Cristhian Rincn Lpez

15 de febrero de 2012

UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE QUMICA FARMECUTICA BIOLGICA LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR PRCTICA No. 1 USO Y CUIDADO DE UN MICROSCOPIO

OBJETIVO: Conocer la importancia del microscopio en el campo de la Biologa Celular, as como las partes que lo integran, uso y cuidado del mismo.

INTRODUCCIN: En su afn de llegan siempre ms lejos en la investigacin de la naturaleza de lo que los lmites de sus rganos sensoriales le imponen, el hombre ha construido mltiples instrumentos que le han permitido acceder all donde los sentidos no podan penetrar. As como el telescopio abri a la humanidad las puertas de lo infinitamente grande, el microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones nfimas, entre ellos la clula, base de la vida. Se contaban as las bases de las modernas ciencias biolgicas que hasta bien entrada la edad moderna se haban fundado en las observaciones directas. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formacin de imgenes pticas aumentadas a travs de lentes convergentes, permiten la observacin de pequeos detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibiran.

FUNDAMENTO: Un microscopio es un dispositivo encargado de hacer visibles objetos muy pequeos. El microscopio compuesto consta de dos lentes (o sistemas de lentes) llamados objetivo y ocular. El objetivo es un sistema de focal pequea que forma una imagen real e invertida del objeto (situado cerca de su foco) prxima al foco del ocular. ste se encarga de formar una imagen virtual de la anterior ampliada y situada en un punto en el que el ojo tenga fcil acomodacin (a 25cm o ms).
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Dada la reducida dimensin del objeto, se hace imperioso el recolectar la mayor cantidad de luz del mismo, utilizando sistemas de concentracin de la energa luminosa sobre el objeto y diseando sistemas que aprovechen al mximo la luz procedente del objeto.

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Los microscopios se pueden clasificar desde un punto de vista muy sencillo en: Simples y Compuestos. Un microscopio simple es aquel que utiliza un solo lente de aumento. Es el microscopio ms bsico. El ejemplo ms clsico es la lupa. El microscopio ptico estndar utiliza dos sistemas de lentes alineados. El objeto por observar se coloca entre el foco y la superficie de la lente, lo que determina la formacin de una imagen virtual, derecha y mayor cuanto mayor sea el poder diptrico del lente y cuanto ms alejado est el punto prximo de la visin ntida del sujeto. El holands Antoni van Leeuwenhoek construy microscopios muy eficaces basados en una sola lente. Esos microscopios no padecan las aberraciones que limitaban tanto la eficacia de los primeros microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke, y producan una ampliacin de hasta 300 veces; gracias a ellos Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir por primera vez las bacterias. Un microscopio compuesto es un microscopio ptico que tiene ms de un lente de objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en lminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imgenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas:

El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar. El sistema de iluminacin comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal manera que producen las ranuras de luz. El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".

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GENERALIDADES: Descripcin del microscopio compuesto: SISTEMA DE SOPORTE: La parte mecnica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revlver, el asa, la platina, el carro y el tornillo micromtrico. Estos elementos sostienen la parte ptica y de iluminacin; adems, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.

El pie y soporte: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular. La columna o brazo: llamada tambin asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior mediante una bisagra, permitiendo la inclinacin del tubo para mejorar la captacin de luz cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo inferior se adapta al pie. El tubo: tiene forma cilndrica. El tubo se encuentra en una carretera superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos. El tornillo macromtrico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rpido de la preparacin. El tornillo micromtrico: mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos. La platina: es una pieza metlica plana en la que se coloca la preparacin u objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje ptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la preparacin. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. Las pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para sujetar la preparacin. Se encuentran en la platina. El revlver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revlver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posicin de trabajo, lo que se nota por el ruido de un pin que lo fija.

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SISTEMA PTICO: El sistema ptico es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Est formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego ampla.

El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercana de la pieza con el ojo del observador. Tiene como funcin aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado. Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revlver y producen el aumento de las imgenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparacin que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersin. o Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican el aumento que producen, la abertura numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El nmero de objetivos vara con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. o El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos crculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

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SISTEMA DE ILUMINACIN: Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos:

Fuente de iluminacin: se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en versiones ms modernas con leds. Por delante de ella se sita un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el dimetro de la parte de la preparacin que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observacin produciendo luces parsitas. El espejo: necesario si la fuente de iluminacin no est construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema ptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cncava se emplea de preferencia con iluminacin artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos ms modernos no poseen espejos sino una lmpara que cumple la misma funcin que el espejo. Condensador: est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparacin, formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del campo del objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliacin); existen condensadores de inmersin, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparacin. La abertura numrica mxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajndose para su uso con objetivos de poca potencia. Diafragma: el condensador est provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolucin del sistema ptico.

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MANIPULACIN DE UN MICROSCOPIO: 1. El banco y la mesa debern encontrarse a una altura que le permita al observador el uso del microscopio en posicin vertical y de manera confortable. 2. Encender la fuente de iluminacin. 3. Montar la preparacin que se desea observar. 4. Separar los binoculares ajustndolos a su propia distancia interpupilar. 5. Enfocar entre el ojo derecho y el izquierdo. Los tubos porta oculares son susceptibles de ajuste, esto se logra enfocando primero la imagen con el objetivo de menor aumento, usando los tornillos macro y micromtrico. 6. Acomode el objetivo seco dbil (10 x) en el revlver, de manera tal que sea ste el que apunte al preparado. 7. Busque con el espejo la mxima iluminacin. En este momento, fijarse si el diafragma est abierto (muchos casos de falla en la iluminacin se deben a un diafragma cerrado). 8. Acomode el preparado en la platina, con el cubreobjetos mirando hacia arriba. En este momento se torna FUNDAMENTAL ubicar el cubreobjetos mirando hacia el objetivo, pues el primer gran error se comete en este punto, cuando fcilmente se puede enfocar con el objetivo seco dbil, pero se torna imposible su enfoque con el objetivo seco fuerte cuando el cubreobjetos queda mirando hacia abajo. 9. Mirando desde un costado del microscopio, descienda el objetivo con el tornillo macromtrico (en sentido horario) hasta su tope inferior, o hasta apoyarlo levemente sobre el preparado. Normalmente los microscopios convencionales poseen un tope que impide su descenso por debajo de cierta marca. Sin embargo, puede darse el caso que tal tope no exista. Por eso se vuelve fundamental observar el descenso desde un costado, a fin de evitar la rotura del preparado (hecho muy comn en la prctica histolgica). 10. Acomode el vidrio de tal manera que el preparado quede a la altura del objetivo. Para ello se valdrn de los tornillos presentes en la platina, que le permitirn mover al preparado en dos planos: vertical y horizontal. El objetivo seco dbil nos permite ver la visin panormica del preparado. Es decir, los tejidos, su ubicacin, y sus relaciones.

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11. Una vez puesto el preparado en el eje del objetivo, con el tornillo macromtrico comience a alejar el objetivo seco dbil del preparado (debern moverlo en sentido antihorario), buscando ver una imagen cada vez ms ntida, hasta pasarse del punto de enfoque. Vuelvan hacia el mximo punto de enfoque con el tornillo macromtrico.

12. Utilice el tornillo micromtrico para dar el enfoque fino. El objetivo seco fuerte nos permite ver detalles de una clula, o la conformacin celular de una estructura. Podremos observar la forma y tamao de clulas o grupo de ellas.

13. Una vez conseguido el enfoque correcto, RECORRA TODO EL PREPARADO, a fin de ir reconociendo imgenes que le sean familiares. 14. Mueva el revlver a fin de acomodar el objetivo seco fuerte (40x). En este momento solamente se podr utilizar para enfoque el tornillo micromtrico. El uso del tornillo macromtrico podr llevar a la ruptura del preparado histolgico. Observe las estructuras con ms aumento. 15. Vuelva al objetivo seco dbil y retire el preparado. Tome otro preparado y vuelva a empezar.

ABERTURA NUMRICA La A. N. de un objetivo est impresa en el objetivo junto con otras especificaciones del objetivo. Esta puede variar desde 0.04 para objetivos de bajo aumento hasta 1.3 o 1.4 para objetivos apocromticos de altos aumentos para uso con aceite de inmersin. La A. N. de un objetivo se define por: A. N. = I.R. sen Donde I.R., es el ndice de refraccin del medio, por ejemplo, aire, agua, o aceite, y es la mitad del ngulo del mximo cono de luz que sale o entra al objetivo. Incrementar el ndice de refraccin del medio entre el lente frontal del objetivo y la muestra da como resultado una mayor A. N. efectiva de trabajo. Los objetivos estn disponibles para agua (IR = 1.33), glicerina (IR = 1.47) y aceite de inmersin

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(IR = 1.51) aun cuando algunos de estos objetivos, especialmente los antiguos. generalmente no son intercambiables sin incurrir en artefactos de imagen. Un objetivo con gran A. N. colecta ms luz, brinda una imagen ms brillantes y es capaz de definir detalles ms finos (por ejemplo, tienen un mayor poder de resolucin) comparado con un objetivo con menor A. N. La relacin entre imagen e intensidad est dada por: A. N. 4/AT2 Donde AT son los Aumentos Totales CUIDADOS PARA UN MICROSCOPIO 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. 5. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos. FACTORES QUE DAAN AL MICROSCOPIO 1. Lavar las lentes con alcohol. 2. Mojar los objetivos con xilol o alcohol, o bien con a l g u n a o t r a sustancia.
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3. Usar papel ordinario para limpiar las lentes. 4. Poner los dedos sobre las lentes . 5 . L i m p i a r e l s o p o r t e o l a p l a t i n a c o n x i l o l . 6.Limpiar el interior de las lentes con tela o papel, en caso de que sea completamente necesario, utiliza un pincel de cerdas muy pequeas y/o utiliza papel seda.7 . D e j a r e l m i c r o s c o p i o s i n o c u l a r e s . 8.Guardar el microscopio con aceite de inmersin en el objetivo. 9. Transportar el microscopio con una sola mano. OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS Microscopio de Contraste de Fases. Su sistema est compuesto por lente ocular, anillo de fases, lente del objetivo, lente del condensador y diafragma anular. Tiene una amplificacin de 1,000 a 2,000 nm. Permite observar estructuras muy difciles de distinguir. No requiere de una tincin. Microscopio de Fluorescencia. Se compone de un primer filtro de corte o filtro de excitacin, espejo dicroico, segundo filtro de corte o filtro de emisin, fuente de iluminacin y condensador. Se observan m u e s t r a s t e i d a s , inmunofluorescencia directa o indirecta. Microscopio de Interferencia. Es un instrumento que permite la medida de la masa de regiones pequeas y transparentes de clulas vivas, obtenindose datos de t i p o cualitativo y cuantitativo. Sus componentes son a n a l i z a d o r rotable, un cuarto de longitud de onda, objetivo de interferencia, condensador, polarizador y filtro de interferencia. Microscopio Electrnico de Barrido. Est compuesto por un can de electrones (nodo, ctodo y electroimn), sistema de barrido y de lentes. Su resolucin depende de la cantidad de electrones emitidos, contando as con un lmite de resolucin. Tiene una amplificacin de 100,000 a 200,000 veces y una alta resolucin en 3D. Microscopio Electrnico de Transmisin. Est compuesto por can electrnico, c o n d e n s a d o r , cmara de muestra, lente objetiva, i n t e r m e d i a , p r o y e c t o r , pantalla fluorescente y cmara fotogrfica). Utiliza electrones con una longitud de onda de Proporciona un aumento de las clulas de 100, 000 aproximadamente

lente lente (placa 0.5 . veces

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CONCLUSIONES: Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sita cerca del objeto que se quiere estudiar. El objetivo forma una imagen real aumentada e invertida. Se dice que la imagen es real porque los rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la imagen. La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que acta sencillamente como una lupa. El ocular est situado de modo que no forma una segunda imagen real, sino que hace divergir los rayos luminosos, que al entrar en el ojo del observador parecen proceder de una gran imagen invertida situada ms all del objetivo. Como los rayos luminosos no pasan realmente por ese lugar, se dice que la imagen es virtual.

CUESTIONARIO: 1) Cul es la diferencia entre un microscopio simple y uno compuesto? Un microscopio simple es aquel que solo utiliza un lente de aumento; el ejemplo ms clsico es la lupa. Un microscopio compuesto es un microscopio que tiene ms de un lente. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en lminas tan finas que se transparentan. 2) Qu importancia tiene el uso del microscopio en la Biologa Celular? Nos permite ver estructuras muy pequeas, las cuales no son detectables a simple vista, eso es muy importante porque muchas veces las funciones de algunas estructuras como las protenas dependen de su conformacin molecular, y el microscopio electrnico te permite comprender esta organizacin. 3) Por qu es necesario utilizar aceite de inmersin al utilizar el objetivo del mismo nombre? El aceite de inmersin para microscopa tiene aproximadamente el mismo ndice de refraccin que el vidrio. Mediante el aceite de inmersin se elimina casi completamente la desviacin de los rayos de luz y se aumenta considerablemente la eficacia de los objetivos de los microscopios.

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4) Qu significa resolucin, poder de resolucin y amplificacin, asim i s m o d e q u f a c t o r e s d e p e n d e c a d a u n o d e e l l o s ? P r e s e n t a t u s respuestas a manera de tabla. Resolucin Definicin Es la capacidad que tiene un sistema ptico de aislar dos puntos que se encuentran muy prximos entre s, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro. Poder de resolucin Es la capacidad que tiene un microscopio (o el ojo humano, etc.) de percibir por separado dos puntos pequeos, adyacentes y cercanos. Vale decir, es la capacidad para percibir detalles. En el MO es de 0,2 micras o 200 nm. Principalmente de la apertura numrica de la lente y de la longitud de onda de la luz utilizada. Podemos decir que es un valor determinado, entre otras cosas, por el dimetro de la lente. Amplificacin Es el producto de nmero de aumento del objetivo por los del ocular. Amplificaciones tiles: x1000 a x2000.

Depende

Depende de la habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que estn muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras ms corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, ms finos sern los detalles.

Est determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor ser la distancia focal y mayor ser el aumento.

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5) Realiza una tabla comparativa de todos los tipos de m i c r o s c o p i o s incluyendo: fuente de iluminacin, condensador, longitud de onda, tipo de tincin, resolucin, amplificacin, tipo de lentes, etc.
Microscopio ptico Caractersticas: Permite aumentos desde 25 a 1500veces El poder de resolucin es de 0,2 m La muestra es atravesada por la luz Las lentes son de vidrio Los cortes son muy finos y se obtienen con un microtomo Microscopio electrnico Caractersticas: Permite aumentos superiores a 10.000, 200.000 y excepcionalmente 500.00 El poder de resolucin es de unos 3 a 10 La muestra es atravesada por un haz de electrones emitidos por un filamento de tungsteno Las lentes son campos magnticos Los cortes son ultra finos y se obtienen con un ultramicrotomo La imagen se genera sobre una pantalla fluorescente Ventajas: Se puede ver la ultraestructura de la clula en los cortes de los orgnulos Inconvenientes: No permite observar clulas vivas No se pueden realizar visiones de conjunto Unidades de medida: La unidad oficial es el nanmetro (nm) per es ms empleada el angstrom ()

Ventajas: Se pueden observar clulas vivas Se pueden ver clulas enteras Inconvenientes: Los anlisis no pueden ser muy detallados y profundos Unidades de medida: El micrmetro o micrn (m)

BIBLIOGRAFA: 1. Bernis, M. 1998. Atlas de Microscopa. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Fernando Aldape Barrera. Pgs. 95-107 2. Coll, J. 2000. Experimentos con el microscopio. Mxico D.F. Primera edicin. Ediciones Omega S.A. Pgs. 63-65 3.Lpez, C. 1987.Microscopia en el laboratorio. Xalapa. Facultad de Bioanlisis, U. V. Pgs. 10-21 4. Nachtigall, W. 2002. Microscopa. Materiales. Instrumental. Mtodos. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Omega. Pgs. 8-13 5. Vovides, A. 2000. Microscopa ptica: para las ciencias biolgicas. Chiapas. Universidad de Ciencias y Artes del Estado de Chiapas. Pgs. 14-19.
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