i reactia de fixare a complementului poate fi utilizat pentru identificarea unuia dintre ei, cnd cellalt este cunoscut. In situaia n care reacia de fixare a complementului urmrete detecia de anticorpi necunoscui, procedura este urmtoare: (1) Serul de testat (de la pacient) se titreaz n dubl diluie i se adaug o cantitate stadardizat de antigen n fiecare tub sau godeu. Dac anticorpul specific este prezent n serul de testat se vor forma complexele imune. (2) Apoi, la acest amestec se adaug complementul (de obicei, obinut de la porcul de Guineea). Dac sunt prezente complexele imune, ele vor lega complementul si l vor consuma. (3) n etapa final, este adugat sistemul indicator reprezentat de eritrocite sensibilizate [eritrocite de oaie sensibilizate cu anticorpi (n cantitate subaglutinant) extrai din ser de iepure] (fig. 52).

11

Fig. 52 Reactia de fixare a complementului

Interpretarea rezultatului: - dac anticorpul se potrivete antigenului n prima faz a reaciei, complementul a fost fixat nemaifiind disponibil s se lege de hematiile sensibilizate; astfel, eritrocitele rmn nehemolizate testul fiind interpretat ca pozitiv (hematiile rmn n dop la baza tubului de reacie); - dac anticorpul nu se potrivete cu antigenul (nu exist specificitate), complementul este liber i se leag la eritrocitele sensibilizate care vor fi lizate, iar testul va fi negativ (aspectul n tubul de reacie va fi de hemoliz/rou difuz). Folosind cantiti standardizate de anticorp cunoscut i eantion de antigen, metoda poate fi utilizat pentru testarea antigenelor. Complementul trebuie standardizat cu grij, iar serul de testat trebuie prelucrat n vederea inactivrii oricrei activiti a complementului seric. Efectuarea controalelor recomandate (martorii probei de reacie) este foarte important n aceast tehnic deoarece anumite preparate de anticorpi folosesc complement fr adugarea antigenului, de exemplu, dac este vorba de ser care conine deja complexe imune. De asemenea, unele antigene pot avea activitate anticomplement. De aceea, controlul trebuie s includ anticorp singur, respectiv antigen singur, pentru a verifica dac nu cumva unul dintre acetia nu fixeaz complementul fr intervenia celuilalt. Exprimarea rezultatelor: - concentraia anticorpilor este exprimat ca cea mai ridicat diluie a serului care indic fixarea complementului (diluie la care nu apare hemoliza) - concentraia de antigen este exprimat ca fiind titrul de antigen care limiteaz aciunea hemolitic a complementului. Reacia de fixarea a complementului este foarte mult utilizat n cercetare i n laboratoarele clinice n scopul diagnosticrii infeciei cu M. pneumoniae, micozelor, pentru identificarea paraziilor, virusurilor, a infeciei cu Treponema pallidum (testul Wassermann).

4. Reacia de neutralizare Aceast reacie se bazeaz pe capacitatea anticorpului de a bloca efectul antigenelor toxice, litice sau infectante prin combinaii specifice dintre antigen i anticorp in vivo sau in vitro. Neutralizarea virusurilor 12

Neutralizarea activitii virale este cea mai sensibil i specific metod pentru determinarea identitii unui izolat i pentru determinarea anticorpilor specifici n serul pacientului. Dac anticorpul neutralizant este prezent, virusul nu poate ataca celulele, iar infectivitatea este blocat. O fraciune a virusului infectant poate rmne chiar i n prezena antiserului specific, astfel nct infecia poate fi mai degrab amnat, dect blocat complet. Pentru identificarea izolatelor virale, se folosesc antiserurile specifice cu reactivitate cunoscut. Pentru testarea serologic, suspensia din virusurile de referin este testat mpotriva serurilor de testat. Aceast reacie se poate folosi pentru evidenierea: - efectului citopatic (cel mai frecvent); - hemadsorbiei i hemaglutinrii pentru evidenierea orthomyxovirusurilor i paramyxovirusurilor; - inhibiiei metabolice (colorimetric): acidifierea mediului cu rou-fenol prin dezvoltarea celulelor, dac replicarea virusurilor a fost neutralizat; - reducerii plcii: celulele infectate de numeroase virusuri pot fi detectate aezarea monostratificat cu soluie de agar nutritiv, care conine un colorant vital, cum ar fi rou neutru; celulele infectate apar ca plci necolorate fa de fundalul rou format de celulele viabile; reducerea numrului de plci indic reacia de neutralizare. Neutralizarea toxin-antitoxin Cnd o toxin este pus n contact cu antitoxina corespunztoare, efectul toxic al toxinei este neutralizat. Se poate utiliza: 1) In vivo: testul Schick este folosit pentru determinarea susceptibilitii unui individ la difterie. Prin injectarea intradermic a unei cantiti mici de exotoxin difteric, toxina este neutralizat de antitoxinele din ser dac individul respectiv este imun i nu se produce nici o reacie. Situaia invers este apariia unei zone erimatoase necrotice n cazul n care individul nu prezint antitoxine (individul este susceptibil la acest infecie). 2) In vitro: testul ASLO (Antistreptolizin O) este o reacie de neutralizare folosit pentru a msura titrul de antistreptolizin O= anticorp indui de streptolizina O un antigen virulent (hemolizina) al bacteriei Streptococcus pyogenes. Acest test este valoros mai ales pentru confirmarea sau infirmarea diagnosticului de febr reumatic sau glomerulonefrit acut, situaii n care poate fi determinat, atunci cnd streptococul (Streptococcus pyogenes de grup A) nu mai este prezent. Principiul n acest test, diluia succesiv dublu seriale a unei probe de ser de la pacient este pus n contact cu o cantitate de streptolizin O standard (Ag) i, apoi, dup o scurt incubare necesar pentru combinarea specific, se adaug o suspensie de eritrocite, ca sistem indicator. n tuburile (godeurile) n care diluiile de ser conin suficient streptolizin O (anticorp) efectul litic al antigenelor este inhibat, ceea ce nseamn lipsa hemolizei, 13

n timp ce n tuburile (godeurile) n care anticorpii nu sunt suficieni pentru a neutraliza antigenele, efectul litic al acestora va fi sugerat de prezena hemolizei. Titrul reaciei este dat de diluia din ultimul tub (godeu) n care nu se observ hemoliza; valori normale: 166 250 U/ml. Titruri crescute exist n boli streptococice i post-streptococice: angina, scarlatina, febra reumatic, glomerulonefrita acut.

5. Teste care utilizeaz antigene sau anticorpi marcai Imunofluorescen (IF) Principiul Proteinele, inclusiv anticorpii serici, pot fi marcai folosind colorani fluoresceni (de exemplu, fluoresceina si auramina) prin combinaii chimice, fr a altera ori a interfera cu proprietile biologice sau imunologice ale proteinelor. Apoi, aceste proteine pot fi observate n preparatele microscopice folosind microscopul cu fluorescen (n lumina ultraviolet). Astfel de anticorpi marcai pot fi utilizai pentru identificarea antigenelor pe suprafaa bacteriilor (streptococi, neisserii, treponeme) n celule sau seciuni histologice ori n alte probe. Imunofluorescena este folosit frecvent pentru detectarea anticorpilor si a autoanticorpilor pentru antigenele tisulare i celulare (de exemplu, anticorpi antinucleari, anticorpi antimuchi netezi, anticorpi anticelule parietale). Autoanticorpii apar n bolile autoimune. Imunofluorescena poate detecta anticorpi in situ. Dintr-o mas congelat de esut, cu ajutorul criostatului, se realizeaz o seciune; aceasta confer sigurana c antigenele labile nu sunt distruse de substane fixatoare. Imunofluorescena (IF), (fig. 53) poate fi:

Fig. 53 Imunofluorescena direct i indirect

IMUNOFLUORESCEN DIRECTA, cnd anticorpul marcat cunoscut interacioneaz 14

direct cu un antigen necunoscut i se folosete, n mod obinuit, pentru detectarea antigenului. Anticorpul specific este conjugat cu un compus fluorescent (de obicei, izotiocianat de fluorescein), rezultnd un sistem trasor vizibil cu reactivitate imunologic nealterat. Serul conjugat este adugat la celule sau esuturi pe o lam i se fixeaz pe antigen, formnd un complex imun stabil. Substanele care nu au participat la reacie sunt ndeprtate prin splare, apoi preparatul este colorat i examinat la microscopul cu fluorescen. Antigenul specific legat la anticorpul fluorescent poate fi observat ca un element strlucitor de culoare verde deschis sau galben-portocaliu pe fond ntunecat, n funcie de fluorocrom i de filtrele utilizate. Aspectul fluorescenei este caracteristic pentru fiecare antigen tisular. IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA. n acest test se folosete un proces cu dou etape. Un antigen cunoscut se fixeaz pe lam, se adaug ser necunoscut, apoi preparatul este splat; dac anticorpul seric necunoscut corespunde antigenului, va rmne fixat pe acesta pe lam i va putea fi detectat prin adugarea unui anticorp antiglobulin marcat fluorescent i examinarea cu ajutorul microscopului cu fluorescen. Imunofluorescena indirect este de multe ori mai sensibil dect cea direct, deoarece pe locul antigenului ader mai muli anticorpi marcai. n plus, antiglobulina marcat devine un reactiv universal independent de antigenul utilizat, va intra n reacie cu toate imunoglobulinele G ale acelei specii.

Teste cu marcaj enzimatic (ELISA) Exist multe variante ale acestei metode n funcie de legarea unei enzime de antigen sau anticorp. Enzima este detectat prin testarea activitii enzimatice cu substratul su. Pentru msurarea anticorpului, se folosete metoda indirect: antigene cunoscute se fixeaz pe un suport solid (de exemplu, microplci din material plastic) se incubeaz cu diluii din serul de testat, se spal, apoi se reincubeaz cu o antiimunoglobulin marcat cu o enzim (de exemplu, fosfataza alcalin, peroxidaza). Activitatea enzimatic este msurat prin adugarea unui substrat enzimatic, care -n general- determin formarea unui produs colorat, care poate fi detectat vizual sau cu ajutorul spectrofotometrului. O reacie pozitiv indic faptul c anticorpul a fost prezent n proba, iar intensitatea reaciei este proporional cu concentraia de anticorpi din produs (fig. 54).

Fig. 54. Testul ELISA metoda indirect 1. Antigen adsorbit pe faza solida; 2. Anticorp de testat, in ser; 3,5. Spalare; 4. Antiglobulina marcata enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii . 15

Pentru a msura un antigen se folosete metoda cu doi anticorpi, specifici unul fa de altul. Un anticorp cunoscut este fixat pe un suport solid. Se adaug proba de testat care conine antigenul, iar excesul se spal. Se adaug un anticorp specific marcat enzimatic. Dup o nou splare, se adaug un substrat i activitatea enzimatic este msurat colorimetric i raportat la concentraia antigenului (fig. 55).

Fig. 55 Tehnica identificrii unui antigen test ELISA 1. Anticorp adsorbit pe faza solida; 2. Antigen de testat; 3,5. Spalare; 4. Anticorp specific marcat enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii

Tehnica Western blot este o variant a metodei ELISA. n aceast tehnic, proteinele virale separate prin electroforez n funcie de greutatea lor molecular sau sarcina electric sunt transferate (blotted) pe o hrtie de filtru (de exemplu, nitroceluloz, nylon). Cnd hrtia este expus serului unui pacient, proteinele imobilizate captureaz anticorpul viral specific i este vizualizat cu ajutorul unui anticorp antiuman legat enzimatic. Tehnica Western blot este utilizat pentru a confirma rezultatele obinute prin ELISA la pacienii suspectai c ar fi infectai cu HIV, hepatite virale. Radioimundozarea (Radio Immune Assay) Principiul de baz al radioimunotestrii este similar celui prezentat la testul ELISA. Diferena esenial este aceea c markerul utilizat la ELISA este o enzim, iar cel folosit n RIA este un izotop radioactiv (I125, P32). Etapa final a acestei metode o reprezint detectarea activitii radioactive cu ajutorul unui contor de scintilaie, care sesizeaz att emisiile , ct i pe cele . Dei are un grad ridicat de sensibilitate i specificitate, aceast metod prezint dezavantajul c este costisitoare, reactivii expir repede (short-life), iar n ceea ce privete izotopul este necesar ndeplinirea unor condiii deosebite. Cele mai multe variante RIA folosesc un sistem de testare competitiv. n testul cantitativ pentru anticorpi, suportul solid este nti standardizat prin legarea unui antigen nemarcat i o concentraie standard pentru anticorp care este marcat cu o substan radioactiv. Proba (necunoscut) care conine anticorpul ce trebuie testat (i care este nemarcat) se adaug la mediul de reacie. Concentraia anticorpului n proba 16

necunoscut este determinat prin citirea comparativ a valorilor pe o curb standard. Curba e funcie de gradul de inhibiie a legrii anticorpului marcat combinat cu valorile diluiilor n serie ale cantitilor cunocute de anticorp nemarcat. Metoda de lucru este similar cnd antigenele sunt cele care se detecteaz, cu excepia situaiei n care antigenul marcat este folosit pentru dozarea antigenului liber n prob. RIA se folosete pe scar larg n chimia clinic, endocrinologia clinic i toxicologie, dar nu reprezint un test de rutin n microbiologia clinic. n practica curent, metodele RIA includ teste pentru hormoni steroizi (cum ar fi aldosteronul, cortizonul, progesteronul) hormoni peptidici (corticotropina, hormonul corticostimulant, vasopresina). n unele laboratoare se mai utilizeaz metoda RIA pentru testarea markerilor pentru hepatita B (Ag HBs, Ac HBs, Ac HBc, Ag Hbe, Ac HBe) dar a fost, n genral, nlocuit de tehnica ELISA. Testul RAST (radioallergosorbent test) este o variant specializat a RIA, utilizat pentru a msura cantitatea de anticorpi IgE serici care reacioneaz cu un alergen cunoscut (antigen).

II. in vivo Intradermoreacia (test cutanat)

1. Prick test-ul este un test uor de efectuat i foarte eficient n diagnosticul diferitelor alergii. Alergenii introdui la nivel tegumentar (de obicei la nivelul antebraului) n cteva minute induce eliberarea de mediatori preformai ce cauzeaz secundar vasodilataie local, edem local i prurit. Acest tip de reacie caracterizeaz hipersensibilitatea de tip I. Testul este pozitiv la pacienii cu o varietate mare de tulburri atopice i de obicei se coreleaz cu testul RAST (Radioallergosorbent test) pozitiv pentru IgE seric specific i testul de provocare cu alergeni specifici, pozitiv la nivelul mucoasei nazale sau bronice. Faptul c aceti pacieni cu tulburri atopice dezvolt o reacie imediat la locul de inoculare (prick test) demostreaz c molecule de IgE sunt fixate pe suprafaa celulelor mastocitare, chiar dac simptomatologia este nazal sau bronhial. 2. Patch test-ul implic aplicarea alergenului pe suprafaa normal tegumentar tears n prealabil. De exemplu pacienii cu eczem atopic ce posed Ac specifici (IgE) fa de acarienii din praful de cas, vor dezvolta un patch test pozitiv. Este interesant c o parte din pacienii cu rinit alergic cauzat de praful de cas (ce conine acarieni) dezvolt o reacie patch pozitiv la acest allergen, manifestat printr-un infiltrat bazofilic local, sugernd faptul c infiltrarea nu este specific eczemei atopice. 17

Keratina de suprafa a unei zone neafectate este ndeprtat printr-o tergere uoar i extractul este plasat pe tegument, ntr-o manier ocluziv, pentru 48 de ore, dup care urmeaz examinarea local. Leziunile ce apar sunt macroscopice eczematoase, iar microscopic conin infiltrate de eozinofile i bazofile.

Metode de izolare a anticorpilor Cercettorii imunologi au deseori nevoie de izolate pure de anticorpi, care pot fi imunoglobuline nespecifice sau antigen nespecifice. Izolarea imunoglobulinelor nespecifice din ser, se poate obine prin fracionare secvenial a proteinelor serice, etape ce includ : - precipitarea gama-globulinelor n soluie de 30-50% sulfat de amoniu - filtrarea gelului, pentru obinerea de molecule de dimensiuni corecte - cromatografie de schimb ionic pentru a izola moleculele care sunt ncrcate pozitiv, la un pH neutru. - Cromatografia de afinitate pentru liganzii naturali ai imunoglobulinelor, cum sunt proteina A (proteina A fiind un component al peretelui celular al Stafilococului, ce are capacitatea de a lega regiunile C2 i C3 a majoritii subclaselor de IgG, de exemplu: IgG1, IgG2 i IgG4). Izolarea anticorpilor antigen-specifici se poate realiza prin cromatografia de afinitate, utilizndu-se antigenul cuplat cu Sepharoz ; anticorpul pur este izolat prin metoda imunoabsorbant. Producerea de anticorpi monoclonali Intenia tehnicilor serologice imunologice sunt de a reduce heterogenicitatea antiserurilor utilizate n terapie. Moleculele de antigen ce posed un singur epitop sunt rar ntlnite de-a lungul vieii unui individ. Cele mai multe antigene, conin sute chiar mii de determinani antigenici ce exis pe suprafaa celular sau n interiorul unor mixturi de substane. Cnd aceti antigeni mixai sunt injectai unui animal, un numr egal de clone limfocitare sunt stimulate. Chiar dac fiecare clon produce un anticorp specific, rezultatul final este o mixtur heterogen de molecule de anticorpi, a crei specificitate i afinitate este deseori necunoscut i dificil de a fi controlat. Cnd aceste seruri policlonale sunt utilizate n sistemele de testare bacteriene, pot apare cross-reacii, fie din cauza determinanilor antigenici care se regsesc la diferite specii sau din cauza mutaiilor care pot induce apariia unor epitopi suficient de apropiai ca specificitate pentru a produce reacii detectabile. Intenia de a produce antigene pure prin tehnici de absorbie au avut parte de un succes parial. Cum tiina testrii serologice a evoluat, impresia a fost c disponibilitatea unui anticorp ce posed un grad nalt de heterogenicitate molecular cu o specificitate ngust pentru un singur epitop antigenic, fr dezvoltarea unor cross-reacii, ar putea rezolva multe din problemele cu care se confrunt utilizarea anticorpilor monoclonali. Specificitatea nalt a anticorpilor monoclonali, ca i produs al unei singure clone de 18

celule limfoide, s-a putut obine prin investigaii n fuziunea celular i tehnologia hibridoamelor, cercetri efectuate pe oarecei, de Kohler i Milstein. Prin descoperirile acestor 2 oameni de tiin, este acum posibil s se izoleze linii de clone a unui singur limfocit care este capabil s produc un singur tip de molecul de anticorpi. Cea mai mare realizare a fost nu numai izolarea unei singure linii celulare capabile s sintetizeze un singur tip de molecul de anticorp ci i fuzionarea acestor limfocite de oarece cu celule din mielomul de oarece, cu intenia reuit de a produce celule hibride (fig. 56) cu 2 caractere motenite importante: - capacitatea de a produce anticorpi monospecifici (achiziionai de la limfocitele parentale) i - abilitatea de a crete continuu n cultur, caracter de imortalitate motenit de la linia de celule mielomatoase. Animalele (de obicei oareci sau obolani) sunt imunizai cu un antigen. Odat ce animalele dezvolt un rspuns imun eficient, sunt splenectomizate i se prepar o suspensie celular (se utilizeaz de asemenea ganglionii limfatici). Aceste celule sunt fuzionate cu linii celulare din mieloame, prin adiia de PEG (Poliethylene glycol) are are rolul de a promova fuziunea membranelor celulare. Numai o mic parte a acestor celule vor fuziona (frecvena este de 1/105 sau 1/106). Mixtura fuzionat este transferat ntr-o cultur ce conine HAT care este o mixtur de hipoxantin, aminopterin i timidin.. n aceste condiii celulele splenice pot crete n mediul cu HAT, n timp ce celulele mielomatoase mor n aceste condiii, din cauza defectului metabolic ce nu le permite utilizarea acestor metabolii. Mediul cu HAT n acest moment conine: celule splenice, celule mielomatoase i celule fuzionate. Celulele splenice mor n acest mediu, n mod natural dup 1-2 sptmni iar celulele mielomatoase sunt distruse de prezena HAT. Celulele fuzionate supravieuiesc oricum, din cauza imortalitii bodndite de la celulele mielomatoase. Unele dintre aceste celule care supravieuiesc au capacitatea de a produce anticorpi la fel ca i celulele splenice. Prin tehnici imune, godeurile n care sunt culturile celulare, sunt testate n scopul identificrii anticorpilor dorii. i dac se reuete identificarea, urmeaz clonarea celulei din godeul n care s-a identificat anticorpul dorit. Clona care rezult dintr-un singur progenitor, posed caracter de imortalitate i are capacitatea de a produce anticorpi monoclonali.

19

Fig. 56. Producerea de anticorpi monoclonali

B. Testele pentru evaluarea imunitii mediate celular Evaluarea competenei imune

Diferite teste s-au dezvoltat pentru evaluarea funciei sistemului imun celular. Aceste teste include teste cutanate destinate identificrii Hipersensibilitii ntrziate tip IV, evaluri ale funciei limfocitelor T i B, determinri ale funciilor limfocitelor i neutrofilelor. Multe din aceste proceduri sunt supuse variabilitii biologice astfel standardizarea lor fiind dificil. Oricum evalurile furnizeaz date importante despre funcia celular n infeciile cu patogeni intracelulari, n imunologia tumorilor i rejetului de transplant. Evaluarea competenei celulelor T i B, ca i funcia celulelor fagocitare au o importan primordial n determinarea statusului imun al unui individ cu infecii cronice, sindroame de imunodeficien sau pacieni cu terapii imunosupresive (n patologia malign). 1. Teste cutanate DTH (delayed T hypersensitivy) Imunocompetena i expunerea la anumii ageni infecioi pot fi msurate prin testul cutanat. Aceste proceduri sunt simplu de efectuat i dac sunt interpretate corect, pot fi utilizate n practica medical. Exist 2 tehnici de testare cutanat: fie injectarea intradermic a antigenului, fie testul prin contact direct. Aceste teste pot fi interpretate la 24-72 de ore de la efectuare. a. injectarea intradermic a antigenului s-a utilizat n special pentru evaluarea statusului imunocompetent i a contactului cu agentul etiologic n diferite infecii, cum sunt: tuberculoza, lepra, bruceloza, varicela, limfogranulomatoza venerian, psitacoza, bola hidatic, leishmanioza, afeciuni fungice. b. teste de contact sunt efectuate prin plasarea antigenului pe suprafaa tegumentar i acoperirea zonei cu un plasture; testul este util n determniarea hipersensibilitii la diferite produse: cosmetice sau spunuri. Interpretarea corect a rezultatelor este punctul critic al testelor cutanate. Indurarea n jurul locului de injectare, este rezultatul infiltratului mononuclear i al edemului. Aceast reacie apare la 24-48 de ore dup ce se efectueaz testul. 20

Diametrul zonei de indurare este un indicator al intensitii rspunsului imun celular mpotriva antigenului testat. Eritemul (bine delimitat) de la locul inoculrii este un indicator al hipersensibilitii imediate. Deobicei dispare la 12-18 ore dar poate persista perioade mai lungi de timp. Reacia eritematoas nu ar trebui luat n considerare n interpretarea testului cutanat. n cazul copiilor testele au o valoare mai mic i nu sunt recomandate, mai ales n cursul primului an de via. Copiii probabil nu au fost ndeajuns de expui la antigene ct s-i dezvolte un rspuns adecvat, astfel putnd fi sensibilizai n momentul injectrii antigenului. Pacienii imunosupresai cum sunt indivizii crora li s-a efectuat un transplant, deobicei sunt anergici i lipsete rspunsul la acest test. Reaciile adverse la testele cutanate pot apare la indivizi hipersensibilizai i imunizai. Reacii locale severe reprezentate de eritem, induraie i necroz se pot de asemenea dezvolta. Simptomele sistemice cum sunt: febra i reacia anafilactic sunt rare.

2. Evaluarea limfocitelor Identificarea i evaluarea funciei celulelor T i B la nivelul sngelui periferic este foarte important n diagnosticarea bolilor nsoite de imunodeficiene, boli autoimune i n reacii imune n patologia tumoral. Metodele disponibile pentru separarea limfocitelor i a subpopulaiilor specifice includ: separarea pe gradient de densitate, sortarea celulelor activate prin utilizarea fluorescenei, panning-ul, rozetarea, separarea magnetic. Separarea n gradient de densitate se bazeaz pe faptul c limfocitele sunt mai puin dense dect eritrocitele i granulocitele (fig. 57) i este utilizat pentru a izola majoritatea limfocitelor sanguine.

Fig. 57. Separarea pe baza gradientului de densitate a limfocitelor

Sngele total este defibrinat prin agitare ntr-un recipient cu bile de sticl iar cheagul care rezult este ndeprtat. Apoi sngele este diluat ntr-un mediu de cultur tisular i stratificat ntr-o eprubet plin pe jumtate cu soluie Ficoll. Ficoll are o densitate mai mare dect cea a limfocitelor dar mai mic dect a eritrocitelor i granulocitelor. Dup centrifugare eritrocitele i polimorfonuclearele neutrofile vor trece n parte inferioar a poriunii cu Ficoll formnd un depozit la fundul eprubetei, n timp ce limfocitele se aeaz la interfaa mediului cu Ficoll. Prepararea limfocitelor poate continua prin ndeprtarea macrofagelor i PMN 21

reziduale prin adiie de fier, care va fi ingerat de fagocite, care vor ptea fi ndeprtate prin aciunea unui magnet. Macrofagele pot fi ndeprtate prin lsarea suspensiei celulare s se aeze pe un platou de plastic. Macrofagele vor adera de plastic, n timp ce limfocitele vor putea fi ndeprtate prin splare. Sortarea celulelor activate prin fluorescen Disponibilitatea anticorpilor monoclonali fa de o multitudine de antigene i dezvoltarea flow-citometriei a dus la apariia unei metode foarte eficiente de studiu a clasificrii celulare. n aceast tehnic, recunoscut ca i sortarea celulelor activate prin fluorescen, anticorpii marcai cu substane fluorescente sunt incubai mai nti cu o populaie celular. Celulele conin antigene specifice pe suprafaa lor i se vor lega de anticorpii marcai; celulele sunt diluate excesiv nainte de a fi inoculate ntr-o singur pictur celular; citometrul scaneaz fiecare pictur cu o excitaie intens tip laser. Fluxul celular ce traverseaz laser-ul are o rat de peste 5000 celule per minut iar analiza se efectueaz electronic. Dac celula este marcat, va fi fluorescent i poate fi separat sau sortat prin deflecie electrostatic. Lumina ce rezult n cursul scanrii d informaii despre mrimea celulelor i densitatea antigenelor de suprafa. Citometrele cu fascicol dual, ofer informaii n plus prin scanarea a 2 antigene diferite sitate pe aceeai celul. Instrumentele utilizate sunt foarte sofisticate i necesit o mentenan foarte atent pentru obinerea de rezultate optime (fig. 58). Citometrul ofer informaii asupra lungimii vieii celulelor, n timp ce tehnicile microscopice necesit distrugerea i fixarea celulelor pe lame speciale care pot altera antigenele de suprafa. Oricum, antigene intracelulare trebuie s fie analizate cu metode microscopice. Se fac eforturi continue pentru a se mbunti calitatea anticorpilor monoclonali pentru a furniza informaii corecte despre histologia, structura celular i localizarea antigenelor. Flow citometria poate efectua o analiz difereniat a celulelor albe sanguine furniznd informaii despre numrul celulelor B (cu CD19, CD 20 i HLA-DR pe suprafaa lor) celulelor T (CD3), celulelor Th (CD4) i limfocitelor Tc i Ts (CD8). Aceast tehnic este de asemenea util pentru analiza unor antigene prezente pe celulele maligne n anumite patologii hemoproliferative (fenotiparea celulelor tumorale pentru diagnostic i clasificarea leucemiilor i limfoamelor, evaluarea i prognosticul unei boli maligne, determinarea aneuploidiei ADN-ului).

22

Fig. 58. Sortarea celulelor activate prin fluorescenta

Aceast metod mai ofer informaii despre numrul celulelor T, al raportului CD4/CD8 care este foarte important n sindroamele imunodeficienelor, dar mai ales n SIDA.

Rozetarea Se bazeaz pe faptul c unele populaii limfocitare au receptori pentru eritrocite. Celulele T umane au receptori pentru eritrocitele de oaie (E) reprezentate de moleculele CD2. Cnd sunt amestecate celulele T cu aceste eritrocite, se formeaz rozete astfel se pot separa de limfocitele ce nu formeaz rozete, reprezentate de limfocitele B (fig. 59) pe gradient Ficoll.

Fig. 59.Izolarea subpopulaiilor limfocitare prin rozetare

O modificare adus acestei tehnici permite s se izoleze celulele cu ali receptori, de exemplu unele celule T (celulele T) au receptori pentru fragmentul Fc al IgG (Fc). Aceste celule pot fi identificate i izolate prin rozetare cu eritrocite de bou, sensibilizate cu anticorpi anti eritrocite de bou.

Panning

Populaiile celulare pot fi separate pe platforme sensibilizate cu anticorpi. Anticorpii se leag non-covalent la suprafaa de plastic (ca n cazul unei tehnici imune pe faz solid) i mixtura celular pe aplic pe platform. Celulele antigen (+) se leag de anticorpi iar celulele antigen (-) pot fi ndeprtate prin splare. Prin schimbarea condiiilor de cultur sau prin digestie enzimatic celular pe 23

suprafaa platformei uneori este posibil s se recupereze celulele ce s-au fixat pe suprafa. Astfel, metoda este mult mai eficient pentru ndeprtarea unei subpopulaii celulare, mai degrab dect izolarea ei. De exemplu se poate utiliza pentru separarea CD4 de CD8 i separarea Th de Ts prin utilizarea de anticorpi anti Ig care se leag la suprafaa anticorpului de pe celula B. Prin sensibilizarea platformei cu molecule de antigen, celulele ce se vor lega de acesta pot fi separate dintre celulele care nu s-au legat de antigen (fig. 60).

Fig. 60.Iizolarea subpopulaiilor limfocitare prin metoda panning

Separarea magnetic Aceast metod utilizeaz bile magnetice mbrcate n anticorpi specifici (de exemplu anticorpi anti CD4); bilele sunt amestecate cu populaia celular i se leag de acelea care recunosc anticorpul. Aceste celule pot fi apoi ndeprtate sau izolate prin aplicarea unui cmp magnetic. O alt metod util pentru ndeprtarea populaiilor celulare care nu reprezint interes, se bazeaz pe anticorpi i pe sistemul Complement. Cnd un anticorp specific (de exemplu CD8) este adugat la o mixtur celular, urmat de adugare de Complement, acea subpopulaie celular va fi lizat; n mod natural aceast metod se aplic doar anticorpilor care fixeaz Complementul i unde populaia celular int are suficiente antigene pentru a fixa Complementul n doz litic.

Evaluarea competenei celulelor T Enumararea celulelor T 1. enumerarea numrului total al celulelor T poate fi efectuat prin utilizarea anticorpilor monoclonali la CD3 conjugat cu substane cu fluorescen. Celulele sunt numrate prin microscopie cu fluorescen sau prin flow citometrie; subsetul celulelor T poate fi numrat prin utilizarea anticorpilor monoclonali faa de CD4 sau CD8. 2. metoda rozetelor E poate fi utilizat pentru numrarea celulelor T: celulele T au receptori pentru eritrocitele de oaie; dac limfocitele din sngele periferic sunt amestecate cu o suspensie de eritrocite de oaie, celulele T se vor lega de 24

eritrocitele de oaie i vor forma rozete ce pot fi numrate la microscopia optic.

Evaluarea funciei celulelor T Transformarea limfoblastic n mod normal, celulele T funcionale se transform n celule blastice mari, cu o intensificare a sintezei ADN-ului, cnd sunt expuse la fitohemaglutinin (o substan mitogenic) sau concavalina A (un extract de plante care stimuleaz n mod specific celulele T). Gradul mitozei este msurat prin gradul de ncorporare a timidinei triturate la mediul de reacie, apoi se msoar prin scintilaie spectrometric.

Evaluarea competenei limfocitelor B Enumerarea limfocitelor B 1. prin tehnici imunofluorecente prin utilizarea anticorpilor policlonali marcai cu fluorescein sau prin flow citometrie 2. antiseruri monoclonale mpotriva lanurilor grele sau uoare, se pot utiliza pentru evaluarea subclaselor limfocitelor B 3. rozete EA sau EAC: celulele B au receptori pentru C3 i Fc a moleculei de anticorpi astfel pot forma rozete cu eritrocitele de oaie mbricate cu anticorpii lor (EA); de asemenea pot forma rozete cu eritrocitele de oaie mbrcate cu anticorpi i Complement (EAC) i pot fi numrate la microscop. Testele pentru evaluarea funciilor celulelor B 2. transformarea limfocitar; n mod normal celulele B funcionale pot fi stimulate s se transforme n celule blastice mari cu sintez crescut de ADN, cnd sunt expuse la LPS (lipopolizaharid). Acesta poate fi msurat prin gradul de ncorporare a timidinei triturate adugate la mediul de reacie 3. determinarea nivelului imunoglobulinelor prin electroforeza poteinelor; o scdere sau o cretere a gamma-globulinelor poate atrage atenia asupra unei sinteze anormale de anticorpi 4. cuantificarea diferitelor tipuri de imunoglobuline, prin diferite metode: RIA, ELISA, IF etc 5. imunizarea activ poate fi utilizat in vivo, pentru a testa capacitatea de a produce anticorpi. De exemplu, persoana este imunizat cu trivaccinul DiTePer (anti diftero-tetano-pertusis) apoi este testat prin testul Schick pentru a se evalua dezoltarea imunitii antidifterice.

Evaluarea funciei fagocitare 1. evaluarea chemotaxiei este efectuat prin testarea capacittii celulelor fagocitare de a migra prin membrane spre substana chemotactic 2. evaluarea digestiei sau fagocitozei este efectuat prin vizualizare direct a numrului de particule ingerate utiliznd microscopul 3. evaluarea ingestiei i/sau distrugerea intracelular prin utilizarea testului de reducere cu NBT (nitro blue tetrazolium). n mod normal celulele fagocitare cnd sunt stimulate (de exemplu de endotoxin) inger colorantul i l reduce (virarea culorii din galben n albastru). n condiii anormale capacitatea de distrugene intracelular este asociat cu scderea testului de reducere. 25

Evaluarea sistemului Complement Cea mai simpl msur a activitii Complementului este determinarea concentraiei serice, care induce liza a 50% din preparatul standardizat de eritrocite sensibilizate cu anticorpi (EA). Acest test se poate efectua n godeuri sau n eprubete. Un sistem simplu care furnizeaz o msur a activitii Complementului este hemoliza radial. Tehnica este similar cu cea a imunodifuziei radiale, cu excepia faptului c godeurile conin un ser test i gelul conine EA. O zon de hemoliz se dezvolt n jurul godeului i mrimea acestei zone este proporional cu cantitatea de Complement din godeu. Aceast tehnic msoar activitatea total a cilor clasic i litic (C1-C9) dar dac serul prezint o deficien a Complementului, nu se poate identifica care dintre proteine lipsete. Componentele individuale pot fi msurate separat pentru a determina fie nivelul total fie nivelul funcional. Aceasta este o distincie foarte important att timp ct un component poate fi prezsent n cantiti normale dar nefuncional. Nivelul total al proteinelor sistemului Complement este deobicei msurat cu RIA (Radio Immune Assay) sau prin tehnica ELISA, prin utilizarea unui anticorp specific pentru proteina care este investigat. Nivelele funcionale sunt msurate pentru a detecta fiecare component proteic a Complementului, prin furnizarea unui cocktail de celule roii sensibilizate plus toate componentele necesare pentru liz, cu excepia celei care este investigat.

26

S-ar putea să vă placă și