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1. Unidad 4. Gentica microbiana Objetivos Conocer -Los mecanismos de la herencia -La relacin entre la estructura y funcin del gen -Las diferentes aplicaciones de la microbiologa -Los fundamentos de la regulacin gentica Asimilar La informacin gentica se transmite con gran fidelidad, y las mutaciones tienen un gran significado evolutivo Comprender y discutir Las ventajas e inconvenientes del desarrollo de la Biotecnologa 2. UNIDAD IV.- Gentica microbiana Tema 9.-.Principios generales (8h): Introduccin. Estructura del ADN y el ARN. Replicacin. Estructura de gen. Transcripcin. Traduccin. Regulacin. Recombinacin. Transferencia horizontal. Plsmidos. Transposones. Conjugacin. Transformacin. Transduccin. Estructura de los genomas. Genomica, transcriptmica y protemica. Mutaciones. Reparacin 3. Introduccin Experimento de transformacin de Griffith con neumococos Trminos y conceptos gentica: estudio de la herencia gen: segmento de ADN que codifica un producto funcional genoma: la suma de todo el material gentico de un organismo o virus o viriones haploide un serie de genes diploide dos series de genes clon: poblacin de clulas que son genticamente idnticas genotipo: serie especfica de genes que posee un organismo o virus fenotipo: serie de caractersticas observables El ADN como material gentico se estableci a travs de varios experimentos crticos Fred Griffith (1928) Oswald T. Avery, C. M. MacLeod, and M. J. McCarty (1944) Alfred D. Hershey and Martha Chase (1952) 4. Introduccin El experimento de Alfred D. Hershey y Martha Chase (1952) El ADN como material gentico (continuacin) El Dogma central Estructura del cido nucleco 5. Estructura del ADN y el ARN nuclesido = base nitrogenada + azucar pentosa Enlace fosfodiester Estructura del ADN base nitrogenada A, T, G, C azcar pentosa desoxirribosa normalmente una doble hlice compuesta de dos hebras complementarias reglas de emparejamiento las dos cadenas de A con T polinucletidos son G con C antiparalelas 6. Estructura del ADN y el ARN Estructura del RNA Organizacin del ADN en la clula bases nitrogenadas difiere entre eucariotas y procariotas A, G, C, U (en lugar de T) en procariotas azcar pentosa crculo cerrado en forma superenrrollada ribosa asociado con protenas bsica en general se compone de una sola hebra puede enrollarse alrededor de si mismo forman estructuras con forma de horquilla (hair-shaped structures) con apareamiento de bases complementarias y organizacin crculo cerrado en su forma helicoidal forma extendida superenrrollada reglas de apareamiento A con U G con C Tipos de RNA en eucariotas Cuatro tipos molculas lineales RNA ribosmico (rRNA) asociadas con RNA transferente (tRNA) histonas RNA mensajero (mRNA) enrolladas en RNA reguladores: Pequeos RNA (snRNA) unidades repetidas -pequeas molculas encontradas en el denominadas ncleo eucariota-, aRNA (antisense RNA) y nucleosomas RNAi (RnA interferente) difieren por su estructura y funcin 7. Replicacin Replicacin DNA proceso complejo que implica a numerosas enzimas y protenas en general, el proceso es similar en todos los organismos semiconservativa cada hebra parental es conservada Horquilla de replicacin las dos hebras parentales se separan y sirven de molde para la sntesis de una nuevaen procariotas -bidireccional desde un nico origen de replicacin -replicn en eucariotas porcin del bidireccional genoma que contiene un las dos horquillas mltiples orgenes de replicacin de replicacin se origen y se mueven en replica como sentido contrario una unidad 8. Replicacin Mecanismo del crculo rodante Replicacin DNA (continuacin) mecanismo del crculo rodante se observa durante la replicacin de pequeos genomas circulares ej.: la conjungacin de algunos plsmidos y la replicacin de algunos virus y viriodes 9. Replicacin Mecanismo de la replicacin del ADN-la mejor conocida es la de Escherichia coli-se cree que la de eucariotas es similar-la ADN polimerasa III sintetiza el ADN Cadena conductora: Sntesis continua. La hebra se extiende 5-> 3 desde su extremo SSB: protenas de unin al ADN monocatenario. Mantienen separadas las Helicasas: desenrollan dos hebras desenrolladas las hebras;

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Girasas: Sintetizado por la primasa liberan la tensin del (primosoma) SSB desenrollamiento Movimiento de la horquilla ADN ligasa: Une los fragmentos de ADN Cadena rezagada: Sntesis discontinua. 10. Replicacin Mecanismos de la ADN polimerasa III Mecanismos de la ADN ligasa 11. Replicacin Modelo hipottico de la actividad en la horquilla de replicacin: el 1 modelo se recoge en cinco etapas. 1. Las DNA girasa, las helicasas y las protenas de unin (SSB) desenrollan el DNA para producir segmentos 2 monocatenarios 2. El primosoma sintetiza un cebador de RNA 3. El replisoma tiene dos complejos de DNA polimerasa III. Una polimerasa copia de forma continua la cadena conductora. La cadena rezagada 3 forma un lazo a travs de la otra polimerasa para que ambas cadenas puedan replicarse simultneamente. Cuando la DNA polimerasa III se encuentra con un fragmento de 4 Okazaki completo libera la cadena rezagada 4. La DNA polimerasa I elimina el cebador de RNA y rellena los huecos con DNA complementario 5. La DNA ligasa sella los huecos y une 5 los dos fragmentos 12. Replicacin Algunos datos curiosos sobre la replicacin 30 protenas se requieren para replicar el cromosoma de E. coli se realiza con gran precisin frecuencia de error = 10-9 o 10-10 por base replicada gracias a la actividad de comprobacin y correccin de la ADN polimerasa I y III es muy rpida en procariotas de 750 a 1,000 pares de bases/s en eucariotas de 50-100 pares de bases/s 13. Estructura del gen Estructura del Gen gen secuencia lineal de nucletidos con unos puntos determinados de inicio (el tsp) y de terminacin (el terminador) codifica un polipptido, un tRNA, un rRNA o snRNA o algn otro tipo cistrn gen que codifica un polipeptido Marco de lectura (ORF) organizacin de codones tal que pueden ser ledos de forma que dan lugar a un producto gentico 5 3 3 5 Transcripcin N-terminal C-terminal Traduccin 14. Estructura del gen Estructura del gen Promotor: secuencia de nucletidos que sirve de reconocimiento y unin a la RNA polimerasa Estructura de un promotor Sentido de la RNA polimerasa Hebra molde: hebra tsp que contiene la Regin codificante: regin que especifica la secuencia de informacin aminocidos en un polipptido codificante y dirige la sntesis de RNA 15. Estructura del gen Terminador: seal de la terminacin de la transcripcin Estructura del gen transcripcin Regin remolque: secuencia 3 que es transcrita pero no es traducida Secuencia ShineDalgarno o secuencia de unin Regin lder: secuencia 5 que es a los ribosomas: sitio de reconocimiento del transcrita pero no es traducida ribosoma 16. Transcripcin La transcripcin de DNA produce 4 tipos de RNA Transcripcin en procariotas: tRNA, rRNA, mRNA y RNA reguladores Catalizado por un nica RNA polimerasa compuesta por el ncleo del enzima ( 2 ) y un factor sigma que dirige el ncleo central al promotor. Diferentes factores sigma permiten a la RNA polimerasa reconocer diferentes promotores Los terminadores procariotas son de dos tipos: dependientes del factor rho (no tienen poli U y a menudo no forman hairpin hairpin + 6 uridinas frecuentemente da como resultado mRNA polignico (policistrnico) 17. Transcripcin Transcripcin en eucariotas Tiene varias RNA polimerasas mRNA monognico Los promotores contienen tres elementos comunes la caja TATA~ 30 bases antes del inicio de la transcripcin la caja CAAT~ 75 bases antes del inicio de la transcripcin exn intrn la caja GC ~ 90 bases antes del inicio de la transcripcin RNA nuclear heterogneo 5 cap of eucaryotic mRNA Maduracin del RNA RNA splicing monognico 18. Transcripcin La maduracin del Pre-RNA se produce en un complejo de gran tamao que se denomina partcula procesadora (spliceosome) que contiene el pre-RNA, snRNAs y protenas Algunas molculas de rRNA sufren un proceso de automaduracin y constituyen lo que se denomina Ribozimas: Molculas de RNA con actividad cataltica. 19. Traduccin El Cdigo gentico Forma en la que se almacenan en el genoma las instrucciones genticas para las sntesis de polipptidos colinearidad: la secuencia de pares de bases de ADN

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corresponde a secuencias de aminocidos en el polipptido codificado los codones codifican para aminocidos especficos (en general 20 aminocidos salvo algunos casos en los que emplean seleniocisteina, seleniometionina o pirrolisina en algunas arqueas) se emplea un cdigo de 3 bases combinando las 4 que componen el RNA (A, U, G, C) 64 combinaciones posibles (43) (61 tripletes con sentido para aminocidos y 3 sin sentido o codones de terminacin) los aminocidos son codificados por ms de un codn 20. Traduccinel cdigo gentico est degenerado es decir existen hasta 6 codones diferentes para un determinado aminocidoel cdigo gentico es casi universal el de la tabla se aplica a casi todos los procariotas (bacterias y arqueas) en los genes mitocondriales de plantas y microorganismos UGA codifica triptfano en lugar de terminacin. Este mismo codn puede codificar seleniocisteina en algunas arqueas UAG codifica pirrolisina algunos ciliados (como Paramecium) y la bacteria Mycoplasma tienen cdigos ligeramente diferentestodos los organismos no emplean los mismos codones es decir no tienen los 61 tRNAs necesarios para interpretar el cdigo completoLa diferencia en el uso de codones de un organismo a otro es muy importante en biotecnologa ya que cuando se transfiere un gen de un organismo a otro el gen solo ser interpretado si el organismo receptor posee los codones necesarios a veces la secuencia de nucletidos del mRNA puede ser alterada en lo que se denomina RNA editing (en plantas el codn nuclear CGG es convertido en UGG) 21. Traduccin Balanceo (Wobble) Se denomina a la flexibilidad en las reglas de apareamiento perdida del apareamiento entre bases la tercera posicin del codn es menos importante que la primera o segunda posicin evita que las clulas tengan que sintetizar tantos tRNA diferentes minimiza el efecto de las mutaciones La inosina (I) es un nuclesido que puede aparearse con la adenosina, la citosina y el uracilo La inosina se obtiene mediante la desaminacin de la adenina (otra forma de edicin del tRNA) 22. Traduccin El ribosoma procariotas 70S ribosomas = subunidades 30S + 50S eucariotas 80S ribosomas = subunidades 40S + 60S los ribosomas mitocondriales y cloroplsticos se asemejan a los ribosomas procariotas El ribosoma 70S 20 nm permite alinear el otros rRNAs ribosoma con el pueden tener un mRNA unindose a papel cataltico la RBS 23. Traduccin Genes que codifican tRNA y rRNA Los genes que codifican los genes del tRNA tienen regin promotora, lder, codificante, espaciadora y remolque La regin lder, espaciadora y remolque se eliminan durante la maduracin Los genes que codifican los genes del rRNA tambin tienen regin promotora, lder, codificante, espaciadora y remolque Precursor tRNA las regiones espaciadoras y de remolque pueden codificar molculas de tRNA 24. Traduccin Sntesis de protenas (iniciacin, elongacin y terminacin) traduccin la secuencia de nucletidos del mRNA se traduce en una secuencia polipeptdica el sentido de la sntesis es N terminal C-terminal el sitio de traduccin es el ribosoma que puede formar complejos polirribosmicos: mRNA y varios ribosomas tRNA y activacin de los aminocidos (AAs) lugar de unin del unin del aminocido al tRNA aminocido catalizado por las aminoacil tRNA sintetasas en general hay, como mnimo, uno para cada AA en algunos casos un mismo aminoacil tRNA sintetasa es bifuncional Ambas cargan inicialmente la forma cida y luego la aminan Los brazos D y una misma aminoacil tienen pirimidinas tRNA sintetasa puede complementario poco frecuentes activar glutmico y al codn del glutamina mRNA otra aminoacil tRNA sintetasa puede activar tanto asprtico como asparragina 25. Traduccin tRNA y activacin de los aminocidos (AAs) (Continuacin) aminocido extremo 3 del tRNA resto del tRNA Glutamil tRNA sintetasa unida al tRNA y al ATP 26. Traduccin Iniciacin de la sntesis de protenas implica a las subunidades ribosomales y a numerosas molculas adicionales aminoacil-tRNA iniciador N-formilmetionina-tRNA es el tRNA iniciador bacteriano eucariotas y arqueas emplean metionina-tRNA factores de iniciacin (IFs)

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Posicionan adecuadamente el ribosoma en el extremo 5 del mRNA Elongacin de la cadena polipeptdica Sitios de unin al tRNA en los ribosomas sitio P (sitio peptidil o donador): une al tRNA iniciador o al peptidil-tRNA creciente sitio A (sitio aminoacil): une el aminoacil-tRNA que se Codn de incorpora iniciacin sitio E (sitio de salida): al que se une brevemente el tRNA saliente ciclo de elongacin adicin secuencial de aminocidos a la cadena polipeptidica initiation tiene tres fases codon unin del aminoacil t-RNA reaccin de transpeptidacin translocacin implica numerosos factores de elongacin (EFs) 27. Traduccin Reaccin de transpeptidacin 28. Traduccin Transpeptidacin: Catalizado por la peptidil transferasa (localizada en la 50S). El pptido crece en un aminocido y se transfiere al sitio A 29. Traduccin Translocacin el peptidil t-RNA se desplaza del sitio A al sitio P el ribosoma desplaza un codn a lo largo del mRNA para que un nuevo codn se site en el sitio A el tRNA vaco abandona el sitio P con ayuda de una translocasa (EF-G) 30. Traduccin Terminacin de la sntesis de protenas tiene lugar en alguno de los siguientes codones de terminacin UAA, UAG, and UGA UAA es el ms frecuente tres factores de liberacin (RFs) ayudan a reconocer los codones de terminacin Plegamiento de protenas eucariotas versus procariotas dominios regiones del polipptido estructuralmente independientes separadas unas de otras por porciones de polipptidos menos estructuradas en eucariotas los dominios se pliegan independientemente y correctamente despus de su sntesis los chaperones moleculares no son importantes en procariotas el polipptido no se pliega hasta que se sintetiza el polipptido completo los chaperones moleculares son importantes 31. Traduccin Impiden que el polipptido se pliegue inadecuadamente durante su sntesis Plegamiento de la protena y chaperomes moleculares Chaperones moleculares ayudan al plegamiento del polipptido naciente protegen a la clula contra el dao trmico ej.:.HSP, heatshock proteins ayudan en el transporte de las Permite la protenas a travs de liberacin de DnaK y la membrana DnaJ Permiten el plegamiento final 32. Traduccin Maduracin de protenas eliminacin de una parte del polipptido antes del plegamiento inteinas porcin eliminada exteinas porcin que permanece en la protena Fueron descubiertas en 1990 en el gen de una ATPasa vacuolar de Saccharomyces cerevisiae Actualmente se han identificado ms de 100 en los 3 dominios de los seres vivos 33. Regulacin Regulacin Control de los elementos y procesos celulares. A corto plazo (segundos) los seres vivos pueden modificar la actividad de numerosos componentes celulares a travs de modificacin covalente de protenas (modificacin postraduccional). Esto no modifica la cantidad de protenas sino su actividad. Ej: fosforilacin de protenas Tambin, a corto plazo, puede alterar la estabilidad de las protenas aumentando la degradacin de protenas frente a su sntesis Ej.: activando la proteolisis A largo plazo pueden modificar la expresin de los genes, la estabilidad de los transcritos, y la traduccin Ej: Regulacin gentica Observacin: Los genes y operones se escriben en minscula y cursiva y los productos de su expresin en mayscula normal Ej.:el gen lacZ codifica la protena LacZ 34. Regulacin Tipos de expresin del mRNA: Constitutiva: No hay control sobre su expresin, los genes (denominados constitutivos) se expresan igual en cualquier circunstancia independientemente de las condiciones ambientales. Algunos de estos genes codifican enzimas constitutivos Adaptativa: Se controla su expresin, los genes estn regulados. Pueden dar lugar a enzimas inducibles y a enzimas reprimibles enzimas inducibles su nivel se eleva en presencia de un inductor pequea molcula, en general un sustrato de una ruta catablica en la que participa el enzima. De esta forma solo se inducen cuando son necesarios enzimas reprimibles su disminuye en presencia de un corepresor en general, es el producto final de una ruta en la que el enzima participa Regulacin de la

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sntesis de mRNA Ventajas regulacin de la expresin gnica (la sntesis de un determinado mRNA) permite conservar la energa y materia prima mantiene el balance entre las diversas protenas celulares permite la adaptacin, a largo plazo, a los cambios en el entorno Desventajas requiere el desarrollo y mantenimiento de sistemas reguladores 35. Regulacin Tipos de regulacin gentica Control del inicio de la transcripcin Regulacin negativa Regulacin positiva Control de la terminacin de la transcripcin Atenuacin Antiterminacin Control de la traduccin Control de la estabilidad del transcripto Regulacin con factores sigma Regulacin con RNA antisentido Otros tipos Metilacin de ADN Superenrrollamiento del ADN 36. Regulacin (Control del inicio de la trasncripcin) Control negativo de una ruta catablica 1. Genes transcritos promotor operador Control negativo Genes estructurales protenas represoras existen en forma activa e inactiva inductores y correpresores modifican la Represor Represor actividad del activo Inductor inactivo el objetivo es sintetizar el represor enzima de una ruta solo cuando en general un el sustrato de la ruta est sustrato de la ruta. disponible se ejercen sobre el Inactiva al represor operador 2. Genes no transcritos Un opern Genes estructurales la presencia de una protena reguladora (el represor) en el lugar de regulacin (el operador disminuye la sntesis de mRNA 37. Regulacin (Control del inicio de la transcripcin) Control negativo de una ruta biosinttica Control negativo Genes no transcritos promotor operador (continuacin) Genes estructurales el objetivo es sintetizar el enzima de una ruta en general un producto solo cuando el producto final de una ruta. Activa al final de la ruta no est represor disponible Genes transcritos Un opern Genes estructurales 38. Regulacin (Control del inicio de la trasncripcin) Control positivo la presencia de una protena reguladora (activador) en la regin reguladora promueve la transcripcin ej., opern lactosa regulada por la protena CAP (protena activadora del catabolismo) y el AMP cclico (cAMP) CAP tambin se denomina CRP (protena receptora de cAMP) reconoce y se une a la regin reguladora del opern lac CAP: puede funcionar tanto como controlador positivo como negativo 39. Regulacin (Control del inicio de la trasncripcin) Control positivo de una ruta biosinttica en nivel de cAMP depende de las condiciones ambientales se ejerce sobre el promotor 40. Regulacin (Control del inicio de la trasncripcin) Sistemas globales de regulacin afecta a numerosos genes y rutas simultneamente reguln coleccin de genes o operones controlados por una protena reguladora comn. Ej. El reguln CRP Represin por catabolito Crecimiento en el que el tiene lugar cuando el opern est controlado por organismo cambia de otro catabolito distinto al sustrato inicial de la ruta estrategia metablica permite el empleo preferente de un nutriente frente a otro cuando ambos estn disponibles una fuente de carbono frente a otra (glucosa frente a lactosa) un fuente de nitrgeno frente a otra (amonio frente a nitrato) ej., represin por catabolito de la lactosa y otros operones por glucosa la glucosa, a travs del sistema fosfotransferasa, inhibe una adenilato ciclasa (enzima que sintetiza cAMP) y disminuye los niveles de cAMP, esto bloquea la unin de la protena CAP al opern de la La lactosa no se lactosa y disminuye las sntesis de mRNA y,en consume hasta que consecuencia la de protena. toda la glucosa ha sido En ausencia de glucosa el cAMP aumenta y la consumida protena CAP activa la transcripcin de numerosos operones lac, gal ara. 41. Regulacin (Control del inicio de la trasncripcin) Regulacin del opern gal El opern gal de E. coli consiste en 3 genes estructurales: GalE, GalT y GalK que son transcritos desde dos promotores solapados PG1 y PG2 . La regulacin es compleja ya que GalE (una epimerasa que convierte UDPglucosa en UDP-galactosa) es necesaria para la formacin de UDP-galactosa para biosntesis de la pared celular incluso cuando no emplea galactosa como fuente de carbono. Igual que el opern lac, el opern gal es controlado por CAP-cAMP. Este regulador se une en la regin -35 activado las transcripcin desde PG1 e inhibiendo la transcripcin desde PG2. Cuando las clulas crecen en glucosa (no se forma complejo CAP- cAMP) la transcripcin tiene lugar desde PG2. El represor del

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opern es GalR, que a gran concentracin, forma tetrmeros que se unen a los dos operadores y reprime por completo la transcripcin. A baja concentracin, GalR forma dmeros que se unen a un solo operador y permiten la actividad del promotor PG2 42. Regulacin (Control de la terminacin de la trasncripcin) Atenuacin regulacin de la transcripcin modificando el comportamiento de los ribosomas el avance de los ribosomas depende de la presencia de los aminocidos necesarios en la traduccin. Si estos no estn presentes la traduccin no avanza. observado en bacterias en las que la transcripcin y la traduccin se simultanean (la traduccin de un mRNA tiene lugar a medida que ste es sintetizado) el avance de la transcripcin depende de las estructura del mRNA que se est sintetizando. La formacin de una horquilla de terminacin provoca la terminacin de la transcripcin. En presencia de ribosomas la estructura puede ser distinta. ej.: el opern triptfano en Escherichia coli opern que codifica las enzimas para la ruta biosinttica del triptfano esta regulado por una protena represora, TrpR, bajo el control del triptfano como correpresor el objetivo es no iniciar la transcripcin si el triptfano ya est disponible tambin est regulado por atenuacin el objetivo es terminar la transcripcin si el triptfano ya est disponible 43. Regulacin (Control de la Regin lder entre el operador y el primer gen estructural trpE: terminacin de la transcripcin) contiene un atenuador y la secuencia de un pptido lder ej.: el opern triptfano en Secuencia del pptido lider Atenuador Escherichia coli Se basa en la capacidad que tiene el RNA de la regin lder de Codones de triptfano (Trp) formar tres estructuras Estructura del mRNA en ausencia de ribosomas. Los segmentos secundarias de RNA (los 1 y 2 y 3 y 4 se aparean segmentos numerados (1, 2, 3,4) contienen secuencias complementarias): la pausa de transcripcin Terminador La horquilla formada por los segmentos 1 independiente de Rho y 2 arresta momentneamente la transcripcin En presencia de ribosomas y Trp el pptido lder se sintetiza hasta su el antiterminador alternativo codn de terminacin. Debido a la La horquilla formada por los segmentos 2 presencia de ribosomas los y 3 impide la formacin del terminador segmentos 1 y 2 no se aparean. Los el terminador de transcripcin segmentos 3 y 4 si se aparean y La horquilla formada por los segmentos 3 forma un terminador de y 4 y la secuencia poli-U forman un transcripcin terminador de transcripcin regin lder del opern 44. Regulacin (Control de la terminacin de la transcripcin) No se traduce el mRNA No se transcribe el opern Triptfano disponible para formar trp-tRNA No se transcribe el opern Un ribosoma sintetiza el pptido lder y se detiene en el codn de terminacin Se transcribe el opern Ausencia de triptfano Un ribosoma se detiene en los codones para trp en la regin 1 y obliga a la regin 2 a unirse con la 3. La regin 4 permanece monocatenaria y no se forma el sitio de terminacin 45. Regulacin (Control de la terminacin de la transcripcin) 46. Regulacin (Control de la terminacin de la transcripcin) Transcripcin de la regin lder del opern trp de E. coli. Las parejas de nmeros 1:2, 2:3, y 3:4 corresponden a las parejas de segmentos de RNA que forman estructuras secundarias (la estructura de pausa inicial de la transcripcin (1:2), el antiterminador (2:3), y el terminador (3:4)). Cuando la RNA polimerasa se une al promotor trp e inicia la transcripcin, la polimerasa se detiene en el loop de pausa 1:2. Si un ribosoma no se une rpidamente al mRNA (un indicador de limitaciones en la sntesis de protenas) entonces se forma un terminador con los segmentos 3:4 y la RNA polimerasa es desprendida lntamente La unin de un ribosoma al complejo en pausa tambin desprende la RNA polimerasa. Si hay un adecuado suministro de Trp el ribosoma continua hasta el codn de terminacin del pptido lder. Esto bloquea la formacin del antiterminador 2:3 y se forma el terminador 3:4, parando la transcripcin. Si no hay Trp el ribosoma continua hasta el codn Trp-Trp. Esto impide la formacin del loop 1:2, lo que favorece la formacin del antiterminador. Yanofsky C (2000) Transcription attenuation: once viewed as a novel regulatory strategy. J Bacteriol. 182:1-8.

47. Regulacin Control de la traduccin Un ejemplo es el del gen pyrC que codifica la dihidroorotasa, un enzima de la biosntesis de piridina. Los niveles del enzima varan hasta 10 veces en funcin de la disponibilidad de piridina sin que para ello se modifiquen los niveles de mRNA La transcripcin puede comenzar en cualquiera de los siguientes 4 nucletidos: 5 CCGG 3 Cuando las pirimidinas estn en exceso se inicia por la citosina 2 y se permite la formacin de un bucle que impide la unin de los ribosomas a la RBS Cuando las pirimidinas no estn en exceso la transcripcin comienza por Guanina 4. Entonces no se forma el bucle y los ribosomas se pueden unir 48. Regulacin Regulacin con factores sigma y control de la esporulacin diferentes factores sigma reconocen diferentes promotores sustitucin de los factores sigma modifican la expresin de los genes y operones Ej. Bacillus subtilis factores sigma y esporulacin se sintetizan solo cuando la clula cambia de un crecimiento vegetativo a esporulacin da lugar a la trascripcin de genes relacionados con la esporulacin Muerte programada de la clula madre en el desarrollo de la esporulacin de B. subtilis. Ciclo de la formacin de esporas de Bacillus sp. Las seales ambientales e internas son integradas al nivel de Spo0A, que activa la cascada de los factores sigma de esporulacin. El factor sigma terminal K controla el final de la esporulacin la formacin del cortex, la cubierta y la expresin de las autolisinas CwlC and CwlH49. Regulacin RNA antisentido y el control de las porinas RNA antisentido (antisense RNA) tiene secuencias complementarias a algunos componentes del mRNA necesarios para su expresin (RNA diana) se une al RNA diana e inhibe su funcin Ej.: Porinas (protenas de la membrana externa) diferentes porinas son producidas bajo diferentes condiciones E. coli sintetiza la protena OmpC cuando crece en el intestino y la porina OmpF en ambientes diluidos El RNA antisentido micF se une al mRNA que se traducir en OmpF y bloquea su traduccin cuando la bacteria est en el intestino 50. Regulacin Regulacin de RNAs diana a travs de OxyS (recuadro izquierdo) y DsrA (recuadro derecho).Los RNAs diana se muestran en azul y el antisentido en rojo. Las regiones de interaccin se muestran en verde (no se guarda proporcionalidad en los tamaos). Los signos positivos y negativos indican activacin e inhibicin respectivamente. RBS indica la posicin aproximada del sitio de unin a los ribosomas. Hfq es el factor Q del husped. Los pares de crculos anaranjados representan los ribosomas. Altuvia, Shoshy and Wagner, E. Gerhart H. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 98249826 51. Regulacin Sistema de fosfotransferencia de dos componentes la transferencia de grupos fosforilo controla la transcripcin de genes y la actividad de protenas En el sistema de dos componentes el primer componente percibe una seal en su extremo N-terminal y se autofosforila en su extremo C terminal. El segundo componente regula su respuesta en funcin del fosfato que le transfiere el primer componente Ej.: Esporulacin en Bacillus subtilis Ej.: Quimiotaxis en Escherichia coli La activacin de las quinasas A y B inicia un sistema de fosfotransferencia de dos componentes que activa al regulador de la transcripcin Spo0A 52. Regulacin Sistema de fosfotransferencia de dos componentes (continuacin) Ej.: Quimiotaxis en E. coli El sistema de quimiotaxis est diseado para controlar la rotacin flagelar en direccin contraria (ccw) o a favor (cw) de las agujas del reloj. 53. Regulacin Representacin de las rutas de regulacin Las relaciones entre elementos se indican con lneas Si uno regula positivamente (activa) al otro se indica con una flecha Si inhibe, la lnea termina en una recta Las lneas onduladas indican transformacin o sntesis La regulacin no transcripcional se indica con lneas discontinuas Mazurie et al. Genome Biology 2005 6:R35 doi:10.1186/gb-2005-6-4-r35 54. Transferencia gentica horizontal Transferencia gentica vertical Es la que ocurre desde los ascendientes a los descendientes mediante replicacin Transferencia gentica horizontal transferencia de genes de un organismo maduro e independiente (donador) a otro (receptor)

y y

exogenote DNA que es transferido al receptor endogenote genoma del receptor merozigoto clula receptora que es temporalmente diploide como resultado del proceso de transferencia Tipos principales de transferencia gentica horizontal 55. Plsmidos bacterianos Plsmidos bacterianos pequeas molculas de ADN de doble hebra que, en general, son circulares son replicones tienen su propio origen de replicacin pueden existir en una sola copia o en mltiples copias curado se denomina a la eliminacin de un plsmido puede ser espontnea o inducida mediante tratamientos que inhiben la replicacin de plsmido pero no la reproduccin del husped Tipos de plsmidos bacterianos Episomas: plsmidos que pueden existir tanto integrados en el cromosoma como sin integrar Plsmidos conjugativos: tiene genes que codifican los pili y pueden transferir copias de ellos mismos a otras bacterias durante la conjugacin Plsmidos suicidas: no tienen un replicn que funcione en el husped final Plsmidos de expresin de protenas Plsmidos de clonacin de fragmentos de ADN Plsmidos de resistencia (antibiticos, metales, etc) Plsmidos Col (codifican colicinas un tipo de bacteroicinas, protenas que destruyen otras bacterias) Otros (de virulencia, metablicos) 56. Recombinacin Recombinacin microbiana y plsmidos Recombinacin: proceso en el que una o ms molculas de cidos nucleicos se reorganizan o combinan para producir una nueva secuencia de nucletidosen eucariotas frecuentemente tiene lugar como resultado del entrecruzamiento durante la meiosis 57. Recombinacin Recombinacin bacteriana: varios tipos de recombinacin recombinacin general recombinacin especfica de sitio integracin de genomas vricos recombinacin replicativa (por transposicin) Recombinacin general: puede ser recproca o no recproca Recombinacin general recproca tipo de recombinacin ms comn intercambio recproco entre parejas de cromosomas homlogos el resultado de la ruptura y unin de la hebra de ADN da lugar al entrecruzamiento 58. Recombinacin 59. Recombinacin Recombinacin general no recproca incorporacin de una hebra simple de DNA en el cromosoma para formar un heteroduplex se ha propuesto que ocurre durante la transformacin bacteriana 60. Elementos transponibles Elementos transponibles -Transposicin: movimiento de fragmentos de ADN en el genoma -Elementos transponibles (transposones): segmentos de ADN que contienen los genes necesarios para la transposicin -muy extendidos en bacterias, arqueas y eucariotas Tipos de elementos transponibles secuencias de insercin (elementos IS): contienen solo los genes que codifican los enzimas necesarios para la transposicin (se denominan con la letra IS seguida de un IR= Secuencias inversamente repetidas nmero, ej.. IS5) ej., transposasa Transposones compuestos: llevan genes adicionales a los necesarios para la transposicin. Se denominan Tn seguido de un nmero, Ej. Tn524) Transposones conjugativos: adems de los genes para la transposiscin tienen genes para la conjugacin Effectos: mutaciones en regiones codificantes: ej., delecin de material gentico modifica la traduccin la transcripcin activacin de genes generacin de nuevos plsmidos. Ej. Plsmidos 61. integrones Integrones Se diferencian de los transposones en: (i) no tienen secuencias repetidas en los extremos como las secuencias IS y, (ii) los elementos contienen una integrasa especfica de sitio como la que se encuentra en los fagos y no tiene numerosas productos genticos asociados con la transposicin. Los integrones son elementos mviles de ADN que pueden capturar genes (generalmente de resistencia a antibiticos con su propio lugar de integracin attC). Se componen de un gen integrasa (int) prximo a un lugar de recombinacin (attI site) y un promotor (Pant). Segn el tipo de integrasa se diferencian 3 clases de integrones La organizacin de los integrones de clase I se muestra a continuacin. Los genes aadB, oxa2, aadA2 y oxa 2 se van integrando secuencialmente.

62. Conjugacin Conjugacin bacteriana: transferencia de ADN mediante contacto directo entre clulas Cruce F+ x F- F+ = donador, contiene el factor F (formacin de pilus y transferencia de plsmido) F- = receptor, no contiene el factor F El factor F se replica mediante el mecanismo del crculo rodante y el duplicado se transfiere al receptor el recipiente se convierte en F+ el donador permanece como F+ 63. Conjugacin Conjugacin bacteriana: transferencia de ADN mediante contacto directo entre clulas Conjugacin Hfr Cepa Hfr: donador que contiene el factor F integrado en el cromosoma tanto los genes plasmdicos como los cromosmicos son transferidos Debido a que la ruptura antes de la conjugacin tiene lugar en el gen F, la cepa receptora no se convierte en F+ (salvo que se transfiera todo el cromosoma) Adems de para la transferencia de genes, la conjugacin permite mapear (determina 64. Transformacin Transformacin toma de ADN (desnudo) del medio ambiente e incorporacin en un receptor de forma heredable clula competente capaz de tomar ADN puede ser una forma importante de intercambio gentico en la naturaleza Transformacin artificial transformacin realizada en el laboratorio con especies que normalmente no son competentes (ej., E. coli) numerosas tcnicas son empleadas para hacer las clulas competentes de forma transitoria. Ej.: tratamiento con Cl2Ca, hace las clulas ms permeables al DNA 65. Transduccin Transduccin transferencia de genes bacterianos con virus Fagos virulentos se reproducen empleando el ciclo de vida ltico Fagos atemperados se reproducen empleando el ciclo lisognico Ciclos de vida del fago Lambda bacteria que contiene un profago forma integrada del genoma viral 66. Transduccin Transduccin generalizada cualquier parte del genoma bacteriano puede ser transferido tiene lugar durante el ciclo ltico durante el ensamblado viral, los fragmentos del ADN del husped son errneamente empaquetados en el fago partcula de transduccin generalizada Transduccin especializada tambin denominada restricted transduction llevada a cabo por fagos atemperados que establecen el ciclo lisognico solo una porcin especfica del genoma bacteriano es transferida tiene lugar cuando el profago es cortado incorrectamente 67. Estructura de los genomas Organizacin de los genes en cromosomas en la mayor parte de los organismos las pautas de lectura (ORFs ) no se solapan algunas bacterias y algunos virus tienen genes solapados Escherichia coli Levadura (Saccharomyces cerevisiae) Genes procariotas versus eucariotas procariotas (y virus) la informacin codificante est generalmente contigua eucariotas la mayora de los genes tienen secuencias codificantes Fago X174 interrumpidas por secuencias no codificantes exones secuencias codificantes intrones secuencias no codificantes 68. Estructura de los genomas En los procariotas numerosos genes se organizan el operones. Todos los genes de un operon se transcriben desde un promotor en un nico mRNA. Se muestra el opern tuf-s10 de Borrelia burgdorferi ( enfermedad de Lyme) En eucariotas los genes no forman operones y contienen intrones. Ej.: Receptor de la hormona de crecimiento 69. Genmica Genmica microbiana Genmica estudio de la organizacin molecular de los numerosos genomas han sido genomas, su contenido de informacin, y los completados. Actualmente productos genticos que codifica (26.3.2007) dividido en 3 reas 748 bacterianos genmica estructural 41 de arqueas naturaleza fsica de los genomas 139 de eucariotas genmica funcional como funciona un genoma su examen ha permitido genmica comparativa formular numerosas hiptesis compara los genomas de diferentes sobre los genomas microbianos organismos Descubrimientos interesantes el gnoma mnimo basado en el anlisis del genoma de Mycoplasma genitalium el ms pequeo de los genomas procariotas ~108-121 genes no son necesarios para el crecimiento en el laboratorio ~265-350 genes necesarios para el crecimiento en el laboratorio la mayor parte de los genes identificados tienen funcin desconocida (protenas hipotticas) ej., Mycoplasma genitalium: 22% tienen funcin desconocida e.g., Haemophilus influenzae: > 40% tienen

funcin desconocida e.g., Methanococcus jannaschii: 66% tienen funcin desconocida e.g., E. coli: ~2500 de 4288 genes tienen funcin desconocida 70. Genmica Patrones generales a pesar de la conservacin en las secuencias de protenas, la organizacin de los genomas es muy variable la transferencia horizontal de genes parece haber sido muy importante en la evolucin de las bacterias y las arqueas Genmica funcional (determina como funcionan los genomas) las 3 aproximaciones ms comunes se abordan a travs de proyectos OMA y son: Genmica: secuenciacin y anotacin de genoma (identificacin de genes y fases codantes) Transcriptmica: estudio de la expresin gentica al nivel de RNA Protemica: estudio de la expresin gentica al nivel de protenas DNA chips Permiten el estudio masivo de la expresin de genes al nivel del RNA (el transcriptoma) 71. Genmica Estudio masivo de la expresin de genes, RNA. DNA microarrays (DNA chips) soporte slido (ej. vidrio) que tiene anclado ADN en matrices (puntos) muy ordenadas (las sondas) ADN diana (cDNA) con marcadores Este ADN consiste en la fluorescentes secuencia parcial y complementaria del RNA o cDNA de un gen con el que puede hibridar incubado con mRNA o cDNA (dianas), que hibridan con el Sondas de ADN anclado al soporte ADN Este RNA est marcado con Soporte de vidrio fluorocromos Los genes que se expresan se iluminan en el chip Chip de ADN con el ADN diana hibridado 72. Genmica Estudio masivo de la expresin de genes, Protenas proteoma la coleccin completa de protenas que produce un microorganismo Protemica: estudio del proteoma una aproximacin frecuente es la electroforesis en dos dimensiones Las protenas pueden identificarse posteriormente mediante espectroscopa de masas (MALDI TOF) MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight) Espectrometra de masas mediante ionizacin-desorcin por lser asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo 73. Genmica Genmica en el diseo de vacunas Diferentes aproximaciones al diseo de vacunas, consecuencia de la introduccin continua de una serie de nuevas tecnologas. Los progresos realizados en inmunologa molecular y biotecnologa en las ltimas dos dcadas han desplazado las vacunas clsicas basadas en clulas enteras de patgenos muertos (a) hacia vacunas con subunidades. La aplicacin de la tecnologa del ADN recombinante ha dado como resultado la produccin de vacunas atenuadas vivas (b) mediante la inactivacin de los genes responsables de la patogenicidad. La manipulacin del ADN ha revolucionado la posibilidad de clonar, purificar, y crear subunidades antignicas para eliminar los efectos txicos al mismo tiempo que se mantiene la inmunogenicidad de la protena (c). Adems, bacterias y virus atenuados o no patgenas pueden ser manipulados para que expresen protenas de otro organismo (d). La posibilidad de obtener la secuencia completa de un organismo marca el comienzo de la era genmica que abre nuevas perspectivas en el diseo de vacunas. La totalidad de los antgenos potenciales de un organismo puede ser identificada en el genome mediante anlisis in silico. Los antgenos potenciales son clonados, purificados y sometidos a un anlisis inmunolgico. El proceso completo da lugar a la identificacin de un nmero reducido de candidatos de vacunas. (e). Trends in Biotechnology (2005) 23 (2):57-108 74. Mutaciones Mutaciones y su base qumica mutaciones cambio estable y heredable en la secuencia de nucletidos puede tener o no algn efecto sobre el fenotipo de un organismo, de hecho la mayor parte de las mutaciones son neutras en ese sentido Mutaciones y mutagnesis las mutaciones pueden clasificarse, de forma no excluyente, segn su efecto en el fenotipo mutaciones morfolgicas cambia la morfologa de la clula o la colonia mutaciones letales matan al organismo mutaciones condicionales se expresan solo bajo ciertas condiciones (ej.. alta temperatura) mutaciones bioqumicas cambio en la capacidad metablica de un organismo auxotrofos tienen mutaciones en una ruta biosinttica no pueden sintetizar el producto de una ruta requiere el

producto de esa ruta como nutriente en medios de cultivos mnimos El trmino auxotrofo se contrapone al trmino prototrofo (denominacin que se aplica a cepas que pueden crecer en medio mnimo, sin suplementos) mutaciones de resistencia resistencia a patgenos , productos qumicos y antibiticos 75. Mutaciones Cmo tienen lugar las mutaciones espontneamente se desarrollan en ausencia de agentes externos suelen ocurrir al azar mutacin dirigida (adaptativa) mutaciones que son el resultado de la hipermutacin seguida de seleccin inducida desarrollada tras la exposicin a un mutgeno Mutaciones espontneas Son el resultado de : errores en la replicacin del ADN dao del ADN insercin de transposones Mutaciones inducidas provocada por agentes qumicos o fsicos que daan o alteran le qumica del ADN o que interfieren con los mecanismos de reparacin de ADN 76. Mutaciones Deteccin y aislamiento de mutantes las mutaciones son poco frecuentes (1 de cada 107 a 1011 clulas) para encontrar mutantes se necesitan mtodos de deteccin sensibles y/o mtodos que aumentan la frecuencia de mutacin Tratamiento de clulas de E. coli con un mutgeno como la nitrosoguanidina Soporte Superficie de tercio pelo esterilizada Rplica Los auxtrofos de (medio sin lisina) lisina no crecen Inoculacin de una placa con medio completo e incubacin. Tanto Placa maestra las bacterias de (medio completo) tipo salvaje como los supervivientes mutantes Rplica Todas crecen formarn colonias (medio completo) 77. Mutaciones Seleccin de mutantes empleo de condiciones Tratamiento de auxotrofos de ambientales en las que puede lisina (Lys-) con un mutgeno crecer el mutante deseado como la nitrosoguanidina o la ej, seleccin de revertientes radiacin UV para producir revertientes desde auxotrofa a prototrofa Siembra en un medio mnimo (carente de lisina) Incubacin Solo crecen los prototrofos capaces de sintetizar lisina 78. Mutaciones Medio completo con una Test de carcinogenicidad pequea cantidad de Cultivo de auxtrofos de histidina histidina de Salmonella se basa en la observacin de que la mayor parte de los carcingenos son tambin Medio completo co Medio completo con Medio completo mutgenos un agente mutgen un agente mutgeno con una pequea yyuna pequea una peque el test de mutagenicidad se cantidad de cantidad de histidin cantidad de histidina emplea para identificar histidina compuestos potencialmente carcinognicos e.g., Test de Ames tasa de reversin en presencia de un carcinogeno potencial > tasa de reversin en ausencia de un carcinogeno potencialentonces, si el agente es un mutgeno puede ser carcingeno Revertientes Revertientes inducidos por e espontneos 79. Reparacin de ADN Reparacin de ADN Comprobacin de la lectura (proofreading) correccin de errores en el apareamiento de bases realizado durante la replicacin los errores son corregidos por la ADN polimerasa otros mecanismos reparan apareamientos incorrectos y el ADN daado, estos son: Reparacin por escisin de una hebra, la otra se usa como molde Eliminacin de lesiones (Fotoreactivacin de dmeros de timina) Reparacin postreplicativa (la metilacin de ADN permite distinguir cadenas nuevas y viejas) Reparacin por recombinacin: repara el ADN en ambas hebras implica la recombinacin con una Sobre la cadena de ADN se muestra los molcula no daada principales lugares en los que se daa el ADN. en clulas que se dividen Las depurinaciones (prdida de las purinas) se rpidamente otra copia de indica con flechas rojas. Los sitios que pueden cromosoma esta disponible sufrir un ataque hidroltico se indican con flechas La protean RecA cataliza la verdes y los que pueden sufrir una oxidacin se recombinacin indican con flechas azules 80. Reparacin de ADN Reparacin SOS sistema de reparacin inducible se emplea para reparar daos grandes que paran la replicacin, dando lugar a numerosas brechas La protena RecA inicia la reparacin mediante recombinacin La protena RecA acta tambin como una proteasa, destruyendo una protena represora y as aumentando la proporcin de enzimas de reparacin por excisin Proceso de reparacin SOS: En ausencia de daos, los genes de reparacin se expresan en E. coli a niveles bajos debido a la unin de la protena represona LexA en sus operadores (O). Cuando

la protena RecA se une a una regin daada, destruye la protena LexA y los genes de reparacin se expresan de