Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Dr. M
ef de l
Departa
Univers
Laborat
Public
Univers
Ion Ion
Editura
Iai, Ro
Teh
n m
dacia:
Mihai Mare
lucrri
amentul de M
sitatea Petre
torul de Mico
, Facultatea d
sitatea de tiin
nescu de la Br
a PIM
omnia
hnici de
icologia
e
icrobiologie,
Andrei, Iai
logie Micot
de Medicin V
ne Agricole
rad, Iai
200
laborat
a medic
Facultatea de
toxicologie, D
Veterinar,
i Medicin V
7
tor
cal
Medicin De
Departamentul
Veterinar
entar,
l de Sntate
C
S
sa
S
ad
E
o
w
Ia
Copyright 20
ocietatea Rom
Nici o p
au difuzat n
.R.M.M.M. T
dresate n scri
Societa
OP 6, C
Iai R
Editor v
ing. Ion
Comenz
Societa
OP 6, C
Iai R
e-mail:
www.fu
ditura PIM
os. tefan cel
www.pimcopy
ai Romnia
Descr
Tehni
I. Mar
543.0
582.2
007
mn de Mic
parte a acestei
orice form s
Toate cererile d
is pe adresa:
atea Romn d
CP 1356
Romnia
volum i desig
nu Ailinci
zi la:
atea Romn d
CP 1356
Romnia
comenzi@fu
ungi.ro
Mare nr. 11
.ro
rierea CIP a B
ici de laborat
Mihai Mare
Bibliogr.
Index.
ISBN 978-9
re, Mihai (ed
6
8
II
cologie Medic
i publicaii nu
sau prin orice
de reproducer
de Micologie M
gn copert:
de Micologie M
ngi.ro
Bibliotecii Na
tor n micolo
e. Iai : PIM
973-716-677-
d.)
cal i Micoto
u poate fi repro
mijloace, fr
re a materialel
Medical i M
Medical i M
aionale a Ro
ogia medical
M, 2007
7
oxicologie
odus, transm
acordul scris
lor publicate v
Micotoxicolog
Micotoxicolog
omniei
/ sub red.:
mis, stocat
s al
vor fi
gie
gie
III
Autori
Ingrid Cezara Apetrei
Doctor medic veterinar, doctorand
Laboratorul de Microbiologie Imunologie
Departamentul de Sntate Public
Facultatea de Medicin Veterinar
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar
Ion Ionescu de la Brad, Iai
Olimpia Bazgan
Doctor medic veterinar, doctor n Medicin Veterinar
Profesor universitar
Laboratorul de Micologie - Micotoxicologie
Departamentul de Sntate Public
Facultatea de Medicin Veterinar
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar
Ion Ionescu de la Brad, Iai
Petru Cazacu
Doctor medic veterinar, doctorand
Laboratorul de Histologie
Departamentul de tiine Fundamentale
Facultatea de Medicin Veterinar
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar
Ion Ionescu de la Brad, Iai
Maria Dan
Doctor medic, doctor n Medicin
Laboratorul de Microbiologie
Institutul de Boli Cardiovasculare G. Georgescu Iai
Bogdan Doroftei
Doctor medic, doctor n Medicin
Preparator universitar
Clinica II Obstetric - Ginecologie
Facultatea de Medicin
Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai
IV
Luminia - Iuliana Malic
Doctor medic veterinar, doctorand
Laboratorul de Micologie - Micotoxicologie
Departamentul de Sntate Public
Facultatea de Medicin Veterinar
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar
Ion Ionescu de la Brad, Iai
Magdalena Mare
Medic dentist, doctorand
Preparator universitar
Departamentul de Protetic
Facultatea de Medicin Dentar
Universitatea Petre Andrei, Iai
SC Dentomedica SRL
Mihai Mare
Medic dentist, doctor medic veterinar, doctor n Medicin
ef de lucrri
Departamentul de Microbiologie
Facultatea de Medicin Dentar
Universitatea Petre Andrei, Iai
Laboratorul de Micologie Micotoxicologie
Departamentul de Sntate Public
Facultatea de Medicin Veterinar
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar
Ion Ionescu de la Brad, Iai
V
Volum editat cu sprijinul BRD-GSG
VI
Cuprins
Cap. 1 Tehnici de recoltare, transport i procesare primar
a prelevatelor clinice ............................................................................................... 1
1.1. Sngele ..................................................................................................... 2
1.1.1. Recoltarea sngelui pentru hemocultur ................................... 3
1.1.2. Numrul de hemoculturi i momentul prelevrii ...................... 4
1.1.3. Volumul de snge ce urmeaz a fi nsmnat .......................... 4
1.1.4. Medii de cultur ........................................................................ 4
1.1.5. Durata incubrii i prelucrarea hemoculturilor ......................... 7
1.1.6. Semnificaia hemoculturilor pozitive cu fungi saprobioi ........ 8
1.2. Mduva osoas hematogen ..................................................................... 8
1.3. Lichidul cefalo-rahidian ........................................................................... 8
1.4. Raclatul cornean ....................................................................................... 9
1.5. Prelevatul otic .......................................................................................... 9
1.6. Fluidele intraoculare ................................................................................ 9
1.7. Firele de pr ............................................................................................. 9
1.8. Fragmentele unghiale i scuamele cutanate ............................................. 9
1.9. Secreiile respiratorii joase ..................................................................... 10
1.10. Aspiratul pulmonar ................................................................................ 11
1.11. Biopsia pulmonar ................................................................................. 11
1.12. Alte fluide organice normal sterile ......................................................... 11
1.13. Secreiile purulente din abcese subcutanate sau din plgi deschise ....... 12
1.14. Produsele patologice de la nivelul mucoasei orale................................. 12
1.15. Urina ...................................................................................................... 12
1.16. Secreiile vaginale .................................................................................. 14
1.17. Produse patologice de la nivelul tractului genital masculin ................... 15
1.18. Fragmentele tisulare biopsice ................................................................. 15
1.19. Tehnica aspiraiei cu ac fin .................................................................... 15
Bibliografie selectiv ............................................................................. 18
Cap. 2 Tehnici de microscopie direct ................................................................. 21
2.1. Coloraia negativ cu tu de India .......................................................... 22
2.2. Coloraia negativ cu mercurochrom 2% i tu de India ....................... 23
2.3. Coloraia cu lactofenol i albastru de anilin ......................................... 24
2.4. Coloraia cu hidroxid de potasiu i cerneal Parker ............................... 25
2.5. Clarificarea cu hidroxid de potasiu i dimetil sulfoxid .......................... 25
2.6. Coloraia cu calcofluor alb i KOH 10% ............................................... 26
2.7. Coloraia Gram ....................................................................................... 28
2.8. Coloraia Gram - calcofluor alb ............................................................. 30
2.9. Coloraia Giemsa.................................................................................... 31
2.10. Coloraia May-Grunwald-Giemsa .......................................................... 32
2.11. Coloraia Wright .................................................................................... 34
2.12. Coloraia cu mucicarmin Southgat ......................................................... 35
2.13. Coloraia Musto ..................................................................................... 36
Bibliografie selectiv ............................................................................. 39
VII
Cap. 3 Medii de cultivare ...................................................................................... 41
3.1. Generaliti ............................................................................................. 41
3.2. Compoziia mediilor de cultur .............................................................. 42
3.3. Prepararea i sterilizarea mediilor .......................................................... 43
3.4. Controlul de calitate i pstrarea mediilor ............................................. 44
Medii de cultivare .................................................................................. 46
Bibliografie selectiv ............................................................................. 96
Cap. 4 Tehnici de nsmnare i transplantare ............................................... 101
4.1. Tehnici uzuale ...................................................................................... 101
4.2. Tehnici speciale.................................................................................... 103
4.2.1. Tehnica de purificare a izolatelor levurice .............................. 103
4.2.2. Tehnica nsmnrii levurilor pe Agarul cu fin
de porumb i tween 80 ......................................................... 105
4.2.3. Tehnica de cultivare pe suporturi transparente ...................... 105
4.2.4. Tehnica de cultivare n pictur suspendat ....................... 106
4.2.5. Tehnica de cultivare pe bloc de geloz ................................. 106
4.3. Tehnici de transplantare ....................................................................... 107
Bibliografie selectiv ........................................................................... 108
Cap. 5 Tehnici de examinare microscopic a fungilor din culturi ................. 109
5.1. Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin
(levuri) .............................................................................................. 109
5.2. Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin
(fungi filamentoi) ............................................................................ 110
5.3. Preparatul extemporaneu cu band adeziv ......................................... 110
5.4. Lutarea preparatelor extemporanee ...................................................... 111
Bibliografie selectiv ........................................................................... 112
Cap. 6 Tehnici de histopatologie ........................................................................ 113
6.1. Obinerea probelor ............................................................................... 113
6.2. Examenul macroscopic ........................................................................ 113
6.3. Fixarea .............................................................................................. 113
6.3.1. Formol soluie 10% tamponat pH 6,8 ................................ 115
6.3.2. Fixatorul Bouin ..................................................................... 116
6.3.3. Fixatorul Hollande ................................................................ 116
6.4. Procesarea esuturilor ........................................................................... 117
6.4.1. Deshidratarea ........................................................................ 118
6.4.2. Clarificarea ........................................................................... 119
6.4.3. Impregnarea cu parafin ....................................................... 119
6.4.4. Includerea ............................................................................. 120
6.4.5. Secionarea............................................................................ 120
6.4.6. Etalarea seciunilor ............................................................... 121
6.4.7. Colorarea .............................................................................. 123
6.5. Montarea .............................................................................................. 148
Index
VIII
6.6. Etichetarea i arhivarea ........................................................................ 150
Bibliografie selectiv ........................................................................... 151
Cap. 7 Tehnici de seromicologie ......................................................................... 153
7.1 Fungitell ........................................................................................... 153
7.1.1. Principiul testului .................................................................. 153
7.1.2. Materiale furnizate mpreun cu testul Fungitell .................. 154
7.1.3. Materiale necesare dar nefurnizate mpreun cu kitul .......... 154
7.1.4. Atenionri i precauii ......................................................... 155
7.1.5. Pstrarea reactivilor .............................................................. 155
7.1.6. Recoltarea / Stocarea / Marcarea probelor ............................ 155
7.1.7. Tehnic de lucru ................................................................... 155
7.1.8. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 157
7.1.9. Controlul calitii .................................................................. 158
7.1.10. Limite ................................................................................... 158
7.1.11. Interferarea cu alte substane ................................................ 159
7.1.12. Valori ateptate ..................................................................... 159
7.2. Platelia
Aspergillus ............................................................................ 160
7.2.1. Principiul testului .................................................................. 160
7.2.2. Materiale furnizate odat cu kitul ......................................... 160
7.2.3. Materiale necesare, dar nefurnizate odat cu kitul ............... 161
7.2.4. Conservarea reactivilor desigilai
i a celor reconstituii ............................................................ 161
7.2.5. Tehnica de lucru ................................................................... 162
7.2.6. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 164
7.3. Platelia
Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare
ecoltarea sau prelevarea probelor este o aciune deosebit de important
pentru diagnosticul diverselor micoze interne sau superficiale, ea fiind o
etap critic a acestui demers. Modul de prelevare a probelor i operaiunile ulterioare
la care acestea vor fi supuse sunt specifice fiecrui situs de recoltare i pot reprezenta
tot atia factori limitativi pentru un diagnostic eficient n cazul executrii lor incorecte.
Se recomand ca prelevarea probelor s fie realizat de personalul laboratorului de
micologie, special instruit n acest scop. Cantitatea / volumul prelevatului trebuie s fie
suficient de mare pentru a permite efectuarea examenului microscopic direct,
cultivarea i eventual examenul histopatologic pe biopsie. Procesarea probelor va
ncepe ct mai curnd posibil dup recoltare, fr a depi timpul maxim de ateptare.
Formularul de cerere pentru analize microbiologice
Probele prelevate vor fi nsoite obligatoriu de un formular de cerere pentru
analize microbiologice care va cuprinde datele de identificare ale pacientului, tipul
prelevatului, ora recoltrii i examenele de laborator necesare. Unele date anamnetice
(profesie, cltorii n zone endemice etc.) ca i unele informaii clinice relevante sunt
importante pentru medicul de laborator n procesarea optim a probelor i vor fi
furnizate de ctre clinician n acelai formular. Formularul de cerere va conine i
numele medicului, numrul de telefon, clar indicate, pentru a fi contactat n cazul unor
rezultatele critice sau urgente.
Tratamentele recente cu antifungice trebuie imperios specificate pentru a ajuta
microbiologul la interpretarea rezultatelor testelor i la efectuarea antifungigramei.
Rezultatele serologice i culturale anterioare trebuie de asemenea specificate dac au
fost efectuate.
Precauii
1. Se urmeaz precauiile standard pentru recoltarea i manipularea produselor
biologice. Se trateaz toate probele ca fiind potenial periculoase.
2. Dup recoltare n recipiente adecvate, probele se introduc n pungi din plastic tip
ziplock, cu buzunar lateral (pentru formularul de cerere).
R
1
Tehnici de recoltare, transport i
procesare primar a prelevatelor clinice
Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice
2
Recoltarea
1. Cnd este posibil, probele se recolteaz naintea administrrii agenilor
antimicrobieni.
2. Se identific sursa probei i se specific corect zona, astfel nct n cursul
procesrii n laborator s fie selectat mediul de cultur adecvat.
3. Se indic cnd un microorganism particular este cutat n mod special n prob.
4. Dac o prob este recoltat prin traversul pielii intacte, aceasta se va dezinfecta
cu alcool etilic 70%, urmat de o soluie pe baz de iod (1-2% tinctur de iod
sau 10% soluie de povidon-iod). Excesul de tinctur de iod se ndeprteaz
cu ajutorul unui tampon mbibat n alcool, pentru a preveni eventualele iritaii.
5. Pentru recoltarea din situsuri normal sterile se utilizeaz echipament sterilizat i
tehnic aseptic pentru a preveni contaminarea cu microorganisme n timpul
procedurilor invazive.
6. Colectarea probelor se va face n recipiente ermetice, sterile i rezistente, cu
capac filetat, care nu permit crearea de aerosoli n momentul deschiderii.
7. Se eticheteaz clar recipientul de transport cu numele pacientului, numrul de
identificare, data i ora de colectare.
8. Probele obinute prin aspiraie cu ac fin trebuie transferate ntr-un tub steril sau
flacon de transport nainte de a fi trimise la laborator.
9. Dac din probele fluide s-au executat frotiuri imediat dup recoltare, acestea vor
fi individualizate corespunztor prin notare pe captul mat al lamei. Se
recomand trimiterea a 1-5 frotiuri pentru evaluare citologic. Acestea se vor
fixa imediat prin pulverizarea frotiului cu un fixator citologic sau se introduc n
etanol 95 % pentru 20 minute.
1.1. Sngele
Hemocultura este o important metod de diagnostic care poate orienta sau
reorienta terapia antimicrobian n cazul bolilor infecioase grave. Obiectivul major al
tuturor metodelor de hemocultur este reprezentat de depistarea unui numr mic de
microorganisme n snge, de aceea metodele de hemocultur variaz i sunt aproape
proprii fiecrui laborator. Indiferent de metoda aleas, este esenial prelevarea
sngelui n condiii strict aseptice, nsmnarea acestuia pe un mediu lichid, folosirea
unor metode pentru depistarea creterii microorganismelor n mediu lichid i o faz
final de subcultivare pe un mediu solid pentru identificarea i testarea sesibilitii la
antifungice.
Printre factorii cheie pe care eful de laborator trebuie s-i stabileasc se
numr i metoda de hemocultur, cantitatea i compoziia mediului de cultur,
numrul i momentul prelevrii hemoculturilor, volumul de snge care urmeaz a fi
nsmnat, frecvena subcultivrilor i interpretarea rezultatelor.
Prelevarea se face direct n flacoanele de hemocultur de tipul Hemoline
Performance Duo, BacT/ALERT
este indicat aspiraia din zona central . Pentru formaiunile mai mari, care pot
avea necroze, modificri chistice sau hemoragice centrale, aspiraia poate fi
executat i de la periferie. Dac se aspir numai puroi sau material necrotic
din leziunile mari, AAF poate fi repetat imediat, de la periferie. Dac acul se
plaseaz tangenial n cazul unei formaiuni mici sau dac penetreaz dincolo
de formaiune, materialul nu va putea fi recoltat.
Not: Dac suprafaa zonei de execuie a AAF este localizat lng cutia toracic
(formaiuni nodulare axilare sau supraclaviculare), aspiraia se va executa ntr-un
plan paralel fa de cutia toracic pentru a evita penumotoraxul. n AAF la nivelul
tiroidei, pacientul trebuie instruit s nu nghit sau s vorbeasc cnd acul este plasat
n interiorul formaiunii.
8. Crearea vacuumului i obinerea materialului biologic: aspiraia este executat
dup ptrunderea n leziune i se menine n timp ce acul este acionat viguros
prin multiple micri de ,,du-te - vino, n cteva direcii diferite dar
convergente. ntreaga procedur trebuie s dureze maxim 6-8 secunde. Nu se
rotete acul i nici nu se fac micri de pompare a pistonului seringii (nuntru-
nafar). Rezultatul aspiraiei este extragerea de fragmente de esut i celule
dislocate de bizoul acului.
9. Eliberarea vacuumului i retragerea acului: cnd materialul biologic este
observat la baza acului, procedura se ntrerupe. naintea retragerii acului, se
elibereaz din tensiune pistonul seringii, apoi acul se scoate din formaiune,
drept, fr al nclina. Pistonul revine singur, ncet (fr a fi mpins). O eliberare
insuficient a presiunii negative n interiorul formaiunii va cauza aspirarea
materialului biologic la intrarea n sering, ceea ce-l va face dificil de
recuperat. n situaii excepionale, seringa i acul pot fi cltite cu ser fiziologic
sau fixator care apoi se va centrifuga pentru a prepara un frotiu. Imediat dup
retragerea acului, pe zona puncionat se aplic un tampon mbibat cu
dezinfectant i se preseaz cteva minute, de preferat de ctre un asistent.
Aceasta se realizeaz cu scopul de a preveni formarea unui hematom n zonele
intens vascularizate.
Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice
18
Bibliografie selectiv
1. Artal M E (2004) - Diagnstico histopatolgico de las micosis; Rev
Iberoam Micol; 21:1-9.
2. Bates D W, Cook E F, Goldman L, et al. (1990) - Predicting bacteremia in
hospitalized patients: a prospectively validated model; Ann Intern Med;
113:495-500.
3. Brouqui P, Raoult D (2001) - Endocarditis Due to Rare and Fastidious
Bacteria; Clin Microbiol Rev; 24(1): 177-207.
4. Buiuc D, Negu M (1999) - Tratat de microbiologie clinic; Ed. Medical;
Bucureti.
5. Cicalese L (1999) - Bacterial translocation in intestinal transplant
recipients; Transplantation; 67(9): S589.
6. Darby J M, Linden P, Pasculle W, et al. (1997) - Utilization and diagnostic
yield of blood cultures in a surgical intensive care unit; Crit Care Med;
25:989-994.
7. Debelian G J (1998) - Anaerobic bacteremia and fungemia in patients
undergoing endodontic therapy: an overview; Ann Periodontol; 3(1):281-
287.
8. Doern G V (1994) - Manual blood culture systems and the antimicrobial
removal device; Clin Lab Med; 14:133-147.
9. Edgeworth J D, Treacher D F, Eykyn S J (1999) - A 25-year study of
nosocomial bacteremia in an adult intensive care unit; Crit Care Med;
27:1421-1428.
10. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed.
Viaa Medical Romneasc; Bucureti.
11. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines - dmarche diagnostique;
Elsevier; Paris.
12. Hampton J R, Harrison M J G (1964) - Sterile blood cultures in bacterial
endocarditis; QJ Med; 36:167-174.
13. Harlod C N (1986) - Cost Effective Blood Cultures - Is It Possible or
Impossible to Modify Behavior? Infection Control; 7(1):32-33.
14. Hoog G S de, Guarro J, Gen J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical
fungi; 2
nd
edition; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat
Rovira i Virgili.
15. Jaimes F, Arango C, Ruiz G et al (2004) - Predicting Bacteremia at the
Bedside; Clinical Infectious Diseases; 38:357-362.
16. Lichtman Steven M (2001) - Baterial Translocation in Humans; Journal
of Pediatric Gastroenterology & Nutrition; 33(1):1-10.
17. Lionaskis M S (2004) - The significance of blood cultures positive for
emerging saprophytic moulds in cancer pacients; Clin Microb Infect; 10
(10):922-926.
18. Maoxin W, David E B (2004) - Fine Needle Aspiration, Cancer
Investigation; 22(4).
19. Peeanu V, Peeanu V, Balt M (1997) - Examene i investigaii n
ginecologie i obstetric; Ed. Ex Ponto, Bucureti.
Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare
19
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan
xamenul microscopic direct al produselor patologice recent recoltate poate
orienta diagnosticul ctre o infecie fungic i uneori poate chiar oferi
indicii importante privind etiologia acesteia prin evidenierea unor formaiuni sau
elemente caracteristice. El este obligatoriu pentru orice tip de prelevat cu excepia
sngelui i are valoare diagnostic intrinsec deoarece permite confirmarea rapid a
suspiciunii de infecie micotic i informarea timpurie a clinicianului, cu mult timp
nainte de pozitivarea culturii. Se efectueaz pe prelevate n stare proaspt, cu sau fr
colorare prealabil (calcofluor, Giemsa etc.): lavaj bronhoalveolar (dup centrifugare),
biopsii (frotiuri prin amprent), sput (dup tratare cu N-acetil-cistein), hemoculturi,
prelevate superficiale cutanate, sinusale, conjunctivale, unghiale, auriculare.
Produsele patologice pentru care exist suspiciunea c ar conine fungi se pot
examina microscopic prin una dintre urmtoarele forme:
- preparat extemporaneu ntre lam i lamel, cu soluie 20% KOH (scuame,
fragmente unghiale, secreii linguale, vaginale); sensibilitatea metodei este
relativ sczut, depinznd de abilitatea i experiena anterioar a
examinatorului. n acest scop, se omogenizeaz pe o lam de microscopie
volume egale din materialul patologic i soluia clarificant, dup care se
acoper cu o lamel, astfel nct s se evite formarea bulelor de aer. Decelarea
formaiunilor fungice n prelevate este mult ameliorat dac la soluia
clarificant se adaug un colorant negru clorazol, cerneal Parker sau o
substan fluorescent cu afinitate pentru glicanul din peretele fungilor
(Blankophor, Calcofluor n proporie de 0,1%). Utilizarea substanelor
fluorescente incumb examinarea preparatului la un microscop cu fluorescen.
- preparat extemporaneu cu soluie 20% KOH + substan fluorescent sau frotiu
colorat cu aceeai substan fluorescent (Calcofluor, Blankophor etc.); este
metoda optim de detecie a fungilor n prelevate datorit unei sensibiliti i
specificiti excelente, dar necesit microscopie n lumin ultraviolet (fig. nr.
2-1 vezi Anexa). Cteva fragmente din prelevatul recoltat de la pacient se
depun pe o lam de sticl, ntr-o pictur de lichid clarificant (soluie 10-20%
KOH cu adaos de calcofluor 0,1%) care prin digerarea keratinei i a celulelor
somatice va permite observarea la microscop a diverselor formaiuni
E
2
Tehnici de microscopie direct
Tehnici de microscopie direct
22
caracteristice fungilor. Dup un contact de cca. 10-15 minute (eventual mai
ndelungat n cazul fragmentelor unghiale), lama se acoper cu o lamel i se
examineaz la microscop, cu obiectivele 10, 20 i 40, dup caz. Aciunea
lichidului clarificant poate fi intensificat prin nclzirea lamei la flacra unui
bec de gaz, fr ns a-l aduce la fierbere. n general, lama se poate examina
cnd opacitatea preparatului s-a diminuat vizibil.
- frotiu colorat Gram: pune cu uurin n eviden filamentele, pseudohifele,
artrosporii i blastosporii de dimensiuni mari, ns este inadecvat pentru
detecia celulelor levurice de dimensiuni mici de exemplu, Candida glabrata
(fig. nr. 2-2 vezi Anexa)
- frotiu pregtit pentru imunofluorescen prin tratare cu anticorpi monoclonali
cuplai cu markeri fluoresceni (n special pentru detecia Pneumocystis
jiroveci n prelevatele respiratorii)
- preparat extemporaneu colorat cu tu de India: pune n eviden levurile capsulate
din genul Cryptococcus, n sedimentul LCR, urinar, etc. (fig. nr. 2-3 vezi
Anexa)
- frotiu colorat May-Grunwald-Giemsa: metod de rutin pentru depistarea
levurilor intracelulare de tip Histoplasma, dar poate fi utilizat i pentru
detectarea levurilor prin microscopie direct (fig. nr. 2-4 vezi Anexa)
- frotiu necolorat sau colorat cu albastru de metilen 3%: metoda se poate folosi
pentru detectarea levurilor din hemoculturi, ns alte tehnici cu specificitate
mai ridicat sunt recomandate (fig. nr. 2-5 vezi Anexa)
- preparat extemporaneu cu band adeziv, colorat cu albastru de metilen n
lactofenol: metod expeditiv de diagnostic tip one-step a leziunilor de
Pityriazis versicolor (fig. nr. 2-6 vezi Anexa)
- frotiuri obinute prin etalare sau amprent (pornind de la prelevate ca aspiratul
bronic, LBA sau biopsiile) care apoi se coloreaz Musto sau cu calcofluor i
se examineaz n vederea decelrii aspectelor particulare care ar pleda pentru o
zygomicoz, aspergiloz etc.
Elementele morfologice identificabile prin examen microscopic direct sunt
levurile (burjeonate sau nu, intra- sau extracelulare, cu sau fr capsul), fragmentele
hifale, septate sau nu, uneori ramificate, celulele fumagoide - celule cu aspect
muriform, melanizate, de 4-12 m diametru, septate longitudinal i transversal,
granulele (numite i scleroi - elemente sferice, dure, de cca. 1 mm diametru, formate la
nivelul micetoamelor prin ntreeserea dens a hifelor), rar structurile de fructificare ale
unor fungi filamentoi.
2.1. Coloraia negativ cu tu de India
Scop
Se recomand pentru decelarea levurilor aparinnd speciei C. neoformans n
sedimentul unor fluide biologice (LCR, urin, etc.).
Echipamente
Lame i lamele de microscopie, mnui de unic folosin, pipete
Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan
23
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Reactivi
Tu de India sau tip Parker
Mod de lucru
1. Pe o lam de sticl degresat se depun i se amestec o pictur din sedimentul
probei de analizat i o pictur tu de India;
2. Se acoper cu o lamel de sticl evitnd formarea bulelor de aer;
3. Preparatul extemporaneu astfel obinut se examineaz la microscop
(x100, x400).
Rezultatul colorrii
Cryptococcus neoformans se prezint sub form de celule levurice rotunde,
nmugurite sau nu, nconjurate de un halou clar, necolorat, facil de vizualizat pe fondul
maron-negru al preparatului. Datorit necolorrii capsulei polizaharidice, metoda mai
poart denumirea de coloraia negativ cu tu de India.
2.2. Coloraia negativ cu mercurochrom 2% i tu de India
Scop
Reprezint o variant mbuntit a metodei anterioare, permind
vizualizarea a trei zone n componena capsulei i a unor corpusculi n interiorul
celulelor levurice la C. neoformans, ceea ce crete considerabil specificitatea
examenului microscopic direct.
Echipamente
Lame i lamele de microscopie, mnui de unic folosin, pipete
Reactivi
Soluie 2% mercurochrom (C
20
H
8
Br
2
HgNa
2
O
6
sarea disodic a 2,7-dibrom-4-
(hidroxomercurio)-fluoresceinei)
Tu India (sau tu negru tip Parker)
Mod de lucru
1. Pe o lam de sticl degresat se depun succesiv i se omogenizeaz o pictur
din sedimentul probei de analizat, o pictur sol. 2% mercurochrom i o
pictur tu de India;
2. Se acoper cu o lamel;
3. Se examineaz la microscop (x100, x400, x1000).
Rezultatul colorrii
Cryptococcus neoformans se prezint sub form de celule levurice rotunde,
nmugurite sau nu, nconjurate de o capsul clar, format din 3 zone concentrice; n
interiorul celulelor levurice sunt adesea observabili corpusculi de form rotund.
Tehnici de microscopie direct
24
2.3. Coloraia cu lactofenol i albastru de anilin (Lactophenol Cotton Blue)
Scop
Metod destinat colorrii i evidenierii prin microscopie a fungilor din unele
prelevate clinice i culturi.
Echipamente
Lame i lamele de microscopie, curate i degresate, ans de nsmnare,
mnui de protecie, pahar Berzelius, plnie, hrtie de filtru, agitator magnetic.
Reactivi
Lactofenol cu albastru de anilin
Albastru de anilin ......................................... 0,05 g
Fenol, cristale .............................................. 20,00 g
Glicerol ...................................................... 40,00 ml
Acid lactic .................................................. 20,00 ml
Ap distilat ............................................... 20,00 ml
Prepararea acestei soluii dureaz cca. dou zile:
1. n prima zi, se dizolv albastrul de anilin n apa distilat. Se las peste noapte
pentru decantarea colorantului insolubil;
2. AIIa zi, purtnd mnui de protecie, se adaug cristalele de fenol n acidul
lactic, ntr-un pahar Berzelius. Se omogenizeaz apoi folosind un agitator
magnetic pn la dizolvarea complet a fenolului;
3. Se adaug glicerolul;
4. Se filtreaz soluia de albastrul de anilin i se adaug n soluia de fenol /
glicerol / acid lactic. Se amestec i se pstreaz la temperatura camerei n
flacoane cu dop picurtor.
Mod de lucru
1. Se etaleaz pe o lam o cantitate suficient de prob;
2. Se adaug 1-2 picturi soluie de lactofenol i albastru de anilin;
3. Se omogenizeaz uor;
4. Se acoper cu o lamel i se examineaz la microscop.
Rezultatul colorrii
Fungii albastru-nchis
Not:
Soluia de lactofenol i albastru de anilin este disponibil comercial: Merck, Remel,
Becton-Dickinson (Lactophenol blue solution)
Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan
25
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Reactivi
Soluia A
Hidroxid de potasiu .......................................... 10 g
Glicerol ........................................................... 10 ml
Ap distilat .................................................... 90 ml
Se dizolv KOH n ap i apoi se adaug glicerolul.
Soluie B
Calcofluor alb .................................................. 0,1 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml
Se dizolv calcofluorul alb pulbere n apa distilat uor nclzit.
Mod de lucru
1. Se amestec o pictur din fiecare soluie (A i B) n centrul unei lame de
microscopie;
2. Se etaleaz proba de esut n soluie i apoi se acoper cu o lamel, comprimnd
preparatul cu captul unei anse de nsmnare. Excesul de lichid se elimin;
3. Alternativ, n funcie de natura prelevatului se pot obine i frotiuri prin
amprent sau tergere, care se trateaz apoi cu soluiile reunite menionate;
4. Se nclzete uor lama i se examineaz la microscopul cu fluorescen echipat
cu filtre adecvate.
Rezultatul colorrii
Elementele fungice prezente n preparat vor apare colorate n albastru
fluorescent sau verde-deschis, n funcie de filtrele utilizate.
Note:
1. Este o metod expeditiv i sensibil, totui este necesar ca microscopul cu fluorescena s
fie dotat cu filtre care s determine o sensibilizare la lumina ultraviolet, cu o lungime de
und joas, de cca. 400 nm.
2. Calcofluorul alb (M2R pulbere - Polysciences sau Blankophor BA - Bayer) este utilizat ca
agent de albire n industria hrtiei, legndu-se selectiv de celuloz i chitin. Este un
colorant fluorescent pentru fungi.
Tehnici de microscopie direct
28
2.7. Coloraia Gram
*
Scop
Identificarea fungilor prin examenul microscopic al frotiurilor executate din
diverse lichide biologice.
Fixator
Metanol absolut
Echipamente
Lame de sticl pentru microscopie (25/75 mm) cu un capt mat, pipete Pasteur,
anse de nsmare microbiologic, ace de inoculare, recipiente pentru depozitarea de
deeuri biologice
Materiale opionale, depinznd de sursa probelor i de protocolul laboratorului:
a) plit nclzitoare, 60C;
b) centrifug;
c) agitator tip Vortex;
d) tuburi sterile cu dop filetat;
e) foarfece sterile, bisturie, pense.
Reactivi
Soluia de cristal violet
Cristal violet ....................................................... 2 g
Etanol 95% ..................................................... 20 ml
Oxalat de amoniu ............................................. 0,8 g
Ap distilat .................................................... 80 ml
Se dizolv cristalul violet n etanol i oxalatul de amoniu n ap. Se las soluia
de oxalat de amoniu peste noapte pentru solubilizare complet sau se nclzete uor
pn la dizolvare. Se amestec cele dou soluii i apoi se filtreaz.
Soluia iod-iodurat Gram (soluia Lugol)
Iod ....................................................................... 1 g
Iodur de potasiu ................................................ 2 g
Ap distilat .................................................. 275 ml
Se adaug iodul peste iodura de potasiu, n aproximativ 25 ml ap distilat.
Cnd solubilizarea este complet se adaug restul de ap.
Atenie! Iodul este coroziv. Se evit inhalarea, ingestia sau contactul cu pielea.
*
vezi coloraia Gram-calcofluor alb
Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan
29
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Soluia de alcool-aceton
Etanol 95% ................................................... 100 ml
Aceton ......................................................... 100 ml
Se omogenizeaz i se pstreaz ntr-un recipient brun, etichetat cu data
preparrii, la temperatura camerei. Soluia este stabil 1 an.
Atenie! Etanolul i acetona sunt inflamabile.
Safranin O 0,4 %
Safranin O ......................................................... 1 g
Ap distilat .................................................. 250 ml
Mod de lucru
1. Frotiurile pot fi fixate prin nclzire sau cu metanol;
2. Frotiurile se pot usca n aer sau se menin pe o platin nclzitoare electric, la
60C, pn la uscare:
3. Dac frotiurile sunt uscate n aer se vor trece de dou sau trei ori printr-o flacr.
Pentru a evita denaturarea frotiului, acesta nu se supranclzete.
4. Se las lama s se rcesc nainte de colorare;
5. Fixarea cu metanol previne liza eritrocitelor. De asemenea, fixarea cu metanol
este recomandat pentru toate prelevatele clinice lichide, n special pentru
urin, deoarece previne splarea probelor n timpul colorrii. Metanolul se
stocheaz n sticle brune cu dop etan. O cantitate de lucru poate fi pstrat n
recipieni de plastic, dac aceasta se nlocuiete la fiecare 2 sptmni. Pentru
fixare, se adaug cteva picturi de metanol pe lam, se las n contact timp de
1 minut, apoi se vars i se las lama s se usuce la aer;
6. Se inund frotiul astfel fixat, cu soluie de cristal violet. Se las n contact 60
secunde;
7. Se vars soluia de cristal violet i se cltete lama uor cu ap de robinet.
Atenie! Cltirea excesiv poate determina ndeprtarea cristalului violet din
celulele gram-pozitive. Apa se vars pe unul din capetele lamei, oblic, pentru a
asigura o curgere lent peste frotiu.
8. Se cltete apoi cu soluie Lugol, timp de 3 secunde;
9. Se inund frotiul cu soluie Lugol i se las n contact 30 secunde;
10. Se spal cu ap de robinet;
11. Se toarn soluie alcool-aceton peste frotiu, ntr-un capt al lamei, oblic, pn
cnd soluia care se scurge la capatul opus devine clar. Timpul de decolorare
variaz n funcie de grosimea frotiului (n general 8-10 secunde);
12. Se spal cu ap de robinet;
13. Se inund lama cu soluie de safranin 0,4 %, timp de 30 secunde;
14. Se ndeprteaz colorantul (safranin 0,4%) cu un jet de ap de robinet ;
15. Se usuc lama n aer, n poziie vertical, iar apoi se terge reversul acesteia cu
un erveel mbibat n alcool sau aceton.
Tehnici de microscopie direct
30
Rezultatul colorrii
Fungii sunt Gram-pozitivi, deci se vor colora n violet.
Note:
1.Dac soluia de cristal violet prezint precipitat sau sediment, se refiltreaz nainte de
utilizare. Unii colorani, n special safranina, se pot contamina. Cnd se suspecteaz
acest lucru, se nlocuiesc.
2. Evaporarea poate altera eficacitatea reactivilor; soluiile de lucru trebuie schimbate
regulat.
3. Zilnic sau cnd se folosete un nou lot de reactivi se realizeaz controlul de calitate prin
executarea unui frotiu din Escherichia coli (ATCC 25922) i Staphylococcus
epidermidis (ATCC 12228) sau Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Acesta se
fixeaz i se coloreaz dup tehnica descris mai sus. Rezultatele colorrii frotiului de
control:
a) coco-bacili Gram-negativi: roz;
b) coci Gram-pozitivi: violet intens.
4. Cteva dintre cauzele cele mai frecvente care duc la obinerea unor rezultate
nesatisfctoare ale coloraiei Gram:
a) utilizarea unor lame de microscopie insuficient degresate. Pentru acest lucru, se
pstreaz lamele ntr-un pahar cu etanol 95%. Excesul de alcool se
ndeprteaz prin tergerea sau flambarea lamelor nainte de utilizare;
b) executarea unor frotiuri prea groase;
c) supranclzirea frotiului cnd acesta este fixat prin cldur;
d) splarea excesiv pe durata procedurii de colorare.
2.8. Coloraia Gram - calcofluor alb
Scop
Uneori, fungii nu se pot distinge cu acuratee n frotiurile colorate Gram sau
pot rmne mascai de alte materiale din prob. n aceast situaie, calcofluorul alb
poate fi utilizat pentru supracolorarea frotiurilor colorate Gram n vederea unei mai
bune evidenieri a elementelor fungice.
Echipamente
Lame i lamele pentru microscopie, hrtie de filtru, beioare din lemn,
microscop cu fluorescen, sticlrie de laborator
Reactivi
Xilen
Metanol absolut
Soluie de hidroxid de potasiu 10 sau 20%
Calcofluor alb
Mod de lucru
1. Se coloreaz frotiul prin tehnica de colorare Gram;
2. Se aplic peste frotiul colorat Gram un fragment de hrtie absorbant, pentru a-l
usca;
Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan
31
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Reactivi
Soluia de colorare I (May- Grnwald)
May-Grnwald pulbere ................................... 0,3 g
Metanol absolut ......................................... 100,0 ml
Dup preparare se pstreaz ntr-un recipient etan, la temperatura camerei
timp de 24 ore. Se filtreaz nainte de utilizare.
Soluia de colorare II (Giemsa)
Colorant Giemsa pulbere .................................... 1 g
Glicerol ........................................................... 66 ml
Metanol absolut .............................................. 66 ml
Colorantul Giemsa se dizolv n glicerol i apoi se nclzete la 56C timp de
90-120 minute. Se adaug metanolul agitnd pentru omogenizare. Soluia final se
pstreaz la temperatura camerei ntr-un recipient nchis. Se filtreaz nainte de
utilizare.
Soluia tampon Srensen pH 6,8
Fosfat de sodiu dibazic .................................... 0,3 g
Fosfat de sodiu monobazic .............................. 0,7 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml
Dup preparare, soluia se pstreaz la frigider; este stabil timp de 1 an.
Mod de lucru
1. Se fixeaz frotiurile n metanol absolut, timp de 30 secunde;
2. Se ndeprteaz metanolul;
3. Se aplic soluia de colorare I proaspt diluat 1:1 cu soluie tampon, timp de 5
minute (lama va fi poziionat orizontal sau introdus ntr-un pahar);
4. Se transfer lamele fr splare prealabil n soluia de colorare II diluat recent
cu 9 pri de soluie tampon, pentru 10-15 minute;
5. Se imerseaz lamele n soluie tampon pentru ndeprtarea colorantului;
6. Se spal lamele cu ap de robinet din abunden;
7. Se transfer ntr-un pahar cu ap pentru 2-5 minute;
8. Se usuc apoi ntr-o poziie oblic. Nu se usuc prin tergere;
9. Se poate monta o lamel, ns nu este neaprat necesar.
Rezultatul colorrii
Fungii nuane de roz, albastru, violet
Tehnici de microscopie direct
34
Note:
1. Este important ca lamele s nu se usuce n timpul colorrii, pentru a preveni apariia
artefactelor sau formarea de precipitate.
2.Soluia stoc May-Grunwald i colorantul Giemsa sunt disponibile comercial
2.11. Coloraia Wright
Scop
Evidenierea formelor levurice la Histoplasma capsulatum var. capsulatum
prin examen microscopic al frotiurilor executate din snge i mduv osoas
hematogen
Fixator
Metanol absolut
Echipamente
Lame i lamele pentru microscopie, curate i degresate, sticlrie de laborator,
hrtie de filtru
Reactivi
Soluie de colorare (care poate fi achiziionat ca soluie gata preparat sau ca pulbere
din diverse surse comerciale)
Colorant Wright pulbere .................................. 0,3 g
Metanol absolut ......................................... 100,0 ml
Dup preparare, soluia se menine ntr-un recipient etan la temperatura
camerei timp de 24 ore i se filtreaz nainte de utilizare.
Soluie tampon Sorensen pH 6,4
KH
2
PO
4
anhidru ............................................ 6,63 g
Na
2
HPO
4
anhidru ........................................... 2,56 g
Ap distilat .......................................... ad 1000 ml.
Mod de lucru
1. Se usuc frotiul i se fixeaz apoi cel puin 30 secunde n metanol absolut;
2. Se ndeprteaz metanolul prin nclinarea lamei;
3. Se aplic soluia de colorare, timp de 2 minute, peste lama poziionat orizontal,
numrnd picturile;
4. Se adaug peste colorant aceeai cantitate din soluia tampon. Se omogenizeaz
atent colorantul i soluia tampon fr a atinge suprafaa filmului de lichid (va
apare o strlucire metalic la suprafaa amestecului);
5. Se las amestecul n contact cu frotiul timp de 3 minute;
6. Se cltete lama cu ap distilat timp de 30 secunde;
Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan
35
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Borax 5%
Borat de sodiu .................................................. 5,0 g
Ap distilat .......................................... ad 100,0 ml
Soluia este stabil 3 luni.
Bisulfit de sodiu 1%
Bisulfit de sodiu .................................................. 2 g
Ap distilat ............................................. ad 200 ml
Se pstreaz la 4C.
Clorur de aur 0,2%
Clorur de aur .................................................. 0,2 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml
Se pstreaz la frigider n recipiente etane, riguros igienizate n prealabil.
Soluia este stabil 1 an.
Atenie! Se evit contactul i inhalarea.
Tiosulfat de sodiu 2 %
Tiosulfat de sodiu ............................................... 4 g
Ap distilat ............................................. ad 200 ml
Se pstreaz la 4C.
Verde luminos 1%
Verde luminos SF yellow ................................... 1 g
Ap distilat ............................................. ad 100 ml
Acid acetic glacial .................................... 5 picturi
Dup preparare se pstreaz la frigider.
Atenie! Se evit contactul i inhalarea.
Mod de lucru
1. Fixarea: se nclzete acidul cromic 5% pn la 65C pe o plit electric i apoi
se imerseaz imediat lamele timp de 1 minut;
2. Cltire de dou ori n ap distilat ;
3. Se introduc preparatele n bisulfitul de sodiu, timp de 1 minut;
4. Se cltesc lamele n ap distilat
Tehnici de microscopie direct
38
5. Impregnarea argentic: soluia de lucru se transfer ntr-un vas de sticl Pyrex i
apoi se imerseaz lamele. Se nclzete rapid la 90-95C timp de 2-3 minute:
soluia i schimb culoarea de la cenuiu la negru, iar lamele devin maro;
6. Cltire de trei ori n ap distilat;
7. Lamele se introduc n clorur de aur 0,2% timp de 1 minut;
8. Cltire cu ap distilat;
9. Imersare n tiosulfat de sodiu, timp de 1 minut;
10. Cltire cu ap distilat;
11. Contra-colorarea cu verde luminos, timp de 1 minut;
12. Cltire cu ap de robinet, timp de 2 minute;
13. Deshidratare n etanol 95% cteva secunde, apoi n alcool absolut, de dou ori
timp de cteva secunde;
14. Se introduc lamele n xilen sau metil-ciclohexan cteva secunde, pentru
clarificare;
15. Se monteaz lamele n Eurik.
Rezultatul colorrii
Fungii culoare brun-negricios
Fondul verde
Not:
1. Coloraia Musto este versiunea rapid a metodei Gomori-Grocott, utiliznd tot
principiul impregnrii argentice.
2. Soluiile din bateria de colorare se rennoiesc dup 4 etape sau din 2 n 2 sptmni.
3. Aceast metod comport n principal trei faze:
fixarea cu acid cromic
colorarea cu nitrat de argint - metenamin
contra-colorare cu verde luminos
4. Oxidarea gruprii hidroxil a polizaharidelor fungice parietale i complexarea lor cu
reactivul argentic, determin coloraia brun-negricioas a fungilor pe un fond verde
al preparatului.
5. Aceast tehnic prezint mai multe avantaje:
reproductibilitate excelent i rapiditate (aproximativ 20 minute)
costuri moderate
posibilitatea de aplicare pentru o varietate larg de probe biologice, inclusiv
pentru prelevatele bronho-alveolare n investigarea pentru pneumocistoz
simplitatea tehnicii i uurina cu care se detecteaz elementele fungice, chiar
dac acestea sunt foarte rare
6. Pentru reuita coloraiei trebuie respectate trei condiii eseniale:
indicaiile tehnice
folosirea unei lame-martor la fiecare serie de colorare
rennoirea regulat a reactivilor
7. Frotiurile sero-fibrinoase (lichid pleural, articular etc.) prezint uneori inconvenientul
c se desprind de pe lam n cursul colorrii. Acest inconvenient nu poate fi remediat,
dar dac frotiul nu s-a desprins n totalitate se poate recurge la o metod de
examinare microscopic direct ntre lam i lamel.
Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan
39
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Bibliografie selectiv
1. Bridgman C P (1992) - Micoscopic Anatomy Laboratory Manual;
Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri.
2. Buiuc D, Negu M (1999) - Tratat de microbiologie clinic; Ed. Medical;
Bucureti.
3. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed. Viaa
Medical Romneasc; Bucureti.
4. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines - dmarche diagnostique; Ed.
Elsevier; Paris.
5. Hoog G S de, Guarro J, Gen J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical fungi;
2
nd
ed; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.
6. Houwen B (2000) - Blood Film Preparation and Staining Procedures;
Laboratory Hematology; Carden Jennings Publishing Co Ltd.
7. Richardson M D, Warnock D W (2003) - Fungal infection - Diagnosis and
Management; Blackwell Publishing.
8. Zerba R, HuiHuicho L, Guillen A (1996) - Modified India ink preparation for
C.neoformans in cerebrospinal fluid specimens; J Clin Microbiol; 34(9):2290-
2291.
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
41
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
3.1. Generaliti
efinirea mediilor de cultur ntr-o manier complet i complex, n
contextul varietii covritoare a entitilor taxonomice microbiene i a
exigenelor nutritive extrem de diverse pe care acestea le reclam n dezvoltarea lor,
este o ncercare destul de dificil pentru microbiologul practician. Acest demers
rmne n domeniul speculativ, deoarece orice ncercare n acest sens va tinde s
satisfac mai curnd legile semanticii dect rigorile practicii medicale.
Totui, putem defini mediile de cultur ca un complex de substane chimice
pure sau dimpotriv, de substraturi organice i minerale cu un grad mai redus de
puritate, care s ofere microorganismelor posibilitatea dezvoltrii i multiplicrii,
imitnd pe ct posibil condiiile trofico-habituale din organismele gazd sau din
biotopurile naturale specifice.
Izolarea n condiii de laborator a fungilor din prelevatele patologice, indiferent
de natura lor, este o necesitate indiscutabil pentru nelegerea procesului morbid
infecios i pentru iniierea terapiei etiotrope.
Diversitatea fungilor, ca bioentiti cu potenial patogen, justific includerea n
mediile de cultur a unei game largi i variate de nutrieni care s asigure izolarea
i/sau identificarea lor n condiii optime. Au fost formulate astfel o multitudine de
medii de cultivare incluznd ingrediente cu grade diferite de specificitate, care s
corespund dezideratelor de eficien, precizie i expeditivitate din micologia clinic.
Investigarea particularitilor biochimice ale fungilor, n special a profilului lor
enzimatic, a fcut posibil n ultimul timp formularea unor medii de cultur mai
complexe, care permit identificarea mai facil a acestor microorganisme din
prelevatele patologice. Astzi, o adevrat industrie, susinut de o intens activitate de
cercetare, produce o gam extrem de diversificat de substraturi nutritive i medii de
cultivare, care ofer generoase posibiliti de folosire n demersul diagnostic al bolilor
infecioase induse de fungi.
D
3
Medii de cultivare
Medii de cultivare
42
3.2. Compoziia mediilor de cultur
Particularitile metabolice i numrul apreciabil al fungilor incumb folosirea
unor substraturi nutritive variate, fcnd practic imposibil obinerea unui mediu
standard pentru toate speciile de interes medical. Unele formule (Sabouraud, Czapek,
PDA) permit totui dezvoltarea unui numr mare de entiti taxonomice aparinnd mai
multor genuri.
n general, principalele componente ale mediilor de cultur sunt reprezentate
de substanele nutritive, agenii revelatori, factorii inhibitori, apa i agenii de
solidificare (n cazul mediilor solide).
Substanele nutritive sau nutrienii sunt reprezentate de o grupare pletoric de
substane chimice care sunt incluse n medii pentru a oferi fungilor: o surs de carbon,
o surs de azot i promotori de cretere (substane minerale, vitamine, acizi grai etc.).
Din punct de vedere al structurii chimice, nutrienii pot fi:
n cazul surselor de carbon:
1. monozaharide (glucoza sau dextroza, fructoza, manoza, galactoza, xiloza,
ramnoza, arabinoza)
2. di- i oligozaharide (zaharoza sau sucroza, lactoza, maltoza, celobioza,
trehaloza, rafinoza)
3. polizaharide (amidon, glicogen, celuloz, chitin etc.)
4. acizi organici (tartric, citric, oxalic, malonic etc.)
5. lipide
n cazul surselor de azot:
1. substane anorganice azotate (nitrai, nitrii, sruri de amoniu)
2. peptide i proteine (pepton, hidrolizat de cazein, gelatin, cazein,
keratin, ovalbumin)
3. aminoacizi (glicin, triptofan, glutamin, histidin .a.)
4. uree
n cazul promotorilor de cretere:
1. substane minerale (sub form de sruri care s conin Na, K, Mg, Ca,
Fe, Cu, Zn, Co, P, S .a.)
2. vitamine (tiamin, acid nicotinic, inozitol etc.)
3. acizi grai cu lan lung de atomi de carbon (C
12
-C
24
), necesari pentru
dezvoltarea levurilor lipodependente ale genului Malassezia.
Se recomand ca n mediile de cultur solide destinate izolrii fungilor,
raportul C:N s fie de 9-12:1. Factorii inhibitori sunt reprezentai de substane ce pot
supresa dezvoltarea unor categorii de microorganisme, mai ales a celor contaminante,
indezirabile n manoperele de izolare i identificare a fungilor cu semnificaie clinic.
Este vorba, n principal, de bacterii i fungi saprobioi, ubicuitari, care alturi de fungii
patogeni sau condiionat patogeni, compun n mod obinuit microflora diverselor
prelevate recoltate din situsuri normal nesterile. Pentru anihilarea dezvoltrii
bacteriilor, se recomand nglobarea n mediile de cultur destinate izolrii fungilor, a
unor substane din grupa antibioticelor (penicilin, streptomicin, cloramfenicol,
gentamicin, ciprofloxacin, tobramicin) sau a coloranilor (cristal violet, Rose
Bengal).
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
43
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Tabelul 3-1
Utilitatea diagnostic a unor medii cromogene
Denumirea mediului i
firma productoare
Specii identificate Aspectul coloniilor
CandiSelect 4
(Bio-Rad)
Candida albicans
Culoare roz-violet, contur
regulat
C. tropicalis
Culoare turcoaz intens,
bombate, contur regulat,
de tip S.
C. glabrata
Culoare turcoaz mai
estompat, strlucitoare,
plate, contur regulat, de
tip S.
C.krusei
Culoare verde-turcoaz,
mate, contur neregulat, de
tip R.
Chromogenic Candida
Agar (Oxoid)
C. albicans
Culoare verde
C. tropicalis
Culoare albastru-nchis
C. krusei
Culoare roz-nchis, mate,
contur neregulat
C. glabrata
Culoare galben-bej
C. parapsilosis
Culoare brun
CHROMagar Candida
(BD Sciences)
C. albicans
Culoare verde-smarald
C. glabrata
Culoare violet-deschis
(lila), mate
C. krusei
Culoare roz-pal,
albicioase la periferie, de
tip R
C. tropicalis
Culoare albastr-verzuie
pn la albastru-metalizat
Candida ID2
(bioMrieux)
C. albicans
Culoare albastr
C. tropicalis
C. lusitaniae
C. kefyr
Culoare roz
Candichrom II
(Elitech, Frana)
C.albicans
Alte levuri
Culoare alb -crem,
colonii lucioase,
albastre verzui
Culoare alb
Agar cu extract de
semine de Niger
(Birdseed Agar)
Cryptococcus
neoformans
Culoare brun
Alte levuri Culoare alb crem
Medii de cultivare
46
Medii de cultivare
M01 Agar acetat Fowell
Compoziie
Acetat de sodiu x 3H
2
O
Agar
Ap purificat
5 g
20 g
ad 1000 ml
Preparare: se dizolv acetatul de sodiu trihidrat n ap, dup care se
ajusteaz pH-ul ntre 6,5-7 nainte de a aduga agarul. Se
nclzete amestecul pn la completa solubilizare a agarului.
Se sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz translucid
pH final la 25C : 6,5-7
Controlul calitii: Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 dezvoltare cu
producere de ascospori
Utilizare: stimularea producerii formelor sexuate la levuri
Stocare: n eprubete, 4 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: nu se comercializeaz.
M02 Agar acetat McClary
Compoziie
Acetat de potasiu
Glucoz
Clorur de sodiu
Sulfat de magneziu
heptahidrat
Extract de drojdie
Agar
Ap purificat
9,8 g
1 g
1,2 g
0,7 g
2,5 g
15 g
ad 1000 ml
Preparare: se dizolv ingredientele n apa prenclzit, nainte de a aduga
agarul. Se nclzete amestecul pn la completa solubilizare a
agarului. Se sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de 15
minute.
Aspect: geloz glbuie, translucid
pH final la 25C : 6,0 0,2
Controlul calitii: Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 dezvoltare cu
producere de ascospori
Utilizare: stimularea producerii formelor sexuate la levuri
Stocare: n eprubete 4 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: nu se comercializeaz.
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
47
C
a
p
i
t
o
l
u
l
C, dup care se
Medii de cultivare
48
repartizeaz n plci Petri. Nu se autoclaveaz. nainte de
utilizare se recomand verificarea sterilitii i a pH-ului.
Aspect: mediu omogen, opalescent, alb-glbui
pH final la 25
0
C: 6,8 0,2
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231 ++
Candida kefyr ATCC 8553 ++
Candida tropicalis ATCC 1369 ++
Utilizare: mediu recomandat pentru izolarea i identificarea speciilor
aparinnd genului Candida. Inocularea se realizeaz din
culturi proaspete, iar incubarea are loc la o temperatur de 25
2C, 18-24 ore (3-5 zile dac este necesar)
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: Becton Dickenson (SUA)
M05 Agar Blasto "D"
Compoziie
Glucoz
Tween 80
Sulfat de potasiu
Citrat de magneziu
Fosfat dipotasic
Asparagin
Aminoacizi de tipul
"Casamino"
Clorur de sodiu
Agar
Ap deionizat
7 g
0,2 ml
0,5 g
1,5 g
5 g
5 g
3 g
0,85 g
15 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele se adaug n apa purificat prenclzit i se fierb
apoi sub agitare pn la completa lor dizolvare. Se sterilizeaz
prin autoclavare la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz clar, transparent
pH final la 25
0
C: 6,6 0,2
Utilizare: transformarea formei filamentoase n form levuric la specia
Blastomyces dermatitidis, prin incubare la 37
0
C.
Stocare: n eprubete 2 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: nu se comercializeaz.
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
49
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Preparare : mediul se gsete sub form ready for use (Sigma Aldrich),
ct i sub form de pulbere pentru prepararea n laborator.
Pulberea se dizolv n ap bidistilat n cantitate de 10,4 g
pentru mediul uzual i 20,8 g pentru mediul dublu concentrat.
Aspect: bulion transparent de culoare roiatic
Utilizare: pentru utilizare, mediul se tamponeaz cu MOPS [3-(N-
morpholino) propanesulfonic acid], concentraia final a
acestuia fiind 0,165 mol/litru. Se obine astfel un pH cu
valoarea 7,0 convenabil dezvoltrii microorganismelor ce vor
fi testate.
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: Sigma Aldrich (Germania).
M40 Agar SABHI
Este un mediu de cultivare disponibil comercial n multiple
variante (cu i fr Cloramfenicol, Gentamicin sau
Cicloheximid) obinut prin amestecul unor cantiti
echivalente de Agar Sabouraud i Agar infuzie cord - creier. Se
recomand pentru cultivarea i izolarea selectiv a fungilor
patogeni.
Disponibil comercial: Remel (SUA), Becton Dickinson (SUA).
M41 Agar Sabouraud cicloheximid
Compoziie
Pepton
Dextroz
Agar
Cicloheximid
Cloramfenicol
Ap distilat
10,0 g
10,0 g
15,5 g
0,4 g
0,05 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat, amestecnd continuu,
cu meninerea temperaturii de fierbere timp de un minut.
Autoclavarea are loc la o temperatur de 115
o
C timp de 15
minute.
Aspect: geloz de culoarea chihlimbarului, transparent
pH final la 25C: 6,9 0,2
Controlul calitii: Aspergillus niger ATCC 16404
Aureobasidium pullulans ATCC 9348
Blastomyces dermatitidis ATCC 56218 +
Candida albicans ATCC 10231 +
Escherichia coli ATCC 25922
Microsporum audouinii ATCC 9079 +
Medii de cultivare
72
Penicillium roquefortii ATCC 9295
Phialophora verrucosa ATCC 10223 +
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Streptomyces rimosus ATCC 10970
Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 +
Utilizare: mediu pentru izolarea selectiv a fungilor rezisteni la
cicloheximid, n special a dermatofiilor
Stocare: n eprubete 2 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: Becton Dickinson (SUA), Merck (Germania), Remel (SUA),
Biokar Diagnostics (Frana).
M42 Agar Sabouraud cloramfenicol
Compoziie
Pepton
Glucoz
Cloramfenicol
Agar
Ap distilat
10 g
40 g
0,5 g
15 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele se adaug n apa distilat prenclzit, apoi
amestecul se fierbe sub agitare pn la completa dizolvare a
acestora; mediul astfel obinut se repartizeaz n eprubete sau
flacoane i se sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de
15 minute.
Aspect: geloz de culoarea chihlimbarului, transparent
pH final la 25 C: 5,6 0,2
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231 ++
Aspergillus niger ATCC 16404 ++
Trichophyton rubrum ATCC 28188 ++
Escherichia coli ATCC 25922
Proteus vulgaris ATCC 13315
Utilizare: izolarea unei game largi de fungi patogeni i oportuniti din
prelevatele patologice
Stocare: n eprubete 4 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: Remel (SUA), Biokar Diagnostics (Frana), Becton Dickinson
(SUA), bioMrieux (Frana).
M43 Agar Sabouraud Emmons
Compoziie
Pepton
Glucoz
Agar
Ap distilat
10 g
20 g
15 g
ad 1000 ml
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
73
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Preparare: ingredientele se adaug n apa distilat prenclzit, apoi
amestecul se fierbe sub agitare pn la completa dizolvare a
acestora. Se ajusteaz pH-ul la valoarea 7,0. Mediul astfel
obinut se repartizeaz n eprubete sau flacoane i se
sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz de culoarea chihlimbarului, transparent
pH final la 25 C: 7,0 0,2
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231 ++
Aspergillus niger ATCC 16404 ++
Trichophyton rubrum ATCC 28188 ++
Escherichia coli ATCC 25922
Proteus vulgaris ATCC 13315
Utilizare: izolarea unei game largi de fungi patogeni i oportuniti din
prelevatele patologice (variantele aditivate)
Stocare: n eprubete 4 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: exist numeroase variante mbuntite cu Cloramfenicol,
Gentamicin, Cicloheximid.
M44 Agar snge - glucoz - cistein
Compoziie
Tripton agar baz
L-cistein
Snge de berbec
defibrinat
Cloramfenicol
Ap deionizat
33 g
1 g
50 ml
0,5 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele (cu excepia sngelui) se solubilizeaz n apa
prenclzit, apoi se autoclaveaz timp de 15 minute la 121C.
Dup autoclavare, mediul se rcete lent la 45-50C, moment
n care se adaug sngele i se omogenizeaz.
Aspect: geloz de culoare roie-vie, opac
pH final la 25
0
C: 7,2 0,2
Controlul calitii: Escherichia coli ATCC 25922 -
Utilizare: mediu de conversie (folosit pentru transformarea formei
filamentoase n cea levuric) pentru identificarea tulpinilor de
Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis,
Paracoccidioides brasiliensis i Sporothrix schenckii.
Stocare: n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: nu se comercializeaz.
Medii de cultivare
74
M45 Agar selectiv cu triptofan
Este un mediu solid cu o compoziie simpl, incluznd ca
ingrediente principale doar L-triptofan (0,01%) i o surs
lipidic. La pH 5 i 37
o
C, permite dezvoltarea selectiv a
speciei Malassezia furfur, cu producerea unui pigment brun ce
difuzeaz n substratul nutritiv subiacent.
M46 Agar Staib (Agar cu infuzie de Niger) Bird seed Agar
Compoziie
Extract apos din semine
de Niger
Glucoz
Fosfat monopotasic
Creatinin
Agar
1000 ml
10 g
1 g
1 g
15 g
Preparare: 50 g semine de Niger (Guizotia abyssinica) se autoclaveaz
ntr-un litru de ap timp de 10 minute la 115C, apoi se
filtreaz. n acest extract apos se adaug restul ingredientelor i
se nclzete pn la completa dizolvare a acestora. Se readuce
volumul la 1000 ml i se autoclaveaz la 121C timp de 15
minute. Mediul se poate aditiva cu cloramfenicol (500 mg/l).
Aspect: geloz de culoare bej, opalescent
pH final la 25C : 5,5- 6,0
Controlul calitii: Cryptococcus neoformans ATCC 14116: colonii brune, cu
aspect mucoid;
Candida albicans ATCC 10231 : colonii netede, lucioase;
Utilizare: mediu diferenial pentru Filobasidiella (Cryptococcus)
neoformans; mediul este util i pentru diferenierea speciilor
Candida albicans (colonii de tip S, lucioase, similare celor de
pe mediile uzuale de cultivare) i Candida dubliniensis
(colonii de tip R, majoritatea cu marginile franjurate).
Stocare: n eprubete 2 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: Becton - Dickinson (USA)
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
75
C
a
p
i
t
o
l
u
l
M60 AM3
(Antibiotic medium 3)
Compoziie
Extract de carne pulbere
Extract de drojdii
Pepton
Dextroz
Clorur de sodiu
Fosfat dipotasic
Fosfat monopotasic
Ap distilat
5,0 g
1,5 g
5,0 g
1,0 g
3,5 g
3,68 g
1,32 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele se dizolv n ap distilat prenclzit sub agitare
continu. Se repartizeaz n tuburi sau flacoane i se
autoclaveaz la 121C timp de 15 minute.
Aspect: mediu transparent de culoarea chihlimbarului
pH final la 25
0
C: 7,0 0,5
Controlul calitii: incubare la 35
0
C 2
0
C / 24 ore
Escherichia coli ATCC 10536 +
Staphylococcus aureus ATCC 6538 +
Candida albicans ATCC 10231 +
Utilizare: mediu destinat depistrii rezistenei la amfotericin prin
metoda benzilor E-test.
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: Becton Dickenson (SUA)
M61 Mediu sintetic pentru testul de filamentare
Compoziie
Glucoz
Fosfat monopotasic
Clorur de calciu
Sulfat de magneziu
Sulfat de amoniu
Ap distilat
0,5 g
2,0 g
0,05 g
0,05 g
0,5 g
ad 1000 ml
Preparare: dup solubilizarea glucozei i a tuturor srurilor, pH-ul se
ajusteaz la 6,75 cu ajutorul unei soluii de hidroxid de potasiu
2M i amestecul se sterilizeaz prin autoclavare
Aspect: mediu lichid, transparent
pH final la 25C: 6,75-6,80
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231 ++
Candida parapsilosis ATCC 22019 ++
Medii de cultivare
84
Utilizare: permite producerea de tubi germinativi la tulpinile de Candida
albicans, prin incubare pe baia de ap, la 37C timp de 4 ore.
Este utilizat pentru trierea selectiv a tulpinilor levurice i
identificarea prezumtiv a speciilor C. albicans i C.
dubliniensis (diferenierea ntre acestea necesit teste
suplimentare).
Stocare: n eprubete 4 luni la 2-8C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: nu este disponibil comercial.
M62 Mediul Bilai
Compoziie
KH
2
PO
4
KNO
3
MgSO
4
x 7H
2
O
KCl
Amidon pudr
Glucoz
Sucroz
Agar
Ap distilat
1 g
1 g
0,5 g
0,5 g
0,2 g
0,2 g
0,2 g
18,0 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat prenclzit, se fierb un
minut, apoi se autoclaveaz la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz albicioas, opalescent
pH final la 25C: nu se determin
Controlul calitii: Fusarium solani ATCC 22278 - dezvoltare cu sporulare
intens
Utilizare: mediul induce formarea conidiilor la Fusarium
Stocare: n eprubete 4 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: nu este disponibil comercial.
M63 Mediu cu lapte diluat
Compoziie
Lapte natural pasteurizat
Cloramfenicol
Ap distilat steril
170 ml
0,250 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele se omogenizeaz sub protecia unei hote cu flux
laminar de clas II i se repartizeaz n flacoane. Este
obligatorie folosirea laptelui pasteurizat UHT, deoarece este
steril.
Aspect: mediu lichid, de culoare alb, opac
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
85
C
a
p
i
t
o
l
u
l
* Trichophyton Agar 3
Compoziie
Aminoacizi Casamino
Difco
Dextroz
Fosfat monopotasic
Sulfat de magneziu
Agar
Inozitol
Tiamina HCL
Ap distilat
2,5 g
40,0 g
1,8 g
0,1 g
15,0 g
50,0 mg
200 g
ad 1000 ml
* Trichophyton Agar 4
Compoziie
Aminoacizi Casamino
Difco
Dextroz
Fosfat monopotasic
Sulfat de magneziu
Agar
Tiamin HCl
Ap distilat
2,5 g
40,0 g
1,8 g
0,1 g
15,0 g
200 g
ad 1000 ml
* Trichophyton Agar 5
Compoziie
Aminoacizi Casamino
Difco
Dextroz
Fosfat monopotasic
Sulfat de magneziu
Acid nicotinic
Agar
Ap distilat
2,5 g
40,0 g
1,8 g
0,1 g
200 g
15,0 g
ad 1000 ml
Medii de cultivare
94
* Trichophyton Agar 6
Compoziie
Nitrat de amoniu
Dextroz
Fosfat monopotasic
Sulfat de magneziu
Agar
Ap distilat
1,5 g
40,0 g
1,8 g
0,1 g
15,0 g
ad 1000 ml
* Trichophyton Agar 7
Compoziie
Nitrat de amoniu
Histidin HCl
Dextroz
Fosfat monopotasic
Sulfat de magneziu
Agar
Ap distilat
1,5 g
30,0 mg
40,0 g
1,8 g
0,1 g
15,0 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele se amestec cu apa distilat pn la completa
dizolvare i se fierb un minut. Se autoclaveaz la 121C timp
de 12 minute.
Aspect: geloz glbuie, uor opalescent
pH final la 25C: 6,8 0,2
Controlul calitii: Trichophyton concentricum ATCC 9358 ++
Trichophyton schoenleinii ATCC 4822 ++
Trichophyton verrucosum ATCC 34470 ++
Utilizare: cultivarea i identificarea speciilor aparinnd genului
Trichophyton
Stocare: n eprubete 4 luni la 2-8C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: Difco (SUA)
M76 Agar pepton 3% (Agar Sabouraud conservare)
Compoziie
Pepton
Agar
Ap distilat
30,0 g
20,0 g
ad 1000 ml
Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat, amestecnd continuu,
cu meninerea temperaturii de fierbere timp de un minut.
Luminia Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mare
95
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
4.1. Tehnici uzuale
a regul general, nsmnarea prelevatelor se poate face prin mai multe
tehnici uzuale:
- epuizare pe medii solide condiionate fie n plci Petri, fie n tuburi (n pant)
asigur separarea fungilor cu semnificaie clinic de cei contaminani i inhib
prin diluare eventualele substane antimicrobiene cu rol antifungic;
- etalare n puncte izolate prin spotare: la unele prelevate paucibacilare sub
form de lichide organice LCR, pasaje din hemoculturi (fig. nr. 4-1 vezi
Anexa), sedimente, fragmente de esut i prin nepare: la fire de pr, scuame,
diverse raclate;
- nglobare n medii solide pretopite i rcite la 45C: la fire de pr, fragmente
unghiale, scuame.
n timpul nsmnrilor se va ine seama de urmtoarele reguli:
- nsmnrile se vor executa n boxe sau hote speciale, care se pot steriliza
periodic i nu permit formarea de cureni de aer n timpul lucrului.
nsmnarea prelevatelor provenite din situsuri normal sterile se va face
preferabil sub protecia unei hote microbiologice clas 2, pentru a preveni
eventuala lor contaminare cu spori fungici ambientali.
- Se evit conversaia i orice micare n jurul operatorului;
- Instrumentul utilizat la nsmnare (ans microbiologic, ac de nsmnare,
pipet etc.) nu se va atinge de obiecte nesterilizate (halat, mas de lucru );
- nsmnrile se vor executa ntr-un timp scurt, pentru a reduce la minim
contactul materialului de nsmnat cu atmosfera ambiant;
- n timpul ct tuburile de cultur sunt deschise, vor fi inute ntr-o poziie oblic,
ct mai aproape de orinzontalitate i cu deschiderea n imediata apropiere a
flcrii becului de gaz;
- Operatorul trebuie s poarte masc de protecie;
- Tuburile i plcile Petri nsmnate se noteaz cu markerul, fr a omite numrul
probei, denumirea abreviat a mediului de cultivare i data nsmnrii.
C
4
Tehnici de nsmnare i transplantare
Tehnici de nsmnare i transplantare
102
nsmnarea se execut n faa flcrii unui bec de gaz care asigur condiii de
antisepsie n timpul aciunii. n micologia medical, produsele patologice se
nsmneaz n mod similar cu cel din bacteriologie. Acul de nsmnare / ansa se
flambeaz i se rcete n ser fiziologic sterilizat, apoi se ia un fragment de produs
patologic ce ader de ac i se depune pe suprafaa mediului de cultur. Din aceeai
prob, se nsmneaz mai multe plci sau tuburi, n puncte separate, cte 3 4
fragmente de cercetat.
Culturile se examineaz zilnic, urmrindu-se aspectul macroscopic (suprafaa,
relieful, culoarea, prezena pigmentrii, consistena i viteza creterii). n timpul
dezvoltrii, coloniile i schimb aspectele macroscopice. Aspectele coloniilor se
noteaz periodic, pentru a surprinde toate caracterele culturale. Paralel se face i
examenul morfologic al fragmentelor de colonii.
ansele de izolare a fungilor cu semnificaie clinic cresc direct proporional
cu numrul probelor nsmnate. Temperatura de incubare dup nsmnare este de
36-37C pentru prelevatele interne / profunde i de 30C pentru cele superficiale.
Atenie! Fragmentele biopsice recoltate din leziuni suspecte de zygomicoz nu
se omogenizeaz cu diluant prin mojarare sau fragmentare, deoarece se distruge
miceliul i cultura va fi fals negativ. Temperatura de incubare recomandat este
37C.
Pentru izolarea levurilor, nsmnarea prelevatelor se face pe Agar Sabouraud
aditivat cu cloramfenicol. Acest mediu permite o bun dezvoltare a levurilor i
supreseaz multiplicarea eventualelor bacterii contaminante. Pentru levurile lipo-
dependente ale genului Malassezia, cultivarea prelevatelor se face fie pe Agarul
Sabouraud cu cloramfenicol pe suprafaa cruia s-a etalat prin striere o fin pelicul de
ulei de msline sterilizat prin autoclavare, fie pe medii speciale (Dixon, Leeming). Pe
Agar Sabouraud cu cloramfenicol, culturile mixte aprute prin asocierea a dou sau
mai multe specii de levuri sunt uneori dificil de observat, de aceea ideal ar fi ca
nsmnarea prelevatelor s se fac pe un mediu diferenial cromogen, care pe lng
discriminarea ntre speciile levurice poate aduce informaii eseniale pentru
identificarea agentului etiologic. Se realizeaz astfel ntr-o singur etap, att izolarea,
ct i identificarea levurii / levurilor incriminate. Pe mediile de izolare, levurile de
interes medical se dezvolt n 24-72 ore de incubare. n funcie de proveniena
prelevatului se va face i alegerea temperaturii de incubare. Pentru prelevatele
provenind din situsuri n care n mod normal temperatura este identic cu cea a
organismului, se va alege temperatura de 37C pentru incubare. n cazul celor
provenind de la nivelul tegumentului sau unghiilor, incubarea se va face att la 37C,
ct i la 30C, deoarece unele levuri cultivabile la 30C dar necultivabile la 37C, pot
avea semnificaie clinic fiind cauza unor micoze superficiale.
n cazul dermatofitozelor, se recomand ca primocultura s se efectueze n
plci Petri i nu n tuburi, deoarece att nsmnarea ct i manoperele ulterioare sunt
mult facilitate. Mediul de elecie pentru izolarea dermatofiilor este Agarul Mycobiotic
(Agar Sabouraud aditivat cu cloramfenicol i cicloheximid); prezena
cloramfenicolului suprim dezvoltarea bacteriilor care pot contamina prelevatul, iar
cicloheximida (Actidione) inhib multiplicarea fungilor contaminani, facilitnd
izolarea dermatofiilor. Materialul patologic se nsmneaz n mai multe puncte
pentru a crete probabilitatea izolrii dermatofiilor i a putea acorda semnificaie
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
103
C
a
p
i
t
o
l
u
l
4.2.2. Tehnica nsmnrii levurilor pe Agarul cu fin de porumb i tween 80
(metoda Dalmau)
Prin cultivare submers pe acest mediu, levurile i exprim plenar toate
detaliile morfologice: blastospori, pseudohife (pseudofilamente), filamente (hife),
clamidospori, artrospori, ascospori. n funcie de gen i specie, aceste formaiuni apar
sau nu i prezint anumite caracteristici utile identificrii. Rezultatele acestui test pot fi
doar rareori utilizate singular; de obicei, ele se coroboreaz obligatoriu cu rezultatele
profilului biochimic al tulpinii n cauz (fermentarea zaharurilor, asimilarea diverselor
surse de carbon sau azot, producerea unor enzime ca ureaza, fenol-oxidaza,
hexozaminidaza, L-prolin-aminopeptidaza, catalaza.
Tehnica de lucru: se pregtesc plci Petri cu o grosime a mediului de 4-5 mm
(cca. 25-30 ml mediu / plac cu 90 mm); dup solidificare, cu ajutorul ansei
microbiologice cu care s-a prelevat n prealabil o mic poriune din colonia levurii de
identificat, se practic 3 incizii ale mediului, dup cum urmeaz: primele dou
paralele ntre ele, la distan de cca. 1-1,5 cm, apoi o aIIIa perpendicular pe celelalte
(fig. nr. 4-3). n timpul nsmnrii mediului, ansa se menine nclinat sub o inciden
de cca. 60-70 fa de orizontal. Poriunea de agar astfel nsmnat se acoper cu o
lamel sterilizat. Dup o incubare de 48-72-96 ore la 25C-30C, placa Petri se
examineaz direct la microscop, formaiunile dezvoltate n mediu fiind observabile
prin traversul lamelei. Alternativ, dup nsmnare, mediul nu se acoper cu lamel,
iar pentru examinare se preleveaz cu ajutorul ansei un bloc de geloz de pe linia de
nsmnare i se etaleaz prin strivire ntre lam i lamel. Se examineaz apoi la
microscop, fr colorare suplimentar, urmrindu-se prezena clamidosporilor, forma i
mrimea pseudohifelor, modul de dispunere a blastosporilor (blastoconidiilor) de-a
lungul acestora.
Fig. nr. 4-3. Tehnica nsmnrii levurilor pe CMA (cultivare submers).
4.2.3. Tehnica de cultivare pe suporturi transparente
Metoda const n plasarea unei lamele sterilizate pe suprafaa gelozei, foarte
aproape de colonia activ. Miceliul va crete peste lamel, care la un anumit interval de
timp poate fi ridicat i examinat la microscop.
Tehnici de nsmnare i transplantare
106
n locul lamelelor se pot folosi ptrate de celofan de mrimea lamelelor,
sterilizate prin autoclavare. Inoculul se depune n mijlocul ptratului de celofan, iar
dup dezvoltarea miceliului, pelicula de celofan se monteaz pe lam i se examineaz
la microscop.
4.2.4. Tehnica de cultivare n pictur suspendat
Inele de sticl cu diametrul de 2 cm i nlimea de 1 cm se imerseaz n
parafin topit i imediat se aeaz pe o lam de sticl sterilizat. n interiorul inelului
de sticl se pune o pictur de ap distilat sterilizat. Lamela de sticl se flambeaz i
n zona central se depune o pictur de bulion Sabouraud, n care se nsmneaz
materialul de cercetat. Marginea superioar a inelului de sticl se greseaz cu lanolin,
se trece prin flacr pentru sterilizare i se aplic apoi lamela cu pictura nsmnat
n jos.
Lamela se examineaz la microscop dup cteva zile de incubaie.
4.2.5. Tehnica de cultivare pe bloc de geloz (cultivarea pe lam)
Cultura pe bloc de geloz (pe lam) este recomandat pentru studierea n
dinamic a morfologiei structurilor de fructificare (generatoare de conidii) la fungii
filamenoi septai (nu ns la cei din genurile Aspergillus i Penicillium). n acest scop,
fungul de identificat se nsmneaz n dou puncte opuse ale unui bloc de geloz
(PDA) de 1 x 1 x 0,5 cm etalat pe o lam de sticl. Dup nsmnare, acesta se
acoper cu o lamel, iar lama se aeaz pe o baghet de sticl n form de U plasat
ntr-o camer umed (de fapt, o plac Petri ce conine un fragment de hrtie de filtru
umectat cu cca. 5 ml ap distilat). Camera umed (fig. nr. 4-4) se incubeaz la 25-
30C, un timp variabil, pn la apariia pe lam a structurilor de fructificare cu
morfologie caracteristic, fapt constatat n urma examinrii microscopice. n final,
blocul de geloz se ndeprteaz, iar din lam, respectiv lamel, se obin prin adugare
de lactofenol i montare, dou preparate extemporanee. Aceste dou preparate obinute
se pot pstra, dac vor fi lutate, timp de aproximativ cinci ani.
Fig. nr. 4-4. Camer umed pentru cultivarea fungilor pe bloc de geloz.
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
107
C
a
p
i
t
o
l
u
l
4.3. Tehnici de transplantare
Prin transplantri sau pasaje se urmrete izolarea n stare pur a fungilor de
interes medical din culturile mixte sau meninerea lor n timp, n condiii de laborator
(tulpini de colecie) i obinerea de colonii monosporale.
Din culturile pe medii lichide, recoltarea materialului de transplantat se poate
face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de nsmnare. Cu pipeta Pasteur se recolteaz o
cantitate din cultura veche, din care se nsmneaz cteva picturi n mediul lichid i
cteva picturi pe suprafaa mediului solid. n cazul transplantrii cu ansa, se introduce
ansa sterilizat n cultura veche, apoi se face nsmnarea pe mediile proaspete (nti
pe mediul lichid i apoi n trei puncte pe mediul solid).
Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa sau cu o
microspatul, lund o cantitate redus de miceliu de la periferia coloniei vechi. Acest
material biologic se transfer pe bulion i pe un mediu agarizat (Agar Sabouraud, PDA,
Agar Czapek Dox, Agar cu extract de mal etc.).
Tehnici de nsmnare i transplantare
108
Bibliografie selectiv
1. Bazgan O (1999) - Diagnostic de laborator i igiena alimentelor de
origine animal; Ed. Moldogrup; Iai.
2. Buiuc D, Negu M (1999) - Tratat de microbiologie clinic; Ed. Medical;
Bucureti.
3. Coman I, Mare M (2000) - Micologie medical aplicat; Ed. Junimea;
Iai.
4. Constantinescu O (1974) - Metode i tehnici n micologie; Ed. Ceres;
Bucureti.
5. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed.
Viaa Medical Romneasc; Bucureti.
6. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines dmarche diagnostique;
Elsevier; Paris.
7. Guho E, Midgley G, Guillot J (1996) - The genus Malassezia with
description of four new species; Antonie van Leeuwenhoek; 69:337-355.
8. Hoog G S de, Guarro J, Gen J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical
fungi; 2
nd
edition; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat
Rovira i Virgili.
9. Ribes J A, Vanover-Sams C L, Baker D J (2000) - Zygomycetes in Human
Disease; Col Rev; 2(13):236-301.
10. Ribes J A, Vanover-Sams C L, Baker D J (2000) Zygomycetes in Human
Disease; Col Rev ; vol. 13(2): 236-301.
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
109
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
xamenul microscopic al fragmentelor de colonii fungice urmrete:
- Aspectul hifelor - septate sau nu;
- Aspectul miceliului - difuz, gros, colorat, incolor;
- Prezena i tipul sporilor sexuai - zigospori, ascospori;
- Prezena corpilor fructificani asexuai (tipul i aspectul sistemului sporal,
aranjarea (mbinarea) conidioforilor i a sporangioforilor, forma, culoarea,
mrimea i eventuala septare a sporului;
- Prezena i tipul unor structuri particulare: rizoizi, stoloni, scleroi, celule Hlle.
Pentru studiul morfologiei microscopice a fungilor obinui n urma
nsmnrii prelevatelor se utilizeaz mai multe tehnici, n funcie de tipul acestora:
- levuri - frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen etc.) sau preparate
extemporanee (ntre lam i lamel) cu tu de India sau lactofenol i albastru
de anilin;
- fungi filamentoi preparate extemporanee cu lactofenol i albastru de anilin,
preparate cu band adeziv sau preparate obinute prin cultivare pe lam.
5.1. Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin (levuri)
Este o metod mai rar utilizat pentru studierea morfologiei levurilor, ns este
uneori preferat pentru expeditivitatea sa, mai ales n cazul levurilor din primoculturi.
n acest scop, pe o lam de microscopie curat i degresat, se depune o pictur de
lactofenol cu albastru de anilin n care se va suspensiona apoi cu micri ct mai fine,
cu ajutorul unei anse microbiologice, o mic poriune din colonia levuric de studiat.
Suspensia astfel obinut se acoper cu o lamel i se examineaz la microscop (x10,
x20, x40, x100 dup caz). Pentru reuita preparatului, este important cantitatea de
material biologic prelevat din colonie; aceasta trebuie s fie cat mai redus, astfel nct
densitatea suspensiei obinute s fie mic.
E
5
Tehnici de examinare microscopic
a fungilor din culturi
Tehnici de examinare microscopic a fungilor din culturi
110
5.2. Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin
(fungi filamentoi)
Se obine parcurgnd urmtoarele etape:
- se depune o pictur de lactofenol pe o lam de microscopie, curat i degresat;
- se preleveaz cu ajutorul unui ac sau al unei microspatule metalice un fragment
de dimensiuni milimetrice din colonia de examinat, se etaleaz n pictura de
lactofenol i se dilacereaz cu micri fine miceliul, utiliznd dou ace;
- se acoper cu o lamel curat, se preseaz, se nclzete uor la flacr pentru a
obine un film ct mai fin de lactofenol i a elimina eventualele bule de gaz;
- se examineaz la microscop, folosind succesiv obiectivele x10, x20, x40,
eventual x100;
- n cazul n care se dorete pstrarea preparatului n lamotec, pentru conservarea
sa, acesta se poate luta (fig. nr. 5-1 vezi Anexa).
5.3. Preparatul extemporaneu cu band adeziv
n acest caz, prelevarea structurilor fungice de la nivelul coloniilor se face cu
ajutorul unui fragment de band adeziv transparent (tip scotch), cu dimensiuni de
1,0-1,5 x 2,5-3,0 cm, cu care se amprenteaz marginea coloniei. Acest fragment de
band adeziv se lipete apoi pe o lam pe care s-a etalat n prealabil o pictur de
lactofenol (fig. nr. 5-2). Opional, peste band se pot etala o nou pictur de lactofenol
i apoi o lamel, n vederea ameliorrii vizibilitii la examinarea microscopic
ulterioar. n cazul coloniilor care sporuleaz intens (Aspergillus spp., Penicillium spp.
etc.) se recomand pregtirea a 2-3 preparate cu band adeziv din acelai loc prima
va fixa sporii, iar urmtoarele vor recolta conidioforii, astfel nct prin examinarea
ulterioar s fie surprinse toate aspectele utile ncadrrii taxonomice.
Fig. nr. 5-2. Obinerea preparatului extemporaneu cu band adeziv
180
scotch
lam
lamel
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
111
C
a
p
i
t
o
l
u
l
O alt variant a tehnicii presupune etalarea fragmentului de band adeziv pe
o lamel cu o pictur de lactofenol, adugarea peste aceasta a unei alte picturi de
colorant i apoi a lamei de microscopie. Preparatul se rotete apoi cu 180 pentru a-l
aduce n poziia de examinare. Prin acest procedeu, claritatea imaginii este maxim
datorit faptului c ntre ochiul examinatorului i structurile fungice se interpune doar
lamela, nu i banda scotch ca n tehnicile anterioare.
5.4. Lutarea preparatelor extemporanee
Etanarea sau lutarea preparatelor este necesar pentru a evita evaporarea
lichidului de montare. Suprafeele lamei i lamelei, pe care se aplic substanele de
etanare, trebuie s fie perfect uscate i curate. Substanele folosite la etanare nu
trebuie s reacioneze cu lichidul de montare, s fie impermeabile, elastice, persisente
i s adere de suprafaa sticlei.
Rinile naturale
Se pot folosi pentru lutare colofoniul, guma arabic, erlacul, balsamul de
Canada.
Lacul pentru unghii este cel mai utilizat la etanarea preparatelor deoarece se
usuc repede i se manipuleaz uor. Se ndeprteaz excesul de lichid de montare de
pe lam i lamel, prin tergere cu un fragment de hrtie de filtru. Cu un penson se
aplic un strat subire de lac peste marginea lamelei i suprafaa lamei din imediata
apropiere a acesteia. Se las s se usuce, apoi se poate stoca.
Cimentul Thorner, cunoscut sub denumirea de Glyceel este format din:
- ulei polimerizat .......................... 31,75 ml
- alcool metilic industrial ................ 4,76 ml
- acetat de butil ............................. 20,41 ml
- toluen (fr sulf) ......................... 20,41 ml
Glyceelul este un lichid siropos, incolor, se usuc repede, formnd o pelicul
elastic, rezistent i care ader bine de sticl.
Amestecul de cear galben de albine i colofoniu
20 g cear de albine se topesc ntr-o capsul de porelan, apoi se adaug treptat
80 g colofoniu i se nclzesc pn la topirea complet. Amestecul se aplic cu o
spatul pe marginile lamei i lamelei montate. nainte de fiecare folosire, amestecul se
retopete.
Amestecul de colofoniu i lanolin (60%, respectiv 40%)
Se omogenizeaz prin topire, apoi se distribuie n plci Petri i se las la
solidificare. n momentul folosirii, se lichefiaz cu ajutorul aplicatorului nclzit la
flacr. Se folosete similar cu celelalte lichide de lutare.
Tehnici de examinare microscopic a fungilor din culturi
112
Bibliografie selectiv
1. Bazgan O (1999) - Diagnostic de laborator i igiena alimentelor de
origine animal; Ed. Moldogrup; Iai.
2. Buiuc D, Negu M (1999) - Tratat de microbiologie clinic; Ed. Medical;
Bucureti.
3. Coman I, Mare M (2000) - Micologie medical aplicat; Ed. Junimea;
Iai.
4. Constantinescu O (1974) - Metode i tehnici n micologie; Ed. Ceres;
Bucureti.
5. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed.
Viaa Medical Romneasc; Bucureti.
6. Harris J (2000) - Safe, low-distortion tape touch method for fungal
mounts; J Clin Microbiol; 38(12):4683-4684.
7. Hoog G S de, Guarro J, Gen J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical
fungi; 2
nd
edition; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat
Rovira i Virgili.
Petru Cazacu
113
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Petru Cazacu
ragmentele de esut recoltate de la pacient n vederea diagnosticului trebuie
procesate n laboratorul de histopatologie pentru a obine preparate
permanente care vor fi examinate microscopic de ctre morfopatolog. Fragmentele de
esut pot fi recoltate prin biopsie, prin exerez chirurgical i prin autopsie. Procesarea
esuturilor n vederea diagnosticului histopatologic presupune o suit de operaiuni i
tehnici care vor permite vizualizarea elementelor fungice intratisulare i / sau a
leziunilor specifice determinate de acestea.
6.1. Obinerea probelor
Probele de esut primite n laboratorul de histopatologie trebuie s fie nsoite
de un formular de cerere a examenului de laborator n care vor fi specificate datele
pacientului i istoricul bolii, precum i descrierea zonei de origine a fragmentului de
esut. Probelor primite li se va atribui un numr care va identifica fiecare prob pentru
fiecare pacient. Acest numr va corespunde cu numrul de ordine din registrul
laboratorului.
6.2. Examenul macroscopic
Examinarea macroscopic const n descrierea probelor, alegerea zonelor
relevante pentru diagnostic i introducerea lor (total sau parial) n mici casete din
plastic, unde vor sta pe toat durata procesrii iniiale, pn n momentul includerii n
parafin. Iniial, casetele sunt plasate ntr-un fixator.
6.3. Fixarea
Fixarea are scopul de a conserva morfologia esuturilor aa cum se prezint ea
n momentul recoltrii. Fixarea trebuie realizat ct mai curnd posibil dup prelevarea
probelor de esut pentru a preveni autoliza. Nu exist un fixator perfect, dei
formaldehida este considerat aproape un gold standard. Exist o varietate de
fixatori, care se vor folosi n funcie de tipul de esut.
F
6
Tehnici de histopatologie
Tehnici de histopatologie
114
Factorii care influeneaz procesul fixrii:
-soluia-tampon;
-penetrarea;
-volumul piesei vs. volumul fixatorului;
-temperatura;
-concentraia fixatorului;
-intervalul de timp.
Fixarea trebuie realizat la un pH aproape de neutralitate, adic ntre 6 i 8.
Datorit hipoxiei esuturilor, fixatorul trebuie s aib capacitatea de a tampona
aciditatea acestora prevenind dehiscena lizozomal i autoliza tisular consecutiv
acesteia. Aciditatea favorizeaz formarea de pigment hem - formol care apare colorat
n negru, prin depuneri polarizate n esuturi. Soluiile-tampon includ fosfatul de sodiu,
bicarbonatul de sodiu, cocodilatul de sodiu i veronalul. Formolul comercial este o
soluie de formaldehid n tampon fosfat cu pH 7.
Penetrarea esuturilor depinde de difuzibilitatea fiecrui fixator. Formolul i
alcoolul penetreaz foarte bine, iar glutaraldehida foarte prost. Ceilali fixatori au un
grad intermediar de penetrabilitate tisular. O posibilitate de a rezolva acest
inconvenient este secionarea ct mai fin a esuturilor (2-3 mm grosime), deoarece
penetrarea unei seciuni subiri va fi mult mai rapid dect cea a unei seciuni mai
groase.
Volumul de fixator este de asemenea extrem de important. Acesta trebuie s fie
n raport de 10:1 (fixator-esut). Se recomand schimbarea fixatorului la diferite
intervale de timp pentru a evita o eventual scdere a volumului acestuia. Agitarea
probelor n fixator va intensifica fixarea.
Creterea temperaturii, ca n cazul tuturor reaciilor chimice, va crete viteza de
fixare, dar se va avea totui n vedere s nu degradeze esuturile. Formolul fierbinte va
fixa esuturile mai repede i acesta este adesea primul pas n procesarea automatizat a
esuturilor.
Concentraia fixatorului va fi cea mai redus concentraie activ, acest fapt
reprezentnd i un avantaj economic. Formolul este cel mai activ la 10%;
glutaraldehida este n general activ la concentraii de 0,25-4%. Concentraiile prea
ridicate pot avea efect advers asupra esuturilor producnd artefacte asemntoare cu
cele ale creterii temperaturii fixatorului.
De asemenea, foarte important este intervalul de timp recomandat pentru
meninerea probelor n afara fixatorului. Dup fixare, probele vor fi prelucrate rapid
deoarece prin deshidratare se vor produce artefacte. esuturile meninute temporar n
afara vasului cu fixator, se vor umezi cu ser fiziologic.
Tipul fixatorului indicat este dat de tipul de esut i de detaliile histologice care
urmeaz a fi vizualizate. Formolul este utilizat pentru toate esuturile recoltate
chirurgical i necropsic, cnd se dorete obinerea unor preparate colorate H-E.
Formolul este cel mai puin pretenios dintre toi fixatorii atunci cnd condiiile de
fixare nu sunt cele ideale, el dunnd aproape neglijabil esutului respectiv. Pentru
fixarea esuturilor n vederea procesrii lor pentru diagnosticul histopatologic al
micozelor profunde se folosesc frecvent urmtorii fixatori: soluia de formol 10%
tamponat pH 6,8, fixatorul Bouin i fixatorul Hollande. Pentru fixarea frotiurilor
Petru Cazacu
115
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Reactivi
Acetat de cupru .............................................. 75 mg
Ap distilat ................................................ 3000 ml
Acid picric ................................................... 120 mg
Formaldehid ................................................ 300 ml
Acid acetic glacial .......................................... 45 ml
Se dizolv acetatul de cupru n ap fr nclzire, apoi se adaug treptat acidul
picric. Se amestec pn se dizolv complet. Se adaug formaldehida i acidul acetic.
Se eticheteaz i se dateaz.
Atenie! Soluia este carcinogen, iritant i coroziv.
Timpul de fixare
Probele de dimensiuni mici 2-4 ore, iar cele mai mari pn la 3 zile.
Tehnica fixrii
1. Probele biopsice sunt imersate imediat n fixatorul Hollande, notndu-se timpul
pe recipient;
2. Cnd fixarea este complet, proba de esut se trece apoi n etanol 70%;
3. Nu se permite ca probele fixate cu Hollande s vin n contact cu soluia de
formol 10%, deoarece poate determina apariia unui precipitat albastru.
Note:
1. Se lucreaz ntr-un spaiu bine ventilat sau n nia chimic, se poart mnui, halat i
ochelari de protecie. Se evit contactul i inhalarea.
2. Acidul picric poate exploda dac se usuc. Este toxic prin expunere cutanat.
3. Formaldehida este iritant puternic pentru ochi i piele. Este toxic prin ingestie i
inhalare. Afecteaz aparatul respirator. Este coroziv i carcinogen. Se eticheteaz
cu: ATENIE FORMALDEHID !
4. Acidul acetic afecteaz aparatul respirator. Este coroziv.
6.4. Procesarea esuturilor
Odat ce esuturile au fost fixate, ele trebuie nglobate ntr-o form care s
permit manipularea i efectuarea unor seciuni seriate foarte subiri. Cel mai folosit
material n acest scop este parafina. esuturile incluse n parafin pot fi secionate n
fragmente cu grosimi de la 3 la 10 m, uzual 4-6 m. Tehnica de includere n parafin
a esuturilor fixate se numete Procesarea esuturilor. Paii principali ai acestui
proces sunt deshidratarea i clarificarea.
- esuturile fixate umed (n soluii apoase) nu pot fi direct impregnate cu parafin
deoarece aceasta nu este miscibil cu apa. De aceea, esuturile trebuie
deshidratate. Aceasta se realizeaz de obicei cu ajutorul unor soluii de etanol,
de concentraii crescnde - 70%, 95% i 100%. Uneori, primul pas este tratarea
cu un amestec format din formol i etanol. Pot fi utilizai i ali deshidratani,
dar unii prezint dezavantaje majore: acetona dei este foarte rapid, este
inflamabil, de aceea se poate utiliza doar pentru mici seturi de esuturi
Tehnici de histopatologie
118
procesate manual. Dioxanul poate fi utilizat fr clarificare, dar vaporii si sunt
toxici.
- Etapa urmtoare se numete Clarificare i const n ndeprtarea
deshidratantului cu o substan care va fi miscibil cu mediul de includere
(adic cu parafina). Xilenul este agentul de clarificare cel mai frecvent
ntrebuinat. Toluenul clarific bine i este mult mai tolerant fa de cantitile
mici de ap rmase n esuturi, dar este de 3 ori mai costisitor dect xilenul.
Cloroformul acioneaz lent i este periculos pentru cei care-l manipuleaz.
Salicilatul de metil este rar utilizat datorit costului ridicat.
n final, proba de esut este impregnat cu agentul de includere care aproape
ntotdeauna este parafina. Parafina poate avea diferite puncte de topire, ceea ce permite
obinerea unor grade variate de duritate. Un produs numit Paraplast conine un adaos
de plastifiani care fac ca blocurile de parafin s fie mai uor de procesat de ctre
tehnologi n vederea secionrii. Pentru a asigura o mai bun penetrare a esutului de
ctre agentul de includere, n interiorul procesatorului de esuturi se poate crea o
presiune negativ cu ajutorul unei pompe de vacuum.
Procedurile de mai sus sunt aproape ntotdeauna automatizate pentru un volum
mare de probe ce trebuie procesate de rutin. Automatizarea const ntr-un dispozitiv
circular, programabil, care imerseaz succesiv probele de esut n diferite bi de
deshidratare i clarificare, dup o scal de timp presetat.
Dup procesarea probelor n procesatorul de esuturi, acestea sunt nc n
casete, urmnd a fi incluse n parafin lichid. Procesul este foarte important deoarece
esuturile trebuie orientate corespunztor n momentul includerii pentru a asigura
obinerea ulterioar a unor seciuni de calitate. O alternativ pentru includerea n
parafin este folosirea diverselor mase plastice care permit obinerea unor seciuni
subiri. Astfel de mase plastice sunt meta-acrilatul de metil, meta-acrilatul glicol i
eponul. Materialele plastice necesit reactivi speciali pentru deshidratare i clarificare,
de obicei foarte costisitori. Pentru secionarea acestor blocuri este necesar un microtom
special. Blocurile trebuie s fie mici, tehnica pretndu-se de exemplu pentru biopsiile
hepatice sau cerebrale.
6.4.1. Deshidratarea
1. Dac piesa de esut a fost imersat n ap dup scoaterea din fixator, ea trebuie
s fie transferat n etanol 30%, 1-2 ore;
2. Etanol 50%, 1-2 ore;
3. Etanol 70%, 1-2 ore;
4. Etanol 95%, 1-2 ore;
5. Etanol 100%, 1-2 ore;
6. Etanol 100%, 1-2 ore;
7. esuturile deshidratate vor fi pregtite pentru clarificare, adic se scot piesele
histologice din etanol i se trec n toluen.
Not: Etanolul absolut produce o deshidratare foarte rapid a esuturilor: pentru a avea
aceast siguran, flacoanele cu etanol se vor pstra nchise etan.
Petru Cazacu
119
C
a
p
i
t
o
l
u
l
6.4.2. Clarificarea
1. Se transfer piesele histologice din etanol 100% ntr-un amestec constituit din o
parte toluen i 3 pri etanol 100%, 1 or;
2. Se trec apoi n amestecul de 1:1 toluen-etanol 100%, 1 or;
3. Apoi n amestecul de 3:1 toluen-etanol 100%, 1 or;
4. Toluen 100%, 3-4 ore;
5. Toluen 100%, 3-4 ore;
6. Dup clarificare, esuturile sunt gata pentru impregnare cu parafin.
Not:
Agenii de clarificare, cum ar fi etanolul, trebuie introdui lent pentru a preveni
degradarea esuturilor. Aceste amestecuri de toluen i etanol permit n plus i ndeprtarea
oricror urme de ap. Flacoanele se nchid etan. Apariia unei turbiditi a soluiilor sau a
unor pete opace pe esuturi sunt indicatori siguri ai deshidratrii incomplete. n ambele cazuri,
lamele cu seciuni se reintroduc n etanol 100% pentru o deshidratare suplimentar, apoi se
continu cu bile de toluen - etanol. Insuficienta ndeprtare a alcoolului va determina
imposibilitatea impregnrii cu parafin n zonele respective ale esutului, ceea ce va produce
dificulti de secionare. Actualmente, exist numeroi ageni de clarificare disponibili
comercial (Histosolve, Americlear etc.) care sunt mai puin toxici i au un miros mai plcut
dect toluenul sau xilenul.
6.4.3. Impregnarea cu parafin
1. Se transfer esuturile din agentul de clarificare ntr-un nou flacon cu un amestec
prenclzit de parafin - toluen 1:2. Se acoper etan flaconul i se las la
etuv, la 45C, timp de 1 or;
2. Se transfer esuturile ntr-un al doilea flacon care conine un amestec nclzit de
parafin - toluen 1:2. Se acoper flaconul i se meine la 45C timp de 1 or;
3. Se transfer piesele apoi n prima baie de parafin pur. Aceasta este un flacon
cu parafin lichid care se menine n etuv setnd o temperatur superioar
punctului de topire al parafinei. Piesele se menin n aceast baie timp de 2-4
ore;
4. Se transfer piesele n a doua baie de parafin, unde se menin nc 2-4 ore;
5. Se includ (pasul urmtor).
Not:
O alternativ a metodei de impregnare:
1. Se introduce piesa histologic n agentul clarificator proaspt i apoi se adaug
parafin pn la saturarea clarificatorului. Se las n repaus 1 or la 30C 60C,
apoi se mai adaug parafin i se las peste noapte. n dimineaa urmtoare, se
adaug parafin pn cnd amestecul conine aproximativ 75 % parafin, apoi se
menine 1 or la 45C.
2. Se trece piesa apoi direct prin 2 bi de parafin pur.
Tehnici de histopatologie
120
6.4.4. Includerea
1. Se lubrifiaz interiorul barelor Leuckart, al sticlelor de ceas sau al diferitelor
tvie metalice cu un amestec de etanol 60% - glicerin 9:1. Acesta va preveni
aderarea parafinei la recipientul ce constituie forma de turnare a blocurilor.
Acest lucru nu este necesar dac se utilizeaz matrie de hrtie.
2. Se rcete matria prin meninerea prii sale inferioare pe ghea cteva minute.
3. Se scoate recipientul cu parafin topit din etuv i se vars n matri.
4. Se introduce esutul n matri cu ajutorul unei pense hemostatice nclzite i se
verific dac piesa a fost orientat corect. n funcie de dimensiunea matriei,
se pot include simultan mai multe piese (1-10) obinndu-se un numr
echivalent de blocuri. Etichetele din hrtie sunt ataate n parafin, la marginea
matriei, n dreptul piesei histologice.
6.4.5. Secionarea
Dup includere, esuturile trebuie secionate pentru a putea fi etalate pe lam.
Secionarea se realizeaz cu un microtom, la grosimi de 4-6 m. Pentru realizarea unor
seciuni corespunztoare este necesar ca lama cuitului s fie perfect ascuit; se prefer
utilizarea cuitelor single use. Odat obinute seciunile, acestea se depun pe suprafaa
apei dintr-o baie de ap prenclzit, fapt care ajut la deplierea panglicii secionate.
Fragmentele de panglic sunt recuperate cu ajutorul unei lame de microscopie. Lama
cu seciunea etalat este apoi plasat ntr-o etuv timp de aproximativ 15 minute pentru
ca, prin topirea parial a parafinei, seciunile s adere mai bine la lam.
1. Blocurile de parafin cu piesele incluse, se secioneaz rectangular pe lng
esut, lsndu-se civa milimetri de parafin pe fiecare fa a blocului;
2. Urmeaz o nou fasonare a blocului cu ajutorul unei lame de ras. Se va ndeprta
mai nti parafina de pe faa de secionare la microtom, ct mai aproape de
esutul din bloc. Urmtoarele secionri se vor face pe celelalte fee ale
blocului, n aa fel ca acestea s devin paralele una cu alta. Se va lsa
suficient parafin la baza blocului astfel nct acesta s poat fi ataat la
obiectiv. Tierea bazei blocului se va face n aa fel nct ea s fie paralel cu
faa de secionare;
3. Se ataeaz blocul de parafin la discul obiectiv. Se depune un mic fragment de
parafin pe discul obiectiv i se modeleaz cu o spatul nclzit prin flambare
la un bec de gaz. Se las ca stratul de parafin s se rceasc, apoi se pregtesc
cele dou suprafee (baza blocului i suprafaa obiectului) n vederea aderrii
prin topirea stratului superficial de parafin (se ating cele dou suprafee timp
de cteva secunde cu spatula bine nclzit). Se preseaz apoi blocul de
parafin pe discul obiectiv i se las n repaus pentru solidificare;
4. Se fixeaz discul obiectiv cu blocul ataat n mandrina microtomului, se
ajusteaz poziia n aa fel ca blocul s fie paralel cu tiul cuitului de
microtom;
5. Ajustarea unghiului cuitului se face prin ncercri succesive. Unghiul diedru
format de faa cuitului i faa blocului trebuie s fie de aproximativ 5 grade.
Petru Cazacu
121
C
a
p
i
t
o
l
u
l
6.4.7. Colorarea
Procesul de includere n parafin, necesar secionrii pieselor, trebuie urmat de
deparafinarea seciunilor etalate pe lam astfel nct s fie permis penetrarea
coloranilor hidrosolubili. Lamele cu seciuni se deparafineaz prin trecerea succesiv
n bi de xilen (sau nlocuitori), alcool etilic i ap. Tehnicile de colorare sunt diverse
i se selecteaz n funcie de abilitatea lor de a colora diferite componente celulare i
esuturi. Coloraia de rutin este Hematoxilin-Eosin (HE), celelalte metode de
colorare sunt coloraii speciale, pentru c se utilizeaz n situaii specifice conform
nevoilor de diagnostic.
6.4.7.1. Coloraia Hemalaun Eozin
Scop
Aceasta este cea mai comun coloraie histologic i histopatologic utilizat
pentru studierea de ansamblu a citoarhitectonicii tisulare. n cazul micozelor profunde,
permite aprecierea leziunilor la nivel microscopic, ns are o valoare diagnostic redus
pentru decelarea speciei implicate. Hemalaun-Eozin este o metod de colorare de
rutin, dar care necesit o execuie atent pentru a asigura obinerea unor rezultate
corecte i uniforme. Evideniaz elemente fungice aparinnd genurilor Pneumocystis,
Blastomyces, Coccidioides, dar i unele aspecte din cromomicoze, rinosporidioz,
adiaspiromicoz, ca i fenomenul Splendore-Hoeppli sau culoarea original a fungilor
dematiacei (pigmentai).
Fixator
Se obin rezultate excelente, comparabile, folosind diveri fixatori
Tehnica de secionare
Seciuni cu grosimea de 4-5 m, din fragmente de esut incluse n parafin
Echipament
Sticlrie de laborator, timer de laborator
Reactivi
Hematoxilina Ehrlich (1886)
Hematoxilin ...................................................... 2 g
Etanol 95% ................................................... 100 ml
Ap distilat .................................................. 100 ml
Glicerin ....................................................... 100 ml
Alaun de potasiu, n exces ..................... aprox. 20 g
Acid acetic ...................................................... 10 ml
Tehnici de histopatologie
124
Hematoxilina Harris
Hematoxilin ................................................... 5,0 g
Etanol 95% .................................................. 50,0 ml
Alaun de potasiu .......................................... 100,0 g
Ap distilat ................................................ 1000 ml
Oxid de mercur ................................................ 2,5 g
Se dizolv hematoxilina n etanol i alaunul n ap cu ajutorul cldurii. Se
amestec cele dou soluii. Amestecul se aduce la fierbere ct mai repede posibil i
apoi se adaug oxidul de mercur. Se continu fierberea pn cnd apare o culoare
purpurie intens (rou-nchis, violet), apoi se introduce recipientul ntr-o baie de ap
pn la rcirea complet. Dup rcire, se adaug 40 ml de acid acetic glacial. Cnd se
observ o strlucire aurie a soluiei, aceasta se filtreaz. Dac aceast strlucire nu
apare, coloraia va fi de calitate inferioar.
Hematoxilina Mayer
Hematoxilin ................................................... 5,0 g
Ap distilat ............................................... 700,0 ml
Alaun de potasiu ............................................ 50,0 g
Glicerin .................................................... 300,0 ml
Iodat de sodiu .................................................. 0,4 g
Acid acetic glacial ....................................... 20,0 ml
Se dizolv hematoxilina ntr-o cantitate redus de ap, apoi alaunul n
aproximativ 650 ml de ap distilat. Se amestec cele dou soluii i se completeaz
pn la 700 ml. Se adaug iodatul de sodiu n soluie, dup care aceasta se nclzete
blnd pentru a grbi oxidarea hematoxilinei. Soluia se las la rcit pentru o jumtate
de or, se filtreaz, apoi se adaug acidul acetic glacial i glicerina. Soluia poate fi
utilizat imediat i este stabil 2-3 luni.
Soluia de albstrire Scott
Sulfat de magneziu ........................................ 20,0 g
Bicarbonat de sodiu ......................................... 3,5 g
Ap distilat ................................................ 1000 ml
Se dizolv srurile separat, apoi se amestec soluiile i se adaug un cristal de
timol.
Alcool - acid 0,5 %
Etanol 70% ................................................ 100,0 ml
HCl ................................................................ 0,5 ml
sau
Petru Cazacu
125
C
a
p
i
t
o
l
u
l
HCl ................................................................... 3 ml
Etanol 95% ..................................................... 97 ml
Se adaug acidul clorhidric peste alcool.
Eozin Y - alcoolic, soluia stoc
Eosin Y, solubil n ap i alcool ................... 2,5 g
Ap distilat ............................................... 500,0 ml
Acid clorhidric concentrat ................................ 4 ml
Se dizolv eozina (tetrabromfluorescein de sodiu) n ap i se adaug treptat
acidul clorhidric care se va combina cu sodiul. Precipitatul rezultat este forma acid a
tetrabromfluoresceinei, insolubil n ap. Se las precipitatul s se stabilizeze i apoi se
decanteaz supernatantul fluid. Se adaug aproximativ 500 ml ap distilat peste
precipitat i se agit pn cnd colorantul se afl complet n suspensie, apoi se las n
repaus pentru sedimentare. Se repet procesul de splare de aproximativ 6 ori, pn
dispar toate urmele de ioni de sodiu i clor. Se filtreaz i apoi se las hrtia de filtru
mpreun cu colorantul la uscat n etuv (max. 60C). Ponderea pulberii de colorant
dizolvate n 100 ml de etanol 95% este de 0,5 g. Se filtreaz i se stocheaz ntr-un
recipient transparent cu dop rodat. Tratnd eozina astfel, se va obine un colorant cu o
putere tinctorial mai mare, colorantul fiind mult mai stabil n alcool.
Pentru utilizare se dilueaz 1:5 n etanol 95%.
Tehnica de colorare
1. Deparafinarea i hidratarea cu ap distilat a seciunilor;
2. Se imerseaz preparatele ntr-una din soluiile de hematoxilin, un timp variabil,
conform variantei de hematoxilin ntrebuinate: 5-10 minute pentru
hematoxilina Mayer, 5 minute pentru hematoxilina Harris i 15 minute pentru
hematoxilina Ehrlich;
3. Se spal lamele cu ap distilat, apoi se introduc n soluia de albstrire Scott
pentru 1-2 minute. Se cltesc n ap distilat i se examineaz la microscop.
Seciunea trebuie s fie supracolorat;
4. Se difereniaz cu alcool - acid 0,5% pentru a ndeprta excesul de colorant din
fond, lsnd colorai numai nucleii;
5. Cltire cu ap distilat i apoi reimersare n soluia de albstrire Scott pentru
nc 1-2 minute;
6. Se reexamineaz la microscop i dac seciunile sunt suficient decolorate se
continu cu pasul urmtor. Dac seciunea este insuficient difereniat atunci se
repet paii 4 i 5;
7. Splare n ap de robinet 5-10 minute;
8. Colorare cu eozin alcoolic (se las lamele cu seciuni n soluia de colorare
pn cnd acestea sunt uor supracolorate);
9. Cltire n 2 bi de etanol 95%;
10. Difereniere n alcool absolut pn cnd se obine o coloraie optim;
Tehnici de histopatologie
126
11. Deshidratare ntr-o baie de alcool absolut;
12. Clarificare n cteva bi de xilol;
13. Montarea lamelelor cu balsam de Canada, Xam sau alte medii neutre de
montare care sunt miscibile cu xilolul.
Rezultatul colorrii
Nucleii albastru purpuriu
Hematiile rou
Celulele musculare roz intens
Fibrele de colagen roz
Not:
Pentru realizarea coloraiei Hematoxilin-Eozin, se poate folosi oricare din soluiile
de hematoxilin prezentate la reactivi.
6.4.7.2. Albastru Alcian pH 2,5 pentru mucopolizaharide acide
Scop
Coloraia cu Albastru Alcian pune n eviden mucopolizaharidele acide. Se
poate utiliza pentru evidenierea mucopolizaharidelor capsulare la Cryptococcus
neoformans. Este o metod destul de eficient pentru diferenierea criptococilor
capsulai tipici de ali patogeni yeast-like, cu form i dimensiuni similare.
Fixator
Formol 10% tamponat pH 6,8, Bouin sau Hollande
Tehnica de secionare
Seciuni cu grosimea de 4 m, din fragmente de esut incluse n parafin
Echipamente
Pahare Berzelius, pH-metru, cuptor cu microunde, microscop
Reactivi
Acid acetic 3%
Acid acetic glacial ............................................ 3 ml
Ap distilat ............................................. ad 100 ml
Soluia este stabil 1 an.
Soluie Albastru Alcian
Acid acetic glacial 3% .................................. 100 ml
Albastru Alcian 8GX .......................................... 1 g
Petru Cazacu
127
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Se amestec cele dou ingrediente apoi se ajusteaz pH-ul la 2,5, utiliznd acid
acetic. Se filtreaz i se adaug un cristal de timol, apoi se eticheteaz i se dateaz.
Soluia este stabil 2 pn la 6 luni.
Atenie! Conine acid, evitai contactul i inhalarea.
Nuclear fast red (Kernechtrot)
Sulfat de aluminiu...25,0 g
Ap distilat.......500 ml
Nuclear fast red.0,5 g
Se dizolv sulfatul de aluminiu n ap. Se adug Nuclear fast red i se dizolv
prin nclzirea soluiei. Se filtreaz i se adaug un cristal de timol. Soluia este stabil
timp de 1 an.
Atenie! Iritant - se va evita contactul i inhalarea.
Tehnica de colorare
1. Se hidrateaz preparatul n ap distilat;
2. Se introduc lamele n acid acetic 3%, 3 minute;
3. Se introduc preparatele n soluia de albastru Alcian, la cuptorul cu microunde
(la o treapt superioar), timp de 30 secunde; n metoda convenional, soluia
de albastru Alcian cu lamele, se menine la temperatura camerei, timp de 30
minute;
4. Se spal lamele cu ap de robinet 2 minute i apoi se cltesc n ap distilat;
5. Se coloreaz cu Nuclear fast red, 5 minute, apoi se spal n ap de robinet;
6. Se deshidrateaz, se clarific i se monteaz lamela.
Rezultatul colorrii
Mucopolizaharidele acide: albastru
Nucleii: roz-roiatic
Note:
1. Nu este o coloraie specific pentru capsula C. neoformans, deoarece s-a constatat c
peretele altor fungi ca Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis sau
Rhinosporidium seeberi pot fixa colorantul; ns, datorit diferenelor morfologice
certe, aceti fungi nu pot fi confundai cu C. neoformans.
2. Albastru Alcian face parte din grupul coloranilor bazici polivaleni solubili n ap.
Culoarea albastr se datoreaz prezenei cuprului n moleculele sale. Soluia de acid
acetic glacial 3% (pH 2,5) i soluia de albastru Alcian coloreaz mucopolizaharidele
acide sulfatate i carboxilate dar i sialomucinele (glicoproteinele) sulfatate i
carboxilate. Se crede c srurile formeaz legturi cu gruprile acide ale acizilor
mucopolizaharidici.
3. Pentru siguran se poart mnui, ochelari de protecie i halat. Se adug acidul
acetic n ap. Coloraia se face sub hot. Se evit contactul i inhalarea coloranilor.
Acidul acetic este iritant pentru aparatul respirator. Este de asemenea coroziv.
Tehnici de histopatologie
128
6.4.7.3. Coloraia Bauer
Scop
Coloraia Bauer pune n eviden glicogenul, diferite mucosubstane i fungii
Fixator
Este recomandat formolul 10% tamponat pH 6,8, dar se pot folosi i ali
fixatori. Majoritatea coloraiilor tricromice necesit ca fixatori acidul picric sau clorura
mercuric. Formolul fixeaz bine esuturile, dar pentru obinerea unei coloraii de
calitate superioar se recomand o fixare secundar cu lichidul Bouin.
Tehnica de secionare
Seciuni cu grosimea de 5 m, din fragmente de esut incluse n parafin
Echipament
Sticlrie de laborator, microscop
Reactivi
Reactiv Schiff de Tomasi
Fucsin bazic .................................................... 1 g
Ap distilat ............................................. ad 200 ml
Metabisulfit de potasiu ....................................... 1 g
Acid clorhidric 1N .......................................... 20 ml
Crbune activat (pulbere) ................................... 2 g
Se nclzete apa distilat pn la fierbere ntr-un flacon Erlenmeyer de
dimensiuni mari. Se ndeprteaz flaconul de pe sursa de cldur i se adaug imediat
colorantul, cu grij, pentru c dizolvarea are loc cu efervescen. Se agit pn la
dizolvarea colorantului. Se las soluia s se rceasc pn la 50C, apoi se adaug
acidul clorhidric i se omogenizeaz. Se las n continuare soluia la rcit pn la 25C,
moment n care se adaug metabisulfitul de potasiu. Se omogenizeaz din nou. Se
nchide flaconul cu dop etan i se pstreaz la ntuneric pentru 1-2 zile. Dac soluia
nu este limpede, se adaug crbune activat i se agit pentru aproximativ un minut. Se
filtreaz soluia. Se pstreaz la temperatura de refrigerare, ntr-un flacon de sticl
nchis etan. Metabisulfitul de potasiu se poate nlocui cu cel de sodiu, fr a diminua
calitatea coloraiei. Conform Indexului Merck, bisulfitul de sodiu comercial este
realizat predominant din metabisulfit de sodiu. Soluia final trebuie s fie incolor sau
de culoarea chihlimbarului, dar foarte pal. Soluiile brune vor colora adesea foarte
prost. De obicei, acestea au fost realizate dintr-o fucsin bazic care conine o cantitate
inferioar de pararosanilin.
Petru Cazacu
129
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Soluia de lucru
Soluia stoc A .............................................. 25,0 ml
Soluia stoc B ............................................... 25,0 ml
Se omogenizeaz ct mai atent. Soluia va rmne stabil 3-4 zile.
Acridin orange
Acridin orange ............................................... 0,1 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml
Tehnica de colorare
1. Dup trecerea lamelor cu seciuni prin xilen i etanol, acestea se introduc ntr-o
baie de ap;
2. Hematoxilin feric Weigert (soluia de lucru), 5 minute;
3. Se spal cu ap de robinet;
4. Se introduc lamele n soluia de acridin orange, 2 minute;
5. Se spal n ap de robinet, 30 minute;
6. Se deshidrateaz, clarific i monteaz ntr-o rin nefluorescent.
Rezultatul colorrii
Se utilizeaz filtrele BG 12 i OG 4 (galben) i / sau OG 5 (portocaliu).
Fungii vor apare colorai fluorescent verde-rou.
Not:
Aceasta este cea mai indicat metod de screening.
6.4.7.5. Coloraia Gridley
Scop
Coloraia Gridley pune n eviden fungii viabili din preparatele histologice
obinute din esuturi incluse n parafin i secionate. Nu este satisfctoare pentru
detecia elementelor fungice neviabile, degradate.
Fixator
esuturile se fixeaz n soluie tamponat de formol 10 %, cu pH 6,8
Tehnica de secionare
Seciuni cu grosimea de 5 m, din fragmente de esut incluse n parafin
Echipament
Sticlrie de laborator, microscop
Tehnici de histopatologie
132
Reactivi
Reactiv Schiff de Tomasi
Vezi coloraia Bauer (6.4.7.3).
Fucsin-aldehid
Fucsin bazic .................................................... 1 g
Paraldehid, proaspt ...................................... 1 ml
Acid clorhidric concentrat ................................ 1 ml
Etanol 70 % .................................................. 200 ml
Se dizolv colorantul n etanol, apoi se adaug paraldehida i acidul clorhidric.
Se las la temperatura camerei timp de 48-72 ore, pentru maturare. Se pstreaz la
frigider, soluia fiind stabil 2-3 luni.
Acid cromic
Trioxid de crom .................................................. 5 g
Ap distilat .................................................. 500 ml
Decolorant
Metabisulfit de sodiu .......................................... 5 g
Ap distilat .................................................. 500 ml
Metanil yellow (Galben metanil)
Metanil yellow .................................................... 1 g
Ap distilat .................................................. 400 ml
Acid acetic glacial .................................... 2 picturi
Tehnica de colorare
1. Dup trecerea seciunilor prin bile cu xilen i etanol, acestea se imerseaz n
ap distilat;
2. Se introduc apoi n acid cromic, 1 minut;
3. Se spal cu ap de robinet;
4. Se trateaz cu soluie de metabisulfit, 1 minut;
5. Se spal cu ap de robinet;
6. Se cltesc cu ap distilat;
7. Se introduc lamele n reactivul Schiff, 20 minute;
8. Se spal cu ap de robinet;
9. Se cltesc cu etanol 70%;
10. Colorare cu fucsin-aldehid, 30 minute;
11. Se cltesc cu etanol 95%;
12. Se spal cu ap de robinet;
Petru Cazacu
133
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Soluia A
Trioxid de crom ................................................ 50 g
Ap distilat .................................................. 500 ml
Soluia B
Sulfit de sodiu ..................................................... 5 g
Ap distilat .................................................. 500 ml
Soluie C
Etanol 70% ................................................... 495 ml
Acid clorhidric .................................................. 5 ml
Tehnica de colorare
1. Dup trecerea seciunilor prin bile cu xilen i etanol, acestea se introduc n ap
distilat;
2. Imersare n soluia A, 10 minute;
3. Cltire cu ap de robinet;
4. Decolorare n soluia B, 1 minut;
5. Splare cu ap de robinet;
6. Cltire cu ap distilat;
7. Tratare cu reactiv Schiff fluorescent, 20 minute;
8. Splare cu ap de robinet;
9. Imersare n soluia C, dou bi, cte 5 minute fiecare;
10. Splare cu ap distilat;
11. n final, preparatele se deshidrateaz, clarific i apoi se monteaz lamela cu o
rin nefluorescent.
Rezultatul colorrii
Pentru examinare se utilizeaz filtrele BG 12, OG 4 (galben) i / sau OG 5
(portocaliu). Fungii apar colorai n galben-fluorescent cu acriflavin i verde-rou cu
acridin orange.
Note:
1. Aceast metod de colorare este utilizat frecvent ca metod de screening.
2. Dac fluorescena fondului este prea intens pentru a distinge fungii, aceasta se poate
atenua prin tratare cu hemalaun (1 minut) sau cu soluie apoas 0,5% de
permanganat de potasiu (1 minut). Aceast atenuare se realizeaz nainte de
deshidratarea final, cu precauie pentru a nu reduce excesiv fluorescena fungilor.
6.4.7.9. Coloraia Gomori-Grocott (Methenamine silver - modificat)
Scop
Evidenierea fungilor n esuturi. Este o coloraie superioar pentru depistarea
filamentelor aspergilare, a chitilor de Pneumocystis, a elementelor tipice pentru
Tehnici de histopatologie
140
Candida, zygomicete, Cryptococcus, Histoplasma, Blastomyces, Paracoccidioides,
Coccidioides, Lacazia loboi, Penicillium marneffei, Rinosporidium, Emmonsia. De
asemenea, evideniaz actinomicetele, Nocardia i algele de tipul Prototheca sau
Chlorela.
Fixator
Fragmentele de esut se fixeaz n soluie de formol 10 % tamponat pH 6,8.
Tehnica de secionare
Seciuni din fragmente de esut incluse n parafin, cu grosimea de 4-5 m
Echipamente
Sticlrie de laborator, cuptor cu microunde
Reactivi
Acid cromic 2%
Trioxid de crom ............................................. 10,0 g
Ap distilat ............................................. ad 500 ml
Dup solubilizare, soluia se transfer ntr-un recipient etan n care poate fi
stocat pn la 6 luni.
Atenie! Acidul este coroziv, posibil carcinogen, se evit contactul i
inhalarea.
Metabisulfit de sodiu 1%
Metabisulfit de sodiu ....................................... 5,0 g
Ap distilat ............................................. ad 500 ml
Soluia este stabil 6 luni.
Borax 5%
Borat de sodiu .................................................. 5,0 g
Ap distilat ............................................. ad 100 ml
Soluia este stabil 3 luni.
Metenamin-argint, soluia stoc
Metenamin 3%
(hexametilentetraamin) ........................... .100,0 ml
Nitrat de argint 5% ........................................ 5,0 ml
Petru Cazacu
141
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Cele dou soluii se amestec ntr-un recipient brun de sticl, tratat n prealabil
cu amestec sulfo-cromic, cltit n ap distilat i uscat. Soluia este stabil 3 luni, la
temperaturi de refrigerare.
Atenie! Coroziv, posibil carcinogen.
Clorur de aur 0,5%
Clorur de aur .................................................. 0,5 g
Ap distilat .......................................... ad 100,0 ml
Se pstreaz la frigider, n recipiente tratate cu amestec sulfo-cromic, cltite i
uscate. Soluia este stabil 1 an.
Atenie! Se evit contactul i inhalarea.
Verde luminos 0,2%
Verde luminos (Light Green SF yellow) ......... 0,2 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml
Acid acetic glacial ......................................... 0,2 ml
Soluia este stabil 6 luni.
Atenie! Se evit contactul i inhalarea.
Tehnica de colorare
1. Deparafinare i hidratare n ap distilat;
2. Lamele cu seciuni se transfer n soluia de acid cromic 2% i se menin n
cuptorul cu microunde la o treapt superioar, 45 secunde; alternativ, se pot
menine i 5 minute, dar la o treapt inferioar (n metoda convenional,
acidul cromic 5%, se menine pe baie de ap la 60C, timp de 1 or);
3. Se spal lamele n ap de robinet i apoi se cltesc cu ap distilat;
4. Urmeaz tratarea cu soluia de metabisulfit de sodiu 1%, 1 minut, la temperatura
camerei;
5. Splare n ap de robinet, apoi cltire n 3 bi succesive de ap distilat;
6. Se introduc lamele cu seciuni n soluia de metenamin-argint, la cuptorul cu
microunde (treapt superioar), 70 secunde: esuturile trebuie s capete o
coloraie brun, asemntoare hrtiei de ambalaj. Se agit preparatul n soluia
fierbinte (n metoda convenional soluia de argint se nclzete pe baie de ap
la 60C, pentru o or sau pn la apariia unei coloraii brune);
7. Cltire n 2 bi de ap distilat;
8. Tratare cu clorur de aur 5% , 1 minut sau pn la apariia unei coloraii gri;
9. Splare n ap distilat;
10. Tiosulfat de sodiu 5%, 3 minute;
11. Splare n ap de robinet i cltire n ap distilat;
12. Verde luminos 1 minut;
13. Cltire n ap distilat;
14. Preparatele se deshidrateaz, se clarific i apoi se monteaz lamela.
Tehnici de histopatologie
142
Rezultatul colorrii
Fungii brun-negri
Fondul verde
Note:
1. Componentele mucopolizaharidice ale peretelui celulelor fungice sunt oxidate pn la
punerea n libertate a gruprilor aldehidice. Gruprile aldehidice reacioneaz
ulterior cu nitratul de argint, reducndu-l pn la argint metalic.
2. n cazul n care culoarea acidului cromic vireaz n brun, atunci este necesar ca acesta
s fie schimbat. De notat c soluia 2% este mai indicat dect cea 5%, utilizat n
metoda convenional, acidul cromic mai concentrat provocnd desprinderea esutului
de pe lam cnd se utilizeaz tehnica cu microunde.
3.Cnd culoarea fungilor nu vireaz n negru, se verific prospeimea acidului cromic, a
metabisulfitului de sodiu i a boraxului.
4. Cnd lucrm cu soluia de nitrat de argint, dac se observ o tulburare a sa sau un
aspect de oglind pe faa paharului, atunci este necesar prepararea unei noi
soluii.
5. Pentru protecie se vor purta mnui, ochelari de protecie i halat de laborator. Se
respect modul de lucru cu soluiile sub hot. Se evit contactul i inhalarea. Acidul
cromic: coroziv pentru piele i mucoase. Foarte toxic! Organul int este rinichiul.
Carcinogen. Metabisulfitul de sodiu: toxic prin ingestie, poate cauza gastroenterite.
Iritant pentru piele, ochi i mucoase. Nitratul de argint: iritant sever pentru piele i
ochi, oxidant. Posibil carcinogen. Tiosulfatul de sodiu: toxic prin ingestie, poate irita
stomacul. Iritant pentru piele, ochi i tractul respirator. Verde luminos SF yellow:
posibil carcinogen.
6. Exist n comer i kit-ul de colorare GMS Staining Kit, produs de Ventana, nr. catalog
860-007 ; informaii: Europe Ventana Medical Systems, S.A. Parc dInnovation BP
30 144 Rue G. de Kaysersberg F - 67404 Illkirch Cedex France 33 (0) 3 90 40 52 00.
6.4.7.10. Coloraia fluorescent cu acid periodic Schiff
(PAS - fluorescent)
Scop
Aceast metod de colorare pune n eviden fungii, prin microscopia cu
fluorescen.
Fixator
Fragmentele de esut sunt fixate n soluie de formol 10% tamponat pH 6,8,
dar pot fi folosii i ali fixatori.
Tehnica de secionare
Seciuni din fragmente de esut incluse n parafin, cu grosimea de 5 m
Echipamente
Sticlrie de laborator, microscop cu fluorescen
Petru Cazacu
143
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Reactivi
Soluie de acid periodic
Vezi coloraia Schmorl (6.4.7.6.).
Reactiv Schiff fluorescent
Vezi coloraia Gridley fluorescent (6.4.7.8.).
Alcool - acid 5%
Vezi coloraia hemalaun eozin (6.4.7.1.).
Tehnica de colorare
1. Se deparafineaz i se hidrateaz seciunile;
2. Tratare cu acid periodic, 10 minute;
3. Splare n ap de robinet;
4. Cltire cu ap distilat;
5. Tratare cu reactiv Schiff fluorescent, 20 minute;
6. Splare n ap de robinet;
7. Alcool - acid, dou bi a 5 minute fiecare;
8. Splare cu ap de robinet;
9. Lamele cu seciuni se deshidrateaz, se clarific i apoi se monteaz lamela cu o
rin nefluorescent.
Rezultatul colorrii
Se utilizeaz filtrele BG 12, OG 4 (galben) i / sau OG 5 (portocaliu). Fungii
apar colorai n galben-fluorescent cu acriflavin i verde-rou cu acridin orange.
Note:
1. Unele formaiuni fluorescente vor apare colorate n rou sau roz la coloraia PAS.
2. Dac fluorescena fondului este prea intens pentru a distinge fungii, aceasta se poate
atenua prin tratare cu hematoxilin 1 minut sau cu soluie apoas 0,5% de
permanganat de potasiu 1 minut. Fluorescena se atenueaz naintea deshidratrii
finale. Aceasta atenuare a fluorescenei de fond trebuie s se fac cu precauie pentru
a nu reduce fluorescena fungilor.
6.4.7.11. Coloraia cu acid periodic Schiff
Scop
Coloraia cu acid periodic Schiff (engl. Periodic Acid Schiff, PAS) se poate
utiliza pentru colorarea fungilor din preparatele histologice.
Fixator
Probele de esut sunt fixate n soluie formol 10% tamponat pH 6,8, dar se pot
utiliza i ali fixatori (ns glutaraldehida trebuie evitat).
Tehnica de secionare
Seciuni din fragmente de esut incluse n parafin cu grosimea de 4-5 m
Tehnici de histopatologie
144
Echipamente
Sticlrie de laborator, cuptor cu microunde
Reactivi
Acid periodic 0,5 %, dup McManus
Acid periodic ................................................... 0,5 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml
Dup completa solubilizare a acidului periodic, soluia se eticheteaz cu data
preparrii i iniialele denumirii. Soluia este stabil 1 an.
Atenie! Se va evita contactul i inhalarea.
Reactivul Schiff (Lillie, la rece)
Fucsin bazic .............................................. 10, 0 g
Metabisulfit de sodiu ..................................... 18,0 g
Ap distilat ............................................. 1000,0 ml
Acid clorhidric ............................................. 10,0 ml
Se adaug fucsina i metabisulfitul n acidul clorhidric. Se agit soluia timp de
2 ore, apoi se menine la ntuneric, la temperaturi de 8-10C. Soluia devine limpede,
de culoare brun-deschis pn la galben-deschis. A doua zi se adaug:
Crbune activat (pulbere) ................................ 5,0 g
Se omogenizeaz 1-2 minute, apoi se filtreaz prin hrtie de filtru Whatman nr.
2 ntr-un cilindru gradat de 1000 ml. Hrtia de filtru se va nlocui frecvent. Se readuce
volumul la 1000 ml cu ap distilat. Soluia final trebuie s fie incolor sau de
culoarea chihlimbarului, dar foarte pal. Soluiile brune vor produce frecvent coloraii
necorespunztoare. De obicei, aceste soluii au fost preparate cu fucsin bazic ce
conine o cantitate mic de pararosanilin. Se pstreaz la frigider, soluia fiind stabil
timp de 6 luni. La prepararea reactivului se vor purta mnui, ochelari de protecie,
masc i halat de protecie. Se lucreaz sub hot, recipientul cu reactiv se pstreaz
acoperit, iar soluiile de preparare n nia chimic.
Atenie! Reactivul este carcinogen i corosiv, se evit inhalarea. Acidul
clorhidric este caustic, se va utiliza cu atenie!
Petru Cazacu
145
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Hematoxilina Gill
Hematoxilin ................................................... 4,0 g
Sulfat de aluminiu.......................................... 70,4 g
Ap distilat .............................................. 750,0 ml
Etilenglicol ................................................ 250,0 ml
Iodat de sodiu ................................................. 4,0 g
Acid acetic glacial ....................................... 20,0 ml
Se amestec etilenglicolul cu apa distilat, se adaug hematoxilina, iodatul de
sodiu, apoi sulfatul de aluminiu i acidul acetic glacial. Se agit o or la temperatura
camerei. Se filtreaz nainte de utilizare. Soluia poate fi utilizat imediat i este stabil
pentru aproximativ un an. Hematoxilina trebuie s fie anhidr; dac este hidratat
(C
16
H
14
O
6
x 3H
2
O) se utilizeaz o cantitate de 4,72 g.
Tehnica de colorare
1. Deparafinarea i hidratarea seciunilor cu ap distilat;
2. Se introduc apoi lamele n acid periodic 0,5 %, timp de 5 minute;
3. Cltire n ap distilat;
4. Se introduc lamele cu seciuni n reactivul Schiff, la cuptorul cu microunde
(treapt superioar), pentru 45-60 secunde; preparatul va cpta o culoare
magenta (n metoda convenional, reactivul Schiff se menine la temperatura
camerei, timp de 30 minute);
5. Se spal continuu n ap de robinet, timp de 5 minute;
6. Tratare cu hematoxilin, timp de 3 minute;
7. Se spal n ap de robinet, apoi n ap distilat;
8. Se deshidrateaz n alcool, se clarific i se monteaz lamela.
Rezultatul colorrii
Glicogenul i fungii: magenta (fig. nr. 6-2 vezi Anexa)
Nucleii celulelor somatice: albatri
Note:
1. Pentru a verifica calitatea reactivului Schiff, se adaug n 10 ml de formaldehid cteva
picturi de reactiv Schiff; culoarea trebuie s vireze imediat n rou-purpuriu.
2. Dac n timpul pstrrii la frigider a reactivului culoarea acestuia vireaz n roz,
reactivul Schiff se nlocuiete.
3. Dac se observ un precipitat alb n recipientul cu reactiv Schiff, acesta se poate
redizolva prin nclzirea uoar a rectivului i agitarea soluiei.
6.4.7.12. Coloraia Ziehl - Neelsen
Scop
Aceast coloraie este utilizat pentru evidenierea bacteriilor din genul
Mycobacterium, diferenierea filamentelor de Nocardia (Ziehl pozitive) i actinomicete
Tehnici de histopatologie
146
(Ziehl negative). De asemenea, se pot pune n eviden elemente fungice caracteristice
speciilor de Histoplasma i Blastomyces.
Fixator
Fragmentele de esut se fixeaz n soluie de formol 10 % tamponat pH 6,8.
Tehnica de secionare
Seciuni din fragmente de esut incluse n parafin, cu grosimea de 4-5 m
Echipamente
Sticlrie de laborator, cuptor cu microunde
Reactivi
Fenol-Fucsin Ziehl - Neelsen
Fucsin bazic ................................................. 2,5 g
Ap distilat ............................................... 250,0 ml
Etanol absolut ............................................. 25,0 ml
Cristale de fenol topite ................................. 12,5 ml
Se omogenizeaz, se filtreaz i se pstreaz ntr-un recipient brun de sticl.
Acesta se eticheteaz cu data preparrii i cu timpul de stabilitate al soluiei (cca. 1 an).
Atenie! Carcinogen i toxic.
Alcool - acid 1%
Acid clorhidric ................................................ 10 ml
Etanol 70 % .................................................. 990 ml
Se omogenizeaz i se eticheteaz cu data preparrii i timpul de stabilitate al
soluiei (1 an).
Atenie! Coroziv.
Albastru de metilen, soluia stoc
Albastru de metilen .......................................... 0,7 g
Ap distilat ................................................. 50,0 ml
Se omogenizeaz, se filtreaz i se pstreaz ntr-un recipient etan. Se
eticheteaz menionndu-se data preparrii i perioada de stabilitate a soluiei (1 an).
Albastru de metilen, soluia de lucru
Albastru de metilen sol. stoc ............................ 5 ml
Ap distilat .................................................... 45 ml
Petru Cazacu
147
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Soluia se pstreaz ntr-un recipient de sticl, fiind stabil timp de 2 luni. Se
va evita contactul i inhalarea.
Tehnica de colorare
1. Deparafinare, apoi hidratare cu ap distilat a seciunilor etalate pe lame;
2. Lamele se introduc n soluia de fenol-fucsin, care apoi se menine n cuptorul
cu microunde (treapt intermediar), 45 secunde. Lamele se vor lsa n soluia
fierbinte timp de nc 5 minute. Soluia se filtreaz o dat pe sptmn;
3. n metoda convenional, preparatele se menin la etuv, la 60C timp de 1 or;
4. Splare cu ap de robinet;
5. Tratare cu alcool - acid 1% pn la apariia culorii roz-deschis, persistente;
6. Splare cu ap de robinet, 5 minute;
7. Cltire cu ap distilat;
8. Albastru de metil, soluie de lucru, 30 secunde;
9. Cltire cu ap de robinet;
10. Se deshidrateaz, se clarific i se monteaz lamela cu balsam de Canada.
Rezultatul colorrii
Structurile acido-rezistente roii strlucitoare
Fondul albastru
Note:
1. Componenta lipoidic a bacteriilor acido-rezistente se coloreaz cu fenol-fucsin,
rezistent la decolorarea cu acid diluat.
2. Se utilizeaz filtre Millipore
TM
pentru filtrarea apei necesare n procesul colorrii.
3. n timpul preparrii soluiilor se vor purta mnui, ochelari de protecie i halat. Se
evit contactul i inhalarea soluiilor.
4. Fucsina bazic este carcinogen.
5. Acidul clorhidric: iritant puternic pentru piele, ochi i aparatul respirator.
6.4.7.13. Reactivi suplimentari
Amestec sulfo-cromic (pentru tratarea sticlriei)
Scop
Curarea sticlriei utilizate la colorare i pentru proceduri care necesit
sticlrie perfect igienizat.
Echipamente
Balon de 4000 ml, agitator magnetic, un recipient de sticl cu volum de 6-7
litri, cu capac
Tehnici de histopatologie
148
Reactivi
Soluie acid de curare
Bicromat de potasiu ....................................... 400 g
Ap distilat ................................................ 4000 ml
Acid sulfuric ................................................. 400 ml
Se dizolv bicromatul de potasiu n ap. Se toarn soluia ntr-un recipient de
6-7 litri, apoi se adaug ncet acidul sulfuric. Soluia se pstreaz pn cnd culoarea sa
devine maro-nchis (depinde de frecvena utilizrii). Se eticheteaz i se dateaz.
Soluie acid de splare a sticlriei 1,5%
Ap distilat .................................................. 985 ml
Acid clorhidric ................................................ 15 ml
Se omogenizeaz i se eticheteaz.
Note:
Pentru protecie se vor utiliza mnui, ochelari i halat. Acidul sulfuric: vaporii sunt
toxici, nu se inhaleaz. Afecteaz pielea, aparatul respirator, reproductor i esuturile fetale.
Este iritant pentru piele, ochi i aparatul respirator. Acidul sulfuric concentrat se adaug lent
n ap i soluii apoase, nu invers. Bicromatul de potasiu: toxic prin inhalare i ingestie.
Afecteaz sistemul reproductor i esuturile fetale. Coroziv pentru piele, ochi i mucoase.
Acidul clorhidric: puternic iritant pentru piele, ochi i aparatul respirator. Este coroziv.
6.5. Montarea
Montarea presupune n prealabil deshidratarea i clarificarea seciunilor.
nainte de introducerea lamelor cu seciuni n prima baie de etanol, acestea se
usuc prin compresare uoar cu hrtie de filtru pe ambele fee. De asemenea, lamele
se terg pe verso cu un tifon curat pentru a ndeprta resturile de colorant.
Urmeaz deshidratarea:
1. Etanol 95 %, 5 minute;
2. Etanol 95 %, 5 minute;
3. Etanol 100 %, 5 minute;
4. Etanol 100%, 5 minute;
5. Toluen, 10 minute.
Dac seciunile nu sunt complet deshidratate, la introducerea lor n toluen va
apare o turbiditate albicioas. Aceasta va limita conservabilitatea preparatelor.
Petru Cazacu
149
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Medii de montare
Balsamul de Canada
Este o rin a coniferului Abies balsamea, dizolvat n proporie de 55 % n
xilol. Prin nvechire capt o coloraie glbuie, iar unele coloraii nu se conserv
corespunztor (ex. coloraiile cu fucsin acid, verde luminos).
D.P.X.
Distiren 80 ..................................................... 10,0 g
Dibutilftalat ................................................. 80,5 ml
Xilol ............................................................. 35,0 ml
Este o rin sintetic, neutr chimic, ceea ce asigur o conservare mai bun a
coloranilor i implicit a preparatelor.
Pe lama umectat cu toluen se pune o pictur de mediu de montare, iar
deasupra se aeaz o lamel:
1. Lamela se aeaz pe lam, sub o inciden de 45, atingnd cu marginea pictura
de mediu de montare; dup ce pictura s-a extins pe toat lungimea marginii ce
formeaz unghiul diedru cu lama, aceasta se preseaz uor (fig. nr. 6-3 a, b).
Fig. nr. 6-3
Montarea seciunilor n medii
anhidre (a, b) i
n medii apoase (c, d).
Tehnici de histopatologie
150
2. Se depune o pictur de mediu de montare pe lam i una pe lamel, apoi
acestea se aduc paralel pn cnd cele dou picturi conflueaz, apoi lamela se
preseaz uor (fig. nr. 6-3 c, d).
Se ndeprteaz eventualele bule de aer de sub lamel cu ajutorul unui ac de
disociere. Excesul de mediu de montare se ndeprteaz cu ajutorul unui tifon mbibat
n benzen. Preparatele histologice astfel obinute se menin n poziie orizontal la
temperatura camerei, timp de 2-3 zile.
6.6. Etichetarea i arhivarea
Dup ce excesul de mediu de montare este ndeprtat, preparatele se pot
eticheta. Preparatele histologice se eticheteaz prin plasarea unor mici etichete
dreptunghiulare adezive la captul mat al lamei. Aceast etichet se completeaz cu
ajutorul unei tu rezistent la ap i va cuprinde instituia, numrul din registrul
laboratorului, anul, natura probei, coloraia etc.
Arhivarea preparatelor histologice trebuie s asigure n primul rnd protejarea
acestora de ocuri mecanice, de lumin, umiditate i praf. Dup interpretarea
microscopic i fotografierea aspectelor morfologice de interes, preparatele histologice
permanente se arhiveaz n cutii speciale n ordinea seriei, n fante numerotate, iar
cutiile se introduc n sertarele histotecii. Blocurile de parafin se vor pstra n plicuri
care vor avea aceleai nsemnri ca i preparatele i vor fi depozitate n rafturile unor
dulapuri special destinate acestui scop. n registrul de laborator, n dreptul fiecrei
probe de esut, se vor nota datele de identificare i locul de depozitare al preparatelor
i blocurilor (Histoteca nr., sertarul nr, cutia nr.., rndul nr...). Ele se
menin minim 10 ani i sunt refcute cnd este necesar. Pentru o mai bun conservare,
preparatele histologice permanente se vor luta. Lutarea se poate realiza cu lac de
unghii, parafin topit sau cu amestecul 3:6:1 format din colofoniu, cear de albine i
seu. Acestea se aplic cu o pensul fin pe marginea lamelei, de jur mprejur, astfel
nct s se realizeze etaneizarea seciunii.
Petru Cazacu
151
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Bibliografie selectiv
1. Bancroft J, Stevens A (1982) - Theory and Practice of Histological
Techniques, 2
nd
ed., Churchill Livingstone, N.Y.
2. Bancroft, J D, Stevens A (1982) - Theory and practice of histological
techniques 2
nd
ed., Churchill Livingstone, Edinburgh & London, UK.
3. Carson F (1990) - Histotechnology: A Self-Instructional Text, 1
st
ed., ASCP,
III.
4. Crookham J, Dapson R (1991) - Hazardous Chemicals in the Histopathology
Laboratory, 2
nd
ed., Anatech.
5. Culling C F A (1974) - Handbook of histopathological and histochemical
techniques; 3
nd
ed., Butterworth, London, UK.
6. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed. Viaa
Medical Romneasc; Bucureti.
7. Gray P (1954) - The Microtomist's Formulary and Guide. The Blakiston
Co. Robert E. Krieger Publishing.
8. Hayashi I , Tome Y, Shimosato Y (1989) - Thiosemicarbazide used after
periodic acid makes methenamine silver staining of renal glomerular
basement membranes faster and cleaner; Stain Technology.
9. Humason G L (1967) - Animal tissue techniques, 2
nd
ed., W H Freeman &
Company, San Francisco, Ca, USA.
10. Lillie R D (1954) - Histopathologic technique and practical histochemistry 2
nd
ed., Blakiston, New York, USA.
11. Lillie R D, Glenner G G (1957) - Journal of Histochemistry and
cytochemistry; 5:311.
12. Luna L (1968) - Manual of Histologic Staining Methods of the AFIP, 3
nd
ed.,
McGraw-Hill, NY.
13. McManus J F A, Mowry R W (1960) - Staining Methods Histologic and
Histochemical; Harper & Row, New York, NY, USA.
14. Sheehan D, Hrapchak B (1980) - Theory and practice of Histotechnology; 2
nd
ed., Battelle Press, Ohio.
15. http://www-medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html
Ingrid Apetrei, Mihai Mare
153
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Ingrid Apetrei, Mihai Mare
7.1 Fungitell (Cape Code Inc. SUA)
Test de detecie rapid a (1,3)--D-glucan-ului
7.1.1. Principiul testului
ungitell este un test cromogen, sensibil i rapid, ce poate detecta (1,3)--D-
glucanul din serul de analizat n circa o or. (1,3)--D-glucanul este un
constituent al peretelui celor mai importani fungi de interes medical precum Candida
sau Aspergillus. Abilitatea testului de a detecta n ser (1,3)--D-glucanul cu exprimare
n picograme, reprezint un balon de oxigen pentru clinicieni, privind identificarea
precoce a infeciilor fungice invazive. (1,3)--D-glucanul se regsete n doze mici n
sngele indivizilor sntoi, dar valorile serice de 80 pg/ml sau mai mari, la pacienii
cu risc crescut vor putea fi corelate cu infecii fungice invazive. Analiza seriat a
probelor prelevate de la pacienii cu risc pentru infecii fungice a relevat utilitatea
diagnostic a acestui test, rezultatele fiind verificate prin metode alternative de
diagnostic.
Fungii care nu sintetizeaz (1,3)--D-glucan, precum specii din genul
Cryptococcus sau aparinnd clasei Zygomycetes, respectiv Absidia, Mucor sau
Rhizopus, nu vor pozitiva testul. Un rezultat pozitiv nu va indica i clasa fungic a
speciilor incriminate, testul fiind recomandat pentru stabilirea unui diagnostic
prezumtiv n colaborare cu alte proceduri de diagnostic, precum examenul micologic al
prelevatelor clinice, tehnicile de histopatologie n cazul prelevatelor biopsice sau
analiza imagistic (Rx, CT, RMN). Testul poate decela (1,3)--D-glucanul produs de
fungii primar patogeni sau de cei oportuniti aparinnd genurilor: Candida,
Aspergillus, Fusarium, Trichosporon, Saccharomyces, Acremonium, Coccidioides,
Histoplasma, Sporothrix, Blastomyces i Pneumocystis.
Rezultatele testului sunt cuantificate n pg/ml ser, cu valori minime de detecie
stabilite la 31,25 pg/ml. Cu toate acestea, intervalul de detecie a fost ncadrat n limite
superioare pentru o mai bun acuratee a testrii i pentru evitarea unor posibile
interferri antigenice. Valori ale (1,3)--D-glucanului mai mici de 60 pg/ml sunt
considerate a fi negative, iar depirea acestei valori (pozitivarea testului) nu va putea
fi automat corelat cu prezena evolutiv a bolii fr o serie de investigaii clinice /
F
7
Tehnici de seromicologie
Tehnici de seromicologie
154
paraclinice complementare, n vederea stabilirii unui diagnostic ct mai exact. Valori
mai mari sau egale cu 80 pg/ml sunt interpretate ca fiind net pozitive, cu valoare mare
de diagnostic pentru evoluia unei afeciuni invazive cu etiologie fungic.
Valorile cuprinse n intervalul 60-79 pg/ml sugereaz o posibil infecie
fungic, dar acestea au valoare diagnostic incert, fiind recomandat retestarea seric
a pacienilor la intervale de timp prestabilite (2-3 ori pe saptmn). Rezultate fals
pozitive au fost nregistrate la pacienii hemodializai, n cazul folosirii membranelor
celulozice sau administrrii unor produse de origine sangvin precum albumina sau
imunoglobulinele, n timp ce utilizarea pentru hemodializ a unor membrane
confecionate din celuloz triacetat sau polimetil-metacrilat nu au provocat creteri ale
valorilor de (1,3)--D-glucan seric. Fiind un test cromogen rezultatele obinute mai pot
fi interferate de prezena bilirubinei serice sau de turbiditatea serului de analizat
cauzat de hiperlipemie.
7.1.2. Materiale furnizate mpreun cu testul Fungitell
Fungitell este destinat diagnosticului in vitro. Urmtoarele materiale (libere de
orice urm de 1,3--D-glucan) sunt furnizate mpreun cu kitul i suficiente pentru 2
plci de microtitrare:
1. Reactivul Fungitell - (1,3)--D-glucan liofilizat, specific LAL (Limulus
Amebocyte Lysate) sau lizat din amebocitele unei specii de crab;
2. Tampon Pyrosol (Tris HCl 2M pH 7,4);
3. Glucan standard liofilizat ce conine ntre 250 i 350 pg s.a. / fiol i solvent
inert;
4. Ap - reactiv conform standardului ISO 3696:1987;
5. Microplci de titrare cu 96 godeuri, cu fund plat;
6. KCl 1,2 M
7. KOH 0,25 M
7.1.3. Materiale necesare dar nefurnizate mpreun cu kitul
Toate materialele i sticlria trebuie s fie libere de interferare glucanic.
Sticlria trebuie s fie uscat la cald, depirogenat la 235C timp de 7 ore, pentru a fi
adecvat folosirii. Toate recipientele din material plastic vor fi libere de orice tipuri de
interferri. Materialele de unic folosin sunt de preferat.
1. Vrfuri pipete 10-100 l, 250 l, 1000 l;
2. Micropipete pentru volume de 20l, 200 l i 1000 l;
3. Micropipet multipas pentru volume de 100 l;
4. Tuburi de testare pentru diluia probelor i pregtirea mixului de extracie seric;
5. Incubator-cititor cu fluorescen, lungime de und 405 nm monocrom, cu 2500
uniti densitate optic i software pentru interpretare asistat de PC;
6. Tuburi sterile de plastic cu dop, pentru mixarea probelor;
7. Tuburi de colectare a serului.
Atenie! Vrfurile de pipet cu filtru de bumbac pot constitui surs de glucan.
Toate produsele furnizate de Cape Code. Inc. sunt certificate ca fiind libere de
interferare glucanic.
Ingrid Apetrei, Mihai Mare
155
C
a
p
i
t
o
l
u
l
7.3. Platelia
Candida Ac
Detecia anticorpilor serici anti-manan
prin metoda imunoenzimatic
7.3.1. Introducere
Incidena crescut a infeciilor fungice invazive reprezint o constant a
patologiei umane n ultimele dou decenii. Infeciile produse de diverse specii
aparinnd genului Candida au rangul de infecii nosocomiale, oportuniste grave,
caracterizate printr-o morbiditate accentuat asociat mediului spitalicesc, traduse prin
prelungirea perioadei de spitalizare a pacienilor i creterea consumului de antifungice
sistemice. Mortalitatea direct atribuabil acestor infecii se plaseaz n jurul valorii de
40%. Diagnosticul se stabilete cu dificultate ca urmare a lipsei unor semne clinice cu
caracter patognomonic. n practica clinic, la stabilirea unui diagnostic concur o serie
de tehnici - radiologice, micologice etc., care permit evaluarea riscului instalrii unei
candidoze invazive.
n acest context, dozarea anticorpilor anti-Candida, bisptmnal, va ajuta la
orientarea diagnosticului etiologic prin completarea examenelor micologice de rutin.
Seroconversia i nivelul ridicat al anticorpilor sunt n general asociate unui focar de
candidoz profund.
Chiar dac apariia anticorpilor i cuantificarea acestora se realizeaz tardiv,
acestea sunt elemente preioase n vederea stabilirii unui diagnostic, fie el chiar i
retrospectiv n cazul n care pacienii au fost tratai empiric, fr o examinare
micologic anterioar. Observarea unui nivel ridicat de anticorpi poate pune n discuie
existena unei candidoze evolutive. n practica clinic, este recomandat ca reacia de
evideniere a anticorpilor anti-Candida s fie dublat i de detecia antigenelor
circulante (GM). n fapt, numeroasele studii efectuate au demonstrat c pacienii care
au fost diagnosticai cu o candidoz profund au prezentat pe parcursul infeciei o
antigenemie crescut n absena anticorpilor sau un nivel ridicat al anticorpilor n
absena antigenelor detectabile, astfel nct cele dou teste sunt complementare.
7.3.2. Principiul testului
Platelia Candida Ac este o tehnic imunoenzimatic de tip indirect, n doi
timpi, ce permite detecia anticorpilor anti-manan (izotip A, G i M) n serul uman.
Acest test automatizabil se preteaz practicii medicale ntr-un laborator spitalicesc de
micologie clinic.
7.3.3. Materiale furnizate mpreun cu kitul
- Soluie de lavaj concentrat, care se va dilua de 10 ori n ap distilat steril : 10
ml soluie de lavaj la 90 ml ap distilat;
- Conjugat (gata de utilizare) - anticorpi de capr anti-Ig (A, G, M) umane marcai
cu peroxidaz;
- Diluant pentru eantioane (gata de utilizare);
Tehnici de seromicologie
166
- Tampon pentru substrat de peroxidaz (gata de utilizare) - soluie de acid citric i
acetat de sodiu pH 5,2 coninnd 0,009% H
2
O
2
i 4% DMSO;
- Soluie cromogen (concentrat) - soluie de DMSO 90% coninnd tetra-metil
benzidin (TMB);
- Soluie de stopare (gata de utilizare) - soluie de acid sulfuric 1,5N;
- Film adeziv.
7.3.4. Materiale necesare dar nefurnizate mpreun cu kitul
- Ap distilat sau perfect demineralizat pentru pregtirea soluiei de lavaj;
- Agitator tip Vortex;
- Centrifug pentru tuburi Eppendorf conice, de 1,5 ml capacitate;
- Spltor de microplci;
- Spectrofotometru echipat cu filtre de 450 / 620 nm;
- Incubator de microplci (37
0
C);
- Kit comercial Platelia Candida Ac.
7.3.5. Tehnica de lucru
naintea utilizrii, toi reactivii vor fi adui la temperatura ambiant (20 25
0
C).
Pregtirea gamei de etalonare :
Soluia-mam, gata de utilizare (se dilueaz R4 n raport 1/20).
Exemplu : 40 l de R4 Ac + 800 l din soluia diluant
Realizarea gamei de etalonare n 6 puncte (concentraii variabile de anticorpi) :
80 UA (uniti anticorpi) - diluia soluiei-mam 1/5 : 100 l soluie-mam
+ 400 l diluant.....Tubul E1;
40 UA : diluia soluiei-mam pn la punctul 80 UA : 200 l din tubul E1
+ 200 l diluant.....Tubul E2;
20 UA : diluia soluiei-mam pn la punctul 40 UA : 200 l din tubul E2
+ 200 l diluant.....Tubul E3;
10 UA : diluia soluiei-mam pn la punctul 20 UA : 200 l din tubul E3
+ 200 l diluant.....Tubul E4;
5 UA : diluia soluiei-mam pn la punctul 10 UA : 200 l din tubul E4
+ 200 l diluant.....Tubul E5;
2,5 UA : diluia soluiei-mam pn la punctul 5 UA : 200 l din tubul E5
+ 200 l diluant.....Tubul E6.
Diluia eantioanelor (seruri de testat, seruri de control negativ i pozitiv)
Se dilueaz extemporaneu eantioanele - dou diluii succesive de 1/80 : 10 l
ser + 790 l de diluant rezultnd 1/80, apoi 10 l din diluia precedent + 790 l
diluant rezultnd diluia final 1/6400.
Ingrid Apetrei, Mihai Mare
167
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Reacia imunoenzimatic
- Se stabilete un plan de lucru privind distribuia serului de control i a etaloanelor
n funcie de numrul eantioanelor de testat;
- Se distribuie serul diluat (punctele de reper de la E1 E6, eantioanele de testat i
cele de control) 100 l per godeu;
- Se identific baretele cu ajutorul unui marker permanent;
- Se acoper microplaca cu ajutorul unui film adeziv, ntinzndu-se ct mai bine pe
toat suprafaa n vederea asigurrii unei bune etaneizri;
- Se aeaz placa n incubatorul de microplci timp de 60 minute la 37
0
C;
- Se prepar soluia de lavaj (prin diluare 1:10). Se pregtesc 200 ml pentru dou
barete, respectiv 20 ml soluie de lavaj concentrat la 180 ml de ap distilat;
- Se ndeprteaz filmul adeziv i se aspir coninutul tuturor godeurilor;
- Coninutul aspirat se depune ntr-o soluie de hipoclorit de sodiu 2%, iar splarea
godeurilor se face de 4 ori, cu circa 300 l soluie de splare / godeu;
- Se usuc baretele prin tamponare cu o hrtie absorbant i se lovesc uor pentru
eliminarea n totalitate a soluiei de splare;
- Se omogenizeaz flaconul ce conine conjugatul, apoi se distribuie cte 100 l n
godeurile aferente;
- Se acoper din nou microplaca cu filmul adeziv i se incubeaz timp de 60
minute la 37
0
C;
- Se ndeprteaz filmul adeziv i se aspir coninutul tuturor godeurilor, n
maniera prezentat anterior;
- Prepararea soluiei de revelare prin diluarea de 50 de ori a soluiei cromogene
concentrate n soluia tampon pentru peroxidaz (e.g. 5 ml de reactiv tampon
substrat de peroxidaz la 100 l de soluie cromogen concentrat tetrametil-
benzidin) i distribuirea rapid a acesteia, n volum de cte 200 l, n toate
godeurile;
- Reacia este lsat s se desfoare n obscuritate, timp de 30 minute, la
temperatura ambiant;
- Se stopeaz reacia enzimatic prin adugarea a 100 l soluie de stopare n
fiecare godeu;
- Se citete densitatea optic la 450 / 620 nm pe parcursul a 30 de minute dup
stoparea reaciei.
7.3.6. Interpretarea rezultatelor
Valori ale densitii optice ateptate:
Densitate optic : 0,400 < DO la punctul din scala etalon 5 UA < 1,200
Raport :
- DO corespunztoare punctului etalon 20 UA / DO nseamn 5 UA > 2
- DO corespunztoare punctului etalon 10 UA / DO nseamn 5 UA > 1,4
Tehnici de seromicologie
168
- DO corespunztoare punctului etalon 2,5 UA / DO nseamn 5 UA < 0,8
Concentraia n anticorpi;
- C3 < 2,5 UA/ml
- C5 = concentraia indicat pe flacon 2,5 UA/ml
Curba etalon este realizat n baza a 6 repere / etaloane - 2,5, 5, 10, 20, 40, 80
UA/ml preparate pe baza R4, etalonul etichetat i furnizat odat cu kitul. Se va opta
pentru trasarea sigmoid a curbei de etalonare care s permit extrapolarea pe abscis a
concentraiilor n UA/ml (interpretare logaritmic) i pe ordonat DO (liniar). Dac
cititorul nu permite acest tip de trasare, se poate opta doar pentru o trasare de reliefare
a etaloanelor.
- < 0,5 UA/ml: ser negativ
- ntre 5 10 UA/ml: ser intermediar (rezultat incert)
- 10 UA/ml: ser pozitiv
Ingrid Apetrei, Mihai Mare
169
C
a
p
i
t
o
l
u
l
7.4. Platelia
Candida Ag
Detecia mananului seric prin metoda imunoenzimatic
7.4.1. Introducere
Antigenul Candida, n acest caz mananul - polizaharid major de perete,
reprezint markerul principal n identificarea unei candidoze invazive. Eliberarea
acestui polizaharid n organism are loc intermitent, iar prezena seric a acestuia este de
multe ori pasager. Detecia rapid a acestui compus depinde de o serie de factori,
precum captarea de ctre anticorpii specifici circulani i degradarea de ctre
manozidazele serice. Deci evidenierea mananului seric va trebui corelat cu cea a
anticorpilor antimanan circulani. Tandemul celor dou tipuri de teste va concura att
la ameliorarea gradului de sensibilitate ct i la cea a precocitii stabilirii unui
diagnostic integrat.
7.4.2. Principiul testului
Platelia
Bibliografie selectiv
1. Aketagawa J, Tanaka S, Tamura H, Shibata Y, Saito H (1993) - Activation
of Limulus coagulation factor G by several (1,3)--D-glucans: Comparison
of the potency of glucans with identical degree of polymerization but
different conformations; J Biochem; 113:683-686.
2. Alexander B (2002) - Diagnosis of fungal infection: new technologies for
the mycology laboratory; Transpl Infectious Dis; 4 (Suppl. 3):32-37.
3. Becker M J, de Marie S, Willemse D, Verbrugh H A, Bakker-
Woudenberg I A J M (2000) - Quantitative galactomannan detection is
superior to PCR in diagnosing and monitoring invasive pulmonary
aspergillosis in an experimental rat model; J Clin Microbiol; 38:1434-
1438.
4. Bretagne S, Costa J-M, Marmorat-Khuong A et al. (1995) - Detection of
Aspergillus species DNA in bronchoalveolar lavage samples by
competitive PCR; J Clin Microbiol; 33:1164-1168.
5. Bretagne S, Costa J-M, Bart-Delabesse E et al. (1997) - Comparison of
serum galactomannan antigen detection and competitive polymerase chain
reaction for diagnosing invasive aspergillosis; J Clin Infect Dis; 26:1407-
1412.
6. Chambon-Pautas C, Costa J-M, Chaumette M-T, Cordonnier C, Bretagne
S (2001) - Galactomannan and polymerase chain reaction for the
diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid
leukaemia; J Infect; 43:213-214.
7. Costa C, Costa J-M, Desterke C, Botterel F, Cordonnier C, Bretagne S
(2002) - Real-time PCR coupled with automated DNA extraction and
detection of galactomannan antigen in serum by enzyme-linked
immunosorbent assay for diagnosis of invasive aspergillosis; J Clin
Microbiol; 40:2224-2227.
8. Erjavec Z, Verweij P E (2002) - Recent progress in the diagnosis of fungal
infections in the immunocompromised host; Drug Resist; 5:3-10.
9. Faille C, Mackenzie D W, Michalski J C, Poulain D (1992) - Evaluation
of an enzyme immunoassay using neoglycolipids constructed from
Candida albicans oligomannosides to define the specificity of anti-mannan
antibodies; Eur J Clin Microbiol Infect; 11:438-446.
10. Fishman J A , Rubin R H (1998) - Infection in organ-transplant recipients;
New England Journal of Medicine; 338(24):1741-1751.
11. Freydiere A M, Guinet R, Boiron P (2001) - Yeast identification in the
clinical microbiology laboratory: phenotypical methods; Med Mycol;
39:9-33.
12. Fukazawa Y (1989) - Antigenic structure of Candida albicans.
Immunochemical basis of the serological specificity of the mannans in
yeasts; Immunol Ser; 47:37-62.
13. Georges E, Garrigues M L, Stynen D, Poirot J L (1991) - Spcificit in
vitro d'un anticorps monoclonal (Acm) anti-mannane et du latex sensibilis
Tehnici de seromicologie
174
par cet anticorps au cours de la candidose dissmine exprimentale; J
Mycol Med; 118:21-24.
14. Hashiguchi K, Niki Y, Soejima R (1994) - Cyclophosphamide induces
false-positive results in detection of Aspergillus antigen in urine; Chest;
105:975-976.
15. Hashimoto A , Yamakami Y, Kamberi P et al. (1998) - Comparison of
PCR, (1-3)-beta-D-glucan and galactomannan assays in sera of rats with
experimental invasive aspergillosis; J Clin Lab Anal; 12:257-262.
16. Hebart H, Loeffler J, Kanz L, Einsele H (2000) - Molecular methods in
the diagnosis of infections in the immunocompromised host; Curr Opin
Infect Dis; 13:355-359.
17. Hyams K C (1998) - Developing case definitions for symptom-based
conditions: the problem of specificity; Epidemiol Rev; 20:148-156.
18. Iwanaga S, Morita T, Nakamura T, Aketagawa J (1986) - The hemolymph
coagulation system in invertebrate animals; J. Protein Chem; 5: 255-268
19. Jacquinot P M , Plancke Y, Sendid B, Strecker G, Poulain D (1998) -
Nature of Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a
monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species;
FEMS Microbiol Lett;169:131-138.
20. Jacquinot P M, Plancke Y, Sendid B, Strecker G, Poulain D (1998) -
Nature of Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a
monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species;
FEMS Microbiol Lett;169:131-138.
21. Jarvis W R (1995) - Epidemiology of nosocomial fungal infections, with
emphasis on Candida species; Clin Infect Dis; 20:1526-1530.
22. Kappe R (1989) - Coexistence of free antigens, free antibodies and
immune complexes in sera from patients with suspected deep-seated
candidosis; Mycoses; 32:24-32.
23. Kato A, Takita T, Furuhashi M et al. (2001) - Elevation of blood (1,3)--
D-glucan concentrations in hemodialysis patients; Nephron; 89:15-19.
24. Kawamura S, Maesaki S, Noda T et al. (1999) - Comparison between
PCR and detection of antigen in sera for diagnosis of pulmonary
aspergillosis; J Clin Microbiol; 37:218-220.
25. Kontoyiannis D P, Vaziri I, Hanna H A et al. (2001) - Risk factors for
Candida tropicalis fungemia in patients with cancer; Clin Infect Dis;
33:1676-1681.
26. Kurzai O, Heinz W J, Sullivan D J et al. (1999) - Rapid PCR test for
discriminating between Candida albicans and Candida dubliniensis
isolates using primers derived from the pH-regulated PHR1 and PHR2
genes of C.albicans; J Clin Mircobiol; 37:1587-1590.
27. Latge J P (1999) - Aspergillus fumigatus and aspergillosis; J Clin
Microbiol; 12:310-340.
28. Lescher-Bru V, Cavalier A, Pernot-Marino E et al. (1998) - Aspergillus
galactomannan antigen detection with Platelia
Aspergillus: multiple
positive antigenemia without Aspegillus infection; J Mycol Med; 8:112-
113.
Ingrid Apetrei, Mihai Mare
175
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
ungii prezint o serie de nsuiri metabolice i eco-fiziologice care pot fi
utile n demersul de identificare a speciei, n special pentru discriminarea
ntre specii cu caractere culturale i aspecte microscopice similare. Evaluarea prezenei
sau absenei acestor nsuiri se realizeaz prin punerea n practic a unor teste cum ar fi
cele biochimice i cele fiziologice.
Aceste teste sunt mijloace absolut necesare n laboratorul clinic, n special
pentru identificarea levurilor de interes medical. Dei importana lor este covritoare
i unanim recunoscut, aceste teste nu reuesc de fiecare dat s elucideze cu exactitate
apartenena taxonomic a unei anumite tulpini i sunt necesare teste suplimentare, n
principal de biologie molecular, pentru identificarea acesteia. Deoarece testele de
biologie molecular bazate pe analiza ADN-ului sunt accesibile doar laboratoarelor din
Centrele de Referin i sunt relativ costisitoare, utilizarea profilul biochimic i a
caracterelor morfologice reprezint o soluie acceptabil pentru laboratoarele clinice,
rspunznd de manier satisfctoare cerinelor de diagnostic din spitale i ambulatorii
de specialitate. Profilul biochimic cuprinde datele obinute prin efectuarea unei
multitudini de teste, ntre care cele mai importante sunt redate n continuare.
8.1. Fermentarea zaharurilor
Utilizarea metabolic a zaharurilor n condiii de anaerobioz presupune
cultivarea levurilor pe medii minimale coninnd 0,3% extract de drojdie i 0,5%
pepton, aditivate cu un anumit substrat glucidic n proporie de 2%. Interpretarea se
face pe baza dioxidului de carbon acumulat n tubuleele Durham introduse n mediu.
Cele mai utilizate zaharuri sunt: D-glucoza, D-galactoza, maltoza, sucroza, rafinoza,
trehaloza i D-xiloza. Acest test este util n diferenierea diverselor specii aparinnd
genului Candida, dar nu i a levurilor din genurile Cryptococcus i Rhodotorula care
sunt nefermentative.
F
8
Teste biochimice i fiziologice
Teste biochimice i fiziologice
180
8.2. Capacitatea de asimilare a surselor de carbon
Abilitatea levurilor de a crete pe diverse medii n prezena anumitor substane
chimice adugate ca unic surs de carbon, poart numele de auxanogram.
Substanele folosite pentru acest test sunt mai numeroase i mai diverse n ceea ce
privete complexitatea structural:
- hexoze: D-glucoz, D-galactoz, L-ramnoz, L-sorboz;
- pentoze: D-xiloz, D-riboz, L-arabinoz, D-arabinoz;
- dizaharide: sucroz, maltoz, celobioz, trehaloz, lactoz, melibioz;
- trizaharide: rafinoz, melezitioz;
- polizaharide: amidon solubil, inulin;
- alcooli: eritritol, adonitol, D-manitol, m-inozitol, metanol, etanol, glicerol, glicol,
1,2-propandiol, 2,3-butandiol, dulcitol, D-sorbitol;
- acizi organici: succinat, citrat, DL-lactat, D-gluconat, D-glucuronat, 2-ceto-D-
gluconat, 5-ceto-D-gluconat;
- ali compui: D-glucozamin HCl, N-acetil-glucozamin.
8.3. Capacitatea de asimilare a surselor de azot
Principiul acestui test este similar cu cel al testului anterior. Sursele de azot
testate sunt: nitraii, etilamina, L-lizina, cadaverina, nitriii, creatina, creatinina. Testul
de asimilare a nitratului de sodiu este important pentru diferenierea levurilor
aparinnd genurilor Cryptococcus i Rhodotorula prin determinarea activitii nitrat-
reductazei cu anumii ageni revelatori de tipul acidului sulfanilic i alfa-naftilaminei.
8.4. Testul de hidroliz a ureei (producerea de ureaz) la levuri
Scop
Acest test pune n eviden capacitatea unor levuri de a produce enzima numit
ureaz. Se folosete pentru identificarea prezumtiv a levurilor aparinnd genurilor
Cryptococcus, Rhodotorula i Trichosporon.
Tehnic de lucru
Se folosesc medii lichide care conin uree i un indicator (rou-fenol): bulion
Christensen preparat n laborator, medii gata de utilizare comercializate de diverse
firme (BD Diagnostics, BioMrieux, Remel etc.). n urma scindrii ureei de ctre
ureaza secretat de levuri, se produce o cretere a pH-ului prin eliberarea amoniacului,
fapt semnalat de virarea culorii indicatorului de la galben-chihlimbar la roz-rou.
Se nsmneaz 0,5 ml mediu de testare cu o ans ncrcat de celule,
prelevat din cultura levurii de identificat. n paralel, se nsmneaz obligatoriu un
martor pozitiv (Cryptococcus neoformans) i unul negativ (Candida albicans).
Rezultatele se citesc dup 3, respectiv 24 ore de incubare la 37C. Interpretare: testul
este pozitiv pentru genurile Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon i negativ
pentru Blastoschizomyces, Candida i Geotrichum.
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
181
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Precauii
Tulpina de testat trebuie s fie necontaminat bacterian, deoarece se pot
produce erori prin interferarea reaciei.
8.5. Testul de hidroliz a ureei (producerea de ureaz) la dermatofii
Scop
Pune n eviden producerea de ureaz de ctre dermatofii, prin cultivare pe
bulion sau agar Christensen. n cazul producerii acestei enzime, ureea din mediu este
descompus cu generare de amoniac care va modifica pH-ul mediului (alcalinizare),
fenomen indicat de schimbarea culorii indicatorului; astfel, culoarea mediului va vira
de la galben-orange la roz-rou (fig. nr. 8-1, vezi Anexa).
Tehnic de lucru
Mediul solid, turnat n pant, se inoculeaz ntr-un singur punct, cu tulpina de
analizat. n paralel, se inoculeaz un martor pozitiv (e.g. T. mentagrophytes) i un
martor negativ (e.g. T. verrucosum). Dup inoculare, mediul se incubeaz la 25-30C,
timp de pn la 7 zile.
Testul ureazei este:
- pozitiv pentru urmtoarele specii de dermatofii M. canis, M. cookei, M.
gypseum, M. nanum, M. persicolor, M. praecox, T. ajelloi, T. mentagrophytes
(ambele varieti) i T. Terrestre;
- slab pozitiv pentru urmtoarele specii de dermatofii E. floccosum i rar M.
canis;
- variabil (inconstant pozitiv sau negativ, n funcie de tulpin) pentru urmtoarele
specii de dermatofii M. audouinii, T. rubrum, T. schoenleinii, T. tonsurans i
T. violaceum;
- negativ pentru urmtoarele specii de dermatofii M. ferrugineum, T.
concentricum i T. verrucosum.
Precauii
Este obligatorie absena contaminrii bacteriene a culturii dermatofitului din
care se fac pasajele pe mediul Christensen.
8.6. Testarea rezistenei la cicloheximid
Testul se refer la abilitatea levurilor de a se dezvolta pe medii de cultur
coninnd dou concentraii de cicloheximid 0,01%, respectiv 0,1%. Aceste
concentraii pot fi critice pentru anumite specii, supresndu-le total sau parial
dezvoltarea, sau dimpotriv, pot fi permisive pentru altele, creterea lor nefiind deloc
stnjenit.
Teste biochimice i fiziologice
182
8.7. Producerea de fenol-oxidaz
Producerea acestei enzime este detectat cu ajutorul unor discuri impregnate
cu acid cafeic (Caffeic Acid Disk, Remel SUA) sau prin cultivarea levurilor pe medii
bogate n polifenoli de tip acid cafeic (Agar pe baz de extract din semine de Niger
sau Agar cu acid cafeic i citrat feric) i permite identificarea speciei Cryptococcus
neoformans pe baza unei reacii de culoare. Sub aciunea fenol-oxidazei, care
catalizeaz oxidarea polifenolilor i transformarea lor n pigment melanic, apare o
brunificare a discului ntr-un interval de aproximativ 4 ore de incubare la 30C,
respectiv colonii brune pe mediile amintite, dup 48-72 ore (fig. nr. 8-2, vezi Anexa).
8.8. Testarea producerii altor enzime
Enzime cum ar fi -galactozaminidaza, L-prolin-aminopeptidaza etc., sunt
evideniabile prin cultivarea levurilor pe medii cromogene: CandiSelect 4 (fig. nr. 8-
3, vezi Anexa), Candichrom
Acest set de medii este disponibil comercial: Trichophyton Agar 1-7 (Remel,
BD Diagnostics).
Tuburile cu cele 7 medii se nsmneaz prin transferul unui mic fragment din
colonia de testat, avnd grij s nu se preleveze i poriuni de mediu. Ele se incubeaz
apoi la 25-30C sau la 37C (cnd se suspicioneaz T. verrucosum), timp de 14 zile.
Interpretarea rezultatelor se face dup 7, respectiv 14 zile, innd cont de eventuala
stimulare a creterii pe mediile aditivate cu vitamine sau aminoacizi comparativ cu cea
observat pe mediile bazale (tabelul 8-1).
Tabelul 8-1
Comportamentul dermatofiilor pe setul de 7 medii aditivate cu factori trofici
Specia 1 2 3 4 5 6 7
E. floccosum + + + + +
M. audouinii + + + + + + +
M. canis + + + + + + + + + + + + + +
M. cookei + + + + + + +
M. ferrugineum + + + + + + + +
M. gypseum + + + + + + +
M. nanum + + + + + + + +
M. persicolor + + + + + + +
M. praecox + + + + + + +
T. ajelloi + + + + + + +
T. concentricum - + + + + + -
T. mentagrophytes
var. interdigitale
+ + + + + + + + + + + + + +
T. mentagrophytes
var. mentagrophytes
+ + + + + + + + + + + + + +
T. rubrum + + + + + + + + + + +, - + +
T. schoenleinii + + + + + + + +
T. terrestre + + + + + + +
T. tonsurans +, - +, - +, - + +, - + +, - , -
T. verrucosum - + + + - - -
T. violaceum +, - + + + + + + +
Legend: + (cretere normal), - (absena creterii), + + (cretere stimulat), (cretere disgonic)
8.10. Testul de cultivare pe Agar BCP lapte glucoz.
Scop
Permite observarea schimbrilor de pH datorit indicatorului (bromcrezol
purpur) inclus n mediu i ajut la diferenierea speciilor de dermatofii de interes
clinic.
Tehnic de lucru
Mediul, turnat n plci Petri sau flacoane cu capacitate de 25-30 ml (nclinat n
acest caz), se nsmneaz cu tulpina dermatofitului de identificat ntr-un singur punct.
Recipientele nsmnate se incubeaz la 30C timp de 5-10 zile, funcie de viteza de
cretere a fiecrei tulpini n parte. Alcalinizarea mediului n urma dezvoltrii culturii
Teste biochimice i fiziologice
184
dermatofitului va antrena virarea culorii acestuia, de la albastru-pal la violet-purpuriu.
Speciile capabile s alcalinizeze mediul sunt: E. floccosum, M. audouinii, T.
mentagrophytes (var. interdigitale), T. schoenleinii, T. terrestre, T. verrucosum, T.
violaceum. Unele specii (T. verrucosum) sunt capabile s hidrolizeze cazeina din lapte,
producnd o clarificare a mediului n jurul coloniei.
Precauii
Trebuie s ne asigurm c tulpina de testat nu este impurificat cu alte
microorganisme (bacterii sau fungi) care ar putea da reacii pozitive eronate.
8.11. Testul de perforare a firului de pr in vitro
Scop
Diferenierea speciilor de dermatofii de interes clinic pe baza producerii
organelor perforatoare in vitro.
Tehnic de lucru
Se utilizeaz fire de pr de copil, care se cupeaz n fragmente de 0,5-1 cm i
se autoclaveaz n plci Petri timp de 10 minute la 121C. Dup autoclavare, se adaug
n fiecare plac cte 25 ml ap distilat sterilizat i cteva picturi extract de drojdie
10%. Plcile astfel pregtite se nsmneaz cu cteva fragmente din colonia
dermatofitului de identificat, apoi se incubeaz la 25C, timp de 21 zile. La fiecare 7
zile, utiliznd fragmente de pr inoculate, se pregtesc preparate extemporanee (cu
lichid clarificant, ntre lam i lamel). O alt variant, ar fi etalarea unor fragmente de
0,5-1,5 cm din firele de pr autoclavate direct pe suprafaa coloniilor dezvoltate pe
Agar Sabouraud i continuarea incubrii timp de 21 zile. Testul pozitiv este indicat de
prezena organelor perforatoare care strbat tija pilar din loc n loc, avnd traiect
perpendicular pe aceasta (fig. nr. 8-9, vezi Anexa). Comportamentul speciilor de
dermatofii la acest test este prezentat n tabelul 8-2.
Tabelul 8-2
Comportamentul speciilor de dermatofii la testul de perforare a firului de pr
Test de perforare pozitiv Test de perforare negativ Test de perforare variabil
M. canis M. audouinii E. floccosum
M. cookei M. praecox T. erinacei
M. gypseum T. equinum T. tonsurans
M. persicolor T. concentricum
T. ajelloi M. ferrugineum
M. galinae T. rubrum
M. nanum T. schoenleinii
T. terrestre T. verrucosum
T. mentagrophytes T. violaceum
T. soudanense
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
185
C
a
p
i
t
o
l
u
l
8.12. Testul de cultivare pe boabe de orez
Scop
Este util pentru diferenierea M. audouinii (cretere restrictiv, pigment brun-
maroniu, absena sporulrii) de M. canis (cretere abundent, pigment galben,
sporulare intens) (fig. nr. 8-10, vezi Anexa). Aceast metod este util i pentru
inducerea sporulrii unor tulpini dermatofitice nesporulate, disgonice sau cu sporulare
atipic.
Tehnic de lucru
Mediul se prepar n flacoane Erlenmeyer cu capacitate de 100 ml, n care se
adaug 8 g orez decorticat i 25 ml ap distilat. Se sterilizeaz prin autoclavare la
121C timp de 15 minute. Dup inoculare, flacoanele se incubeaz la 25-30C timp de
pn la 2 sptmni.
8.13. Testul de filamentare (testul de blastez sau germ-tube test)
Scop
Test tip screening pentru trierea izolatelor de levuri n laboratorul clinic i
identificarea prezumtiv a tulpinilor de C. albicans i C. dubliniensis.
Tehnic de lucru
Ca medii pentru blastez se utilizeaz serul sanguin de cal, serul sanguin uman
(Atenie! Risc crescut de contaminare cu HIV, HVB) sau medii artificiale
comercializate de diverse firme (Germ Tube Solution Remel, SUA). n fiole cu
capacitatea de 2 ml se pun n contact 0,5 ml suspensie levuric i 0,5 ml ser sanguin de
cal. Fiolele se menin apoi n baia de termostatare la 36C timp de 2 ore. Suspensia
levuric se prepar n soluie salin fiziologic, densitatea acesteia ajustndu-se la 0,5
Mc Farland (cca. 10
5
-10
6
celule/ml). Dup expirarea celor 2 ore, fiolele se agit i din
fiecare amestec se preleveaz un volum de 25 l care se etaleaz apoi ntre lam i
lamel. Preparatul extemporaneu astfel obinut se examineaz la microscop n vederea
decelrii tubilor germinativi caracteristici tulpinilor de Candida albicans i Candida
dubliniensis filamente scurte care emerg din blastospor fr trangulare (fig. nr. 8-11,
vezi Anexa). Ca martor al filamentrii, se utilizeaz de fiecare dat o tulpin-tip de
Candida albicans. Se va avea n vedere c i alte levuri pot produce formaiuni
similare de tipul pseudofilamentelor, ns ele se difereniaz de adevraii tubi
germinativi prin existena unei trangulri la locul de emergen din blastospor.
Precauii
Nu se recomand suspensionarea levurilor direct n mediul de blastez,
deoarece concentraia mare a acestora pe unitatea de volum scade sensibilitatea reaciei
prin diminuarea drastic a numrului de celule care vor produce tubi germinativi.
Nivelul rezultatelor fals negative este n mod normal de cca. 5%, ns el tinde s
creasc odat cu mrirea densitii suspensiei levurice.
Teste biochimice i fiziologice
186
8.14. Testul de termotoleran / termostimulare
Scop
Testul este folosit n special pentru diferenierea speciilor de dermatofii, dar
este aplicabil i n cazul altor fungi filamentoi sau levuriformi. Are la baz faptul c
unele specii de dermatofii tolereaz temperatura de 37C pentru dezvoltare (E.
floccosum, T. mentagrophytes, T. rubrum, T. schoenleinii, T. tonsurans, T. verrucosum,
T. violaceum), altele nu (T. ajelloi, T. terrestre etc.); n plus, pentru unele specii (T.
verrucosum, T. soudanense), temperatura de 37C acioneaz chiar stimulativ asupra
dezvoltrii coloniilor comparativ cu temperaturile mai sczute (25C, 30C).
Tehnic de lucru
n vederea studierii acestor caracteristici, se nsmneaz perechi de tuburi
coninnd Agar Sabouraud solidificat n pant cu tulpinile n cauz i se incubeaz
difereniat la 25 sau 30C i 37C (n cazul dermatofiilor), la 30C, 37C, 40C, 42C
i 45C (n cazul levurilor) i la 30C, 37C, 40C, 42C, 45C, 52C i 54C (n cazul
fungilor filamentoi) . Interpretarea testului se realizeaz n momentul cnd coloniile
ajung la maturitate pe mediile incubate la temperatura cea mai sczut (25-30C sau
37C). Principalele aspecte privind permisivitatea dezvoltrii la aceste temperaturi n
cazul unor specii de fungi de interes clinic sunt prezentate n tabelul 8-3.
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
187
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Tabelul 8-3
Comportamentul diverselor specii de fungi la testul de termotoleran
Nr. crt. Specia 37C 40C 42C 45C 52C 54C
1 Absidia corymbifera + + + + + -
2 Cunninghamella bertholletiae + + + + + -
3 Mucor circinelloides + - - + - -
4 Mucor indicus + + + - - -
5 Rhizomucor variabilis + - - - - -
6 Rhizomucor pussilus + + + - - +
7 Rhizomucor miehei + + + + + +
8 Rhizopus azygosporus + + + + + -
9 Rhizopus microsporus + + + + - -
10 Rhizopus oryzae + + ? + + -
11 Saksenaea vasiformis + + + - - -
12 Syncephalastrum racemosum + + - - - -
13 Malassezia furfur + + - - - -
14 Malassezia pachydermatis + + - - - -
15 Malassezia sloofiae + + - - - -
16 Malassezia sympodialis + + - - - -
17 Arxiozyma telluris + + - - - -
18 Candida albicans + + + + - -
19 Candida chiropterorum + + - - - -
20 Candida dubliniensis + + + - - -
21 Candida glabrata + + + - - -
22 Candida kefyr + + - - - -
23 Candida krusei + + - - - -
24 Candida lusitaniae + + + - - -
25 Candida tropicalis + + - - - -
26 Geotrichum capitatum + + - - - -
27 Pseudoalescheria boydii + - - - -
28 Acremonium alabamense + + + + - -
29 Coccidioides immitis + + + - - -
30 Cladophialophora arxii + + - - - -
31 Cladophialophora bantiana + + - - - -
32 Emmonsia parva + + - - -
33 Epidermophyton floccosum + - - - - -
34 Exophiala dermatitidis + + - - - -
35 Trichophyton mentagrophytes + - - - - -
36 Trichophyton rubrum + - - - - -
37 Trichophyton schoenleinii + - - - - -
38 Trichophyton tonsurans + - - - - -
39 Trichophyton verrucosum + - - - - -
40 Trichophyton violaceum + - - - - -
41 Scedosporium prolificans + + - - - -
42 Sporothichum pruinosum + + + + - -
43 Aspergillus fumigatus + + + + v v
44 Bipolaris specifera + + - - - -
Legend: + (dezvoltare normal), ? (nu sunt date disponibile), v (rspuns variabil), - (absena dezvoltrii)
Teste biochimice i fiziologice
188
Bibliografie selectiv
1. Artal M E (2004) - Diagnstico histopatolgico de las micosis; Rev
Iberoam Micol; 21:1-9.
2. Barnett J A, Payne R W, Yarrow D (2000) - Yeasts: Characteristics and
Identification; 3
nd
edition; Cambridge University Press; Cambridge.
3. Bosnea D, Diaconescu V, Colar L et al. (2003) - Particularitile izolatelor
din hemoculturi la Centrul de Cardiologie Iai (2001-2003); Rev Med
Chir; 107-3(Supl.1):176-179.
4. Buiuc D (1998) - Microbiologie clinic; Ed. Didactic i Pedagogic RA;
Bucureti.
5. Buiuc D, Negu M (1999) - Tratat de microbiologie clinic; Ed. Medical;
Bucureri.
6. Coman I, Mare M (2000) - Micologie medical aplicat; Ed. Junimea;
Iai.
7. Fidel P L, Vazquez J A, Sobel J D (1999) - Candida glabrata: review of
epidemiology, pathogenesis and clinical disease with comparison to
Candida albicans; Clin Microbiol Rev ; 12(1):80-96.
8. Freydire A-M, Guinet R (1997) - Rapid methods for identification of the
most frequent clinical yeasts; Rev Iberoam Micol; 14:85-89.
9. Giammanco G M, Pizzo G, Pecorella S, Distefano S, Pecoraro V, Milici M
(2002) - Identification of Candida dubliniensis among oral yeastisolates
from an Italian population of human immunodeficiency virus-infected
(HIV+) subjects; Oral Microbiol Immunol; 17:89-94.
10. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed.
Viaa Medical Romneasc; Bucureti.
11. Gorka B Z (2002) - Vulvovaginitis candidiasica; Rev Iberoam Micol;
19:22-24.
12. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines dmarche diagnostique;
Elsevier; Paris.
13. Hazen K C, Howell S A (2003) - Candida, Cryptococcus and other yeasts
of medical importance; In Murray P (ed.) - Manual of clinical
microbiology; 8
th
edition.; ASM Press; Washington.
14. Hoog G S de, Guarro J (1995) - Atlas of clinical fungi; Centraalbureau
voor Schimmelcultures; Baarn.
15. Hoog G S de, Guarro J, Gen J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical
fungi; 2
nd
edition; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat
Rovira i Virgili.
16. Jabra-Rizk M A, Ferreira S M S, Sabet M et al.(2001) - Recovery of
Candida dubliniensis and other yeasts from human immunodeficiecy
virus-associated periodontal lesions; J Clin Microbiol ; 39(12):4520-4522.
17. Ribes J A, Vanover-Sams C L, Baker D J (2000) - Zygomycetes in Human
Disease; Clin Microbiol Rev; 13(2):236-301.
18. Salkin I F, Gordon M, Samsonoff W, Rieder C (1985) - Blastoschizomyces
capitatus, a new combination; Mycotaxon; 22:375-380.
Mihai Mare, Olimpia Bazgan
189
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Mihai Mare
9.1. Extracia ADN-ului pentru PCR
e prefer folosirea kit-urilor comercializate (e.g. High Pure PCR Template
Preparation Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)
metodelor artizanale de extracie a ADN-ului. Recomandabil este ca fiecare laborator
s se familiarizeze i s foloseasc de rutin unul, cel mult dou metode / kit-uri de
extracie.
9.2. Extracia ADN-ului cu ajutorul kit-ului
High Pure Template Preparation Kit (levuri)
Principiul metodei
Reactivii acestui kit permit lizarea celulelor ntr-o scurt perioad de timp de
coincubare cu proteinaza K, n prezena unui inactivator al nucleazelor (guanidina
hidrocloric). Acizii nucleici precipit i ader la suprafaa unor fibre de sticl
existente ntr-un microtub, ceea ce ulterior va permite prezervarea lor n timpul
operaiunilor de splare-centrifugare destinate ndeprtrii moleculelor indezirabile. Nu
sunt necesare precipitri sau extracii suplimentare cu solveni organici.
Etape
1) din cultura tulpinii levurice (pe medii solide uzuale, veche de 24-48 ore)
se preleveaz o ans de 10 l bine ncrcat (aproximativ 10
8
- 10
9
celule);
2) se suspensioneaz levurile prelevate ntr-un ml ap purificat / distilat
sterilizat;
3) se centrifugheaz suspensia obinut 5 minute la 10000 rpm;
4) se ndeprteaz supernatantul, apoi se adaug peste sediment 200 l
Tissue lysis buffer (TLB);
5) se adaug 40 l proteinaz K;
6) se vortexeaz energic;
7) se incubeaz la 55C timp de 30 de minute;
8) se centrifugheaz imediat pentru a readuce n supernatant picturile de
condens aprute pe buon;
9) se adaug 200 l Lyis Binding Buffer (LBB);
S
9
Tehnici de micologie molecular
Tehnici de micologie molecular
192
10) se vortexeaz;
11) se incubeaz la 70C timp de 15 minute;
12) se repet etapa nr. 8;
13) se adaug 100 l izopropanol;
14) se vortexeaz;
15) se transfer n microcoloan (disponibil n kit);
16) se centrifugheaz 1 minut la 8000 rpm;
17) se nlocuiete tubul colector pentru microcoloan;
18) se adaug 450 l Inhibitor Removal Buffer;
19) se centrifugheaz 1 minut la 8000 rpm;
20) se repet etapa nr. 17;
21) se adaug 450 l Washing Buffer;
22) se centrifugheaz 2 minute la 13000 - 14000 rpm;
23) se aeaz microcoloana pe un tub Eppendorf de 1,5 ml;
24) se adaug exact n centrul microcoloanei 50 l Elution Buffer prenclzit
la 70C;
25) se centrifugheaz 1 minut la 8000 rpm;
26) se marcheaz corespunztor i se pstreaz la + 4C.
9.3. Extracia ADN-ului prin crioprecipitare (fungi filamentoi)
Principiul metodei
Celulele sunt lizate cu ajutorul cloroformului, dup care ADN-ul este precipitat
prin meninerea la temperaturi sczute.
Etape
1) ntr-un tub Eppendorf de 1 ml capacitate, coninnd 40-100 mg Kieselgel-
2, se introduc 300 l CTAB buffer;
2) se adaug apoi cu ajutorul unei spatule, o mic poriune din colonia de
analizat, care se fragmenteaz n poriuni ct mai mici;
3) se adaug 200 l CTAB buffer;
4) se vortexeaz;
5) se incubeaz la 65C, timp de 10 minute;
6) se adaug 500 l cloroform;
7) se vortexeaz;
8) se centrifugheaz 5 minute la 14000 rpm;
9) se transfer stratul superior ntr-un nou tub Eppendorf;
10) se adaug un volum dublu (aprox. 800 l) de alcool etilic absolut prercit
(+ 4C);
11) se agit uor;
12) se menine amestecul la 20C, minim 30 minute (chiar i pn a II-a zi),
pentru precipitarea ADN-ului;
13) se centrifugheaz 5-10 minute la 14000 rpm;
14) se las n repaus pentru decantare;
15) se spal precipitatul cu alcool etilic 70% rece;
Mihai Mare
193
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Fig. nr. 9-2 Aspectul celor dou tipuri de
benzi dup developarea gelului de agaroz n
bromur de etidiu i fotografiere n UV; n
ordine, de la stnga la dreapta: Candida
albicans martor, Candida dubliniensis
martor i o tulpin de identificat (1B5D - C.
dubliniensis).
Mod de lucru
1 - Se calculeaz cantitile de reactivi necesare preparrii mixului (conform
tabelului 9-1) avnd n vedere cele patru eantioane ce vor fi folosite (martor
pozitiv 1, martor pozitiv 2, martor negativ, proba de testat). Se vor aduga n
plus cantitile de reactivi necesare pentru nc un eantion, astfel nct n
momemtul divizrii mix-ului, cantitile necesare pentru cele patru eantioane s
fie suficiente.
Tabelul 9-1
Prepararea mixului
Numr de eantioane: 4+1
MIX Volum / eantion (l) Volum / Mix (l)
PCR Buffer 10x 2 10
MgCl
2
25 Mm 2 10
dTTP, dATP, dCTP, dGTP 2,5 mM 2 10
Amorse
DUBF (20 M) 0,5 2,5
DUBR (20 M) 0,5 2,5
ITS 1 (20 M) 0,5 2,5
ITS 4 (20 M) 0,5 2,5
Amplitaq gold
5 U/l
0,25 1,25
Ap purificat
ad 20 l
10,5 52,5
ADN 1 l
Tehnici de micologie molecular
196
2. Se decongeleaz reactivii (cu excepia Amplitaq gold) i se menin la ghea
pn la utilizare;
3. Se prepar mixul, se adaug enzima i apoi se vortexeaz;
4. Se distribuie mixul n tuburi PCR de 0,2 ml;
5. Se adaug:
- 1 l ADN Candida albicans n eantionul pentru martorul pozitiv 1;
- 1 l ADN Candida dubliniensis n eantionul pentru martorul pozitiv 2;
- 1 l ADN tulpin de identificat n eantionul probei de testat;
- 1 l ap purificat n eantionul martorului negativ.
6. Se introduc tuburile n thermocycler i se supun urmtorului regim termic:
50C/5 minute
95C/ 10 minute
apoi, 94C/ 30 sec.
58C/ 30 sec.
72C/ 30 sec.
30 cicluri
apoi, 72C/ 10 minute
7. Dup ncheierea amplificrii, eantioanele se menin la + 4C pn la
vizualizarea pe gel de agaroz.
9.6. Identificarea molecular a levurilor prin PCR
i secvenializarea regiunilor ITS
Reactivii necesari acestei tehnici constau n:
- matricea ADN care conine regiunea de amplificat (n cazul de fa :
ITS 1 i ITS 4 din cadrul ADN-ului codant al ARN-ului ribozomal);
- doi primeri (amorse) specifici care identific nceputul i sfritul
regiunii de amplificat;
- ADN-polimeraza care copie regiunea de amplificat;
- nucleotide, cu ajutorul crora ADN-polimeraza va genera noul ADN;
- soluia tampon care asigur condiiile de reacie necesare activitii
ADN-polimerazei;
Primeri pentru regiunile ITS
ITS 1 : 5-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG (3)
ITS 4 : 5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC (3)
ITS 5: 5-GGA AGT AAA GTC GTA ACA AGG (3)
LR6: 5-CGC CAG TTC TGC TTA CC (3)
V9D: 5-TTA AGT CCC TGC CCT TTG TA (3)
LS266: 5- GCA TTC CCA AAC AAC TCG ACTC (3)
Mihai Mare
197
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Tehnica de lucru
1. Se decongeleaz reactivii necesari (cu excepia enzimei Taq) i apoi se menin la
ghea pn n momentul utilizrii;
2. Se calculeaz cantitile necesare pentru amplificarea numrului de eantioane
luate n lucru (conform tabelului 9-2), adugnd totdeauna un supliment pentru
un eantion n plus (n vederea suplinirii pierderilor din timpul pipetrii
ulterioare a mix-ului). Volumul final al fiecrui eantion va fi de 50 l. Astfel,
dac avem doar o singur prob de ADN pentru identificare, vom pregti un
mix pentru 3+1 eantioane: proba ADN pentru identificare, un martor pozitiv,
un martor negativ i un eantion suplimentar; n cazul a dou probe pentru
identificare: 4+1 .a.m.d.
Tabelul 9-2
Prepararea mixului
Reactivi
Volum/eantion
(l)
Volum/ total mix (l)
Concentraia
final
Tampon PCR 10x 5 (nr. eantion+supliment)x5 1x
MgCl
2
25 mM 5 (nr. eantion+ supliment)x5 2,5 mM
dNTP 2,5 mM 5 (nr. eantion+ supliment)x5 0,25 mM
Primer ITS 1 20M
sau primer V9D 20
M
1,25
(nr. eantion+
supliment)x1,25
25 p mol
Primer ITS 4 20 M
sau primer LS 266
20 M
1,25
(nr. eantion+ supliment)x
1,25
25 p mol
Amplitaq Gold 5U/
l
0,25
(nr. eantion+
supliment)x0,25
1,25 U
Ap distilat steril
ad 45 l
27,25
(nr. eantion+
supliment)x27,25
-
ADN * 5 l -
* fiecare eantion cu ADN-ul su, exceptnd martorul negativ i eantionul
suplimentar
3. Se vortexeaz mix-ul i se repartizeaz cte 45 l n tuburi PCR cu volum de
0,2 ml;
4. Se adaug n fiecare tub (martor pozitiv, probe de analizat) 5 l ADN,
omogeniznd apoi coninutul cu ajutorul pipetei;
5. Se plaseaz tuburile n thermocycler i se supun urmtorului regim termic:
95C/ 10 min
apoi, 94C/ 30 sec.
58C/ 30 sec.
72C/ 30 sec.
30 cicluri
apoi, 72C/ 10 min.
Tehnici de micologie molecular
198
6. Purificarea produilor PCR obinui, cu ajutorul kit-urilor comercializate (de tip
QIAquick, Qiogen)
Aceast etap este necesar pentru ndeprtarea primerilor, nucleotidelor,
enzimelor, srurilor, agarozei, bromurii de etidiu i a altor impuriti restante n
eantioanelor de ADN i obinerea n stare pur a regiunilor amplificate prin PCR.
- se transfer produii de PCR ntr-un tub Eppendorf de 1,5 ml;
- se adaug un volum de 5 ori mai mare de tampon PB i se omogenizeaz (225 l
tampon PB pentru 45 l);
- se introduce amestecul ntr-o coloan QIAquick;
- se centrifugheaz apoi timp de 30-60 sec la 13000 rpm pentru fixarea ADN-ului
pe coloan;
- se ndeprteaz faza lichid, plasndu-se coloana pe acelai tub colector;
- se spal ADN-ul fixat pe coloan adugnd 0,75 ml tampon PE i se
centrifugheaz apoi 30-60 sec la 13000 rpm;
- se ndeprteaz lichidul i se recentrifugheaz;
- se aeaz coloana pe un tub Eppendorf de 1,5 ml;
- se elueaz ADN-ul prin depunerea strict n centrul membranei a 50 l tampon
EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5);
- se menine 1 minut la temperatura camerei;
- se centrifugheaz 1 minut la 13000 rpm;
7. Verificarea produilor de PCR prin migrare n gel de agaroz.
Precizri importante
- gel de agaroz 3% n TAE 1x;
- eantioanele ce urmeaz a fi pipetate se compun din 5 l produs PCR i 2 l
albastru de bromfenol;
- martorii de greutate molecular ce urmeaz a fi co-pipetai (500 g/ml) se prepar
din 1 l marker 100 pb, 9 l ap distilat steril i 2 l albastru de bromfenol
6x;
- migrare timp de o or la 100 V;
- developare n baie cu bromur de etidiu, timp de minim 15 minute;
- vizualizarea gelului n lumin UV (la transluminator i fotografierea benzilor de
ADN).
8. Secvenializarea fragmentelor de ADN amplificate prin PCR (de preferat
utiliznd un secvenializator de tip BigDye Perkin Elmer, SUA)
9.Analiza secvenelor cu ajutorul unui soft specializat (e.g. CHROMAS fig. nr.
9-3) i compararea cu secvenele dintr-o baz de date n vederea detectrii
speciilor cu un nalt grad de omologie a secvenelor. Sistemul BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool) (fig. nr. 9-4) i baza de date GenBank a National
Center for Biotechnology Information (NCBI) - Bethesda (SUA) sunt cele mai
utilizate mijloace pentru identificarea fungilor (adresa URL:
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Mihai Mare
199
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Fig. nr. 9-3. Interfaa de lucru a software-ului CHROMAS
Fig. nr. 9-4. Pagina de lucru pentru analiza secvenelor de ADN
Tehnici de micologie molecular
200
9.7. Reactivi utilizai n tehnicile de biologie molecular
- CTAB tampon
Tris ............................................ 2,42 g
Clorur de sodiu .......................... 8,2 g
EDTA sodic .............................. 0,74 g
Bromur de cetil-amoniu ............ 2,0 g
Ap bidistilat .......................... 100 ml
Se ajusteaz pH-ul la valoarea 7,5
cu ajutorul unei soluii HCl 1N.
Se autoclaveaz 15 minute la
121C. Se pstreaz la temperatura camerei.
- Proteinaza K
Proteinaz K .......................... 10 U/ml
Tris (pH 7,4) .............................. 0,24 g
Clorur de calciu dihidrat ........ 3,0 mg
Ap bidistilat .......................... 100 ml
Se sterilizeaz prin filtrare i se
pstreaz n fiole la -20C.
- TAE tampon 50x (Tris-acetate
EDTA buffer 50x)
Tris-HCl ...................................... 240 g
Acid acetic glacial .................. 57,1 ml
EDTA disodic 0,5 M ............... 100 ml
Ap bidistilat ................... ad 1000 ml
Se sterilizeaz prin autoclavare timp
de 15 minute la 121C. Se stocheaz la
temperatura camerei. Se dilueaz cu ap
bidistilat n momentul folosirii.
- TE tampon (Tris-EDTA buffer)
Tris ............................................ 0,12 g
Na-EDTA .................................. 0.04 g
Ap bidistilat ..................... ad 100 ml
Se ajusteaz pH-ul la valoarea 8,0 cu
soluie NaCl 1 N. Se sterilizeaz prin
autoclavare timp de 15 minute la 121C. Se
stocheaz la temperatura camerei.
- TBE tampon (Tris Borate ETDA
buffer)
Tris ............................................ 108 g
Acid boric ..................................... 55 g
EDTA tetrasodic ......................... 9,3 g
Ap bidistilat ................... ad 1000 ml
pH 8,3
- PB tampon (Phosphate Buffer 0,2 M)
Fosfat disodic anhidru ............... 21,8 g
Fosfat monosodic anhidru ........... 6,4 g
Ap bidistilat .................. ad 1000 ml
Se ajusteaz pH-ul la 7,4; se
stocheaz la temperatura camerei.
- PE tampon (Phosphate Elution
Buffer)
Const ntr-o soluie 4mM de fosfat
monopotasic care se prepar prin diluarea cu
ap bidistilat a unei soluii stoc de fosfat
monopotasic 1M.
Mihai Mare
201
C
a
p
i
t
o
l
u
l
Bibliografie selectiv
1. Donnely S M, Sullivan D J, Shanley D B, Coleman D C (1999) - Phylogenetic
analysis and rapid identification of Candida dubliniensis based on analysis of
ACT 1 intron and exon sequences; Microbiol; 145(8):1871-1882.
2. Hoog de G S, Guarro J, Gen, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical fungi; 2
nd
edition ; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.
3. Kawasaki M, Aoki M (2006) - Application of molecular biological techniques to
medical mycology; In Topley & Wilsons, Microbiology and Microbial
Infections 10
th
edition; Hodder Arnold.
4. Kurtzman C P, Boekhout T, Robert V, Fell W, Deak T (2003) - Methods to
identify yeasts; In: Boekhout T, Robert V (eds) - Yeasts in Food; B.Behrs
Verlag GmbH & Co; Hamburg; Germany.
5. Peman J, Martin-Mazuelos E, Rubio Calvo M C (eds) (2001) - Guia Practica de
Identificacion y Diagnostico en Micologia Clinica; Rev Iberoam Micol; Bilbaos.
Mihai Mare
203
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
0
Mihai Mare
Tabelul 10-1
Codul i intervalul concentraiilor de antifungic al benzilor E-test
(AB Biodisk, Solna-Suedia)
Cod Denumire antifungic Intervalul concentraiilor
(m /ml)
AP Amfotericin B 0,002 32
FC 5 Flucitozin 0,002 32
FL Fluconazol 0,016 256
IT Itraconazol 0,002 32
VO Voriconazol 0,002 32
CS Caspofungin 0,002 32
POS Posaconazol 0,002 - 32
10.1. Tehnica de lucru pentru levuri
(fungi din genurile Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon)
1 - Prepararea inoculului
Pornind de la culturi efectuate pe Agar Sabouraud sau PDA, vechi de 24 ore
(Candida spp.) sau 48-72 ore (Cryptococcus neoformans) se prepar o suspensie n ser
fiziologic sterilizat utiliznd ansa microbiologic.
Densitatea suspensiei se ajusteaz la valoarea 0,5 McFarland pentru levurile genului
Candida i 1 McFarland n cazul tulpinilor de C.neoformans.
2 - nsmnarea mediului
Ca mediu de testare se folosete Agar RPMI MOPS glucoz 2%, cu grosime de 4
0,5 mm. n cazul amfotericinei B, pentru depistarea cu acuratee a rezistenei este
recomandat mediul AM3.
n vederea nsmnrii mediului, se depun n centrul plcii cca. 200 l inocul (pentru
cele cu 90 mm) sau 400 l (pentru cele cu 150 mm). Inoculul se disperseaz apoi n trei
direcii cu ajutorul unui tampon. Plcile se las n repaus la 35C timp de 1015 minute,
10
Tehnici de evaluare a sensibilitii la
antifungice
Tehnici de evaluare a sensibilitii la antifungice
204
pentru uscarea suprafeei mediului (o alternativ ar fi expunerea suprafeei mediului la fluxul
de aer laminar dintr-o hot microbiologic cls. II).
3 - Alegerea antifungicelor
n funcie de tulpinile testate vom alege benzile E-test cu antifungice (tabelul 10-2).
Tabelul 10-2
Alegerea antifungicelor pentru testare
Trichosporon spp. Candida spp. Cryptococcus spp. Rhodotorula spp.
AP (CMI-uri
obinuit crescute)
FL
IT
VO
AP
CS (frecvent CMI-uri
crescute pentru
C.parapsilosis)
FC
FL (rezisten
primar pentru
C.krusei)
IT
VO
AP
FL
VO
AP
FL(frecvent CMI-uri
crescute)
IT
VO
4 - Aplicarea benzilor E-test
- Numrul optim al benzilor ce vor fi aplicate este de 5/plac 150 mm i 1/plac
90 mm, dispuse radiar, concentraia maxim fiind plasat excentric;
- Benzile se stocheaz la -20C i se las la temperatura camerei 15 20 de minute,
nainte de a fi utilizate;
- Benzile se pot aplica cu ajutorul unei pense, cu aplicatorul manual, cu stiloul
vacuumatic Nema C88 sau cu aplicatorul automat Simplex C76. Dup aplicare, se verific
contactul ntre benzi i mediu, eliminnd prin presare eventualele bule de gaz;
- Benzile se aplic cu scala gradat nspre capacul plcii i cu concentraia maxim
spre periferia acesteia;
- Odat aplicate, benzile nu se mic.
5 - Incubarea plcilor se face cu capacul n jos, timp de 24-48 ore (Candida spp.) i 48-72 de
ore (C.neoformans).
6 - Citirea concentraiei minime inhibitorii (CMI) se face lund n considerare punctul n care
elipsa zonei de inhibiie intersecteaz banda E-test.
Reguli de citire a CMI n cazul levurilor
- AP: se va ine cont de toate coloniile ; citire la 100% inhibiie (fig. nr. 10-1);
- FL, IT, VO: citire la 80 % inhibiie; se ine cont de prima schimbare n modul de cretere a
coloniilor (diminuarea dimensiunilor acestora). Nu se va ine cont de microcolonii (chiar
semiconfluente) care pot apare n interiorul zonei de inhibiie. n schimb, dac sunt prezente
macrocolonii ele semnific heterorezisten (prezena unei clone rezistente pe lng cea
sensibil) i se va raporta CMI-ul maxim (fig. nr. 10-2);
Atenie! Plcile se citesc sistematic la 24 i 48 de ore.
- FC: citire la 90- 95 % inhibiie. Nu se ine cont de microcoloniile ce pot apare la periferia
zonei de inhibiie (fig. nr. 10-3);
Mihai Mare
205
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
0
- CS : citire la 100 % inhibiie. Poate apare uneori efecul paradoxal de cretere - microcolonii
n jurul concentraiilor maxime: nu va fi luat n considerare la lectura CMI (fig. nr. 10-4);
n cazul asimetriilor (concentraii diferite pe cele dou laturi ale benzii E-test) se va raporta
drept CMI concentraia cea mai mare.
Fig. nr. 10-1. Aspectul zonei de inhibiie n
cazul AP (CMI: 0,064 mg/l)
Fig. nr. 10-2. Aspectul zonei de inhibiie n
cazul FC (CMI: 0,064 mg/l)
Tehnici de evaluare a sensibilitii la antifungice
206
Fig. nr. 10-3. Aspectul zonei de inhibiie
n cazul unei tulpini de C. krusei
(rezisten la FL); CMI: > 256 mg/l
Fig. nr. 10-4. Aspectul zonei de inhibiie
n cazul CS (CMI: 0,094 mg/l)
10.2. Tehnica de lucru pentru fungi filamentoi
(fungi din genurile Aspergillus, Fusarium, Rhizopus, Scedosporium)
1- Prepararea inoculului
Peste culturile de 5-7 zile dezvoltate pe SDA sau PDA nclinat, se adaug 1-2
ml ser fiziologic steril i cu ajutorul unei pipete Pasteur sau anse microbiologice se
realizeaz o suspensie de spori i hife care se transfer ntr-un tub steril. Acesta se
vortexeaz uor i apoi se las n repaus cca. 15-20 minute pentru sedimentarea
particulelor grosiere. Dup expirarea acestui interval de timp, supernatantul se
recupereaz i se transfer n alt tub steril. Turbiditatea acestuia se ajusteaz cu ser
fiziologic la 0,5 McFarland sau se corecteaz astfel nct s se obin o transmitan de
cca. 70% prin citire la spectrofotometru (530 nm). Concentraia obinut va fi de cca.
10
6
UFC/ml inocul.
2- Inocularea plcilor
Se realizeaz n mod similar celui prezentat pentru levuri.
3- Alegerea antifungicelor (tabelul 10-3)
Mihai Mare
207
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
0
Tabelul 10-3
Alegerea antifungicelor pentru testare
Aspergillus spp. Fusarium spp. Rhizopus spp. Scedosporium spp.
AP (A.terreus
rezisten primar)
CS
IT
POS
VO
AP
VO
POS
AP
POS
CS
*
POS
*
VOR
*
*doar pentru S. apiospermum i S.aurantiacum
4 - Aplicarea benzilor E-test
Se realizeaz n mod similar celui prezentat la levuri.
5 - Incubarea plcilor
Se realizeaz la 35C timp de 24-48-72 de ore n funcie de dinamica dezvoltrii
fiecrei tulpini. Pentru tulpinile de Fusarium spp. plcile se incubeaz la 35C timp de
24-48 de ore, apoi se menin la 25C pentru 24-48 ore n vederea clarificrii CMI.
6 - Citirea CMI:
- Rhizopus spp. - la 18-24 ore;
- celelalte specii- 24-48 (chiar 72 ore pentru tulpinile cu cretere lent) .
Reguli de citire a CMI n cazul fungilor filamentoi
- AP: citire la 100% inhibiie; elipsa zonei de inhibiie trebuie s fie clar (fig. nr. 10-5)
- IT, VO, POS : citire la 100% inhibiie (fig. nr. 10-6)
- CS : citire la inhibiie parial (fig. nr.10-7)
Fig. nr. 10-5 Aspectul zonei de
inhibiie n cazul AP
(CMI: 16 mg/l)
Tehnici de evaluare a sensibilitii la antifungice
208
10.3. Testarea sensibilitii la antifungice prin metoda difuzimetric Kirby-Bauer
(cu discuri)
Pentru testarea sensibilitii la voriconazol i fluconazol a levurilor din genul
Candida i Cryptococcus se poate folosi i metoda recomandat de CLSI (M44-A). n
acest scop, se utilizeaz ca mediu de testare Agarul Meller-Hinton aditivat cu 2%
glucoz (ca agent de stimulare a creterii) i 0,5 g/ml albastru de metilen (pentru
evidenierea optim a conturului zonelor de inhibiie a creterii), volumul repartizat n
Fig. nr. 10-6. Aspectul zonei
de inhibiie n cazul IT
(CMI: 0,75 mg/l)
Fig. nr. 10-7. Aspectul zonei de
inhibiie n cazul CS
(CMI: 0,047 mg/l)
Mihai Mare
209
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
0
1
1
Ingrid Cezara Apetrei
gam variat de metode analitice este astzi disponibil pentru a studia
agenii biologici din spatele uilor nchise. Din moment ce nu exist la ora
actual o metod standardizat, universal acceptat, n plan naional i internaional
pentru determinarea / cuantificarea fungic de macro / microclimat, studierea
comparativ a mai multor metode sau tehnici de recoltare i analiz va servi unei mai
bune aprecieri ambientale, dezideratul final constnd n scderea ncrcturii
microbiologice n ansamblu. n general, ncrctura fungic de microclimat ar trebui s
aib coresponden cu cea exterioar n privina genurilor / speciilor identificate i s
fie mai redus din punct de vedere cantitativ.
Fungii aeropurtai sunt factori antisanogeni binecunoscui, producnd alergeni,
substane cu efect iritant i/sau toxic. Inhalarea sau contactul direct cu aceste subtane
pot induce la indivizii mai sensibili un rspuns alergic amplu cu episoade febrile,
strnut, congestie conjunctival, rinoree, dermatit etc. n funcie de particularitile
imunitare ale fiecrui caz n parte, rspunsul alergic poate fi imediat sau ntrziat.
Cercetrile privind influena sporilor fungici din habitate asupra sntii umane sau
animale sunt n continu desfurare. Dac se constat un nivel fungic mai ridicat n
spaiile nchise dect n exterior, atunci sigur se poate vorbi de existena unor factori
care favorizeaz aceast schimbare a raportului de fore. n plus, identificarea anumitor
genuri / specii fungice, chiar n cuantum sczut, la nivel de microclimat, impune
efectuarea unor evaluri ulterioare ce s conduc la interpretri statistice. Scopul
recoltrii probelor este acela de a aprecia ntregul prin analiza subseturilor
populaionale ale acestuia. La ora actual exist o multitudine de metode de testare ce
pot fi utilizate pentru detecia fungilor aflai n aerosuspensie sau sedimentai i a celor
care se dezvolt pe diverse suporturi / substraturi inerte din diverse spaii.
O
11
Tehnici de aeromicologie
Tehnici de aeromicologie
212
11.1. Caseta AIR-O-CELL
2
Principii procedurale
Caseta Air-O-Cell destinat colectrii probelor de aer este un dispozitiv
destinat analizrii rapide a unei game variate de particule aerosolizate (aeroparticule),
precum spori fungici, pollen, celule epiteliale, fibre, particule anorganice sau poriuni
din corpul unor insecte (fig. nr. 11-1).
Aerul ptrunde n caset absorbit cu ajutorul unei pompe, iar particulele sunt
impactate pe un substrat incolor i aderent, ntr-o camer numit capcan de spori, ca
apoi acesta s fie eliberat printr-un orificiu de evacuare.
Designul i construcia casetei sunt gndite de o aa manier nct particulele
aspirate s fie distribuite i depozitate uniform pe suprafaa aderent a lamei de sticl
din interior.
Beneficii
Acest instrument de recoltare este util pentru testrile iniiale, mai ales atunci
cnd creterea fungic nu este vizibil. Este o tehnic rapid, simpl i ferit de
contaminrile ce pot surveni n timpul manoperelor clasice.
Dezavantaje
Fungii nu vor putea fi identificai cu uurin la nivel de specie prin utilizarea
acestei metode, deoarece ei nu sunt cultivabili. De exemplu, Aspergillus spp. i
Penicillium spp. sunt de cele mai multe ori identificate mpreun ca urmare a
similitudinilor privind morfologia sporilor. Viabilitatea sporilor nu va putea fi de
asemenea analizat. Calibrarea fluxului de aer nu va putea fi modificat dect la cerere,
depinznd de posibilitile firmei productoare, iar caseta va fi utilizat doar cu
minipompa furnizat la livrare (fig. nr. 11-2).
Fig. nr. 11-1 Caseta AIR-O-CELL
Prelevarea probelor
Caseta este destinat pentru un debit de aspirare de 15 l/minut. Dac rata de
absorbie scade, sporii se pot pierde iar repartizarea particulelor n ansamblu se va
2
Air-O-Cell este marc nregistrat a Zefon International. EMSL Analytical
Fig. nr. 11-2. Mini pomp
ZEFON, adaptat
Casetei AIR-O-CELL
Ingrid Cezara Apetrei
213
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Determinarea greutii probei recoltate
Determinarea masei prafului colectat se realizeaz prin cntrirea cupei de
rotaie ce conine filtrul poliuretanic, att nainte ct i dup colectarea probelor,
utilizndu-se o balan electronic de laborator cu o deviaie standard admis de maxim
0,1 mg. Filtrul poliuretanic este sensibil la umiditatea aerului, de aceea formula final
de calcul va ine cont de schimbrile majore privind umiditatea relativ a zonei de
microclimat unde are loc recoltarea.
INRS recomand urmtoarea succesiune procedural:
- Pregtirea cupei se va realiza cu atenie: va fi splat cu o soluie decontaminant
fierbinte i cltit de mai multe ori, de preferat numai cu ap distilat steril;
- Va fi lsat 12 ore s se usuce la temperatura de 50C - 60C;
- Filtrul se va pregti separat i se va pstra ntr-un loc uscat ferit de praf sau alte
impuriti;
- Se vor purta mnui de protecie pe toat durata desfurrii manoperelor de
recoltare.
Procesarea probelor dup recoltare
Dup recoltare, cupele sunt recondiionate de maniera amintit anterior, fiind
totui recomandat plasarea lor, dup nlturarea capacului protector, ntr-un termostat
la 50 60C timp de 4 ore, dac prelevarea a avut loc ntr-un spaiu cu umiditate
relativ prea ridicat. Dup condiionare, se determin masa probei colectate cu
formula:
H = H
m
-H
unde:
H
m
- reprezint diferena de greutate a cupelor nainte i dup recoltare;
H
- reprezint cea mai mare valoare de diferen nregistrat ntre cele dou cntriri,
nainte i dup recoltarea probelor.
Determinarea concentraiei particulelor
Concentraia se calculeaz n mg/m
3
fiind determinat prin formula :
C [
mg
m
3
=
M
F
unde :
M - reprezint masa probei colectate, dup specificaiile amintite (n mg);
V - reprezint volumul de aer filtrat (n m
3
).
Tehnici de aeromicologie
224
Manipularea filtrului poliuretanic al dispozitivul CIP 10
Filtrul poliuretanic este deosebit de rezistent la aciunea agenilor chimici i
stabil din punct de vedere structural. Poate fi splat prin metode uzuale, incinerat sau
mineralizat funcie de tipul analizei ce urmeaz a fi realizat.
Urmtoarele operaiuni de splare sunt permise asupra filtrului poliuretanic, n
vederea recuperrii prafului recoltat:
- Se las filtrul ntr-o soluie cald de splare,15 minute;
- Se extrage din soluie cu mna protejat de mnui;
- Se cltete cu ap distilat de mai multe ori pn cnd soluia de splare rmne
clar;
- Se recupereaz i praful depus la baza cupei de recoltare tot prin splare i se
adaug lichidului deja obinul prin splarea filtrului;
- Urmeaz filtrarea i centrifugarea n vederea recuperrii depozitului de analizat,
pierderile ce apar pe parcursul desfurrii manoperelor fiind neglijabile
11.8. Aprecierea ncrcturii fungice aeropurtate
prin tehnica sedimentrii Koch
Se utilizeaz plci Petri sterilizate, cu diametrul de 90 mm, n care se
repartizeaz cte 15-20 ml mediu agarizat special destinat cultivrii fungilor
(Sabouraud cloramfenicol agar, PDA, Agar cu extract de mal). Se oprete instalaia de
climatizare i n absena personalului de lucru se expun plcile cu mediu, fr capac, n
anumite puncte prestabilite, un interval de timp variabil ntre 5 i 15 minute.
n fiecare punct de recoltare se expun cte 2 plci din fiecare mediu. Pe
capacul fiecrei plci se inscripioneaz tipul de mediu, data i ora recoltrii, poziia
plcii, timpul de expunere. Dup expirarea timpului de expunere stabilit, plcile se
acoper cu capacele proprii, se nvelesc n hrtie i se transport n caserole de plastic
la laborator, unde se incubeaz, la temperatura de 25
o
C. Obligatoriu, n paralel se
incubeaz cte o plac martor coninnd aceleai medii, fr a fi deschise n prealabil.
Dup 5 zile se monitorizeaz eventuala dezvoltare a coloniilor i se calculeaz
nr. UFC /m
3
aer.
N.0PC
m
3
uc
=
N 10 000
SK
N - media numrului de colonii dezvoltate pe suprafaa mediului din cele 2 plci
expuse;
S - suprafaa plcii (cm
2
) (3,14 x R
2
);
K - coeficientul timpului de expunere: pentru 5 minute este egal cu 1, pentru
10minute este egal cu 2, iar pentru 15minute este egal cu 3.
Ingrid Cezara Apetrei
225
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
1
1
1
Bibliografie selectiv
1. Barry S L, Wegman D H (2000) - Occupational Health: Recognizing &
Preventing Work - Related Disease & Injury, 4
th
edition; Lippincott
Williams & Wilkins.
2. EMSL Analytical (2003) - LARO-100 Sampling Guide.
3. Goddish Thad (2002) - Indoor Environment Notebook: Everything You
Wanted to Know About Indoor Air Pollution and More; Ball State
University, Department of Natural Resources and Environmental
Management; LARO-100 Product Information.
4. Grinshpun Surgey A (2002) - Collection and Enumeration of Airborne
Spores Using Aerosol Impactors with Low Jet-To-Plate Distance, Project
3, Micro5 Microcell (5 lpm); University of Cincinnati Environmental
Health Foundation.
5. * * * - Minnesota Department of Health (2003) - Environmental Health in
Minnesota: Testing for Mold; Sampling methodology for fungal
bioaerosols and amplifiers in cases of suspected indoor mold proliferation.
6. * * * - Qualit de lair. Air des lieux de travail - Dtermination du dpt
alvolaire de la pollution particulaire. Mthode de la coupelle rotative.
(Air-Quality: Workplace Air - Gravimetric determination of particulate
pollution deposits. Rotating disk method); NF X43-262.
7. * * * - Atmosphres sur les lieux de travail - Dfinition des fractions de
taille pour le mesurage des particules en suspension dans lair. (Workplace
Atmospheres - Size fraction definitions for measurement of airborne
particles.); NF EN 481 X43-276.
8. * * * - Air des lieux de travail - Dtermination par rayons X de la
concentration de dpt alvolaire de silice cristalline- chantillonnage par
dispositif coupelle rotative. (Workplace Air - X-Rays Determination of
the conventional alveolate fraction of crystalline silica - Sampling using a
rotating cup device); NF X43-295.
9. * * * - Qualit de lair - Dfinitions des fractions de taille des particules
pour lchantillonnage li aux problmes de sant. (Air Quality - Particle
size fraction definitions for health related sampling); NF ISO 7708.
10.* * * - Air des lieux de travail - Dosage par spectromtrie infrarouge
transforme de Fourier de la silice cristalline - chantillonnage par
dispositif coupelle tournante ou sur membrane filtrante. (Workplace Air -
Fourier Transform Infrared Spectrometric determination of crystalline
silica - Sampling using a rotating cup device or filtering membrane); XP
X43-243.
Luminia-Iuliana Malic
229
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
2
Luminia-Iuliana Malic
12.1. Clasificarea fungilor n funcie de clasele de risc biologic
n funcie de gradul de risc biologic pe care microorganismele l prezint
pentru om, acestea se clasific n trei clase:
- Clasa I cuprinde acele microorganisme care rareori pot manifesta risc de
mbolnavire la om i animale;
- Clasa II cuprinde acele microorganisme care pot cauza apariia de afeciuni la
om i animale i pot reprezenta un pericol pentru personalul din laborator risc
individual redus, risc colectiv neglijabil. Profilaxia i tratamentul folosite n
afeciunile cauzate de aceste microorganisme sunt eficace. Cuprinde
majoritatea fungilor de interes clinic (tabelul 12-1);
- Clasa III cuprinde acele microorganisme care pot cauza afeciuni la om i care
reprezint un real pericol pentru personalul din laboratoarele de micologie
risc individual mare, risc colectiv semnificativ. De asemenea, exist riscul
diseminrii n colectivitate. Tratamentul i profilaxia sunt eficace;
- Clasa IV cuprinde acele microorganisme care pot cauza afeciuni grave la om i
care reprezint un pericol pentru personalul din laborator risc individual
crescut, risc colectiv crescut. De asemenea, exist riscul de contaminare a
colectivitilor, iar de cele mai multe ori, nu exist un tratament eficace al
afeciunilor cauzate de aceste microorganisme
12
Norme generale de biosecuritate n
laboratoarele de micologie medical
Norme generale de biosecuritate n laboratoarele de micologie medical
230
Tabel 12-1
Clasificarea principalelor specii de fungi n funcie de grupa de risc biologic i
capacitatea alergizant
Specia
Clasa de
risc
biologic
Capacitatea
alergizant
Aspergillus fumigatus 2 X
Blastomyces dermatitidis 3
Candida albicans 2 X
Cladophialophora bantiana 3
Candida tropicalis 2
Coccidioides immitis 3 X
Cryptococcus neoformans var. neoformans 2 X
Cryptococcus neoformans var. gattii 2 X
Emmonsia parva var. parva 2
Emmonsia parva var. crescens 2
Epydermophyton floccosum 2 X
Fonsecaea compacta 2
Fonsecaea pedrosoi 2
Histoplasma capsulatum var. capsulatum 3
Histoplasma capsulatum var. duboisii 3
Madurella grisea 2
Madurella mycetomatis 2
Microsporum spp. 2 X
Paracoccidioides brasiliensis 3
Penicillium marneffei 2 X
Scedosporium apiospermum 2
Scedosporium prolificans 2
Sporothrix schenckii 2
Trichophyton rubrum 2
12.2. Norme generale de biosecuritate
- Accesul n laborator este permis doar personalului autorizat;
- Personalul din laborator trebuie s participe la implementarea i respectarea
normelor de biosecuritate;
- Pardoseala laboratorului va fi confecionat din materiale rezistente acoperite cu
rini epoxidice sau linoleu antistatic, neted, uor lavabil;
- Pe uile de acces n Laboratorul de Micologie Medical se va aplica semnul
internaional Pericol biologic (Biohazard) care, n cazul acestor laboratoare
corespunde nivelului 2 de securitate microbiologic (fig. nr. 12-1). Cu acelai
semn se vor marca frigiderele i congelatoarele folosite pentru pstrarea
microorganismelor cu risc biologic 2;
Luminia-Iuliana Malic
231
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
2
Fig. nr. 121. Semnul convenional pentru risc biologic (Biohazard)
- Uile i ferestrele laboratorului trebuie sa fie n permanen nchise pentru
asigurarea izolrii spaiului;
- Laboratorul va fi separat de zona de circulaie a personalului cu ajutorul unui sas;
- Laboratorul trebuie s fie n permanen ventilat forat. Aportul de aer va fi de
cca. 60 m
3
per persoan per or;
- Toate suprafeele de lucru se vor spla i dezinfecta zilnic. Toate reziduurile vor
fi incinerate n incinte speciale, autorizate, iar depozitarea i transportul
acestora se va face n cutii nchise ermetic, rezistente i impermeabile, n
funcie de fiecare tip de reziduu, marcate de asemenea cu semnul de risc
biologic;
- Laboratorul trebuie s beneficieze de un lavoar pentru splarea minilor, care s
funcioneze prin acionarea cu ajutorul cotului sau cu o pedal;
- Transportul probelor de la i ntre laboratoare se va realiza cu ajutorul lzilor
izoterme, ermetice, rigide, rezistente la lovituri, uor de curat i dezinfectat;
- Personalul din laborator va evita contactul direct cu materialele potenial
patogene. n acest scop se va folosi echipament de protecie adecvat n
momentul manevrrii probelor sau a culturilor fungice. Echipamentul de
protecie va fi ndeprtat n momentul prsirii zonei de lucru. Minile se vor
spla n mod repetat cu spun lichid antiseptic, dup fiecare ndeprtare a
mnuilor de protecie;
- Este interzis pipetarea materialului patologic cu gura;
- n zona de lucru nu se vor depozita cri sau hrtii, deoarece sunt dificil de
sterilizat;
- n laboratoarele de micologie medical sunt strict interzise:
Consumarea de alimente sau buturi de orice fel;
Depozitarea de alimente i buturi;
Folosirea lentilelor de contact;
Norme generale de biosecuritate n laboratoarele de micologie medical
232
Aplicarea de produse cosmetice;
- Plgile se vor acoperi cu bandaj nainte de aplicarea echipamentului de
protecie.
12.2.1. Tehnici de laborator folosite n zona de lucru
- Toate culturile fungice (n special la speciile cu miceliu aerian sporulat) i
prelevatele clinice se vor manevra de preferat n interiorul unei hote de
protecie biologic clas II, pentru evitarea contaminriii personalului i
incintei laboratorului;
- Plcile ce conin mediu de cultivare pentru fungi se vor nchide i se vor aeza cu
capacul n jos pentru evitarea deschiderii accidentale i contaminrii;
- Incubarea plcilor se va face n termostate cu umidificatoare;
- n cazul utilizrii mediilor de cultivare repartizate n tuburi, acestea trebuie s
beneficieze de dopuri fixe, sigure;
- Deschiderea plcilor i tuburilor ce conin medii de cultivare se va face doar sub
protecia unei hote microbiologice de clas II sau n vecintatea flcrii unui
bec de gaz;
- n cazul fungilor dimorfici se impune analizarea acestora sub protecia unei hote
de securitate biologic grad III. Plcile cu astfel de culturi se etaneizeaz
obligatoriu cu Parafilm.
12.3. Metode de protecie primar
Aceste metode se refer la echipamentele de protecie a personalului i la
aparatura utilizat n vederea realizrii proteciei microbiologice.
12.3.1. Hote de protecie biologic
Hotele sau cabinetele de protecie sunt incinte n care fluxul de aer este filtrat
i dirijat astfel nct s se obin diferite grade de protecie biologic. Exist trei tipuri
de astfel de incinte specializate, n funcie de domeniul n care sunt folosite: hote fizico
chimice, hote cu flux laminar verical sau orizontal, hote de protecie biologic clasa
I, clasa II, clasa III i cabinete destinate aplicaiilor PCR.
Hotele fizico chimice sunt folosite pentru reinerea fumului i vaporilor
chimici ce apar n urma manipulrii diferiilor reactivi, dar nu realizeaz protecia
biologic.
Hotele cu flux laminar de aer sunt dotate cu filtre principale HEPA (High
Efficiency Particulate Air) aflate n spatele zonei de lucru, aerul fiind ntotdeauna
filtrat nainte de a trece peste probe. Fluxul de aer poate fi verical sau orizontal. Aceste
hote ofer protecie doar pentru materialul care se afl n interior, operatorul nefiind
protejat microbiologic. Aceste hote sunt recomandate pentru protecia n momentul
manevrrii mediilor de cultivare i a reactivilor sterilizai.
Hotele de protecie biologic sunt incinte puternic ventilate, destinate limitrii
riscului de contaminare a personalului din laborator ce lucreaz cu ageni patogeni.
Aceste echipamente sunt destinate limitrii zonei de lucru i evitrii diseminrii
Luminia-Iuliana Malic
233
C
a
p
i
t
o
l
u
l
1
2
1
2
Anex
Fig. nr. 2-1.
Zygomicoz cerebral experi-
mental; examen microscopic
direct; frotiu prin amprent,
coloraie cu calcofluor, x 200.
Fig. nr. 2-2.
Frotiu secreie vaginal;
col. Gram, x 400.
Fig. nr. 2-3.
Frotiu sediment LCR; col. tu
de India, x 400.
Anex
238
Fig. nr. 2-4.
Frotiu mduv osoas
hematogen;
Col. May-Grunwald-Giemsa,
x 400.
Fig. nr. 2-5.
Frotiu hemocultur;
necolorat, x 900.
Fig. nr. 2-6.
Preparat extemporaneu cu
band adeziv; lactofenol cu
albastru de metilen, x 900.
Anex
239
A
n
e
x
Fig. nr. 4-1.
nsmnarea hemoculturii n pictur.
Fig. nr. 5-1.
Lutarea preparatelor extemporanee.
Fig. nr. 6-1.
Zygomicoz pulmonar;
Col. Fontana-Mason, x 400.
Anex
240
Fig. nr. 6-2.
Candidoz renal;
col. PAS, 400.
Fig. nr. 8-1.
Testul de hidroliz a ureei negativ
(stnga), pozitiv (dreapta)
Fig. nr. 8-2.
Colonii de C. neoformans pe Agar cu
extract din semine de Niger
Anex
241
A
n
e
x
Fig. nr. 8-3.
Aspectul coloniilor aparinnd
speciilor levurice identificabile
prin cultivare pe CandiSelect
4.
Fig. nr. 8-4.
Aspectul coloniilor aparinnd
speciilor levurice identificabile
prin cultivare pe CHROMagar
Candida.
Fig. nr. 8-5.
Aspectul coloniilor aparinnd
speciilor levurice identificabile
prin cultivare pe Chromogenic
Candida Agar.
Anex
242
Fig. nr. 8-6.
Kitul Auxacolor 2
Fig. nr. 8-7.
Aspectul galeriei Auxacolor 2
n cazul speciei C. tropicalis
Fig. nr. 8-8.
Aspectul galeriei de
identificare -Microplate
(Biolog)
Anex
243
A
n
e
x
Fig. nr. 8-9.
Aspect microscopic, preparat
extemporaneu, x 1000 fir de
pr - organe perforatoare in
vitro.
Fig. nr. 8-10.
Cultur de M. canis pe boabe
decorticate de orez
Fig. nr. 8-11.
Candida albicans
Tubi germinativi, preparat
extemporaneu cu lactofenol i
albastru de anilin; x 400
Index
245
I
n
d
e
x
Index
(
(1,3)Dglucan,...........................................153
5
5flucitozin..................................................203
A
abcessubcutanat............................................12
acidcafeic.....................................................182
acidnicotinic.................................................182
acridin.........................................................235
ADNpolimeraza...........................................196
Agar
acetatFowell.............................................46
acetatMcClary..........................................46
acidaceticdicloranextractdedrojdie......59
apderobinet...........................................76
BCGCandida..............................................47
BIGGY........................................................47
Blasto"D"..................................................48
Borelli........................................................64
Bromcrezolpurpurcazeinglucoz..........49
Christensen...............................................50
Ciocolat.....................................................49
ciree.........................................................79
cuacidcafeicicitratferic........................51
cuamidon..................................................76
cuextractdecartofiglucoz...................52
cuextractdedrojdieicloramfenicol.......52
cuextractdedrojdieifiton....................53
cuextractdemal.....................................81
cuextractdeorez......................................53
cuextractdepaprika.................................54
cuextractdesol........................................54
cuextractdetutun....................................55
cufindeovz.........................................66
cufindeporumb...................................55
cufindeporumbiTween80...............56
cufrunzedegaroaf.................................56
cuinfuziedeNiger.....................................74
cuLcanavaninglicinalbastrude
bromtimol............................................57
cusucrozicreatin................................58
cusucroz,creatinidicloran.................59
CzapekDox...............................................86
DicloranRoseBengalcloramfenicol...91
dicloran,extractdedrojdie18%glicerol..60
difereniereAspergillus.............................60
Dixon...................................................61,62
glicerin.....................................................79
glucozpeptondrojdie.......................62
infuziecordcreier..................................63
izolareCandida.........................................63
Lactrimel...................................................64
Leeming.....................................................65
Littman......................................................65
mal...........................................................80
MuellerHintonglucoz2%.................66
Nickerson..................................................47
Pal.............................................................67
pentrustudiereamorfologieilevurilor.....68
peptonglucozfluconazol..................69
pepton3%...............................................94
RPMIMOPSglucoz..............................90
SABHI........................................................71
Sabouraudcicloheximid..........................71
Sabouraudcloramfenicol..........................72
Sabourauddiluat.......................................75
SabouraudEmmons..................................72
SabouraudTTC..........................................87
sngeglucozcistein..........................73
selectivcutriptofan..................................74
Staib..........................................................74
Takaschio..................................................75
Trichophyton.....................................92,182
Trichophyton1..........................................92
Trichophyton2..........................................92
Trichophyton3..........................................93
Trichophyton4..........................................93
Trichophyton5..........................................93
Trichophyton6..........................................94
Trichophyton7..........................................94
Tween80............................................56,75
albastrudemetilen3%..................................22
alcalinizare...................................................183
alcooletilic...................................................234
alcoolizopropilic..........................................234
alcooli...........................................................234
aldehide........................................................234
AM3................................................................83
amfotericinB..............................................203
amorse.........................................................196
amplitaqgold...............................................195
antibioticmedium3.......................................83
Index
246
Antifungigrama
alegereaantifungicelor...................204,206
aplicareabenzilorEtest..........................204
Aspergillus...............................................206
Candida...................................................203
CLSIM44A..............................................208
Cryptococcus...........................................203
Fusarium..................................................206
heterorezisten......................................204
metodadifuzimetricKirbyBauer..........208
preparareainoculului......................203,206
recomandrideinterpretare..................209
regulidecitireaCMI.......................204,207
Rhizopus..................................................206
Rhodotorula............................................203
Scedosporium..........................................206
tehnicadelucrupentrufungi
filamentoi.........................................206
tehnicadelucrupentrulevuri.................203
Trichosporon............................................203
aparateproteticeamovibile...........................12
artrospori........................................................85
ascospori........................................................46
asimilareasurselordeazot...........................180
asimilareasurselordecarbon......................180
aspiratulendotraheal.....................................10
aspiratulprostatic...........................................15
aspiratulpulmonar.........................................11
aspiratultraheostomic...................................10
B
bandadeziv.................................................22
bandaadezivBIOTAPE...............................225
BHI..................................................................63
bifenoli........................................................234
biguanidine...................................................234
biopsiapulmonar..........................................11
biopsiatesticular..........................................15
biosecuritate.................................................229
Blankophor.....................................................21
Blast..............................................................198
blastoconidii...................................................85
bromcrezolpurpur.......................................183
bromurdeetidiu.........................................193
bronhoscopia..................................................11
Bulion
cuuree......................................................77
CzapekDox................................................86
Sabouraud.................................................78
C
C.albicans....................................................185
C.dubliniensis.......................................185,194
calcofluor.......................................................21
capacitatealergizant..................................230
Caseta
AIROCELL..............................................212
BIOCELL...................................................215
CYCLEXD.................................................215
LARO100................................................216
MICRO5..................................................214
caspofungin................................................203
cateter..............................................................3
cernealParker..............................................21
CHROMagarCandida................................45,78
Chromas.......................................................198
clamidospori..................................55,67,85,87
clarificareacuKOHidimetilsulfoxid............25
clasederiscbiologic.....................................229
clorhexidinagluconat...................................234
clorurdebenzalkoniu.................................234
clorurdecetilpiridiniu................................234
colorani.......................................................235
Coloraia
albastruAlcianpentrumucopolizaharide
acide..................................................126
Bauer.......................................................128
Chick........................................................130
cuacidperiodicSchiff.............................143
cucalcofluoralbiKOH10%.....................26
cuhidroxiddepotasiuicernealParker.25
culactofenolialbastrudeanilin............24
cumucicarminSouthgat...........................35
fluorescentcuacidperiodicSchiff........142
FontanaMasson.....................................135
Giemsa......................................................31
GomoriGrocott......................................139
Gram.........................................................28
Gramcalcofluoralb.................................30
Gridley.....................................................131
Gridleyfluorescent................................138
HemalaunEozin.................................123
MayGrunwaldGiemsa.............................32
methenaminesilvermodificat..............139
Musto........................................................36
negativcumercurochrom2%itude
India.....................................................23
negativcutudeIndia............................22
PAS..........................................................143
PASflourescent.....................................142
Schmorl...................................................133
Wright.......................................................34
Index
247
I
n
d
e
x
ZiehlNeelsen.........................................145
compoziiamediilordecultur.......................42
compuicuaternardeamoniu......................234
conservaredermatofii...................................95
controlulcalitiiacizilornucleici.................193
controluldecalitate.......................................44
cromomicoz..................................................12
cultivaresubmers.......................................105
cultivareanpictursuspendat.............106
cultivareapeblocdegeloz.........................106
cultivareapelam........................................106
cultivareapesuporturitransparente...........105
D
dermatofii...................................................184
deteciaCO
2
......................................................4
difereniere...................................................185
dispozitiveintravasculare.................................3
dispozitivulCIP10M.....................................219
DTM................................................................88
durataincubrii................................................7
E
electroforezangeldeagaroz....................193
endodontite....................................................12
epuizarepemediisolide...............................101
etalarenpuncteizolate...............................101
evideniereacapsulei......................................22
examenmicroscopicdirect.............................21
expectoraieindus........................................10
expectoraiespontan....................................10
extractdecartofi............................................80
extraciaADN...............................................191
extraciaADNuluiprincrioprecipitare.........192
F
fenoli.............................................................234
fermentareazaharurilor...............................179
filtreHEPA....................................................232
firedepr.........................................................9
fixarea...........................................................113
Fixatori
Bouin...............................................114,116
Hollande..........................................114,116
soluiadeformol10%tamponat...114,115
flacoanedehemocultur..................................2
fluconazol.....................................................203
fluideleintraoculare.........................................9
formaldehid................................................234
formulardecerere...........................................1
fragmentetisularebiopsice............................15
fragmenteunghiale..........................................9
frotiucitobacteriologic...................................14
frotiucoloratMayGrunwaldGiemsa............22
fungiaeropurtai..........................................211
Fungitell........................................................153
controlulcalitii.....................................158
interpretarearezultatelor.......................157
limite.......................................................158
tehnicdelucru......................................155
valoriateptate.......................................159
G
galactomanan...............................................160
geldeagaroz1%.........................................193
GenBank.......................................................198
germtubetest.............................................185
glutaraldehida..............................................234
Guizotiaabyssinica.........................................74
H
Hemocultura
volumuldesnge........................................4
hexaclorofen................................................234
hidrolizacazeinei..........................................184
hife.................................................................85
hipocloritdeCa............................................234
hipocloritdeK..............................................234
hipocloritdeNa............................................234
hipoclorii.....................................................234
histidin........................................................182
HistidinHCl...................................................94
hotedeproteciebiologic..........................232
hoteledeproteciebiologic.......................233
I
impactorulZefonZA6..................................217
impetigo...........................................................9
imunofluorescen.........................................22
infuziedecartofi......................................52,80
nglobare......................................................101
inozitol..........................................................182
Index
248
inozitol............................................................93
iodofori.........................................................234
itraconazol....................................................203
ITS1......................................194,195,196,197
ITS4......................................194,195,196,197
K
kiturideextracieADN................................191
L
latexaglutinareC.dubliniensis.....................172
lavajulbronhoalveolar....................................11
LBA..................................................................11
lichidpericardic..............................................11
lichidperitoneal..............................................11
lichidpleural...................................................11
lichidsinovial..................................................11
lichidulcefalorahidian.....................................8
Lprolinaminopeptidaza..............................182
Lutare
preparateextemporaneu........................111
M
M.audouinii.................................................185
M.canis........................................................185
mduvaosoashematogen............................8
mananseric..................................................169
markeridegreutatemolecular...................193
mediicromogene............................................45
mediidecultivare...........................................46
mediidifazice....................................................5
mediidifereniale...........................................43
mediihipertone................................................6
Mediu
bazpentrulevuri.....................................82
culaptediluat............................................84
cupine.....................................................85
cusol.........................................................85
deconversie..............................................86
pentruizolareadermatofiilor...................88
sinteticpentrutestuldefilamentare........83
mediul
Christensen.............................................181
Mediul
Bilai............................................................84
KurungYegian...........................................86
NikersenMankovski..................................87
PaganoLevin.............................................87
RPMI1640...........................................70,89
RPMI1640MOPS(CLSI)............................89
RPMI1640MOPS(EUCAST)......................89
metodaDalmau............................................105
metodalizeicucentrifugare.............................5
micetom.........................................................12
momentulprelevrii.........................................4
mucoasaoral................................................12
mucopolizaharidecapsulare........................126
Musto.............................................................22
N
NCBI..............................................................198
negruclorazol.................................................21
O
organeperforatoare.....................................184
P
pstrareamediilor..........................................44
PCR...............................................................191
PCRduplex...................................................194
PDA.....................................................42,52,80
periajulbronic...............................................11
Pityriasisversicolor...................................10,22
plgideschise.................................................12
Platelia
Aspergillus......................................160
PlateliaAspergillus
interpretarearezultatelor.......................164
principiultestului....................................160
tehnicadelucru......................................162
PlateliaCandidaAC
interpretarearezultatelor.......................167
principiultestului....................................165
tehnicadelucru......................................166
PlateliaCandidaAg
interpretarearezultatelor.......................171
principiultestului....................................169
tehnicadelucru......................................170
Platelia
CandidaAc.....................................165
Platelia
CandidaAg.....................................169
posaconazol..................................................203
povidoniod................................................234
prelevatebalanoprepuiale...........................15
prelevatulotic..................................................9
preparareamediilor.......................................43
Index
249
I
n
d
e
x
preparatextemporaneu...........................21,22
Preparatulextemporaneu
cubandadeziv.....................................110
culactofenolialbastrudeanilin..........109
primeri..........................................................196
principiulimpregnriiargentic.....................38
probelebiopsicetransbronhiale.....................11
procesareaesuturilor..................................117
Procesareaesuturilor
clarificarea...............................................119
colorarea.................................................123
deshidratarea..........................................118
etalareaseciunilor.................................121
etichetareaiarhivarea...........................150
impregnareacuparafin.........................119
includerea...............................................120
montarea.................................................148
secionarea..............................................120
producereaaltorenzime..............................182
producereadefenoloxidaz........................182
producereadeureaz...................................180
proteinazaK..................................................191
pseudohife......................................................85
puncierahidian..............................................8
punciesternal................................................8
puncievenoasperiferic...............................3
pungiparodontale..........................................12
purificareaizolatelorlevurice.......................103
R
raclatulcornean................................................9
Recoltare
precauii......................................................1
rezistenalacicloheximid...........................181
risccolectiv...................................................229
riscindividual................................................229
S
snge................................................................2
scotch...........................................................110
scuamecutanate..............................................9
secreiaprostatic..........................................15
secreiipurulente...........................................12
secreiirespiratoriijoase................................10
secreiivaginale..............................................14
secvenializareafragmenteloramplificate...198
secvenializarearegiunilorITS......................196
secvenializator............................................198
seminedeNiger..........................................182
semnificaiahemoculturilorpozitive................8
sersanguin...................................................185
sistemeautomate............................................4
sistemesemiautomate.....................................4
splturabronic..........................................11
speculum........................................................14
sporothricoz.................................................12
sputa..............................................................10
sterilizareamediilor.......................................43
substanecancerigene.................................235
substanedecontaminante..........................233
T
Tehnica
nsmnriilevurilorpeAgarulcu
findeporumbitween80..................105
tehnicaaspiraieicuacfin..............................16
tehnicasedimentriiKoch............................224
Tehnici
deaeromicologie....................................211
deevaluareasensibilitii
laantifungice....................................203
deexaminaremicroscopicafungilor
dinculturi..........................................109
dehistopatologie....................................113
densmnare.......................................101
demicroscopiedirect..............................21
deprocesareprimar..................................1
derecoltare.................................................1
deseromicologie.....................................153
detransplantare.............................101,107
detransport................................................1
testdeopacifiere...........................................75
testureaz......................................................77
testebiochimice...........................................179
testefiziologice............................................179
Testul
deblastez..............................................185
decultivarepeAgarBCPlapteglucoz..183
decultivarepeboabedeorez.................185
dedepistareanecesitilornutritive
speciale..............................................182
defilamentare.........................................185
dehidrolizaureeiladermatofii...........181
dehidrolizaureeilalevuri....................180
deperforareafiruluideprinvitro.......184
determostimulare..................................186
determotoleran..................................186
tiamin.........................................................182
tiaminHCl.....................................................93
tinea.................................................................9
Index
250
transluminator..............................................193
triclosan........................................................234
tubgerminativ..............................................185
tubigerminativi..............................................84
tudeIndia.....................................................22
U
Urina
cateterismvezical......................................13
cateterizarevezical..................................13
recoltarelabrbai....................................13
recoltarelafemei......................................12
recoltareapecateterpreexistent..............13
recoltareaprinpunciesuprapubian.......13
V
valve...............................................................14
vizualizareagelului.......................................193
voriconazol...................................................203
Y
YeastCarbonBase..........................................82
Z
zygomicete.....................................................85
zygomicoza.....................................................15
galactozaminidaza.....................................182
w
w
m
P
V
A
Se
Tr
www.fungi.ro
www.journal.fu
micologiemedi
OP 6, C
Iai, Ro
Consil
Preedinte:
Vicepreedinte
dministrator p
ecretar:
Trezorier:
fungi.ro
icala@gmail.c
CP 1356
omnia
liul director
e:
publicaii:
de M
251
com
:
Dr. M
mih
Dr. Bo
bogd
Ing. Io
ionu
Dr. In
ingr
Dr. Lu
lum
Soci
Micologie M
1
Mihai Mare
aimares@fun
ogdan Dorofte
dandoroftei@
onu Ailinci
utailincai@fun
ngrid Cezara A
ridapetrei@fun
uminia Malic
initamalic@fu
ietatea Rom
Medical i M
ngi.ro
ei
@fungi.ro
ngi.ro
Apetrei
ngi.ro
c
fungi.ro
mn
Micotoxicoloogie