PHARMACOGENETIQUE: lexemple des LAL

May FAKHOURY
Pharmacologie Pdiatrique et Pharmacogntique Hpital Robert Debr Paris - France
1

Variabilit inter et intra individuelle

mdicament
Variation individuelle (pharmacocintique pharmacodynamie)
Physiopathologie
(ge, sexe, poids, pathologie)

Facteurs gntiques
(enzymes de mtabolisme, m transporteurs, Rcepteurs, cibles)

Facteurs environnementaux
(alimentation, polluants, alcool)

Interactions mdicamenteuses

rponse
Efficacit (80% des patients) Effets indsirables (5-20% patients)
2

Pharmacogntique
La pharmacogntique est ltude des variations individuelles d'origine gntique du devenir (Pharmacocintique: PK) et des effets (Pharmacodynamie: PD) des mdicaments dans l'organisme Variations gntiques
enzymes de mtabolisme protines de transport rcepteurs des mdicaments

PG du mtabolisme des mdicaments

Variants allliques stables transmis selon le mode autosomique rcessif (ou co-dominant) Altrant la synthse enzymatique normale Responsables dun phnotype dficitaire - lent atteignant au moins 1% de la population Silencieux en labsence de prise mdicamenteuse

Mcanismes molculaires dinactivation

Rarrangements gniques
dltion complte, duplication gnique

Mutations
site de splicing, codon stop, changement dacide amin

absence de la protine prsence dune protine modifie

instabilit, non fonctionnalit

Les polymorphismes PG
Cibles des mdicaments
rcepteur bta-adrnergique et rponse aux btaagonistes dans lasthme enzyme de conversion et rponse aux IEC rcepteur la 5-hydroxytryptamine et rponse aux neuroleptiques

Mtabolisme et transport des mdicaments

Mtabolisme des mdicaments (foie)

Phase I (fonctionnalisation)
CYP450: 1A, 2C, 2D, 3A ADH estrases poxyde hydrolase X
XOH

O2

ROH

XOH

XOR

XOR

Phase II (conjugaison)
UGTs NAT1 et NAT2 GST TPMT

Phase III (efflux)

MDR MRP
CYP450: cytochrome P450. ADH: alcool dshydrognase. UGTs: uridine 5-triphosphate glucuronosyltransfrase. NAT: N-acetyltransfrase. GST: glutathion S-transfrase. TPMT: 7 thiopurine mthyltransfrase.

Les Cytochromes P450

CYP450
protines hminiques familles (1 4), sous-familles (A F) et groupes (1 20)
Phase I

CYP les plus importants

1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4

Sous-famille CYP3A
(3A4, 3A5, 3A7, 3A43) 30% CYP hpatiques 70% CYP intestinaux >50% des mdicaments
8

Transport actif des mdicaments

famille des ATP binding cassette
MDR (P-glycoprotine, P-gp) et MRP
protines transmembranaires

systme defflux. Dfense

intestin, foie, rein, placenta, tumeurs chimiorsistances

CYP3A/P-gp: barrire
CYP3A: mtabolisme local
inactivation

P-gp/MRP: rejet lextrieur des cellules

de la biodisponibilit

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Substrats CYP3A/P-gp
Classe Molcule CYP3A S S S S S I S S P-gp S S S S S I S ?

dexamthasone Corticodes Immunosuppresseurs ciclosporine FK-506 toposide Anticancreux vincristine ktoconazole Antifongiques nelfinavir Antiviraux cisapride Divers
S: substrat; I: inhibiteur

11

Consquences thrapeutiques
Fonction du mdicament
mdicament ou prodrogue (mtabolite actif) importance de la voie dficitaire dans le mtabolisme (% de mtabolisme) possibilit de dviations du mtabolisme par dautres enzymes (mtabolites forms actifs, toxiques) index thrapeutique

Fonction de lindividu
mtaboliseur lent (groupe minoritaire et homogne)
absence de mtabolisme: surdosage, inefficacit, toxicit

mtaboliseur rapide (groupe majoritaire et inhomogne)

effet insuffisant, inefficacit du traitement dsquilibre mtabolique, interactions mdicamenteuses synthse de mtabolites ractifs (cancer, malformation) 12

Dsquilibre entre les Phase I et II

AGE, ENVIRONNEMENT, GENETIQUE Risques des intermdiaires ractifs: toxicit, cancrognse
PHASE I

CYP450

Dtoxification Conjugaison

PHASE II

13

Gnotype et Phnotype
Facteurs non gntiques (induction, inhibition, interactions)

pe ty no g

pe ty no h p

Relation entre les variations gntiques, les variations de lARN et de lexpression des protines, la biologie et leffet clinique (Brockmoller 2008)
14

Gnotypage
Recherche de mutations, dltion, duplication
prise de sang (facile daccs) pour extraction dADN techniques de biologie molculaires de + en + sophistiques (rapides, prcises)
discrimination alllique (TaqMan), squenage, puce ADN

simple si les modifications gnotypiques sont connues

Inconvnients
ne renseigne pas sur les consquences fonctionnelles
corrlation approximative avec le phnotype

15

Phnotype
Tester une voie mtabolique in vivo
administration dune substance de rfrence (facile
obtenir et spcifique du polymorphisme dintrt)

dosage de la molcule mre et de son mtabolite calcul du rapport indice de mtabolisation rsultat valable pour tous les mdicaments mtaboliss par cette voie

Inconvnients
prsente un (faible) risque car administration dune molcule exogne (utilisation de faibles doses) rsultat influenable par une variabilit dorigine non gntique
altration mtabolique interaction mdicamenteuse
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Exemples deffet de la PG sur la variabilit defficacit et de toxicit des mdicaments

17

PG et effets indsirables
2% des admissions pdiatriques sont dues aux EI 25% des prescriptions impliques dans les EI sont hors AMM (Impicciatore 2001; Clarkson 2001) 59% des mdicaments retrouvs dans les tudes sur les EI sont mtaboliss par au moins une enzyme gntiquement dtermine vs 22% des mdicaments slectionns au hasard
(Philips 2001)

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Associations entre mdicaments et EI

Enzyme
CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 Dihydropyridine deshydrognase UDP glucuronosyl transfrase 1A1

mdicament
antipsychotiques Warfarine tolbutamide Diazpam Propafnone Perhexiline 5-fluoro-uracile Irinitecan

EI
Dyskinsie Hmorragie Hypoglycmie Sdation prolonge Hpatotoxicit Mylotoxiciit Diarrhe Mylosuppression
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CYP2D6 et nortriptyline (PG et PK)

0 13 2 13 2 0

3 to 13

20 Dalen et al. Clin Pharmacol Ther 63:444-452, 1998

Etudes PG et efficacit (2008)

21

Etudes PG et toxicit (2008)

22

Leucmies Aigues Lymphoblastiques

LAL: pathologies tumorales les + frquentes de lenfant
30% des cancers en pdiatrie prolifration clonale de prcurseurs de lignes lymphodes, morphologiquement anormaux et blocage de maturation

Pronostic:
ge (meilleur pronostic est entre 4 et 10 ans) syndrome tumoral critres immunologiques (CD10 ) critres gntiques: t(9;22), t(4;11), hyperplodie, hypoplodie

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Patients traits pour LAL: depuis 1960.

St Jude Hospital EORTC CLG
58951 58881 58831-32
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 O N
1291164 6152065 255 735

: 1999 : 1989-1999 : 1983-1989

Event-Free Survival of ALL pts

4 8 12 Number of patients at risk :

317 1366 500 0 589 296 0 38 100

(years) 16
58951 58881 58831-32

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 O N 4 8 12 Number of patients at risk :

361 1588 587 0 726 363 0 50 123 82 1164 401 2066 165 735

Overall survival of ALL pts

(years) 16
58951 58881 58831-32

Survie: < 10% (1960) et 80% (2008) avec la polychimiothrapie

24

Rponse au traitement multifactorielle

Minimal residual disease (in vivo sensitivity to drugs)

Pui & Evans, NEJM 2006

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Critres gntiques de la maladie

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 Logrank test: p<0.0001

t(12;21) n=74 (23%) Hyperdiploidy n=109 (34%) Others n=122 (38%)

t(9;22) or t(4;11) n=19 (6%)

(years) 4 6 8 10 12

Comparaison des diffrents sous-groupes

t(12;21) Hyper>50 Other
Age
WBC EFS (6y) survival (6y) 4 11.5 86% 95% 3 6.4 84% 90% 4 19.7 62% 77%

t(4;11) or t(9;22)
6 124.6 16% 31% Cav et al., 2003 Cav

26

Expression des gnes

Les gnes expression faible dans les cellules leucmiques rsistantes sont associs avec le cycle cellulaire et lapoptose

Yeoh et al., Cancer cell, 2002

Cario et al., Blood, Jan 2005; 105: 821 - 826

27

Traitement des LAL

Dure moyenne de 2 3 ans (protocole EORTC)
prphase
Corticodes

induction
vincristine daunorubicine
L-asparaginase

consolidation
aracytine MTX 6-MP
cyclophosphamide

intermdiaireIIa maintenance
6-MP MTX-HD aracytine
IIb

6-MP MTX Corticodes

Traitements des LAL peuvent tre inefficaces ou responsables d'effets toxiques

molcules index thrapeutique troit polymorphismes gntiques
enzymes de mtabolisme: CYP450, thymidilate synthase (TS), thiopurine S-mthyltransfrase (TPMT), mthylne ttrahydrofolate rductase (MTHFR), mthionine synthase (MS) transporteurs: rcepteur des folates rduits (RFC), P-gp
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LAL et PG des anti-cancreux

Interaction des anti-cancreux (rectangles) avec les enzymes de mtabolisme et les protines de transport sujets des 29 polymorphismes PG (cercles)

PG et anticancreux
gne
Mthylne ttrahydrofolate rductase (MTHFR) Mthionine synthase (MS) Thymidilate synthase (TS)

fonction
mtabolisme des folates remthylation de la mthionine mtabolisme des analogues des folates systme d'efflux 50% des CYP3A hpatique, variabilit interindividuelle transport des folates mtabolisme des thiopurines

mutations
C677T A1298C A2756G 2R / 3R C3435T C1236T G2677T/A CYP3A5*1 / CYP3A5*3 G80A G238C G460A A719G

impact en clinique
hyperhomocystinmie (cardiovasc et neuro) hyperhomocystinmie 3R/3R: diminution taux plasmatiques des folates rsistance des cellules cancreuses protines tronques et absence CYP3A5 rsistance aux anti-folates accidents mylotoxiques (aplasies mdullaires)

MDR1 / P-gp

CYP3A5 Transporteur des folates (RFC) Thiopurine S-mthyltransfrase (TPMT)

30

6-mercaptopurine (6-MP)
Lanvis
6-MP
ABCC ITPA HGPRT TPMT ABCC HGPRT

6-MP TPMT HGPRT TIMP

6-meMP

TPMT

s if t ac 6-TGN
TPMT

TPMT

TPMT

Incorporation into DNA

HGPRT: hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transfrase. ITPA: inosine triphosphate pyrophosphohydrolase

I to nac x i ti q u fs es
6-meTGN
31

TPMT thiopurine S-mthyltransfrase

Enzyme cytosolique. Activit trimodale Polymorphisme pharmacogntique (Caucasiens)
89% HN 11% HT 1/300 HM: dficient

Principales mutations ponctuelles (95% de la

frquence des allles) TPMT*2 (G238C)
TPMT*3B (G460A) TPMT*3C (A719G) TPMT*3A (*3B et *3C) La frquence des variants TPMT
Caucasiens Asiatiques du Sud-Ouest Asiatiques de lEst Africains 6% 1% 2% 6% *3A *3A *3C *3C
32
Polymorphisme gntique de la TPMT

Protine TPMT et PG
Taux de ARNm et de synthse de la protine TPMT sont pareils chez les WT et les muts Synthse dune protine instable (protolyse)

TPMT*1

TPMT*2

TPMT*3A

Cintique de la dgradation de la TPMT humaine. (Tai et al., 1995) Cin d al.,

33

Gnotype et activit de la TPMT

Polymorphisme pharmacogntique
synthse dune protine instable (Tai et al., 1995)

Variabilit interindividuelle de lactivit

Mtaboliseurs rapides
(90%)

% des sujets

Mtaboliseurs intermdiaires
(10%)

Mtaboliseurs

lents

(0,3%)

activit TPMT

(Weinshilboum and Sadek 1980)

34

Implication en clinique
6-MP TPMT

X TPMT

6-meMP

Lors dadministration de doses standards de 6-MP

HGPRT TIMP TPMT

6-TGN

6-meTGN

Incorporation into DNA

Mtaboliseurs rapides
(90%)

% des sujets

s s nt ique e cid lotox ac y m

Mtaboliseurs intermdiaires
(10%)

tes xicit u ech toto r a hp

(Weinshilboum and Sadek 1980)

Mtaboliseurs

lents

(0,3%)

activit TPMT

35

Avant tout traitement par 6-MP

Au diagnostic
gnotype TPMT
identifier les homozygotes muts prvenir les toxicits svres (aplasies mdullaires

graves)

squenage pour les cas exceptionnels selon la clinique Exemple du patient *3A/*3A (gnotypage au diag.)
adaptation posologique ds le dbut du protocole
50% de la dose de 6-MP (phase intermdiaire) phase IIb: lanvis 1/2 comprim (20 mg/j) entretien: 30% de la dose de 6-MP (15 mg/m2 au lieu de 50 mg/m2) Arrive la fin du protocole sans EI majeur

36

Activit TPMT
Activit TPMT: mesure dans les rythrocytes Contraintes techniques
tube doit arriver rapidement au labo technique complexe, longue et coteuse variabilit de la mesure selon les transfusions.

Variabilit de lactivit
avant traitement: corrlation gnotype/phnotype en cours de traitement: corrlation presque inexistante (induction, inhibition)

37

En cours de traitement: mtabolites??

6 -M P
High TGN Low TPMT Low TGN High TPMT

TPM T

6 -m e M P

HGPRT T IM P

fs 6 -T G N ti ac
In c o r p o r a t io n in t o D N A

TPM T

6 -m e T G N

TGN MeMPN
38

I to nac xi ti qu fs es

TPMT et traitement par 6-MP

Prise en charge des malades
au diagnostic
gnotype TPMT: identifier les HM (prvenir les toxicits svres)

en cours du traitement (phase de maintenance)

variabilit de lactivit de la TPMT trs grande adaptation de la posologie de la 6-MP sur la mesure des concentrations des 6-TGN et des drivs mthyls

39

Le Methotrexate (MTX)
Le mthotrexate (MTX)
anticancreux interfrant dans cycle des folates Mdicament cl du traitement des LAL large variabilit interindividuelle et risque de toxicit
surveillance des concentrations plasmatiques
A L I M E N T A T IO N A c id e F o liq u e

M e th o tre x a te

F o la t e

X DHFR
C o b a la m in e M e t h io n in e S -a d e n o s y l m e t h io n in e B e ta in e m e th y l t r a n s f e ra s e D ih y d r o f o la te P u r in e Im u r e l L a n v is THF 1 0 -f o r m y T H F 5 , 1 0 - m e t h y le n e THF d U M P A c id e F o lin iq u e

s e r in e

TS

TPM T
C H 3 L a n v is C H 3 Im u r e l D N A m e th y la t io n a d e n o s in e H o m o c y s t in e B e ta in e S -a d e n o s y l h o m o c y s te in e

MS

B12

g ly c in e

M THFR
5 -m e th y l T H F ( f o la te c ir c u la n t ) M e t h y l- c o b a la m in e dTMP D N A s y n th s e

40

PG et MTX: TS
La thymidylate synthase (TS)
Enzyme ncessaire pour les cellules prolifrantes Cible importante pour une varit dagents chimiothrapeutiques (MTX, 5-FU) Polymorphisme de longueur dans le gne triple repeat augmentant lactivit TS

Impact du gnotype sur la survie sans vnements chez 205 enfants traits par MTX (Krajinovic 2002)

41

PG et MTX: les transporteurs

MDR1 (P-gp)
Systme defflux (intestin, foie, rein, placenta, tumeurs chimiorsistantes) Polymorphisme pharmacogntique: 2636C>T, 2677G>T/A, 3435C>T Frquence des haplotypes chez les Caucasiens: CGC (HN des 3 SNPs) : 30% TTT (HM des 3 SNPs) : 40%

RFC1 (reduced folate carrier)

Transport du MTX lintrieur des cellules (globules blancs) Polymorphisme G80A (His27Arg) menant une protine non fonctionnelle Frquence 47% chez les Caucasiens
42

PG et MTX: MDR1 et RFC1

Impact de la PG de RFC, MDR1 sur les concentrations plasmatiques du MTX

86 enfants LAL

43

PG et MTX: RFC1
Impact de la PG de RFC1 G80A sur lvolution des LAL
1.0

Probability of survival

RFC1 A80-

.9

.8

RFC1 A80+

.7 0 20 40 60 80 100

Time (months)
44

PG en pdiatrie vs adultes
1.50

0.15

pathologies spcifiques PK (ADME) PD des mdicaments

16aDHEA 16a -hydroxylation

Impact de la maturation

1.00

0.10

0.50

0.05

0.00

0.00 <30 wk >30 wk <24 hr 1-7 d 8-28 d 1-3 mo 3-12 mo >1 yr Adult

Fetus

Nouveau-n NouveauLacroix et al. Eur J Biochem 247:625, 1997

Objectifs des tudes chez les enfants

slectionner les doses optimales par groupes dge, de population bases sur linformation gntique prdictive de la PK et/ou activit
45

6bTestosterone 6b -hydroxylation

CYP3A7

CYP3A4

Etat actuel en clinique

A lexception de la TPMT, aucun test pharmacogntique nest utilis en routine La recherche PG est difficile (surtout en pdiatrie)
populations tudies petites information PG limite (faible nombre de SNPs tudis) gnes tudis indpendamment

Rocha et al., Neoplasia, 2005

Graphe visuel du gnotype pour les enzymes de mtabolisme et de transport 46 impliqus dans les LAL (246 patients/colonnes)
Homozygotes WT: bleu; Homozygotes muts: jaune; Htrozygotes: vert mut

Recherche vs clinique
Recherche: association entre SNPs et clinique (efficacit et toxicit): rsultats des statistiques
ne prdit pas la clinique

Clinique: les cas sont complexes

pathologie, traitements (interactions mdicamenteuses), alimentation interactions des SNPs de diffrents gnes

Il est impratif de raliser des tudes prospectives pour valuer si un polymorphisme gntique amliore le pronostic
47

Et lavenir ?
Les nouvelles molcules anticancreuses sont dveloppes de faon cibler des cellules spcifiques et des signatures gntiques des tumeurs??

Downward, Nature 2006 48 Pui & Evans, NEJM 2006

Et lavenir ?
Au cours de lvaluation des mdicaments (efficacit et toxicit)
tudier la cartographie des polymorphismes (SNPs) rechercher des dsquilibres de liaisons

En clinique
mise disposition du mdecin de tests de dpistage du polymorphisme gntique, ralisables en routine, permettant de prdire la rponse ou de cerner le risque daccident mdicamenteux pour le traitement dun patient
caractriser le profil PG individuel (DNA arrays) adapter le traitement (molcule et posologie)

49