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Definicin Historia Procesos en la biotecnologa alimentaria Etapas en el desarrollo de la biotecnologa Aplicaciones de la biotecnologa Areas biotecnolgicas importantes Procesos biotecnolgicos por fermentacin Produccin de aminocidos, biopolmeros, compuestos aromticos y colorantes Hidrlisis para la obtencin de glucosa y fructosa
Biotecnologa
Uso integrado de la bioqumica, microbiologa y de las ingenieras gentica, bioqumica y de procesos para fabricar productos a partir de microorganismos, cultivos celulares y partes derivadas de ellos (Knorr, 1987). La biotecnologa alimentaria puede definirse como el uso de las tecnologas biolgicas para la produccin, transformacin o conservacin de alimentos, o bien para la produccin de materias primas, aditivos y coadyuvantes empleados en la industria alimentaria (Garca Garibay y col., 1993). Ha permitido el desarrollo de procesos con base en las siguientes aplicaciones: 1. Los mecanismos de control de la expresin y regulacin gentica en microorganismos y en clulas utilizadas.
2. Las leyes de la bioqumica y la fisicoqumica que regulan el comportamiento de stos entes biolgicos y de sus molculas. 3. La fisicoqumica y los fenmenos de transporte involucrados en las operaciones de propagacin, recuperacin y utilizacin de los organismos o partes de ellos.
Bioqumica
Microbiologa Biologa molecular
Biotecnologa
Universo de la Biotecnologa
Ingeniera
Es una de las ms antiguas industrias. La panificacin, produccin de vino y cerveza se remontan al ao 2400 a.c., en India (los Vedas) con un producto similar al yogurt, y en los grabados de una tumba Egipcia describiendo la panificacin y fermentacin alcohlica. Posteriormente los estudios de Luis Pasteur ayudaron a comprender los mecanismos de la fermentacin en la produccin de cerveza, vino, vinagre, etc. Posteriormente se us la papana para la produccin de la cerveza siendo tal vez la primera patente con enzimas exgenas. A principios del siglo pasado (XX) empezaron a prepararse una gran cantidad de productos por fermentacin, tales como la biomasa de microorganismos como alimento, el cido ctrico, y la invertasa de levadura para la hidrlisis del azcar. Muchos alimentos y bebidas comunes se basan en fermentacin natural (queso y yoghurt), o en el uso de enzimas (jarabes fructosados, aspartamo).
El mayor impacto de la biotec. de alim. es la elaboracin de materias primas y aditivos alimentarios: edulcorantes no calricos, jarabes fructosados, aminocidos, vitaminas, etc. En cuanto a las aplicaciones analticas destacan las enzimas para la determinacin especfica de algunos componentes, microorganismos para la evaluacin de la calidad nutricional de alimentos. Tambin se han desarrollado sondas de DNA de anticuerpos para la determinacin rpida de patgenos (Salmonella, Listeria) adulteraciones de protena de origen animal por una de origen vegetal. El mayor beneficio se ha dado en el sector farmacutico y de salud, ya que son productos de alto valor agregado que pagan el costo de la investigacin rpidamente. Los antibiticos produjeron avances en en la tecnologa de fermentaciones, microbiologa industrial, mutaciones no especficas, control de expresin gentica. En los 70s y 80s la tecnologa del DNA recombinante se ha usado para producir protenas de inters farmacutico: insulina, hormona del crecimiento, interfern, activador del plasmingeno. La industria de los alimentos se encuentra muy departamentalizada y no tiene estructura de grupo, adems el consumo de alimentos es masivo, con bajo valor agregado.
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Procesos enzimticos
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Biotecnologa no-convencional: Procesos de fcil implementacin, de pequea o mediana escala, tendientes a resolver problemas de ndole energtico o ecolgico.
Anticuerpos
Ab: Protenas en forma de Y, localizadas en el suero sanguneo, producidas en respuesta a un antgeno especfico (MW~ 150 kDa)
Inmunidad humoral: IgG (Ab), IgM, IgE (alergia), IgD, IgA (secreciones como saliva, calostro, lgrimas)
(Fluorocromo)
Sistema biotina-avidina, que puede ser usado eficientemente en inmunofluorescencia indirecta (IF), Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA). Fluorforo: digoxigenina
ELISA competitiva para la deteccin de Salmonella. Al aumentar la densidad de Salmonella, menos Ab estar disponible para enlazarse al Ag recubriendo los pozos. Esto conduce a menos enlace del Ab de deteccin a los Abs de los pozos y menor nmero de producto final (103-105 cel/mL).
ELISA tipo sndwich para la deteccin de una toxina. Un aumento en el nmero de molculas de toxina conducir a un aumento en la formacin de producto final coloreado.
Procedimiento usado para aislar clulas de hibridoma produciendo anticuerpos monoclonales. PEG= polietiln glicol; HAT= hipoxantn aminopterina timidina.
IMPACTO DEL DESARROLLO BIOTECNOLGICO EN EL PROCESO DE DOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS: Queso Cerveza
Primera Uso emprico de BAL Uso emprico de levaduras generacin Uso emprico de quimosina Uso emprico de malteado
Segunda Aislamiento y uso de BAL Uso de cultivos puros de lev. generacin Extraccin, purific. y carac- Naturaleza enzimtica del terizacin de la quimosina malteado Uso de papana para la clarificacin en fro
Queso Tercera Propagacin masiva de Generac. BAL Seleccin de cultivos lcticos mejorados. Sustitucin de quimosina por proteasas microbianas producidas en gran escala
Cerveza Mejor control de la fermentacin Fermentacin continua para producir cerveza. Prod. y uso de amilasas microbianas para sacarificacin y de -glucanasas termotolerantes. Uso de enzimas (glucosidasas amilasas) para la produccin de cervezas ligeras
Cuarta ADN recombinante para Ing. Gentica para obtener levaduras Generac. producir quimosina y amilolticas y prod. de -acetolactato mejoramiento de BAL descarboxilasa para [diacetilo]<0.5 mg/L Utilizacin ptima de Ing. Gentica y cultivo de tejidos enzimas y m.o. para la para mejoramiento de cebada maduracin acelerada. Procesos con m.o. y enzimas inmovilizadas.
No obstante, estas proteasas no son adecuadas para quesos madurados puesto que tienen un rango diferente de actividades no especficas que la quimosina y no producen los sabores correctos en maduracin prolongada. Las fuentes microbianas son ms baratas y tienen ms estabilidad en su disponibilidad. Adems, los vegetarianos encuentran el uso de la renina bovina inaceptable.
Tipos de Cerveza
Los egipcios y mesopotmicos tenan en la cerveza un alimento imprescindible. Se producan hasta ocho tipos diferentes de cerveza que en Egipto era un monopolio econmico en manos del faran Los avances en la tecnologa cervecera se afianzan en Baviera, alrededor del ao 1400, al descubrirse las ventajas de la fermentacin, no en superficie sino en la profundidad de la cuba Lager: Elaborada con cepas que crecen en el fondo del tanque: S. cerevisiae. Fermentacin a 6-12C, por 8-14 d, despus se almacena por mximo 3 semanas a -1C, antes de embotellar.
Es la que ms se produce en Alemania, E.U., Mxico, etc. Las lagers de E.U. tienden a tener poco lpulo comparado con las europeas, y no son amargas. Con 40-90 kcal/100 ml y <6 % (v/v) alcohol (legislacin mexicana).
Tipos de cerveza
Ale: Se hacen con cepas de superficie que crecen uniformemente en todo el mosto, son S. cerevisiae o S. carlsbergensis. Crecen a 14-23C por 5-7 d. Es casi exclusiva de Inglaterra, y su periodo de aejamiento es de solo 1-3 d. Tiene sabores ms complejos que las lager por la T de fermentacin (sabor afrutado por steres, etc.). Las ales fuertes tienen >5% de alcohol, stout, porter, pale ale, bitter, con colores de amarillo a negro y sabores de ligeros a muy profundos y complejos Cervezas secas y ligeras. Pueden hacerse de ales o lagers, aunque se usan ms comnmente las lagers. La ligera tiene sabor ms simple por menores niveles de carbohidratos no fermentescibles, obtenindose menos alcohol, y por tanto menos caloras (15-30 kcal/100 ml). Las cervezas secas tienen el mismo alcohol que las convencionales, pero con diferente calidad sensorial con menos sensacin de llenado. Sin alcohol: <1 % (v/v) Cervezas sin alcohol: Evaporacin: los componentes voltiles se recuperan del vapor en forma de esencia por destilacin fraccionada. Rectificacin al vaco: Separar CO2 el cual se lava para recuperar voltiles que se adicionan al destilado al vaco (~42C). smosis inversa a P=5-7,5 MN/m2 . Mtodos ms primarios como la simple detencin del proceso de fermentacin (malos sabores)
Fermentacin primaria
La fermentacin es una parte crucial en el proceso de fabricacin de cerveza El proceso de gliclisis y fermentacin fue elucidado primeramente en S. cerevisiae Despus de la coccin se elimina el lpulo, se enfra el mosto y se transfiere al biorreactor. Se agregan ~0.5 L de una suspensin de levadura por 100 L de mosto para disminuir la fase lag. La fermentacin es un proceso anaerbico para generar energa a travs de la reduccin de aceptores electrnicos orgnicos como la G3P o acetaldehdo. Altas conc. de glucosa y otros carbohidratos evitan la respiracin de S. cerevisiae, alterando la estructura mitocondrial, ocasionando que la fermentacin sea la ruta predominante de obtencin de energa, an cuando exista abundante oxgeno, este fenmeno se denomina efecto Crabtree.
Fermentacin secundaria
Cuando todos los CHO fermentescibles se han convertido en EtOH, la cerveza se transfiere a otro tanque, se enfra y se almacena, an con la presencia de las levaduras. El aejamiento vara de varios das a meses, donde la levadura es capaz de ejercer un metabolismo limitado. Se dan otros cambios debido a reacciones qumicas que mejoran el sabor de la cerveza (steres: etil-, isoamil-, feniletil- acetatos: cidos: etil octanoato y etil caprilato) El cambio ms importante es la reduccin en los niveles de diacetilo, el cual tiene un fuerte sabor a mantequilla, indeseable en la cerveza. El diacetilo se forma a partir de -acetolactato (intermediario en la biosntesis de varios aminocidos) a travs de un proceso no enzimtico. El diacetilo se convierte lentamente a acetona por la levadura. Las cerveceras modernas carbonatan la cerveza antes de envasar. Se agrega glucosa para producir CO2 en el producto final.
-acetolactato
Diacetilo
Acetona
Uso de una estrategia de mutagnesis para aislar cepas de levadura con RC alterada
Exponer la levadura al mutgeno
Tecnologa enzimtica. Se usa la capacidad cataltica de las enzimas en solucin o inmovilizadas. Cultivo de tejidos de plantas. Cultivo in vitro de clulas de plantas para obtener sustancias o biotransformaciones requeridas.
Tcnicas de clulas fusionadas. Fusin de dos clulas diferentes, produciendo hbridos con caractersticas de ambos padres. Ingeniera del procesamiento y tecnologa de fermentaciones.
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Categora de Procesos
1. 2. 3. Produccin de clulas microbianas: levadura, vacunas, insecticidas microbianos. Produccin de metabolitos: alcohol, cidos orgnicos, antibiticos, aminocidos, vitaminas y enzimas. Bioconversin de sustratos, no utilizados para crecimiento: hormonas esteroides: Progesterona 11-hidroxiprogesterona por Rhizopus nigricans, luego por sntesis qumica: cortisona y otros tres esteroides (800 tons/ao). Bioconversin de sustratos, usados para crecimiento pero con objeto principal de cambiar su estado fsico: aguas residuales Alimentos fermentados: yoghurt, queso, ensilado, salami, etc. Cultivo de clulas de plantas y animales usando tcnicas microbiolgicas. a) Clulas animales. Anticuerpos monoclonales b) Clulas de plantas
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Procesos Biotecnolgicos
Seleccin del organismo Gentica Aplicada (mutacin, recombinacin, manipulacin de genes)
Esterilizacin
Elim. de slidos
Elim. biomasa
(lino)
"Plant Biotechnology: Current and Potential Impact for Improving Pest Management in U.S. Agriculture, An Analysis of 40 Case Studies," National Center for Food and Agricultural Policy, June 2002, <www.ncfap.org/40CaseStudies.htm>.
Daar el ambiente? Es seguro para comer? Cmo me beneficia? La nueva tecnologa es riesgosa
Preocupaciones del consumidor
Factores que conducen a la hostilidad del consumidor hacia alimentos conteniendo plantas transgnicas
Compuestos indeseables en cultivos comestibles, naturaleza qumica y presencia o ausencia de lneas transgnicas con niveles reducidos de cada compuesto
Suero Produccin de cidos orgnicos (propinico, actico, lctico), etanol, -galactosidasa Medio de cultivo: Protena unicelular (Kluyveromyces marxianus) Levadura para panificacin (S. cerevisiae), despus de hacer disponible los azcares (hidrlisis de lactosa) Bebidas (Rivella, Gefilus)
Agua, 93%
Base hmeda
Dubach, 1988.
Sudamrica, 5.70%
Francia 11.36%
Mxico 0.81%
Canad 2.67%
FAO, 2001
Hidrolizados proteicos
Panadera
Alimentacin humana
Jarabes de suero Protena unicelular (C. utilis, K. marxianus)
Prebiticos
Incrementan el crecimiento de probiticos
Simbiticos
probiticos y prebiticos juntos
Bacteria
Anti-allergy properties of fermented foods: an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria?
M. L. Cross, L. M. Stevenson and H. S. Gill
International Immunopharmacology Volume 1, Issue 5, May 2001, Pages 891-901
Abstract Clinical reports have suggested that dietary consumption of fermented foods, such as yogurt, can alleviate some of the symptoms of atopy and might also reduce the development of allergies, possibly via a mechanism of immune regulation. Controlled studies have indicated that consumption of fermented milk cultures containing lactic acid bacteria (LAB) can enhance production of Type I and Type II interferons at the systemic level. In animal models, LAB have been shown to promote interferon expression, and to reduce allergen-stimulated production of IL-4 and IL-5 in some cases. Recent results have shown that LAB are potent inducers of pro-interferon monokines (IL-12 and IL18), and that cytokine secretion is stimulated by the interaction of Gram-positive cell wall components with surface receptors of mononuclear phagocytes, via NF-B and STAT signalling pathways. However, it is clear that the extent and quality of LAB-induced immunoregulation is strain-dependent. This review discusses the clinical and laboratory evidence for anti-allergy properties of fermented foods, and proposes a model for the mechanism by which some welldefined strains of immunoregulatory LAB might down-regulate a Th2 allergic phenotype.
Milk and Health Research Centre, Institute of Food, Nutrition and Human Health, Massey University, Palmerston North, New Zealand
-lactalbumina Bovina
PM= 14.2 kDa y es muy parecida a la protena humana. 74% de sus aminocidos son idnticos, y un 6% extra tiene un alto grado de similitud qumca. La alfa-LA bovina consiste de 123 aas y cerca del 10% de la protena bovina est glicosilada. Tiene 4 enlaces disulfuro, Cys6-Cys120, Cys28Cys111, Cys61-Cys77, and Cys73-Cys91. Dos puentes (Cys6-Cys120) y (Cys28-Cys111) estn en el dominio-a, el tercero (Cys61-Cys77) est en el dominio-b. El cuarto (Cys73-Cys91) conecta la hlice-C del dominio-a con una hlice-310 en el dominio-b. No tiene tiol libre y es una metaloprotena que enlaza Ca, en donde el Ca estabiliza la estructura.
Embutidos fermentados Los microorganismos reducen la humedad, contribuyen a la estabilidad y proporcionan sabores y aromas caractersticos. M.O.: BAL, Corynebacterium sp., Debaromyces sp., Penicillium expansum, P. nalgioviensis. Pueden ser secos y semisecos, de carne (principalmente cerdo) picada que por accin microbiana llegan a un pH 5.3, y eliminada 25-50% de humedad (secos) 15% (semisecos). - Ahumados/curados (semisecos): Thuringer (alemn). 18-48 h de maduracin a 35-40C, coccin a 105C; 50% humedad - Secos. Salami (italianos). 18-48 h de maduracin a 28-32C; 30-69 d de secado a 10-22C; 35-40% humedad - Ahumados. Boloa (embutido de Lbano, Penn.). Slo de res. 10 d en salmuera a 4C, uso de KNO3; ahumado a 68C por 4-8 d. 50% humedad.
Destiladas
Fortificada
FRUTAS
Uva Vino, champaa, vino espumoso
Sidra, sidra espumosa Perry Kirsch Vinos de frutas:
capuln, ciruela, guayaba, pitahaya, etc.
No destiladas
Cerveza
Tesgino
Destiladas
Whisky
Bourbon, whisky de maz de Tennessee
Agaves
Miel
Qu es el mezcal?
Es aquel producto que se obtiene de la destilacin y rectificacin de mostos preparados directa y originalmente con los azcares de las cabezas maduras de los Agaves, previamente hidrolizadas o cocidas y sometidas a fermentacin alcohlica con levaduras, cultivadas o no. El Mezcal 100% agave puede ser joven, reposado o aejo y susceptible de ser abocado. Este debe ser producido en la Regin del Mezcal en Mxico. Durango, Zacatecas, San Luis Potos, Guerrero y Oaxaca.
SLP ZAC
Agave potatorum
Agave scabra
Agave salmiana
GUE
Agave weberi Agave angustifolia haw Otras especies del genero agave excepto A. tequilana.
3. Molienda
5. Destilacin y Almacenamiento
Mezcal
4. Fermentacin
negro. Se produce cido y gas por fermentacin natural con L. mesenteroides y S. faecalis. - Productos de yuca. El gari es yuca fermentada por 3-4 d, se fre y se mezcla con agua, azcar, especias Alimentos fermentados por mezcla de hongos y levaduras el ragi de origen chino se usa como inculo en varias fermentaciones asiticas. Se hace fermentando harina de arroz y Mucor, Rhizopus, Candida y Saccharomyces le confieren sabor dulce, un poco cido y alcohlico Alimentos fermentados por hongos, seguido de una mezcla de bacterias y levaduras Se usa como inculo el tane koji que es un polvo verde-amarillento conteniendo esporas de A. oryzae y A. soyae, para la primera fermentacin de la salsa de soya. La segunda fermentacin se hace con bacterias y levaduras. Otro producto similar es el miso y sake
Atole agrio
Charagua
BE a base pulque con almbar, chile ancho y hojas de maz tostado. Se calienta y luego se fermenta.
Pozol
BNE cida. Masa de maz nixtama- Tab, Chis, Yuc, Oax, lizado fermentada envuelta en hojas Ver, Gro, QR. de pltano; diluido con agua
Alimentos de frutas
Colonche Tepache
Bebida dulce, gaseosa, ligero olor butirceo, y bajo contenido alcohlico. Fermentacin de jugo de tunas
Bebida dulce refrescante. Se obtiene de la fermentacin de jugo y pulpa de pia, naranja, guayaba, arrallanes Bebida alcohlica elaborada de pia, agua de cebada y masa de maz prieto. Se fermenta por 4 d y se aade dulce, clavo y canela Bebida alcohlica obtenida por infusin del jugo de tunas con cscara de frutos de timbre(4-8cm) (Acacia augustissima)
Chicha
Tejuino
Clonacin
ARDRA=Anlisis de Restriccin de DNA Ribosomal Amplificado AFLP= Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados RAPD= Anlisis de DNA polimrfico amplificado al azar RFLP=Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin
Denaturing gradient gel electrophoresis (Urea 6M, Formamida) Temperature Gradient Gel Electrophoresis
ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) consiste en amplificar el gen 16S rRNA seguido de una separacin de digeridos con diferentes enzimas de restriccin. Estos patrones de restriccin combinados resultan en perfiles ARDRA que permiten diferenciar entre la mayora de las especies. Por ej. los patrones de restriccin obtenidos con respectivamente CfoI, AluI, MboI, RsaI y MspI numerados respectivamente 1,1,1, 2 and 3 rinden en combinacin el perfil ARDRA 11123 que es caracterstico de A. baumannii. El proceso completo de extraccin de DNA (a partir de un cultivo puro), amplificacin del 16S rDNA, restriccin, digestin y electroforesis en agarosa toma un da (hasta 30 cepas).
Figure 1. Patrones de restriccin obtenido despus de digestion con enzimas de restriccin CfoI,
AluI, MboI, RsaI and MspI para 16S rDNA amplificado de diferentes especies de Acinetobacter.
Perfiles ARDRA de cepas de Acinetobacter previamente identificadas a especies genmicas por el uso de hibridacin DNA-DNA. Los patrones se muestran en la Fig. anterior.
Pattern with enzyme Genomic species 1 (A. calcoaceticus) CfoI 2 3 2 (A. baumannii) 1 1 1 AluI 2 2 1 1 1 MboI 1 1 1 1 1 RsaI 1 1 2 2 2 MspI 3 3 3 1 1+3
Strains (N) 7 1 27 33 4 Reference strain ATCC 23055T RUH 583 ATCC 17904 ATCC 19606T LMD 82.54
AFLP
I paso: digerir DNA genmico con una enzima de restriccin que corte frecuentemente (MseI, 4 pb secuencia de reconocimiento) y otra que corte menos fecuentemente (EcoRI, 6 pb secuencia de reconocimiento). Los fragmentos resultantes se ligan a molculas adaptadoreas extremoespecficas. Se realiza una amplificacin preselectiva por PCR usando primers complementarios a c/u de los adaptadores, excepto por la presencia de una base adicional en el extremo 3, seleccionada por el usuario. Ocurre amplificacin de solo 1/16 de los fragmentos de EcoRI-MseI. En un segundo PCR "selectivo", se usan los productos del primer PCR como plantillas, conteniendo los primers dos bases adicionales, seleccionadas por el usuario. Los primers para los adaptadores especficos de EcoRI estn etiquetados por fluorescencia o radioactividad. El perfil electrofortico revela un patrn (huella digital) de fragmentos representando cerca de 1/4000 de los fragmentos de EcoRI-MseI. Primer preselectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCg Adaptador -------------------------------| Primer selectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCgtc Adaptador --------------------------------|
AFLP Comparado con RAPD, se requieren menos primers para realizar escrutinios de todos los sitios posibles. El procedimiento de AFLP tpicamente detecta ms polimorfismos por reaccin que los anlisis por RFLP o RAPD. El anlisis AFLP es especialmente til para el escrutinio de individuos que se retrocruzan (backcross). AFLP's, pueden ser marcadores codominantes, como los RFLP's. La codominancia resulta cuando el polimorfismo se debe a secuencias dentro de la regin ampliada. Pero debido al No. de bandas observadas al mismo tiempo, se requiere evidencia adicional para determinar que un grupo de bandas resulta de diferentes alelos en el mismo locus. Si el polimorfismo se debe a la presencia/ausencia de un sitio de unin al primer, la relacin es dominancia. El alelo que no tiene unin al primer no ser detectado como una banda.
RAPD La complejidad del DNA nuclear eucaritico es suficientemente alta para que aleatoriamente existan pares de sitios complementarios a octa- o decanucletidos de una tira en la orientacin correcta y relativamente cercanos unos de otros para que puedan ser amplificados por PCR. Con algunos decanucletidos escogidos al azar no se amplifica secuencia alguna. Con otros, productos de la misma longitud se generan a partir de DNAs de diferentes individuos. Con algunos otros, se dan patrones de bandeo (ver figura) diferentes para cada individuo de una poblacin. La bandas variables son comnente llamadas DNA polimrfico amplificado al azar (RAPD). Tres de las bandas de la figura son bandas RAPD.
RAPDs exhiben polimorfismo y pueden usarse como marcadores genticos RAPDs son dominantes en el sentido de que la presencia de una banda RAPD no distingue entre estados hetero- y homozigotos.
Tecnologa Enzimtica
El mercado mundial para las enzimas de inters industrial se ha estimado en US $ 625 millones (1989) y $ 2 millardos (2004), siendo Novozymes (55%) y Danisco (30%, Dinamarca) los principales productores, con un ritmo de crecimiento de 2-3% anual. En Mxico el mercado estimado es de US $17 millones. En 1985 se produjeron 80 000 tons de productos enzimticos, equivalentes a 4 000 tons de protena activa. La mayora de las enzimas producidas encuentran aplicacin en la industria de los alimentos: la industria alimentaria ocupa el 62 % (con la tercera parte usada en panificacin), la textil el 5 % y la industria de los detergentes el 33 %. En la industria alimentaria las enzimas se utilizan principalmente para el procesamiento del almidn, en seguida para la elaboracin de quesos, jugos, repostera, jarabes fructosados.
Enzimas en la industria
Kaneka ha encontrado una formiato deshidrogenasa robusta para el reciclaje de cofactores en procesos de oxidacin-reduccin.
Dowpharma ha usado su tecnologa de expresin Pfenex para producir grandes cantidades de enzimas.
Otra adicin comn a los sistemas de masa es la lipoxigenasa. Esta enzima oxida los cidos grasos cis, cis-polienoicos a hydroperxidos, oxidando conjuntamente los grupos -SH de las protenas a grupos -S-S-, aumentando la resistencia de la fraccin del gluten en las protenas de la masa. Tambin acta sta enzima como blanqueador ya que decolora los carotenoides de la harina. La enzima es usualmente aadida en forma de harina de soya desgrasada.
Soybean lipoxygenase
Los cidos grasos libres dan el sabor y aroma caracterstricos de los quesos: liberacin de cidos grasos de cadena corta (C4 y C6) dando sabores fuertes y c. grasos de cadena media (C12 y C14) dan origen a sabores a jabn. Los c. grasos pueden ser biotransformados por la poblacin microbiana del queso, conduciendo a la formacin de compuestos de sabor como acetoacetato, beta-ceto cidos, metil cetonas, steres y lactonas. Tradicionalmente lipasas animales se han usado en los quesos, con cada especie resultando en un perfil de sabor caracterstico. Recientemente, se han introducido lipasas microbianas de Mucor miehei, Aspergillus niger, y A. oryzae.
Queso
Romano Feta
Lipasa
cabrito/cordero pregstrico Mucor miehei
Mozzzarella Ternera/cabrito pregstrico Parmesano Provolone Cheddar A. niger Manchego A. oryzae Azul
Pululanasa cida
(B. acidopullulyticus)
Fructosil transferasa
(B. subtilis)
-amilasa cida
(B. stearothermophilus)
Ligninasas
(Arthrobacter sp.)
Varias
(Irpex lacteus, Formitopsis pincola)
Metodologa
Cultivo continuo Cultivo continuo en cepa transformada genticamente Ingeniera gentica Clulas inmovilizadas/sistema continuo Nueva cepa, sustrato barato, ingeniera gentica
Aminocido
L-lisina L-triptofano L-treonina, L-fenilalanina L-serina L-fenilalanina
Se han usado tcnicas de ADN recombinante eficientemente en Brevibacterium flavum (Lys) y Corynebacterium glutamicum (Glu), con el fin de tener cepas mutantes, con caractersticas regulatorias deseadas e hiperproductoras de aminocidos.
Usos
Utilidad
Reforzar sabor, ablandador de carne Enriquecer el sabor Mejorar sabor, punto de inicio en sntesis orgnica Mejorar la calidad; Antioxidante Antioxidante, aditivo nutritivo
Jugo de frutas Alim. Endulzados Nutricin humana Pan, jugos de frutas Varios, leche en polvo
Pan (Japn), Alim. Aditivo nutritivo animal Prods. de soya; Alim. animal. Aditivo nutritivo, uso en hepatitis (teraputico)
Valor de mercado estimado (2004): $ US 3.5 billones; Ajinomoto (30%), ADM y BASF. 52% alimentos, 30% alim. animal, 18% especialidades qumicas y farmacuticas).
Racemizacin Tanabe (Japn) en 1969 desarroll un proceso continuo utilizando aminoacilasa de A. oryzae inmovilizada en DEAESephadex. Con reactores de 1 m3 se obtienen 200-250 kg de aa/da. Se producen por este mtodo L-Ala, L-Met, L-Phen, L-Trp, LVal (520 ton/mes).
Mtodos tpicos para promover la sobreproduccin de metabolitos Smbolos Produccin Puntos de Control S: Sustrato
Inhibicin represin
Aceleracin
Desregulacin limitacin
Funcin
1: Activacin crecimiento celular 2: Aceleracin de la exc. de producto 3: Elim. de la inhib por retroaliment. y represin 4: Enriquecimiento de la activ. enzim. 5: Reduc. de la ac. enz. que conduce a subproductos
Ruta y control de la produccin de Lis en mutantes auxotrficos de C. glutamicum auxtrofo cuando slo
es capaz de proliferar en Oxaloacetato Aspartato un medio de cultivo si a ste se ha aadido Aspartato cinasa alguna sustancia especfica, que el tipo Aspartil fosfato silvestre, llamado prottrofo no requiere, porque es capaz de Aspartato semi-aldehido sintetizarla.
Glucosa
Homoserina
Dihidropicolinato
Diaminopimelato
Metionina
Treonina
Lisina
Xantana
Xanthomonas campestris
Dextrana
Glucosa con enlace -1-6, ramific. 13, 1-4 (5%). nSacarosa Dextrnsacarasa nfructosa+dextrana PM:0.5-1x106 Da. cido gulurnico y manurnico conectados por enlaces -1-4 y -1-4. Sustituyentes acetil. 50-100,000 residuos.
Alginato
Curdlano
Alcaligenes faecalis
Microbiological media
Aerobic batch fermentation
(Fed & continuous culture systems are also patented)
48 h, pH 7.0
Estabilizacin de espumas Suspensin de frutas, espesante de salsas Reconstitucin de alimentos Emulsiones para cosmticos Impresiones dentales, fibras y pelculas, cubiertas para tabletas. Tintas para impresin, inmovilizacin de clulas y enzimas
Caractersticas
Pelcula extracelular compuesta de microfibras de celulosa Polmero extracelular compuesto de glucosa y rahmnosa. Geles termoreversibles. Producido por Kelco (EUA) Polmeros de glucosa, manosa, fructosa, c. glucurnico. Sustitutos de hidroxi-etilcelulosa en pinturas Lipopolisacrido que funciona como emulsificante
Aroma
Afrutado: pltano, durazno, pera, rosa
Compuestos
3-metil butiril acetato, - y -decalactona, geraniol, citronelol, nerol, linalol, geranil acetato
Mycoacia uda Penicillium decumbens Sporobolomyces odorus Trametes odorata Trichoderma viride
Afrutado: almendras, pasto Pino, rosa, manzana, hongo Durazno Afrutado: miel, rosa, ans Coco
Vanillin
Principal flavor component of vanilla, which is widely used in flavor formulations. US $ 2,500/kg flavor solids. Extracted form pulped wood (vines), and also via microbial biotransformation (also considered natural) Produced from eugenol or isoeugenol by Serratia, Klebsiella or Enterobacer, with a yield of 3.8 g/L. Can also be obtained form callus cells of Vanilla fragrans or V. phaeantha. Higher yields may be obtained by immobilized culture systems with continuous removal of flavor components; passing them through activated charcoal and eluting with 50% ethanol. COO CHO Eugenol Ferulic acid Vanillic acid Vanillin
O O R
O
OCH 3
-lactone
O R
-lactone
OH
-Remove CMP/UMP by adsorption on activated charcoal -Elute adsorbed AMP/GMP with methanol/ammonia
NUCLEOTIDES
Flavor enhancers
5 GMP + 5 IMP: their maximum influence in savory flavor is on fish and vegetable proteins. Less effect on meats, cereals, milk, eggs. MSG: Most profound influence on: meat, followed by fish, vegetables, cereals, egg, milk. UMAMI compounds have a most pronounced effect on chicken, and weaker enhancement on beef, turkey and pork Savory ingredients market: $ US 1 billion/year. HVP, Autolyzed yeast extract, soya bean sauce, MSG, I+G.
2.- Inorgnicos a) Minerales: Azul ultravioleta, dixido de titanio, negro carbn II. Sintticos 1.- Orgnicos: Azoicos, antraquinonas, difenilmetano, otros
Fuente
Vegetales verdes, de hoja Carnes
Zanahorias (-caroteno), tomates (licopeno), Chiles del gnero Capsicum (capsantina), salmon (astaxantina), zempaschitl (lutena)
Benzopiranos Antocianinas Uvas (enocianina), bayas, manzanas Flavonas y flavanonas Nueces, piel de cebolla, t Betalanas Betacianina Betabel Betaxantinas Betabel Pigmentos derivados de Procesos Caramelo Miel, jarabes, refresco de cola, licores Melanoides Jarabes
Condiciones de cultivo
Polvo de arroz 3%; MgSO47H2O 0.1%, KNO3 0.15%, KH2PO4 0.25%, 96 h a 30C Idem, 72 h a 35C Polvo de arroz 5%, Glutamato monosdico 0.15%, MgSO4 7H2O 0.1%, KH2PO4 0.25%, 144 h a 30C
Cultivo slido M. anka Polvo de arroz 168 h, 30-40C M. anka Harina de pan, 192 h, 32C M. kaoliang R 10847 Harina de Mantou 144 h, 32C
Hasta 1960s
Acidificacin (HCl, pH 1.5). Hidrlisis (5-10 T=150C; ED= 12-20). Reaccin con amiloglucosidasa (pH=4-4.5, T=60C, 48-100 h. J. gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa)
Entre 1960s y 70s Licuefaccin con -amilasa (pH5.5-7.0, T=70-90C), ED=20-30. Sacarificacin con amiloglucosidasa (pH=44.5; T=60C, 48-100 h). J. de gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa. Despus de 70s Licuefaccin -amilasa termorresistente (6 a 105C, 2 h a 95C), ED=8-12. Sacarificacin con amiloglucosidasa (pH=4-4.5; T=60C, 48-100 h). J de gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa)
Enzima (90%)
atmsfera
Vapor
90-95C, 2 h
(50-55% solids)
DE=94-98; 31% TS
Mg2+activator
(87% glucose, 5% F)
Resina fuertemente cida cationica, Ca2+, retrasa fructosa y no Separation retiene DP>3-4 C treatment
70-85% TS
US HFCS producers
HFCS
La produccin anual global de HFCS es 10 millones de tons, en base seca (1999). Para esto se utilizan 1500 tons de GI inmovilizada (GII; 1999) Los mayores productores de GII son Genencor (Danisco) y Novo. La GII de Genencor se produce por adsorcin de la enzima purificada en resinas de intercambio inico, reticulada con polietilnimina y glutaraldehdo, y granulada por extrusin. La productividad es de 12-15 tons de HFCS (bs)/kg GII, con t=1900-3600 h. La GII de Novo (Sweetzyme T) se prepara por reticulacin de clulas de Streptomyces murinus con glutaraldehdo, seguido de extrusin Se usa en biorreactores de 1.5 m(d)x5 m(h) a 60-65C, pH 7.5-8.5 (1 h reaccin; 0.5 tons/da) para producir jarabe con 42% de fructosa, que por fraccionamiento se convierte a 55% de fructosa.
Catalizador
Clulas de Flavobacterium aborescens, extruidas y reticuladas
Gist-Brocades
675
(MGIU/L)
1500
1487
Novo A/S
Finnsugar (Spezyme, IGI)
200
1500
1200
*IGIU: Cantidad de enzima que produce un mol de fructosa por minuto &Tiempo de vida media, bajo condiciones ptimas de reaccin.
cido Ctrico
Su produccin rebasa las 3x105 tons/ao Pfizer tiene la mayor planta con capacidad mayor a 8x104 tons/ao 70% es consumido por industria de alimentos y bebidas, donde representa el 55-65% del total de acidulantes 18% se dirige a industria farmacutica Se produce por Aspergillus y Penicillium, aunque tambin levaduras y bacterias pueden acumular c. ctrico a partir de glucosa en un menor tiempo de fermentacin. Su produccin requiere de una operacin defectuosa del CAT y su transporte fuera de la clula.
Degradacin de glucosa a cido ctrico a travs de gliclisis y ciclo de los cidos tricarboxlicos
La nica reaccin anaplertica comprobada en A. niger es la carboxilacin del piruvato, permitiendo la fijacin del CO2 removido de piruvato durante su descarboxilacin a acetil-CoA A partir de glucosa se han tenido rendimientos de 70-90% (w/w), con el mximo terico de 112%. La participacin del ciclo del glioxilato durante la fermentacin ctrica de A. niger es controvertida y solo se ha comprobado en levaduras. Para evitar esta reaccin: Oxalacetato oxalacetato hidrolasa oxalato + acetato Se conduce la reaccin a pH 3.5, al cual sta enzima no acta Los altos niveles de AC inhiben la fosfofructocinasa, la cual se protege en presencia de iones NH4+ a concentraciones superiores a las fisiolgicas
La deficiencia de Mn2+ permite la acumulacin de iones NH4+, modificndose la sntesis normal de lpidos La consecuencia de esto es la presencia de membranas celulares defectuosas con mayor permeabilidad al AC, as como un mayor flujo de C hacia el AC como resultado de la disminucin de lpidos en los componentes celulares Cuando se usan levaduras para producir AC, la fermentacin es independiente de Mn2+, requieren de un pH menos cido (4.5-6.5), requieren de tiamina y se acumula AC en condiciones de limitacin de N
Aspectos Nutricionales
La produccin de AC est relacionada inversamente con el crecimiento celular Los carbohidratos deben ser simples : melaza (14-240 g/L); N: sales de amonio (0.1-0.4 g/L); 0.1-0.2% de fosfato, Fe2+ y Mn2+ en bajos niveles, por lo que se debe remover el Fe de las melazas (EDTA, polietilenamina).
Aspectos Fisicoqumicos
Temperatura de 25-30C, ya que a T mayor se acumula c. oxlico pH inicial 3.5-4.5, pero se mantiene en 2 durante la etapa productiva
Cintica de la fermentacin para producir cido ctrico por A. niger. La fermentacin es sumergida, aerbica en grandes biorreactores de acero inox. en un medio deficiente en hierro.
Diagrama simplificado del proceso de produccin de cido ctrico por cultivo sumergido a partir de melazas
Ni Affinity Column
Crude Extract
Ni Column
Affinity Chromatography
Pure Protein
Gel Electrophoresis
+
Tiempo
Electroforesis en Gel
Molculas cargadas se movern en un campo elctrico Se usa una matriz de gel para tamizar las molculas
Agarosa floja; amplio rango de separacin Acrilamida ms apretada; estrecho rango de separacin
El movimiento a travs del gel depende de la carga y forma NO de la masa Para que el movimiento sea proporcional a la masa (PM) la molcula debe tener un relacin carga/masa constante.
Electroforesis en Gel
El DNA tiene 2 cargas negativas (fosfato disteres) por par de bases Todas las molculas lineales de doble tira del DNA tienen (esencialmente) la misma forma Por tanto el movimiento es proporcional a la longitud (MW)
Distancia 1 / log (MW)
Gel Electrophoresis
DNA cargado en pozos
+
A B C D E
+
Fluorescencuia se incrementa por enlace al DNA
+H N 3
Absorbe a ~520nm Fluoresce a 605nm (Fluoresce naranja bajo luz UV)
XhoI
KpnI
Marker
48
XbaI
ApaI
33
25 17
Anlisis de Restriccin
10
10 Kb
5 Kb
1 Kb
Clicker Question
You have purified your favorite plasmid from a strain of E. coli. You run an agarose gel with a standard of known concentration to quantitate the DNA. But what about protein contamination? Does the presence of contaminating protein interfere with this procedure? A.Yes B.No
Resolucin de molculas muy grandes de DNA por Electroforesis en Gel de Campo Pulsante
180 KiloBP El campo elctrico se reorienta constantemente mientras se corre el gel. Consecuentemente, las molculas de DNA tienen que reorientarse. Pequeos fragmentos se reorientan ms fcilmente.
90 KiloBP 45 KiloBP
Southern Blot
Transferir DNA a membrane
Electroforesis
EcoRI
Strain 1 Strain 2
EcoRI
x x
EcoRI EcoRI Probe
Kornberg has used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model eukaryotic organism. He developed an in vitro yeast transcription system that contained highly purified RNA polymerase II and five helper proteins known as general transcription factors. However, the system did not respond to the addition of other transcription factors known to activate specific genes in cells. This observation led Kornberg to discover a protein complex known as Mediator, which serves to transfer signals from genespecific transcription factors to RNA polymerase II and the general transcription factors.
Mighty Machine In this ribbon structure of part of the yeast RNA polymerase II complex, the clamp protein (yellow) closes on the DNA (blue and green) and growing RNA transcript (red). The bridge helix is shown in green and the complex's active site magnesium ion is shown in pink.
In 2001, Kornberg and his colleagues published high-resolution X-ray crystal structures of a 10-subunit yeast RNA polymerase and of a complex consisting of RNA polymerase, template DNA, and product RNA (Science 2001, 292, 1863 and 1876). These structures showed that the two largest subunits of RNA polymerase lie in the center on either side of a nucleic acid-binding cleft, with the smaller subunits on the outside. The cleft is bridged by an -helix that acts like a ratchet to move the growing RNA transcript out of the active site during RNA synthesis.
3.
La DNA polimerasa extiende los iniciadores usando las hebras blanco como plantilla 4. Despus de un tiempo adecuado de incubacin, la mezcla se vuelve a calentar para separar las tiras, y se contina con este ciclo unas 20-30 veces (calentamiento, alineacin, extensin) Los productos de extensin de un iniciador, pueden servir como plantilla para otro iniciador en el siguiente ciclo Cada ciclo ( aprox. 5 min) involucra: 1. Desnaturalizacin por calor 93C, 5 min (despus de 1er ciclo: 1 min) 2. Enfriamiento para alineamiento de iniciadores 45C, 1 min 3. Extensin de iniciadores 70C, 1 min. Despus del ltimo ciclo se deja 10 min para finalizar las extensiones En cada ciclo se duplica el contenido del DNA blanco original, obtenindose en 20-30 ciclos aumentos en 106-109 de la secuencia blanco
PCR para amplificar secuencias de DNA. (a) calentamiento del DNA blanco y exceso de dos iniciadores, uno complementario de una tira y el otro de la tira complementaria, ms DNA polimerasa. (b) alineamiento y extensin, originndose dos tiras hijas. (c) nuevo ciclo. (d) 2a copia de DNA. (f) Efecto de 20 ciclos PCR en un DNA blanco conteniendo 10 copias inicialmente (la grfica es semilog)
La Taq polimerasa no tiene funcin correctora, por lo cual comete errores en la extensin Cuando la exactitud es crucial, puede usarse la DNA polimerasa del arqueano Pyrococcus furiosus (Top=100C; Pfu), ya que tiene actividad correctora La amplificacin in vivo tomara varios das, por lo cual los termocicladores son muy tiles. La DNA polimerasa termoestable se ha clonado en E. coli y se produce en grandes cantidades El PCR es muy til en la clonacin de DNA porque si se conoce la secuencia en sus extremos puede amplificarse antes de clonar Como herramienta para la secuenciacin de DNA, el PCR produce grandes cantidades de DNA que pueden usarse como plantillas
El PCR puede producir grandes cantidades de DNA mutado Usando oligonucletidos con algunas bases que no se hibridizarn como iniciadores, pueden introducirse mutaciones. Los mutantes puede entonces amplificarse por PCR El DNA mutado puede usarse para transformar clulas, formando derivados mutantes El PCR puede usarse para estudios comparativos evolucionarios, amplificando genes de diferentes fuentes, donde el DNA ya se ha clonado y secuenciado, usando iniciadores que no sean perfectamente complementarios, pero que sean regiones altamente conservadas Con los iniciadores adecuados, puede identificarse una sola clula bacteriana, en presencia de otras, en una muestra Puede usarse para identificacin de individuos (huellas dactilares de DNA)