Clsi OPAS1M27-A2

M27-A2 Vol. 22 No. 15 Substitui a Norma M27-A Vol. 17 No.
Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para Determinao da Sensibilidade de Leveduras Terapia Antifngica: Norma Aprovada Segunda Edio
Este documento apresenta a seleo e preparao de agentes antifngicos; implementao e interpretao de testes e requisitos de controle de qualidade para testes de sensibilidade de leveduras que produzem infeces invasivas. Uma norma de aplicao global desenvolvida mediante processo consensual do NCCLS.
Permission to translate the M27-A2 has been granted to ANVISA by CLSI (Formerly NCCLS). In the event of any variations in meaning that may be introduced through translation, the original NCCLS publication (in English) is authoritative. For each standard, the interpretive data are valid only if the methodology in the standard is followed. NCCLS frequently updates the interpretive tables through new editions and supplements. Users should refer to the most recent edition. In January 2005, NCCLS changed its name to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Copies of the complete current standards and informational supplement (in English) may be obtained from CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, U.S.A.; telephone: +610.688.0100; fax: +610.688.-700; Internet: www.clsi.org. The permission granted by NCCLS/CLSI is limited to distribution of M27-A2 by ANVISA to clinical laboratories in Brazil. Permission to reproduce additional copies or otherwise use the text of these documents to an extent not permitted under Copyright Law must be obtained in writing from the Clinical and Laboratory Standards Institute.
Coordenao da Traduo Silvia Figueiredo Costa Doutora em Doenas Infecciosas e Parasitrias pela Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Organizao Pan Americana de Sade Revisores: Daniel A. da Matta Bilogo, Mestre em Cincias Bsicas em Doenas Infecciosas e Parasitrias-UNIFESP Marcia S. C. Melhem Doutora em Sade Pblica pela USP, Laboratrio de Micologia-Instituto Adolfo Lutz Direitos de Traduo e Reproduo Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Gerencia Geral de Tecnologia em Servios de Sade
NCCLS...
Servindo A Comunidade Mundial das Cincias Mdicas Atravs de Consenso Voluntrio
O NCCLS uma organizao internacional interdisciplinar, sem fins lucrativos, educacional e de desenvolvimento de normas/padres, que promovem o desenvolvimento e uso de normas/padres e diretrizes consensuais voluntrias na comunidade de ateno sade. reconhecido no mundo inteiro pela aplicao de seu singular processo consensual ao desenvolvimento de normas/padres e diretrizes para testes de patologia clnica e questes relacionadas ateno de sade. O NCCLS baseia-se no princpio de que o consenso uma maneira efetiva e custo-eficaz de melhorar os testes clnicos e servios de ateno sade. Alm de desenvolver e promover o uso voluntrio de normas/padres e diretrizes consensuais, fornecemos um foro aberto e isento para tratar questes que afetam a qualidade dos testes de patologia clnica e a ateno sade. PUBLICAES Os documentos do NCCLS so publicados como normas/padres, diretrizes ou relatrios de comit. Norma Documento desenvolvido atravs do processo de consenso, o qual identifica claramente os requisitos especficos e essenciais dos materiais, dos mtodos, ou das prticas a serem usados sem modificaes. Uma norma tambm pode conter elementos discricionrios, que so claramente identificados. Diretriz Documento desenvolvido atravs do processo de consenso, o qual descreve critrios para prticas e procedimentos ou materiais operacionais gerais a serem usados de maneira voluntria. Uma diretriz pode ser usada conforme redigida, ou modificada pelo usurio para adequ-las s suas necessidades especficas. Relatrio Documento que no passou pela reviso consensual e foi publicado pela Diretoria. PROCESSO CONSENSUAL O processo consensual voluntrio do NCCLS um protocolo que estabelece critrios formais para: autorizar um projeto; desenvolver e revisar documentos de maneira transparente; revisar documentos em resposta a comentrios de usurios; aceitar um documento como norma/padro ou diretriz consensual. A maioria dos documentos do NCCLS so sujeitos a dois nveis de consensoproposto e aprovado. Dependendo da necessidade de avaliao ou coleta de campo, os documentos tambm podem disponibilizados para reviso em nvel consensual intermedirio (i.e., tentativo). Proposta Documento consensual do NCCLS que passa por um primeiro estgio de reviso pela comunidade de sade como proposta de norma/padro ou diretriz. O documento deve receber uma reviso tcnica abrangente e minuciosa, incluindo a reviso geral de seu escopo, enfoque e utilidade e uma reviso detalhada de seu contedo tcnico e editorial. Tentativa -Uma norma/padro ou diretriz disponibilizada para reviso e comentrios apenas quando h necessidade evidente de avaliao de campo de um mtodo recomendado ou de coleta de dados especficos relativos a um protocolo recomendado. Deve ser revisada para assegurar sua utilidade. Aprovada Norma/padro ou diretriz que recebeu aprovao consensual da comunidade de ateno sade. Deve ser revisada para avaliao da utilidade do documento final, garantia de consenso (ex., que os comentrios relativos a verses anteriores foram satisfatoriamente resolvidos) e identificao de necessidade de documentos consensuais adicionais. As normas/padres e diretrizes do NCCLS representam uma opinio consensual sobre boas prticas e refletem um acordo substancial de partes interessadas, competentes e compromissadas materialmente, obtido por meio dos procedimentos consensuais estabelecidos pelo NCCLS. As exigncias das normas/padres e diretrizes do NCCLS podem ser mais ou menos rigorosas do que os respectivos regulamentos. Conseqentemente, a adoo desse documento consensual voluntrio no dispensa o usurio da responsabilidade de obedecer aos regulamentos pertinentes. COMENTRIOS Os comentrios dos usurios so essenciais ao processo consensual. Qualquer pessoa pode apresentar um comentrioe todos os comentrios so considerados pelo comit do NCCLS que preparou o documento, em conformidade com o processo consensual. Todos os comentrios, incluindo aqueles que resultaram em mudana no documento, quando publicado no prximo nvel consensual, bem como aqueles que no resultaram em mudana, so respondidos pelo comit em apndice do documento. Incentiva-se os leitores a tecer comentrios de qualquer formato e em qualquer oportunidade sobre qualquer documento do NCCLS. Envie seus comentrios ao seguinte endereo: NCCLS Executive Offices, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087, Estados Unidos. PARTICIPAO VOLUNTRIA Os profissionais de sade de todas as especialidades so instados a participar voluntariamente nos projetos do NCCLS. Para informaes adicionais sobre participao nos comits, favor contatar os Escritrios Executivos do NCCLS.
Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade de Leveduras Terapia Antifngica; Norma AprovadaSegunda Edio
Resumo
A Norma M27-A2Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade de Leveduras; Terapia Antifngica Norma AprovadaSegunda Edio do NCCLS descreve a metodologia de um teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos das leveduras que causam infeces fngicas invasivas, incluindo as espcies de Candida (e Candida glabrata) e Cryptococcus neoformans. A norma trata da seleo e preparao dos agentes antifngicos; da implementao e interpretao dos testes; e do propsito e da implementao dos testes de controle de qualidade. Apresenta tambm uma anlise cuidadosa da responsabilidade dos fabricantes e usurios no controle de qualidade. NCCLS. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade a Terapia Antifngica das Leveduras; Norma AprovadaSegunda Edio. Norma M27-A2 do NCCLS (ISBN 1-56238-469-4). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 Estados Unidos, 2002.
O processo consensual do NCCLS, mecanismo que permite a reviso de um documento, em dois ou mais nveis, pela comunidade de ateno sade, um processo permanente. Os usurios devem prever edies revisadas de qualquer documento. Uma vez que as rpidas mudanas nas tecnologias possam efetuar os procedimentos, mtodos e protocolos nas normas/padres e diretrizes, os usurios devem substituir as edies ultrapassadas pelas edies atualizadas dos documentos do NCCLS. As edies atualizadas esto relacionadas no Catlogo do NCCLS, distribudo s organizaes membros e, mediante solicitao, aos no-membros. Se sua organizao no membro do NCCLS e gostaria de ser, assim como para solicitar um exemplar do Catlogo do NCCLS, favor contatar os Escritrios Executivos do NCCLS. Telefone: 610.688.0100; Fax: + 1 610.688.0700; E-Mail: exoffice@nccls.org; Website: www.nccls.org
M27-A2 ISBN 1-56238-469-4 ISSN 0273-3099
Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade de Leveduras Terapia Antifngica; Norma AprovadaSegunda Edio
Volume 22 Nmero 15
Michael A. Pfaller, M.D., Presidente Vishnu Chaturvedi, Ph.D. Ana Espinel-Ingroff, Ph.D. Mahmoud A. Ghannoum, M.Sc., Ph.D. Linda L. Gosey, M.T.(ASCP) Frank C. Odds, Ph.D., FRC Path. John H. Rex, M.D. Michael G. Rinaldi, Ph.D. Daniel J. Sheehan, Ph.D. Thomas J. Walsh, M.D. David W. Warnock, Ph.D., FRC Path.
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Esta publicao protegida por direitos autorais. Nenhuma parte pode ser reproduzida, armazenada em sistema de recuperao, transmitida ou disponibilizada em qualquer formato ou por qualquer meio (eletrnico, mecnico, fotocpia, gravao ou outros) sem consentimento prvio, por escrito, do NCCLS, exceto nos casos relacionados a seguir. Pelo presente instrumento, o NCCLS concede autorizao para reproduzir partes limitadas desta publicao, para uso em manuais de procedimentos laboratoriais, em local nico; para emprstimo entre bibliotecas ou para uso em programas educacionais, sempre que as vrias cpias dessa reproduo forem distribudas gratuitamente no contenham, em nenhuma circunstncia, mais do que 20% do texto do documento original e inclua o seguinte aviso: Reproduzido mediante autorizao, parte da publicao do NCCLS M27-A2--Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade a Terapia Antifngica das Leveduras; Norma Aprovada--Segunda Edio (ISBN 1-56238-469-4). Cpias da atual edio podem ser obtidas no seguinte endereo: NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, Estados Unidos. Autorizao para reproduzir ou usar o texto deste documento alm das isenes aqui concedidas ou nos termos da Legislao de Direitos Intelectuais pode ser obtida do NCCLS mediante solicitao por escrito. As autorizaes podem ser obtidas no seguinte endereo: Executive Director, NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, Estados Unidos. Copyright 2002. The National Committee for Clinical Laboratory Standards.
Citao Sugerida
(NCCLS. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade a Terapia Antifngica das Leveduras; Norma AprovadaSegunda Edio. NCCLS document M27-A2 [ISBN 1-56238-469-4]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 Estados Unidos, 2002.)
Norma Proposta
Dezembro de 1992
Norma Tentativa
Outubro de 1995
Norma Aprovada
Junho de 1997
Norma AprovadaSegunda Edio

Agosto de 2002
ISBN 1-56238-469-4 ISSN 0273-3099
Membros do Comit
Comit da rea de Microbiologia
An NCCLS global consensus standard. NCCLS. All rights reserved
James H. Jorgensen, Ph.D. Presidente Mary Jane Ferraro, Ph.D., M.P.H. Vice Presidente
University of Texas Health Center San Antonio, Texas Massachusetts General Hospital Boston, Massachusetts
Subcomit para Testes de Sensibilidade a Agentes Antifngicos Michael A. Pfaller, M.D. Presidente Vishnu Chaturvedi, Ph.D. Ana Espinel-Ingroff, M.S., Ph.D. Mahmoud A. Ghannoum, M.Sc., Ph.D. University of Iowa College of Medicine Iowa City, Iowa New York State Department of Health Albany, New York Medical College of Virginia/VCU Richmond, Virginia Center for Medical Mycology, Case Western Reserve University, and University Hospitals of Cleveland Cleveland, Ohio Food and Drug Administration Rockville, Maryland University of Aberdeen Esccia, Reino Unido University of Texas Health Science Ctr. at Houston Houston, Texas University of Texas Health Science Center San Antonio, Texas Pfizer Inc. New York, New York National Cancer Institute Bethesda, Maryland Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia
Linda L. Gosey, M.T.(ASCP) Frank C. Odds, Ph.D., FRC Path. John H. Rex, M.D. Michael G. Rinaldi, Ph.D. Daniel J. Sheehan, Ph.D. Thomas J. Walsh, M.D. David W. Warnock, Ph.D., FRC Path. Consultores Arthur L. Barry, Ph.D.
Clinical Microbiology Institute Wilsonville, Oregon NCCLS Wayne, Pennsylvania NCCLS

Lois M. Schmidt, D.A. Oficial de Ligao Tracy Ann Dooley, M.L.T.(ASCP) 2
Gerente do Projeto Patrice E. Polgar Editor Donna M. Wilhelm Editor Assistente
Wayne, Pennsylvania NCCLS Wayne, Pennsylvania NCCLS Wayne, Pennsylvania
(em 1o de julho de 2002)

Membros Mantenedores Abbott Laboratories American Association for Clinical Chemistry Beckman Coulter, Inc. BD and Company bioMrieux, Inc. CLMA College of American Pathologists GlaxoSmithKline Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Pfizer Inc Roche Diagnostics, Inc. Membros Profissionais AISAR-Associazione Italiana per lo Studio degli American Academy of Family Physicians American Association for Clinical Chemistry American Association for Respiratory Care American Chemical Society American Medical Technologists American Public Health Association American Society for Clinical Laboratory Science American Society of Hematology American Society for Microbiology American Type Culture Collection, Inc. Asociacin Espaola Primera de Socorros (Uruguay) Asociacion Mexicana de Bioquimica Clinica A.C. Assn. of Public Health Laboratories Assoc. Micro. Clinici ItalianiA.M.C.L.I. British Society for Antimicrobial Chemotherapy CADIME-Camara De Instituciones De Diagnostico Medico Canadian Society for Medical Laboratory ScienceSocit Canadienne de Science de Laboratoire Mdical Clinical Laboratory Management Association COLA College of American Pathologists BD Consumer Products College of Medical Laboratory Technologists of Ontario College of Physicians and Surgeons of Saskatchewan ESCMID Fundacin Bioqumica Argentina International Association of Medical Laboratory Technologists International Council for Standardization in Haematology International Federation of Clinical Chemistry Italian Society of Clinical Biochemistry and Clinical Molecular Biology Japan Society of Clinical Chemistry Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations National Academy of Clinical Biochemistry National Association of Testing Authorities Australia National Society for Histotechnology, Inc. Ontario Medical Association Quality Management ProgramLaboratory Service RCPA Quality Assurance Programs PTY Limited Sociedade Brasileira de Analises Clinicas Sociedade Brasileira de Patologia Clinica Sociedad Espanola de Bioquimica Clinica y Patologia Molecular Turkish Society of Microbiology Membros Governamentais Association of Public Health Laboratories Armed Forces Institute of Pathology BC Centre for Disease Control Centers for Disease Control and Prevention Centers for Medicare & Medicaid Services/CLIA Program Centers for Medicare & Medicaid Services Chinese Committee for Clinical Laboratory Standards Commonwealth of Pennsylvania Bureau of Laboratories General Hospital Vienna (Austria) Department of Veterans Affairs Deutsches Institut fr Normung (DIN) FDA Center for Devices and Radiological Health FDA Center for Veterinary Medicine FDA Division of Anti-Infective Drug Products Iowa State Hygienic Laboratory Massachusetts Department of Public Health Laboratories National Center of Infectious and Parasitic Diseases (Bulgaria) National Health Laboratory Service (South Africa) National Institute of Standards and Technology New York State Department of Health Ohio Department of Health Ontario Ministry of Health Pennsylvania Dept. of Health Saskatchewan Health-Provincial Laboratory Scientific Institute of Public Health; Belgium Ministry of Social Affairs, Public Health and the Environment Swedish Institute for Infectious Disease Control Thailand Department of Medical Sciences Membros na Indstria AB Biodisk Abbott Laboratories Abbott Laboratories, MediSense Products Acrometrix Corporation Ammirati Regulatory Consulting Anaerobe Systems Assssor AstraZeneca AstraZeneca R & D Boston, MA Aventis Axis-Shield POC AS Bayer Corporation Elkhart, IN Bayer Corporation Tarrytown, NY Bayer Corporation West Haven, CT Bayer Medical Ltd. BD BD Biosciences San Jose, CA Roche Laboratories (Div.
Membros Ativos
BD Diagnostic Systems BD Italia S.P.A. BD VACUTAINER Systems Beckman Coulter, Inc. Beckman Coulter, Inc. Primary Care Diagnostics Beckman Coulter K.K. (Japan) Bio-Development SRL Bio-Inova Life Sciences International Bio-Inova Life Sciences North America BioMedia Laboratories Sdn Bhd BioMrieux (NC) bioMrieux, Inc. (MO) Biometrology Consultants Bio-Rad Laboratories, Inc. Bio-Rad Laboratories, Inc. - France Biotest AG Blaine Healthcare Associates, Inc. Bristol-Myers Squibb Company Canadian External Quality Assessment Laboratory Capital Management Consulting, Inc. Carl Schaper Checkpoint Development Inc. Chiron Corporation ChromaVision Medical Systems, Inc. Chronolab Ag Clinical Design Group Inc. Clinical Laboratory Improvement Consultants Cognigen Community Medical Center (NJ) Control Lab (Brazil) Copan Diagnostics Inc. Cosmetic Ingredient Review Cubist Pharmaceuticals Dade Behring Inc. - Deerfield, IL Dade Behring Inc. - Glasgow, DE Dade Behring Inc. - Marburg, Germany Dade Behring Inc. - Sacramento, CA Dade Behring Inc. - San Jose, CA David G. Rhoads Associates, Inc. Diagnostics Consultancy Diagnostic Products Corporation Eiken Chemical Company, Ltd. Elan Pharmaceuticals Electa Lab s.r.l. Enterprise Analysis Corporation Essential Therapeutics, Inc. EXPERTech Associates, Inc. F. Hoffman-La Roche AG Fort Dodge Animal Health Allegheny General Hospital (PA) Allegheny University of the
Gen-Probe GlaxoSmithKline Greiner Bio-One Inc. Helena Laboratories Home Diagnostics, Inc. Immunicon Corporation Instrumentation Laboratory International Technidyne Corporation IntraBiotics Pharmaceuticals, Inc. I-STAT Corporation Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, L.L.C. Kendall Sherwood-Davis & Geck LAB-Interlink, Inc. Laboratory Specialists, Inc. Labtest Diagnostica S.A. LifeScan, Inc. (a Johnson & Johnson Company) Lilly Research Laboratories Macemon Consultants Medical Device Consultants, Inc. Merck & Company, Inc. Minigrip/Zip-Pak Molecular Diagnostics, Inc. mvi Sciences (MA) Nabi Nichols Institute Diagnostics (Div. of Quest Diagnostics, Inc.) NimbleGen Systems, Inc. Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. Norfolk Associates, Inc. Novartis Pharmaceuticals Corporation Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. (Raritan, NJ) Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. (Rochester, NY) Oxoid Inc. Paratek Pharmaceuticals Pfizer Inc Pharmacia Corporation Philips Medical Systems Powers Consulting Services Premier Inc. Procter & Gamble Pharmaceuticals, Inc. The Product Development Group QSE Consulting Quintiles, Inc. Radiometer America, Inc. Radiometer Medical A/S Roche Diagnostics GmbH Roche Diagnostics, Inc. Clarian HealthMethodist Hospital (IN)
Hoffmann-La Roche Inc.) Sarstedt, Inc. SARL Laboratoire Carron (France) Schering Corporation Schleicher & Schuell, Inc. Second Opinion Showa Yakuhin Kako Company, Ltd. Streck Laboratories, Inc. SurroMed, Inc. Synermed Diagnostic Corp. Sysmex Corporation (Japan) Sysmex Corporation - Long Grove, IL The Clinical Microbiology Institute The Toledo Hospital (OH) Theravance Inc. Transasia Engineers Trek Diagnostic Systems, Inc. Versicor, Inc. Vetoquinol S.A. Visible Genetics, Inc. Vysis, Inc. Wallac Oy Wyeth-Ayerst Xyletech Systems, Inc. YD Consultant YD Diagnostics (Seoul, Korea) Associaes de Classe AdvaMed Association of Medical Diagnostic Manufacturers Japan Association Clinical Reagents Ind. - Tokyo, Japan Medical Industry Association of Australia Membros Associados Ativos 20th Medical Group (SC) 31st Medical Group/SGSL (APO, AE) 67th CSH Wuerzburg, GE (NY) 121st General Hospital (CA) Academisch Ziekenhuis-VUB (Belgium) Acadiana Medical Laboratories, LTD (LA) Adena Regional Medical Center (OH)
Advocate Healthcare Lutheran General (IL)
Akershus Central Hospital and AFA (Norway) Albemarle Hospital (NC)

Gateway Medical Center (TN)
Geisinger Medical Center (PA) Grady Memorial Hospital (GA)
Health Sciences (PA) Allina Health System (MN) Alton Ochsner Medical Foundation (LA) American Medical Laboratories (VA) Antwerp University Hospital (Belgium) Arkansas Department of Health ARUP at University Hospital (UT) Armed Forces Research Institute of Medical Science (APO, AP) Associated Regional & University Pathologists (UT) Aurora Consolidated Laboratories (WI) Azienda Ospedale Di Lecco (Italy) Bay Medical Center (MI) Baystate Medical Center (MA) Bbaguas Duzen Laboratories (Turkey) Bermuda Hospitals Board Bo Ali Hospital (Iran) British Columbia Cancer Agency (Vancouver, BC, Canada) Brooks Air Force Base (TX) Broward General Medical Center (FL) Calgary Laboratory Services Carilion Consolidated Laboratory (VA) Cathay General Hospital (Taiwan) CB Healthcare Complex (Sydney, NS, Canada)
Central Peninsula General Hospital (AK)
Clendo Lab (Puerto Rico)

Clinical Laboratory Partners, LLC (CT)
Central Texas Veterans Health Care System Centre Hospitalier Regional del la Citadelle (Belgium) Centro Diagnostico Italiano (Milano, Italy) Champlain Valley Physicians Hospital (NY) Chang Gung Memorial Hospital (Taiwan) Changi General Hospital (Singapore) Childrens Hospital (NE) Childrens Hospital & Clinics (MN) Childrens Hospital Medical Center (Akron, OH) Childrens Hospital of Philadelphia (PA)
Childrens Medical Center of Dallas (TX)
CLSI Laboratories (PA) Columbia Regional Hospital (MO) Commonwealth of Kentucky Community Hospital of Lancaster (PA) CompuNet Clinical Laboratories (OH) Cook County Hospital (IL) Cook Childrens Medical Center (TX) Covance Central Laboratory Services (IN) Danish Veterinary Laboratory (Denmark) Danville Regional Medical Center (VA) Delaware Public Health Laboratory Department of Health & Community Services (New Brunswick, Canada) DesPeres Hospital (MO) DeTar Hospital (TX) Detroit Health Department (MI) Diagnosticos da Amrica S/A (Brazil) Dr. Everett Chalmers Hospital (New Brunswick, Canada) Doctors Hospital (Bahamas) Duke University Medical Center (NC) E.A. Conway Medical Center (LA) Eastern Maine Medical Center East Side Clinical Laboratory (RI) Eastern Health (Vic., Australia) Elyria Memorial Hospital (OH) Emory University Hospital (GA) Esoterix Center for Infectious Disease (TX) Fairview-University Medical Center (MN) Federal Medical Center (MN) Florida Hospital East Orlando Foothills Hospital (Calgary, AB, Canada) Fort St. John General Hospital (Fort St. John, BC, Canada) Fox Chase Cancer Center (PA) Fresenius Medical Care/Spectra East (NJ) Fresno Community Hospital and Medical Center Frye Regional Medical Center (NC) Gambro Healthcare Laboratory Services (FL)
Guthrie Clinic Laboratories (PA) Hahnemann University Hospital (PA) Harris Methodist Erath County (TX) Harris Methodist Fort Worth (TX) Hartford Hospital (CT) Headwaters Health Authority (Alberta, Canada) Health Network Lab (PA) Health Partners Laboratories (VA) Heartland Regional Medical Center (MO) Highlands Regional Medical Center (FL) Hoag Memorial Hospital Presbyterian (CA) Holmes Regional Medical Center (FL) Holzer Medical Center (OH) Hopital du Sacre-Coeur de Montreal (Montreal, Quebec, Canada) Hpital Maisonneuve Rosemont (Montreal, Canada) Hospital for Sick Children (Toronto, ON, Canada) Hospital Sousa Martins (Portugal) Hotel Dieu Hospital (Windsor, ON, Canada) Houston Medical Center (GA) Huddinge University Hospital (Sweden) Hurley Medical Center (MI) Indiana State Board of Health Indiana University Institute of Medical and Veterinary Science (Australia) International Health Management Associates, Inc. (IL) Jackson Memorial Hospital (FL) Jersey Shore Medical Center (NJ) John C. Lincoln Hospital (AZ) John F. Kennedy Medical Center (NJ) John Peter Smith Hospital (TX) Kadlec Medical Center (WA) Kaiser Permanente Medical Care (CA) Kaiser Permanente (MD) Kantonsspital (Switzerland)
Keller Army Community Hospital (NY)
Kenora-Rainy River Regional Laboratory Program (Ontario, Canada) Kern Medical Center (CA)
Kimball Medical Center (NJ) King Faisal Specialist Hospital (Saudi Arabia) King Khalid National Guard Hospital (Saudi Arabia) Kings Daughter Medical Center (KY) Klinini Center (Slovenia) Laboratories at Bonfils (CO) Laboratoire de Sant Publique du Quebec (Canada) Laboratrio Fleury S/C Ltda. (Brazil) Laboratory Corporation of America (NJ) Laboratory Corporation of America (MO) LAC and USC Healthcare Network (CA) Lakeland Regional Medical Center (FL) Lancaster General Hospital (PA) Langley Air Force Base (VA) LeBonheur Childrens Medical Center (TN) L'Hotel-Dieu de Quebec (Canada) Libero Instituto Univ. Campus BioMedico (Italy) Louisiana State University Medical Center Maccabi Medical Care and Health Fund (Israel) Magee Womens Hospital (PA) Malcolm Grow USAF Medical Center (MD) Manitoba Health (Winnipeg, Canada) Martin Luther King/Drew Medical Center (CA) Massachusetts General Hospital (Microbiology Laboratory) MDS Metro Laboratory Services (Burnaby, BC, Canada) Medical College of Virginia Hospital Medicare/Medicaid Certification, State of North Carolina Memorial Medical Center (IL) Memorial Medical Center (LA) Jefferson Davis Hwy Memorial Medical Center (LA) Napoleon Avenue Methodist Hospital (TX) Methodist Hospitals of Memphis (TN) MetroHealth Medical Center (OH) Michigan Department of Community Health
Mississippi Baptist Medical Center Monte Tabor Centro Italo Brazileiro de Promocao (Brazil) Montreal Childrens Hospital (Canada) Montreal General Hospital (Canada) MRL Pharmaceutical Services, Inc. (VA) MRL Reference Laboratory (CA) Nassau County Medical Center (NY) National Institutes of Health (MD) Naval Hospital Corpus Christi (TX) Naval Surface Warfare Center (IN) Nebraska Health System New Britain General Hospital (CT) New England Fertility Institute (CT) New Mexico VA Health Care Systems North Carolina State Laboratory of Public Health North Kansas City Hospital (MO) North Shore Long Island Jewish Health System Laboratories (NY) Northwestern Memorial Hospital (IL) O.L. Vrouwziekenhuis (Belgium) Ordre professionnel des technologists mdicaux du Qubec Ospedali Riuniti (Italy) The Ottawa Hospital (Ottawa, ON, Canada) Our Lady of Lourdes Hospital (NJ) Our Lady of the Resurrection Medical Center (IL) Pathology and Cytology Laboratories, Inc. (KY) The Permanente Medical Group (CA) Piedmont Hospital (GA) Pikeville Methodist Hospital (KY) Pocono Hospital (PA) Presbyterian Hospital of Dallas (TX) Queen Elizabeth Hospital (Prince Edward Island, Canada) Queensland Health Pathology Services (Australia) Quest Diagnostics Incorporated (CA) Quintiles Laboratories, Ltd. (GA) Regions Hospital Reid Hospital & Health Care Services (IN)
Research Medical Center (MO) Rex Healthcare (NC) Rhode Island Department of Health Laboratories Riyadh Armed Forces Hospital (Saudi Arabia) Royal Columbian Hospital (New Westminster, BC, Canada) Sacred Heart Hospital (MD) Saint Marys Regional Medical Center (NV) St. Alexius Medical Center (ND) St. Anthony Hospital (CO) St. Anthonys Hospital (FL) St. Barnabas Medical Center (NJ) St-Eustache Hospital (Quebec, Canada) St. Francis Medical Ctr. (CA) St. John Hospital and Medical Center (MI) St. John Regional Hospital (St. John, NB, Canada) St. Joseph Hospital (NE) St. Josephs Hospital Marshfield Clinic (WI) St. Joseph Mercy Hospital (MI) St. Jude Children's Research Hospital (TN) St. Lukes Regional Medical Center (IA) St. Mary of the Plains Hospital (TX) St. Marys Hospital & Medical Center (CO) St. Pauls Hospital (Vancouver, BC, Montreal) St. Vincent Medical Center (CA) Ste. Justine Hospital (Montreal, PQ, Canada) Salina Regional Health Center (KS) San Francisco General Hospital (CA) Santa Clara Valley Medical Center (CA) Seoul Natl University Hospital (Korea) Shanghai Center for the Clinical Laboratory (China) South Bend Medical Foundation (IN) Southwest Texas Methodist Hospital (TX) South Western Area Pathology Service (Australia) Southern Maine Medical Center Specialty Laboratories, Inc. (CA) Stanford Hospital and Clinics (CA)
State of Washington Department of Health Stony Brook University Hospital (NY) Stormont-Vail Regional Medical Center (KS) Sun Health-Boswell Hospital (AZ) Sunrise Hospital and Medical Center (NV) Swedish Medical Center Providence Campus (WA) Tampa General Hospital (FL) Temple University Hospital (PA) Tenet Odessa Regional Hospital (TX) The Toledo Hospital (OH) Touro Infirmary (LA) Trident Regional Medical Center (SC) Tripler Army Medical Center (HI) Truman Medical Center (MO) UCSF Medical Center (CA) UNC Hospitals (NC) University College Hospital (Galway, Ireland) University Hospital (Gent) (Belgium)
University Hospitals of Cleveland (OH) The University Hospitals (OK) University of Alabama-Birmingham Hospital University of Alberta Hospitals (Canada) University of Colorado Health Science Center University of Chicago Hospitals (IL) University of Illinois Medical Center University of the Ryukyus (Japan) University of Texas M.D. Anderson Cancer Center University of Virginia Medical Center University of Washington UZ-KUL Medical Center (Belgium) VA (Denver) Medical Center (CO) Virginia Department of Health VA (Kansas City) Medical Center (MO) VA (Western NY) Healthcare System VA (San Diego) Medical Center (CA)
VA (Tuskegee) Medical Center (AL) VA Outpatient Clinic (OH) Vejle Hospital (Denmark) Washington Adventist Hospital (MD) Washoe Medical Center Laboratory (NV)
West Jefferson Medical Center (LA) West Shore Medical Center (MI)
Wilford Hall Medical Center (TX) William Beaumont Army Medical Center (TX) William Beaumont Hospital (MI) Williamsburg Community Hospital (VA) Winn Army Community Hospital (GA) Winnipeg Regional Health Authority (Winnipeg, Canada) Wishard Memorial Hospital (IN) Yonsei University College of Medicine (Korea) York Hospital (PA)
AUTORIDADES Donna M. Meyer, Ph.D., Presidente CHRISTUS Health Thomas L. Hearn, Ph.D., Presidente Eleito Centers for Disease Control and Prevention Emil Voelkert, Ph.D., Secretrio Roche Diagnostics GmbH Gerald A. Hoeltge, M.D., Tesoureiro The Cleveland Clinic Foundation F. Alan Andersen, Ph.D., Presidente Imediatamente Anterior Cosmetic Ingredient Review John V. Bergen, Ph.D., Director Executivo
MEMBROS DA DIRETORIA Susan Blonshine, RRT, RPFT, FAARC TechEd Wayne Brinster BD Kurt H. Davis, FCSMLS, CAE Canadian Society for Medical Laboratory Science Lillian J. Gill, M.S. FDA Center for Devices and Radiological Health Robert L. Habig, Ph.D. Habig Consulting Group Carolyn D. Jones, J.D., M.P.H. AdvaMed Tadashi Kawai, M.D., Ph.D. International Clinical Pathology Center J. Stephen Kroger, M.D., FACP COLA Willie E. May, Ph.D National Institute of Standards and Technology Gary L. Myers, Ph.D. Centers for Disease Control and Prevention Barbara G. Painter, Ph.D. Bayer Corporation (Retired) Judith A. Yost, M.A., M.T.(ASCP) Centers for Medicare & Medicaid Services
Sumrio Resumo Membros do Comit Membros Ativos Prefcio Enfoque de Sistema de Qualidade 1. Introduo 1.1 Abrangncia 1.2 Definies Agentes Antifngicos 2.1 Fontes 2.2 Pesagem de Agentes Antifngicos 2.3 Preparao de Solues-Padro 2.4 Nmero de Concentraes Testadas 2.5 Seleo dos Agentes Antifngicos para Testes e Relatrio de Rotina Metodologia dos Testes 3.1 Meio Lquido 3.2 Diluies dos Agentes Antifngicos 3.3 Preparao do Inculo 3.4 Meio de Inoculao RPMI-1640 3.5 Incubao 3.6 Leitura dos Resultados 3.7 Interpretao dos Resultados 3.8 Modificaes nas Microdiluies em Caldo 3.9 Impacto do Tempo de Leitura: 24 horas versus 48 horas 3.10 Outras Modificaes Controle de Qualidade 4.1 Propsito 4.2 Responsabilidades no Controle de Qualidade 4.3 Seleo das Cepas de Referncia 4.4 Armazenamento das Cepas de Referncia 4.5 Uso Rotineiro das Cepas de Referncia 4.6 Controle dos Lotes de Meio e Material Plstico 4.7 Freqncia do Controle de Qualidade 4.8 Outros Procedimentos de Controle 4.9 Cepas de Controle de Qualidade
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4.
Referncias Bibliogrficas Apndice A: Meio RPMI 1640 Apndice B: Padro de Turbidez de Sulfato de Brio McFarland 0,5 Apndice C: Diretrizes de Interpretao dos Testes de Sensibilidade in Vitro das Espcies de Candida
Tabela 1. Solventes e Diluentes para a Preparao de Solues Padro de Agentes Antifngicos Tabela 2. Esquema de Preparao de Diluies de Agentes Antifngicos Solveis em gua para Uso em Testes de Sensibilidade por Diluio em Caldo Tabela 3. Esquema de Diluio Seriada de Agentes Antifngicos Insolveis em gua para Uso em Testes de Sensibilidade por Diluio em Caldo Tabela 4. Limites Recomendados para CIMs de 48 Horas para Quatro Cepas de Referncia para Testes de Macrodiluio em Caldo Tabela 5. Limites Recomendados para CIMs de 24 e 48 Horas para Duas Cepas de Controle de Qualidade para Testes de Microdiluio em Caldo Tabela 6. Composio do Meio RPMI-1640 Tabela 7. Modificaes para Circunstncias Especiais Resumo dos Comentrios e Respostas do Subcomit Resumo dos Comentrios dos Delegados e Respostas do Subcomit Publicaes Afins do NCCLS
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Prefcio Com o aumento da incidncia de infeces sistmicas por fungos e de agentes antifngicos, cresceu tambm o interesse em mtodos laboratoriais para orientar a seleo da terapia antifngica. O Comit da rea de Microbiologia do NCCLS estabeleceu o Subcomit para Testes de Sensibilidade a Agentes Antifngicos que, em 1985, publicou seu primeiro relatrio, no qual foram apresentados resultados de um questionrio e um pequeno estudo colaborativo. Esses resultados so resumidos a seguir.
Aproximadamente 20% dos membros do NCCLS que responderam e cujos hospitais tinham mais de 200 leitos estavam realizando testes com agentes antifngicos. A metodologia usada na maioria dos testes era a diluio em caldo. A maioria das cepas testadas era Candida albicans ou outras espcies de leveduras. A maioria dos centros testava poucos isolados por ano. A concordncia dos resultados dos testes de concentrao inibitria mnima (CIM), entre os diferentes laboratrios que participaram no estudo colaborativo, era inaceitavelmente, baixa.
Com base nesses achados, o subcomit concluiu que seria proveitoso desenvolver metodologia mais reprodutvel para testes de referncia. Havia um acordo em relao a vrios elementos da metodologia. Para facilitar a anlise mais apurada das diversas condies de teste, o mtodo de referncia deveria ser o teste de macrodiluio em caldo. Devido a exemplos de antagonismos as drogas, por parte de alguns meios de cultura complexos em relao a certos agentes antifngicos, o subcomit limitou seu interesse a meios sintticos completamente definidos. Os procedimentos de preparao e diluio das solues-padro das drogas desenvolvidas, anteriormente, para testes com agentes antibacterianos, foram adotados aps pequenas modificaes. Embora houvesse acordo em outras reas, precisava-se de dados adicionais para resolver outras questes. Esses incluam a preparao do inculo; tamanho do inculo; escolha entre os vrios meios sintticos; temperatura de incubao; perodo de incubao; e definio do ponto final. Essas questes foram objeto de uma srie de estudos colaborativos.1,2,3,4 Assim, o subcomit chegou a um acordo sobre todos as questes, o que resultou na publicao da Norma M27-P, em 1992. Nos quatro anos seguintes (19921996), estabeleceram-se as faixas de referncia de CIM para duas cepas de controle de qualidade para os agentes antifngicos disponveis,5,6 e disponibilizou-se uma metodologia para o teste de microdiluio em caldo correspondente do teste de referncia por microdiluio em caldo.4,7,8,9 Essas informaes foram includas na norma revisada, publicada em 1995 (M27-T). Em reviso posterior do documento, o subcomit centrou sua ateno no desenvolvimento de pontos de corte relevantes para os agentes antifngicos disponveis10 includos na Norma M27-A (1997). Desde ento, o subcomit desenvolveu as faixas de referncia das CIMs de 24 e 48 horas para os testes de microdiluio com agentes antifngicos, tanto estabelecidos como recm lanados.11 Os resultados desses estudos foram includos na atual Norma M27-A2.
Precaues- Padro
Sendo impossvel saber, com freqncia, o que infectante, todos os espcimes de sangue humano devem ser tratados como infectantes e manuseados de acordo com as precaues-padro. Essas so as novas diretrizes que combinam as caractersticas principais das prticas de precaues universais e isolamento de substncias corpreas. As precaues-padro englobam a transmisso de qualquer patgeno e, por isso, so mais abrangentes do que as precaues universais, que visam apenas aos patgenos transmitidos pelo sangue. As diretrizes relativas s precaues-padro e precaues universais so disponibilizadas pelo U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Guideline for Isolation Precautions in Hospitals.
11
Infection Control and Hospital Epidemiology. CDC. 1996; Vol 17; 1:53-80), (MMWR 1987; 36[suppl 2S] 2S-18S) e (MMWR 1988; 37:377-382, 387-388). No caso de precaues especficas para a preveno da transmisso laboratorial de infeces transmitidas pelo sangue, por meio de instrumentos e materiais de laboratrio, assim como as recomendaes relativas conduta de exposies a sangue, favor reportarse edio mais recente do documento M29Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections do NCCLS.
Palavras-Chave
Antifngico, macrodiluio em caldo, microdiluio em caldo, teste de sensibilidade, leveduras
Enfoque de Sistema de Qualidade

O NCCLS endossa o enfoque de sistema de qualidade para o desenvolvimento de normas/padres e diretrizes, visto que facilita a gesto de projetos; define a estrutura dos documentos por meio de um gabarito; e fornece um processo para identificar os documentos necessrios usando a anlise de lacunas (gap analysis). O enfoque baseia-se no modelo apresentado na edio mais recente do documento HS1 A Quality System Model for Health Care do NCCLS. O enfoque de sistema de qualidade aplica-se a um conjunto central de elementos essenciais dos sistemas de qualidade (EEQS), bsicos a qualquer organizao, a todas as operaes em qualquer rota de fluxograma, de qualquer organizao prestadora de servios de ateno sade. Os EEQS fornecem um arcabouo para a proviso de qualquer tipo de produto ou servio, servindo como guia dos gerentes. Os elementos essenciais dos sistemas de qualidade (EEQS) so os seguintes.
Elementos Essenciais dos Sistemas de Qualidade--EEQS Documentos e Registros Organizao Pessoal Equipamento Compras e Inventrio Controle de Processos Gesto da Informao Gesto de Ocorrncias Avaliao Melhoria de Processos Servios e Satisfao Instalaes e Segurana
A Norma M27-A2 trata dos seguintes elementos essenciais dos sistemas de qualidade (EEQS):
Controle de Processos Gesto da Informao Compras e Inventrio Servios e Satisfao Aprimoramento de Processos
Documentos e Registros
Equipamento
Tabela adaptada do documento HS1 A Quality System Model for Health Care do NCCLS. Etapa do Fluxograma Uma etapa do fluxograma a descrio dos passos necessrios para prover um determinado produto ou servio fornecido pela organizao ou entidade. Por exemplo, a Norma GP26-A2 define uma etapa do fluxograma dos laboratrios clnicos que consiste em trs passos seqenciais: pr-analtico, analtico e ps-analtico. Todos os laboratrios clnicos seguem esses trs processos para prestar servios laboratoriais, a saber, informaes laboratoriais de qualidade. A seta mostra a seqncia, da esquerda para a direita, que todo laboratrio clnico segue. Alm disso, os passos ou subprocessos necessrios encontram-se relacionados logo abaixo do fluxograma. 12
Instalaes e Segurana
Organizao
Gesto de Ocorrncias
Avaliao
Pessoal
Laboratrio de Patologia Clnica

Pr-analticas Avaliao do paciente Solicitao do teste Coleta do espcime Transporte do espcime Recebimento do espcime Analtica Reviso do teste Interpretao Ps-analtica Relatrio de resultados Gerenciamento ps-teste
Adaptado do documento HS1 _ A Quality System Model for Health Care do NCCLS.
A maioria dos documentos do NCCLS est relacionada com os laboratrios de patologia clnica, de maneira que a rota mais comum do fluxograma pode ser representada conforme visto anteriormente. As etapas do fluxograma relativas a outras atividades de ateno sade, ex., servios respiratrios, servios de imagens, etc., ou a outros tipos de organizaes, ex., fabricantes de dispositivos mdicos, iro diferir das dos laboratrios de patologia clnica sero diferentes das dos laboratrios de patologia clnica. Toda etapa do fluxograma descreve a seqncia das atividades necessrias produo dos produtos ou servios de uma organizao ou entidade especfica. Para aqueles documentos relacionados com outras etapas do fluxograma, o cone refletir passos diferentes do processo. A Norma M27-A2 focaliza os Seguintes Passos na Etapa do Fluxograma dos Laboratrios de Patologia Clnica Pr-analticos Analticos Ps-analticos Transporte Recebiment Gesto do Avaliao Solicitao Coleta do Reviso Interpretao Relatrio de do o do Espcime Psdo Paciente do Teste Espcime Do Teste Laboratorial Resultados Espcime Espcime teste X X X X Adaptado do documento HS1 A Quality System Model for Health Care do NCCLS.
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Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade de Leveduras Terapia Antifngica; Norma AprovadaSegunda Edio 1 Introduo
O mtodo descrito neste documento focaliza os testes para leveduras que causam infeces invasivas. Essas leveduras incluem espcies de Candida (incluindo Candida glabrata) e Cryptococcus neoformans. O mtodo no tem sido usado em estudos com fungos dimrficos em fase leveduriforme, como Blastomyces dermatitidis ou Histoplasma capsulatum variedade capsulatum. Outrossim, os testes com fungos filamentosos levantam vrios problemas adicionais em sua normatizao que no foram resolvidos pela atual metodologia. Foi desenvolvido um mtodo de referncia para testes de sensibilidade aos agentes antifngicos, por diluio em caldo, que foi disponibilizado no documento M38Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi do NCCLS.13,14 A Norma M27-A2 um mtodo de referncia que est sendo desenvolvido por meio do processo consensual para facilitar a concordncia entre laboratrios na determinao da sensibilidade de leveduras a agentes antifngicos. Uma aplicao importante de mtodos de referncia fornecer uma base padro, a partir da qual outros mtodos podem ser desenvolvidos, o que tambm resultar em reprodutibilidade interlaboratorial com faixa de erro determinada Por exemplo, os mtodos de microdiluio em caldo descritos neste documento, foram configurados para produzir resultados concordantes com aqueles obtidos pelo mtodo de referncia. Esse mtodo pode ter vantagens especiais, como: facilidade de execuo, economia ou resultados mais rpidos; portanto, seu desenvolvimento pode ser desejvel. Se o mtodo produz resultados concordantes com o mtodo de referncia, ser considerado em conformidade com a Norma M27-A2 do NCCLS. 1.1 Abrangncia
Este documento descreve um mtodo para testar a sensibilidade de leveduras que causam infeces, incluindo as espcies de Candida e Cryptococcus neoformans. Este mtodo no foi validado para a fase leveduriforme de fungos dimrficos, como Blastomyces dermatitidis ou Histoplasma capsulatum variedade capsulatum. O subcomit focalizou o desenvolvimento dos pontos de corte relevantes para os agentes antifngicos disponveis11 e fez referncia aos intervalos de CIM para os testes de microdiluio com agentes antifngicos, tanto estabelecidos, como os recm introduzidos.12 1.2 Definiesa
Antibiograma, n Perfil geral dos resultados da sensibilidade antimicrobiana de uma espcie de micrbio a um painel de agentes antimicrobianos. Concentrao inibitria mnima (CIM), n A concentrao mais baixa de um agente antimicrobiano que impede crescimento visvel de um microorganismo no teste de sensibilidade por diluio em gar ou caldo. 2 2.1 Agentes Antifngicos Fonte
a Algumas destas definies so apresentadas na Norma NRSCL8 - Terminology e Definitions for Use in NCCLS Documents do NCCLS. Para definies mais completas e informaes detalhadas sobre as fontes, favor reportar-se edio mais recente desse documento.
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Os padres ou substncias de referncia dos antifngicos podem ser obtidos comercialmente ou diretamente do fabricante.b No usar solues-padro da farmcia ou outras formulaes para uso clnico. As substncias aceitveis tm o nome genrico da droga no rtulo, bem como sua potncia determinada em ensaios em geral, expressa em microgramas (g) ou Unidades Internacionais por mg de p] e a data de vencimento. As substncias devem ser armazenadas de acordo com as instrues do fabricante, ou a -20 C ou menos, em dessecador (de preferncia sob vcuo). Quando o dessecador retirado do congelador, deve permanecer temperatura ambiente, antes de ser aberto (para evitar a condensao de gua). 2.2 Pesagem das substncias Antifngicas
Todos os agentes antifngicos devem ser submetidos a ensaio para determinar sua potncia. A potncia determinada no ensaio pode com freqncia, varia conforme cada lote de produo da droga. Por isso, o laboratrio deve padronizar suas solues antifngicas com base nos resultados dos ensaios dos lotes de substncias antifngicas que esto sendo usados. Ambas as equaes, a seguir, podem ser usadas para determinar a quantidade de p ou diluentes necessrios para preparar a soluo-me: Peso (mg) = Volume (mL) x Concentrao (g/mL) Potncia da substncia (g/mg) ou Vol. (mL) = Peso (mg) x Potncia da substncia (g/mg) Concentrao (g/mL) (1)
(2)
O antifngico sob forma de p deve ser pesado em balana analtica calibrada com pesos-padro de referncia do National Institute of Standards e Technology (KIST [Gaithersburg, MD]) ou outros aprovados. Em geral, recomenda-se pesar com preciso uma quantidade em excesso do p necessrio e calcular o volume de diluente final para obteno da concentrao desejada final. Exemplo: Para preparar 100mL de uma soluo-padro contendo 1280g de agente antifngico por mL, usando p antifngico com potncia de 750 g/mg, utilizar a primeira equao para estabelecer o peso de p necessrio:
Peso = (mg)
100 mL x 1280 g/mL (Vol. Alvo) (Conc. Desejada) 750 g/mg (Potncia)
= 170,7 mg
(3)
Visto que recomendvel pesar uma poro de p em excesso do requerido, coloca-se p na balana at chegar a 182,6mg. Com essa quantidade de p pesado, utiliza-se a equao (2), anterior, para determinar a quantidade de diluente necessria: (4)
Nos Estados Unidos, os antifngicos sob forma de p ou substncia de referncia podem ser, tambm, adquiridos da U.S. Pharmacopoeia (12001 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852).
15
Volume = (mL)
Conc. final
182,6 mg x (Peso do P)
750 g/mg (Potncia) = 107,0 mL 1280 g/mL (Concentrao desejada)
Portanto, os 182,6 mg de antifngico em p devero ser dissolvidos em 107,0 mL do diluente. 2.3 Preparao de Solues-Padro
As solues-padro de antifngicos so preparadas em concentraes de, pelo menos, 1280 g/mL ou dez vezes a concentrao mais alta a ser testada, sendo sempre a maior das duas. No entanto, existem alguns agentes antifngicos de solubilidade limitada que podem requerer concentraes mais baixas. Em todos os casos, as informaes fornecidas pelo fabricante da droga devem ser consideradas na determinao da solubilidade. 2.3.1 Uso de Solventes no-aquosos
Algumas drogas devem ser dissolvidas em solventes diferentes da gua (ver Tabela 1). As informaes sobre solubilidade de um agente antifngico devem estar anexadas ao produto. Essas drogas devem ser dissolvidas em concentraes 100X mais altas, pelo menos, do que a maior concentrao usada no teste. Os agentes, mais freqentemente, usados incluem: dimetilsulfxido (DMSO), lcool etlico, polietilenoglicol e carboxi-metil-celulose, todos em qualidade analtica. Quando esses solventes forem empregados, recomenda-se preparar uma srie de diluies com esses solventes, a partir da soluo-me, at obteno de 100 vezes a concentrao final. A seguir, cada soluo intermediria dever ser diluda at a concentrao final usada no teste (ver a Tabela 1). Esse procedimento impede artefatos resultantes da precipitao de produtos de baixa solubilidade em meio aquoso. Por exemplo, para preparar uma srie de diluies para os testes, contendo uma droga insolvel em gua, mas solvel em DMSO, cuja maior concentrao final 16g/mL, pesa-se primeiro 4,8mg (assumindo potncia de 100%) do antifngico em p que dissolvido em 3,0mL de DMSO. Isso resulta em soluopadro de 1.600g/mL. A seguir, preparam-se mais diluies dessa soluo-me em DMSO. (Ver as Tabelas 2 e 3). As solues em DMSO sero diludas 10X no meio de cultura usado no teste (ver a Seo 3.3) reduzindo a concentrao final do solvente para 1%. O DMSO nessa concentrao (sem a droga) deve ser usado no teste como controle de diluio. O exemplo anterior assume uma potncia de 100% para o antifngico em p. Se a potncia for diferente, ser necessrio aplicar os clculos fornecidos na Seo 2.2. 2.3.2 Filtragem
Em geral, as solues-padro no contm microorganismos contaminantes, podendo-se assumir que so estreis. Para se ter certeza da esterilidade, necessrio filtr-las atravs de uma membrana-filtro. Os filtros de papel, amianto ou vidros sintetizados, que podem absorver quantidades apreciveis de certos agentes antifngicos, no devem ser usados. Sempre que se usar filtragem, importante documentar a ausncia de absoro por meio dos resultados de ensaios apropriados. 2.3.3 Armazenamento
Pequenos volumes de solues-padro estreis so colocados em frascos estreis de polipropileno ou polietileno, selados, cuidadosamente e armazenados (de preferncia temperatura de -60C ou menores, mas nunca temperatura superior -20 C). Os frascos so retirados, conforme necessrio, e usados no mesmo dia. Qualquer droga no usada deve ser descartada no fim do dia. As solues-padro dos agentes 16
antifngicos, em sua maioria, podem ser armazenadas a -60 C, ou menos, durante seis meses ou mais, sem perda significativa de atividade12. Em todo caso, qualquer orientao fornecida pelo fabricante da droga deve ser considerada como parte destas recomendaes gerais e prevalecer sobre qualquer orientao diferente. indispensvel certificar-se de que no h qualquer deteriorao significativa do agente antifngico, o que poder se refletir nos resultados dos testes de sensibilidade, mediante uso de cepas de controle de qualidade ou cepas de referncia, como as relacionadas na Tabela 4. 2.4 Nmero de Concentraes Testadas
As concentraes a serem testadas devem abranger as concentraes dos pontos de corte e as referentes aos resultados esperados para as cepas controle de qualidade. Com base em estudos anteriores, os seguintes intervalos de concentrao das drogas so importante: anfotericina B de 0,0313 a 16g/mL; flucitosina de 0,125 a 64g/mL; cetoconazol de 0,0313 a 16g/mL; itraconazol de 0,0313 a 16g/mL; fluconazol de 0,125 a 64 g/mL; e os novos triazlicos de 0.0313 a 16 g/mL. 2.5 Seleo dos Agentes Antifngicos para Testes de Rotina e Emisso de Relatrios
Embora pontos de corte j estejam disponveis para algumas combinaes organismo-droga, testes de rotina no so recomendados. Em cada instituio, a deciso sobre realizar ou no, testes de sensibilidade a antifngicos de rotina, deve ser tomada em conjunto com especialistas em doenas infecciosas, comit de farmcia, pessoal de microbiologia clnica e comit de controle de infeces. 2.5.1 Nomes Genricos
Para minimizar erros, no se deve usar os nomes-comerciais dados pelos fabricantes (ex.,usar nome genrico) de todos os agentes antifngicos. 2.5.2 Nmero de Agentes Testados
Para que os testes de sensibilidade de rotina sejam relevantes e prticos, o nmero de agentes antifngicos testados deve ser limitado. Embora isso no seja uma questo premente no caso dos agentes antifngicos, o mesmo princpio deve ser aplicado. 2.5.3 Diretrizes para Emisso Seletiva de Relatrios
vlido realizar testes em determinadas circunstncias: (a) como parte de levantamentos peridicos de srie de testes, com vistas a determinar o a estabelecimento de perfil de sensibilidade de colees de isolados patognicos, provenientes da prpria instituio; (b) para auxiliar na determinao da terapia para infeces orofarngeas refratrias causadas por Candida spp, em pacientes cuja terapia com antifngicos e doses-padro, parece ter fracassado; e (c) para auxiliar na determinao da terapia para infeces invasivas por Candida spp. se a utilidade dos agentes antifngicos azlicos for indeterminada. No h pontos de corte disponveis para interpretar os resultados de testes de qualquer espcie de fungo filamentoso contra qualquer agente antifngico e a relevncia clnica dos testes, com qualquer combinao organismo-droga, permanece incerta (ex., quando a infeco causada por um isolado no C. albicans). S h pontos de corte disponveis para Candida spp. contra fluconazol, itraconazol e flucitosina, sendo que, a relevncia clnica dos testes para qualquer outra combinao organismo-droga permanece incerta. As amostras biolgicas para obteno das culturas e para outros testes devem ser obtidas antes de do incio da terapia com antifngicos. 3 3.1 Metodologia dos Testes Meio lquido
17
3.1.1
Meio Sinttico
Recomenda-se um meio completamente sinttico para os testes de sensibilidade. O meio sinttico denominado RPMI-1640 (com glutamina, sem bicarbonato e com indicador vermelho de fenol) considerado satisfatrio, ou pelo menos to adequado quanto vrios outros meios sintticos, tendo sido usado para desenvolver esta norma3,4 A frmula desse meio apresentada na Tabela 6 e sua preparao est delineada no Apndice A. 3.1.2 Soluo-Tampo
O meio deve ser tamponado a pH 7,0 0,1, em temperatura de 25 C. Deve-se selecionar uma soluotampo que no antagonize os agentes antifngicos. A soluotampo Tris no satisfatria porque antagoniza a atividade da flucitosina. As solues- tampo tipo Zwitterion so preferveis as que atravessam facilmente, a membrana celular, como os fosfatos porque, teoricamente, esses ltimos podem produzir interaes inesperadas com agentes antifngicos. Uma soluo-tampo considerada satisfatria nos testes de sensibilidade a antifngicos o MOPS [cido 3-(N-morfolino) propanosulfnico] (concentrao final de 0,165 mol/L, pH 7,0). O pH de cada lote de meio deve ser verificado com um medidor de pH imediatamente aps sua preparao; o pH pode variar de 6,9 a 7,1 temperatura ambiente (25 C). Os valores de CIM de cada lote de meio de cultura devem ser avaliados usando um painel de organismos de controle de qualidade (ver a Seo 4). 3.2 Preparao de Diluies de Agentes Antifngicos
Os diferentes procedimentos de preparao e armazenamento de solues de agentes antifngicos so as seguintes. (1) (2) Usar tubos de ensaio plsticos e estreis, 12 x 75mm para preparar e realizar os testes. Usar um poo para controle do crescimento contendo meio sinttico RPMI-1640 sem agente antifngico (mas, com solvente no aquoso, quando pertinente) para cada organismo testado. Fechar os tubos com tampas de rosca de plstico ou metal. Agentes Antifngicos Solveis em gua
(3) 3.2.1
Quando se precisa realizar diluio seriada em razo 2 dos agentes antifngicos solveis em gua, estas podem ser preparadas volumetricamente em meio lquido (Tabela 2). O procedimento para os agentes antifngicos no-solveis em gua diferente do empregado para agentes solveis em gua e encontra-se descrito a seguir. Para fazer um nmero pequeno de testes, recomenda-se consultar a metodologia descrita na Tabela 3. O volume total de cada soluo a ser preparada depende do nmero de testes a serem realizados. Visto que se usa 0,1mL de cada concentrao da droga antifngica para cada teste, 1,0mL de soluo ser suficiente para pipetar o necessrio para nove testes. Utiliza-se apenas uma pipeta para os diluentes e, a seguir, acrescentar a soluo-padro do antifngico ao primeiro tubo de ensaio. Emprega-se uma pipeta separada para cada diluio restante dessa srie. Uma vez que a diluio das drogas ser de 1:10 quando combinadas com o inculo, as solues de trabalho de agente antifngico so 10X mais concentradas do que as concentraes finais. Muitas pessoas acreditam que trabalhar com diluies 1:10 (conforme indicado na Tabela 2) fcil e conveniente. Entretanto, algumas pipetas automatizadas dispensam apenas volumes de 1,0 ou 0,1mL. Assim, a razo 1:11 seria prefervel. No importante se o volume final do teste 1,0mL ou 1,1mL. Quando se efetuam diluies 1:11, o esquema de diluio deve ser alterado de maneira a obter as mesmas concentraes finais da droga. 18
3.2.2
Agentes Antifngicos Insolveis em gua
No caso dos agentes antifngicos cujas solues-padro no podem ser preparadas em gua, como cetoconazol, anfotericina B, itraconazol ou os novos azlicos, deve-se preparar uma srie de diluies do agente em solvente apropriado, sendo a primeira 100X a concentrao final (ver a Seo 2.3.1). A seguir, cada soluo no aquosa deve ser diluda 10X em caldo RPMI-1640. Por exemplo, quando se deseja uma srie de diluies com concentraes finais na faixa de 16g/mL a 0,0313g/mL, prepara-se primeiro uma srie de concentraes de 1.600 a 3,13g/mL em DMSO (ver a Seo 2.3.1). Para preparar volumes de 1mL de agente antifngico diludo (suficiente para dez testes), pipeta-se primeiro volumes de 0,9mL do meio RPMI-1640 em cada tubo de ensaio estril, em total de onze. Com auxlio de uma nica pipeta, acrescenta-se 0,1mL de DMSO puro a uma alquota de 0,9mL de meio de cultura (controle de esterilidade do meio); a seguir, pipeta-se 0,1mL da menor concentrao (3,13g/mL) da droga diluda em DMSO, a o outro tubo com 0,9 mL de meio de cultura, seguindo com 0,1mL da concentrao 6,25g/mL e assim sucessivamente, por toda a srie de concentraes, acrescentado-se cada vez, 0,1mL da soluo de antifngico aos volumes de 0,9mL de meio. Esses volumes podem ser ajustados, se necessrio, dependendo do nmero total de testes a serem realizados. Visto que haver uma diluio 1:10 das drogas quando combinadas com o inculo, as solues de trabalho dos agentes antifngicos so 10X mais concentradas do que as concentraes finais. 3.3 Preparao do Inculo
As diferentes operaes de preparao do inculo so as seguintes. (1) Deve-se realizar a subcultura (repique) dos organismos, em tubos estreis com gar Sabourauddextrose ou gar batata-dextrose, executando passagens para assegurar sua pureza e viabilidade. A temperatura de incubao deve permanecer em 35 C. (2) O inculo deve ser preparado escolhendo-se cinco colnias com dimetro de ~1mm de cultura de 24 horas para espcies de Candida ou cultura de 48 horas para C. neoformans. As colnias devem ser suspensas em 5mL de soluo salina estril 0,145 mol/L (8,5g/L NaCl; salina a 0,85%). (3) A suspenso resultante deve ser colocada em agitador de vrtex durante 15 segundos e a densidade celular, ajustada com espectrofotmetro, acrescentando-se soluo salina suficiente para obter a transmitncia equivalente de uma soluo-padro da escala de McFarland 0,5 (ver o Apndice B), em comprimento de onda de 530nm. Esse procedimento fornece uma suspenso-padro de levedura contendo 1 x 106 a 5 x 106 clulas por mL. A suspenso de trabalho produzida fazendo-se uma diluio 1:100 seguida de uma diluio de 1:20 da suspenso-padro com meio lquido RPMI 1640, resultando em concentrao de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 clulas por mL2. 3.4 Inoculao do meio RPMI-1640
Antes de ajustar o inculo, coloca-se 0,1mL de cada uma das diferentes concentraes de agente antifngico em tubos de ensaio 12 x 75mm. Para controle de crescimento coloca-se 0,1mL do diluente da droga, sem agente antifngico. Dentro de 15 minutos aps padronizar o inculo (at duas horas, se o inculo for mantido a 4o C), acrescenta-se e homogeneiza-se 0,9mL do inculo ajustado, a cada tubo de ensaio da srie de concentraes . Isso resulta em diluio 1:10 de cada concentrao de antifngico e uma diluio do inculo em 10% . 3.5 Incubao
19
Com exceo de C. neoformans, os tubos so incubados (sem agitao) a 35 C, durante perodo de 46 a 50 horas, em ar ambiente. Nos testes com C. neoformans, os tubos devem ser incubados por perodo total de 70 a 74 horas, antes de se determinar os resultados. 3.6 Leitura dos Resultados
A quantidade de crescimento nos diferentes tubos contendo o agente antifngico comparada, visualmente, com a quantidade de crescimento no tubo controle de crescimento para cada levedura (sem agente) usado em cada srie de testes, da seguinte maneira. 3.6.1 Anfotericina B
Para anfotericina B, os pontos finais da reao so, claramente, definidos, sendo fcil distinguir a CIM como a menor concentrao de droga que impede qualquer grau de crescimento discernvel. Em geral, no so vistos pontos finais da reao mal definidos. 3.6.2 Antifngicos Flucitosina e Azlicos
Para flucitosina e especialmente para os azlicos, como fluconazol e cetoconazol, os pontos finais da reao so menos claramente, definidos do que os descritos para anfotericina B, o que pode constituir uma fonte substancial de variabilidade. O uso de pontos finais menos rigorosos (aceitando alguma turbidez acima da CIM) tem melhorado a concordncia entre laboratrios, alm de discriminar entre isolados, supostamente, sensveis e isolados resistentes. Quando a turbidez persiste, acima da CIM, freqentemente, idntica para todas as concentraes da droga. O grau de turbidez aceito pode ser estimado diluindo-se 0,2mL da suspenso do controle de crescimento, isento da droga, em 0,8mL do meio de cultura, produzindo um padro de inibio de 80%.5,16 Mesmo a disperso de grumos, que pode se tornar evidente aps incubao, pode fazer com que a determinao do ponto final seja mais reprodutvel. Alm disso, deve-se usar cepas de referncia com sensibilidade pr-definida para a capacitao do pessoal novato do laboratrio. 3.7 Interpretao dos Resultados
Os pontos de corte (breakpoints) para interpretao dos resultados s foram estabelecidos para algumas combinaes organismo-droga (ver o Apndice C). A relevncia clnica dos testes com outras combinaes organismo-droga continua incerta, mas as informaes mais relevantes podem ser resumidas conforme segue. 3.7.1 Anfotericina B
At agora, a experincia usando os testes descritos nesta Norma indica que as CIMs da anfotericina B, para isolados de Candida spp., apresentam-se agrupados em pequeno intervalo entre 0,25 e 1.0g/mL. Quando os isolados que parecem resistentes anfotericina B em modelos animais so testados usando os mtodos da Norma M27, possvel obter valores de CIM superiores a 1g/mL. Infelizmente, a metodologia da Norma M27 no permite a deteco desses isolados de maneira consistente e tudo que se pode concluir, no presente momento, que quando se obtm um valor de CIM de anfotericina B >1g/mL para um isolado de Candida spp., provvel que o isolado seja resistente anfotericina B. Pesquisas em andamento sugerem que testes com Antibiotic Medium 3 suplementado com glicose (dextrose) a 2% permitem maior confiabilidade na deteco dos isolados resistentes.17,18 Entretanto, a reprodutibilidade desse mtodo ainda est sendo estudada19 e os laboratrios que decidirem realizar esses testes devem comparar, cuidadosamente, seus resultados com aqueles obtidos com isolados com resposta conhecida `a anfotericina B. Uma coleo de isolados de referncia, com utilidade potencial foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC): C. lusitaniae ATCC 200950; ATCC 200951, ATCC 200952, ATCC 200953, ATCC 200954; C. albicans ATCC 200955; e C. tropicalis ATCC 200956. 20
3.7.2
Flucitosina
Os pontos de corte para a interpretao dos resultados com Candida spp. e flucitosina foram estabelecidos com base, em grande parte, na farmacocintica da droga (ver o Apndice C). 3.7.3 Fluconazol
Com base em grande acervo de dados do fabricante de fluconazol11 foram estabelecidos pontos de corte para a interpretao dos resultados com Candida spp. e fluconazol (ver o Apndice C). Esses dados so provenientes, principalmente, de estudos com casos de candidase orofarngea e infeces invasivas por Candida spp., em pacientes no-neutropnicos, sendo incerta sua relevncia clnica em outros contextos. Alm disso, esses pontos de corte de interpretao no se aplicam C. krusei e, portanto, imprescindvel identificar a espcie, antes de determinar a CIM. A utilidade dos testes com isolados de C. neoformans est sendo intensamente estudada e dados recentes sugerem correlao entre CIMs elevadas e fracasso clnico.20 3.7.4 Cetoconazol
At agora, a experincia usando os testes descritos nesta Norma indicam que valores de CIM para leveduras variam de 0,03 a 16g/mL. Entretanto, ainda no h dados indicando correlao entre CIM e resultados de tratamento com cetoconazol. 3.7.5 Itraconazol
Com base em grande quantidade de dados do fabricante de fluconazol11 foram estabelecidos pontos de corte para a interpretao dos resultados de testes com Candida spp. e itraconazol (ver o Apndice C). Esses dados so provenientes, principalmente, de estudos de candidase orofarngea, sendo incerta sua relevncia clnica em outros contextos. Alm disso, impossvel ressaltar, de modo convincente a importncia da preparao correta das diluies do itraconazol, dado que um produto insolvel. O uso de solventes incorretos ou desvios no esquema de diluies sugerido na Tabela 3 pode levar a erros substanciais, causados por artefatos de diluio. 3.7.6 Novos Triazis
At agora, a experincia com posaconazol, ravuconazol e voriconazol usando os testes descritos nesta Norma, indica que os valores de CIM para leveduras variam de 0,03 a 16g/mL, sendo que, a maioria dos isolados inibida a 1g/mL de quaisquer dos trs agentes. Entretanto, ainda no h dados indicando correlao entre CIM e resultados de tratamento com estes agentes. 3.8 Modificaes para Microdiluio
H volume substancial de dados publicados documentando excelente concordncia entre os resultados obtidos com a metodologia de macrodiluio descrita anteriormente, e uma adaptao para microdiluio 5,8-10,21-24 . A facilidade de execuo dos testes de microdiluio muito interessante, sendo que a maioria dos laboratrios de patologia clnica, provavelmente, decidir implementar este mtodo ao invs do mtodo de macrodiluio. Os passos e as condies de teste relevantes ao teste de microdiluio so aqui discutidos de maneira detalhada. As concentraes 10X da droga, descritas para o teste de macrodiluio, devem ser diludas 1:5 com RPMI para se conseguir concentrao 2X necessria para o teste de microdiluio. As suspenses dos inculos so preparadas e ajustadas conforme descrito para os testes de macrodiluio. A suspensopadro de levedura misturada durante 15 segundos em vrtex, diluda 1:50 e depois 1:20 com o meio de cultura, para se obter o inculo 2X concentrado usado no teste (de 1 x 103 a 5 x 10 3 CFU/mL). O inculo
21
(2X) ser diludo a 1:1 quando os poos forem inoculados, chegando-se concentrao final desejada de inculo (de 0,5 x 103 a 2,5 x 103 CFU/mL). O teste de microdiluio realizado em placas de microdiluio estreis, descartveis, com mltiplos poos (96 poos em formato de U). As concentraes 2X da droga so dispensadas nos poos das fileiras 1 a 10 das placas de microdiluio, em volumes de 100L, com uma pipeta multicanal. A fileira 1 dever conter a maior concentrao da droga (64 ou 16g/mL) e a fileira 10 a menor concentrao da droga (0,12 ou 0,03g/mL). Essas placas podem ser cobertas com filme plstico, colocadas em sacos de plstico e armazenadas congeladas temperatura -70 C, por at seis meses, sem deteriorao da potncia da droga. Cada poo da placa de microdiluio inoculado, no dia do teste, com 100L da correspondente suspenso 2X concentrada do inculo, o que leva s diluies das drogas e concentrao do inculo antes mencionados. Os poos controle de crescimento contm 100L de meio estril, isento de droga, e so inoculados com 100L das suspenses 2X concentradas dos inculos. Os organismos de CQ so testados da mesma maneira e so includos toda vez que se testa um isolado. A fileira 12 da placa de microdiluio pode ser usada para efetuar o controle da esterilidade (apenas meio isento de drogas). As placas de microdiluio so incubadas a 35 C, observando presena ou ausncia de crescimento visvel. A agitao das placas pode simplificar a leitura dos pontos finais. Os poos de microdiluio recebem uma pontuao (escore) o crescimento em cada poo comparado com o do poo controle do crescimento (isento de droga) com auxlio de um espelho de leitura;. A seguir, cada poo da placa de microdiluio recebe um valor numrico, usando a seguinte escala: 0 = opticamente claro; 1 = crescimento indefinido; 2 = reduo proeminente de crescimento; 3 = ligeira reduo do crescimento; e 4 = nenhuma reduo do crescimento. Quando a formao de grumos na suspenso prejudica a determinao da pontuao dos poos, deve-se tentar pipetar, agitar em vrtex ou outra tcnica de homogeneizao 24,25 . O valor de CIM de anfotericina B definido como a menor concentrao em que se observa o escore 0 (opticamente claro), sendo o CIM de 5-FC e de azis definido como a menor concentrao em que se observa o escore 2 (reduo proeminente de crescimento). Uma diminuio proeminente de turbidez corresponde , aproximadamente, 50% da inibio do crescimento, determinado em espectrofotmetro. Os resultados da microdiluio com leitura de CIM realizada em 48 horas (72 horas, para a maioria dos isolados de C. neoformans) tm maior concordncia com o mtodo de referncia por macrodiluio em caldo23, 24,26 3.9 Impacto do Tempo de Leitura: 24 Horas versus 48 Horas A metodologia da Norma M27-A2 para Candida recomenda ponto final de leitura aps 48 horas. Para a maioria dos isolados, a diferena entre leitura aps 24 horas e aps 48 horas mnima e no altera a categoria de interpretao (i.e., no muda a classificao do isolado como sensvel" ou resistente). Entretanto, pesquisa recente indicou incluso de leituras aps 24 horas porque: (a) possvel, com freqncia, ler CIM aps 24 horas e (b) leituras aps 24 horas podem ser mais relevantes, do ponto de vista clnico, no caso de alguns isolados. Os isolados cuja leitura precoce importante so os que apresentam aumento dramtico de CIM, das 24 horas para as 48 horas, devido ao crescimento indefinido (denominado trailing) e significativo (inibio parcial do crescimento, ao longo de um amplo intervalo de concentraes do antifngico). Com ocorrncia estimada em, aproximadamente, 5% dos isolados27 esse crescimento indefinido pode ser suficiente para fazer com que um isolado que parecia sensvel s 24 horas, se torne completamente resistente aps 48 horas. Duas pesquisas in vivo sobre esse fenmeno e independentes entre si, empregando candidase murina disseminada como modelo27,28, demonstraram que os isolados com esse tipo de comportamento devem ser classificados como sensveis, ao invs de resistentes. Esse conceito foi corroborado pela demonstrao de que o crescimento indefinido pode ser eliminado diminuindo o pH do meio de teste para 5 ou menos29 e, tambm, pela demonstrao clnica de que a candidase orofarngea causada por tais isolados responde dose menor de fluconazol do que a usada para tratar isolados sensveis tpicos30. luz dessas observaes, so fornecidos os intervalos de CIM, para ambas as leituras, de 24 e 48 horas, em testes de microdiluies, para duas cepas de CQ e oito agentes antifngicos sistmicos (Tabela 5).
22
3.10
Outras Modificaes
Alm dos esforos em andamento para simplificar os testes descritos nesta Norma, foram desenvolvidas algumas modificaes mais fundamentais do mtodo, em resposta a problemas especficos, as quais encontram-se descritas na Tabela 7. Essas modificaes no fazem parte da atual metodologia, mas os laboratrios interessados podem ter interesse em explorar sua relevncia clnica. 4 4.1 Controle de Qualidade Propsito
As metas do programa de controle de qualidade so monitorar os seguintes elementos:
preciso e acurcia da metodologia dos testes de sensibilidade; desempenho dos reagentes, condies de teste e instrues usadas no teste; e desempenho das pessoas que realizam os testes e lem os resultados.
Embora outros fatores tambm intervenham, a melhor maneira de alcanar essas metas est no uso de medidas de controle de qualidade e cepas de referncia, selecionadas por sua estabilidade gentica e utilidade no mtodo especfico sob controle6. 4.2 4.2.1 Responsabilidades no Controle de Qualidade Fabricantes (Produtos Comerciais e/ou Internos)
Os fabricantes so responsveis pelos seguintes elementos:
estabilidade dos antifngicos; identificao dos antifngicos; potncia das solues padro; adeso s boas prticas de fabricao; integridade do produto; e responsabilidade e rastreabilidade a um consignatrio. Laboratrio (Usurio)
4.2.2
O laboratrio responsvel pelos seguintes elementos: armazenamento (deteriorao da droga); proficincia do operador; e adeso metodologia (ex., efeito do inculo, condies de incubao [tempo e temperatura]).
23
4.2.3
Responsabilidades Mtuas
Os fabricantes devem desenhar e recomendar um programa de controle de qualidade que permita que o usurio avalie as variveis (ex., nveis de inculo, condies de armazenamento/transporte) provveis de causar problemas no bom desempenho laboratorial e determine se o ensaio tem desempenho correto, quando executado de acordo com as instrues de uso. 4.3 Seleo das Cepas de Referncia
As cepas de referncia ideais para o controle de qualidade dos mtodos de diluio tm valores de CIM prximos aos situados no meio do intervalo de concentraes, para todos os agentes antifngicos testados. Uma cepa-controle ideal inibida na quinta diluio de uma srie log2 de nove diluies, mas as cepas com CIM entre a terceira e stima diluies so aceitveis. Antes de ser aceita como referncia, a cepa deve ser testada, pelo perodo que for necessrio, at demonstrar que seu perfil de sensibilidade aos agentes antifngicos , geneticamente, estvel. A Norma M23 - Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria and Quality Control Parameters do NCCLS fornece diretrizes para seleo de cepascontrole de qualidade apropriadas e para determinao de intervalos de valores aceitveis de CIM. As cepas de CQ relacionadas nas Tabelas 4 e 5 foram selecionadas de acordo com esses critrios.6,7,12 4.4 4.4.1 Armazenamento das Cepas de Referncia Mtodos de Armazenamento para Prazos Curto e Prolongado
As cepas de referncia so armazenadas de maneira a minimizar a possibilidade de sua mutao. H dois mtodos de preferncia para o armazenamento prolongado de cepas de referncia. As leveduras podem ser cultivadas em gar batata-dextrose e depois congeladas a -70 C, conforme descrito por Pasarell e McGinnis.31 Alternativamente, as cepas de referncia (embora, no espcies de Cryptococcus) podem ser preservadas suspendendo as clulas fngicas em soluo de glicerol a 50% em pequenos frascos e armazenando-as a 70o C. Para armazenamento de curto prazo, as culturas-padro de trabalho devem ser cultivadas em tubos de gar Sabouraud ou gar dextrose peptona inclinados at se observar crescimento suficiente, sendo depois armazenadas temperatura de 2 a 8 C. Os repiques so preparados a cada duas semanas pelo mtodo de transferncia seriada. Para evitar a mistura de culturas, recomenda-se no realizar mais do que trs passagens aps a retirada da cepa padro congelada. Deve-se obter uma cultura-padro nova sempre que ocorrerem resultados aberrantes. Fontes de Cepas de Referncia
4.4.2
As cepas de referncia devem ser obtidas de fontes que possam fornecer informaes acerca da origem da cultura (por exemplo, da empresa American Type Culture Collection [ATCC],c de fontes comerciais com histria documentada da cultura, ou de instituies de referncia com capacidade comprovada de armazenar e usar os organismos de maneira compatvel com risco mnimo de contaminao). 4.4.3 Preparao das Cepas para Armazenamento
Para preparar as cepas para armazenamento, deve-se obedecer ao seguinte procedimento: (1) Cultivar os organismos em placas de Petri, durante a noite, em gar Sabouraud-dextrose, ou em gar batata-dextrose, ou gar enriquecido com digerido de soja-casena.
ATCC marca registrada da American Type Culture Collection.
24
(2)
Selecionar o crescimento de vrias colnias e realizar testes de sensibilidade apropriados, para demonstrar resultados esperados de CIM (ver a Tabela 4 para as CIMs esperadas de algumas cepas de referncia). Realizar uma subcultura das cepas, que produziram os resultados esperados, no mesmo meio usado para a cultura primria e incubar durante perodo longo para que ocorra crescimento suficiente (em geral, de um a trs dias). Examinar com cuidado o crescimento resultante para se certificar da pureza da cultura. Suspender o crescimento na soluo estabilizante at fazer suspenso densa (ou, se estiver liofilizado, suspender o crescimento no meio apropriado). Distribuir pequenos volumes (uma ou duas gotas) da suspenso turva em recipientes estreis adequados. Colocar esses recipientes em congelador, mantidos conforme indicado na Seo 2.3.3, ou em nitrognio lquido.
(3)
(4) (5) (6) (7)
As suspenses-padro, preparadas de acordo com o procedimento delineado anteriormente, podem ser mantidas indefinidamente, sem risco significativo de alterao nos perfis de sensibilidade ao agente antifngico. Quando o estoque de recipientes estiver praticamente exaurido, repete-se o processo para produzir um novo estoque. 4.5 Uso Rotineiro das Cepas de Referncia
Para o uso rotineiro das cepas de referncia, necessrio realizar os seguintes procedimentos: (1) Retirar o recipiente da cultura do congelador ou obter um frasco liofilizado. (2) (3) (4) Deixar descongelar a suspenso congelada ou reidratar a cultura liofilizada. Realizar uma subcultura em placas contendo gar batata-dextrose e incub-las a 35 C durante 24 horas, para as espcies de Candida, ou 48 horas para C. neoformans. Retirar quatro ou cinco colnias, realizar subculturas no meio para os testes de sensibilidade apropriados e, a seguir, realizar subculturas em tubos contendo gar inclinado, enriquecido com digerido de soja-casena. Aps incubar as cepas durante a noite, elas devem ser armazenadas temperatura de 2 a 8 C. Realizar as subculturas, em placa contendo gar, a partir do tubo com gar inclinado. Realizar sempre os testes de sensibilidade das colnias de placas cultivadas durante uma noite.
(5) (6) (7)
Os tubos com gar inclinado podem ser usados como culturas-padro de trabalho. Esses tubos devem ser substitudos de duas em duas semanas, pelo menos, por novos tubos do estoque congelado. 4.6 Controle de Lotes do Meio e Equipamento de Plstico
Para controle de lotes de meio de cultura e de artigos plsticos, o procedimento pode ser dividido nos seguintes passos:
25
(1)
Testar cada novo lote de meio usado em tubos de macrodiluio, ou lote de placas de microdiluio, usando uma das cepas-controle de qualidade relacionadas na Tabela 4, para determinar se os valores de CIM esto dentro do intervalo esperado; caso contrrio, rejeitar o lote. Pelo menos um tubo de cada lote deve ser incubado, sem inocular, durante o mesmo perodo necessrio para realizar o teste, de maneira a verificar a esterilidade do meio. Os lotes novos do meio RPMI-1640 devem ser testados para verificar se seu desempenho ser aceitvel, antes de us-los em testes de isolados clnicos, visto que estudos recentes demonstram que alguns lotes no tm desempenho adequado. O pH pode variar de 6,9 a 7,1 (ver a Seo 3.1.2). Registrar os nmeros de lote de todos os materiais e reagentes usados nesses testes. Freqncia dos Testes de Controle de Qualidade Intervalos de CIM
(2) (3)
(4) 4.7 4.7.1
As Tabelas 4 e 5 apresentam os intervalos de preciso dos valores de CIM para um nico teste de controle.6,7,12 Em geral, 1 dentre 20 valores de CIM, em srie de 20 testes consecutivos, pode estar fora do controle (i.e., fora da faixa definida), devido s variaes aleatrias do teste. Dois resultados consecutivos, com valores fora do esperado ou mais de 2 resultados fora do esperado em 20 testes de controle consecutivos, exigem medidas corretivas. Toda vez que se tomar medidas corretivas, a contagem de 20 testes consecutivos recomea. OBSERVAO: No confundir este procedimento com o procedimento para estabelecer o desempenho satisfatrio dos testes de CIM visando realizao de testes de controle de qualidade semanais, ao invs de dirios (ver a Seo 4.7.2). 4.7.2 Freqncia dos Testes
Para monitorar o desempenho geral dos procedimentos para testes, recomenda-se incluir cepas de referncia apropriadas, todo dia que o teste for realizado. Entretanto, a freqncia do monitoramento dos testes pode ser diminuda se o laboratrio puder documentar desempenho satisfatrio com testes de controle dirios. Para esse fim, define-se desempenho satisfatrio da seguinte maneira: (1) Documentao mostrando que todas as cepas de referncia foram testadas durante 30 dias consecutivos de testes. (2) Para cada combinao droga-microorganismo, apenas 3 dentre 30 valores de CIM (i.e., valores de CIM obtidos para uma combinao droga-microorganismo durante 30 dias consecutivos de testes) podem estar fora do intervalo de acurcia definidos s nas Tabelas 4 e 5. OBSERVAO: Este procedimento apenas para estabelecer o desempenho satisfatrio dos testes de CIM, com a finalidade de realizar testes de controle de qualidade semanais, ao invs de dirios. Este procedimento no deve ser confundido com os passos que devem ser seguidos para tomar as medidas de correo definidas na Seo 4.7.1. Quando essas condies forem cumpridas, ser preciso testar cada cepa de referncia pelo menos uma vez por semana e sempre que qualquer reagente for mudado. Sempre que for constatado um valor de CIM fora do intervalo de acurcia, usando o sistema de monitoramento semanal, ser necessrio recomear e manter os testes de controle dirios enquanto no se definir qual a fonte de erro para o resultado aberrante e a resoluo do problema no tiver sido documentada da seguinte maneira: 26
Realizar os testes com cepas de referncia apropriadas durante cinco dias consecutivos. Para cada combinao droga-microorganismo, os cinco valores de CIM (ex., valores de CIM obtidos para uma combinao droga-microorganismo durante cinco dias consecutivos de testes) devem se manter dentro do intervalo de acurcia definidos nas Tabelas 4 e 5. (3) Se a soluo do problema no puder ser documentada (ex., pelo menos um dos cinco valores de CIM estiver fora do intervalo de acurcia) ser necessrio continuar os testes dirios de controle de qualidade. A volta aos testes semanais, no futuro, exigir desempenho satisfatrio documentado durante 30 dias consecutivos adicionais de testes, conforme delineado nesta seo.
No caso de algumas drogas, os testes de controle de qualidade devem ser efetuados com freqncia maior do que uma vez por semana, devido degradao relativamente rpida da droga. 4.8 4.8.1 Outros Testes de Controle Controle do Crescimento
Cada srie de testes de macrodiluio deve incluir um controle de crescimento do meio RPMI 1640, sem agente antifngico, para avaliar a viabilidade dos organismos de teste. Com os testes de caldo, o controle do crescimento tambm serve como controle da turbidez para a leitura dos pontos finais. 4.8.2 Controle de Pureza
Uma amostra de cada inculo deve ser colocada numa placa de gar apropriado e incubada at haver suficiente crescimento visvel para detectar culturas mistas e fornecer colnias isoladas frescas, para o caso de se tornar necessrio fazer uma retestagem. 4.8.3 Controle da Leitura dos Pontos Finais da Reao
A leitura dos pontos finais da reao deve ser monitorada, periodicamente, para minimizar possveis variaes nos testes de CIM entre diferentes observadores. Todo pessoal de laboratrio que realiza esses testes dever ler, separadamente, um conjunto selecionado de testes de diluio. Os resultados devem ser registrados e comparados com os resultados obtidos por um tcnico experiente. As cepas de referncia com valores de CIM pr-determinados so particularmente teis para esta finalidade, especialmente em testes com fluconazol.6,7,12 4.9 Cepas de Controle de Qualidade (ver tambm a Seo 4.3)
As cepas de referncia ideais para o controle de qualidade dos testes de diluio tm valores de CIM prximos ao ponto mdio do intervalo de concentraes utilizado para todos os agentes antifngicos; ex., uma cepa-controle ideal ser inibida na quarta diluio de uma srie de sete diluies, embora, cepas com valores de CIM na terceira ou na quinta diluio tambm sejam aceitveis. As Tabelas 4 e 5 relacionam os intervalos previstos para as cepas consideradas aceitveis como cepascontrole de qualidade. Alm disso, so apresentadas cepas adicionais que podem ser teis para realizar estudos de referncia.6,7,12
27
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11
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Apndice A. Meio RPMI-1640

RPMI-1640 meio tamponado com MOPS 0,165 mol/L, 1 L. 10,4g de meio RPMI-1640 em p (com glutamina e vermelho fenol, sem bicarbonato) 34,53g de tampo de MOPS (cido 3-[N-morfolino] propanosulfnico) Dissolver o meio em p em 900mL de H2O destilada. Acrescentar MOPS (concentrao final de 0,165 mol/L), agitando at dissolver. Enquanto mexer, ajuste o pH para 7,0 a 25 C usando hidrxido de sdio 1 mol/L. Acrescentar gua adicional para levar o meio a um volume final volume de 1 L. Esterilizar por filtragem e armazenar a 4 C at usar.
Apndice B. Padro de Turbidez de Sulfato de Brio McFarland 0,5

Para padronizar a densidade do inculo, utiliza-se uma soluo padro de turbidez de BaSO4 (Soluo Padro de McFarland 0,5). O processo consiste nos seguintes passos. (1) (2) Preparar a soluo padro de turbidez acrescentando 0,5mL de BaCl2 0,048 mol/L (1,175% w/v BaCl22H2O) a 99,5mL de H2SO4 0,18 mol/L (0,36 N) (1% v/v). Verificar a densidade correta da soluo padro de turbidez usando um espectrofotmetro com via de luz (light path) de 1cm e cubeta correspondente para determinar a absorbncia. A 625nm, a absorbncia dever ser de 0,08 a 0,10 para a soluo padro McFarland 0.5. Colocar de 4 a 6mL em tubos com tampas de rosca, do mesmo tamanho dos usados para cultivar ou diluir o inculo em cultura de caldo. Fechar bem os tubos e armazen-los em cmara escura, a temperatura ambiente. Agitar vigorosamente esse padro de turbidez num misturador de vrtex mecnico imediatamente antes de usar. Substituir as solues padro ou verificar novamente as densidades trs meses depois de preparadas.
(3) (4) (5) (6)
31
Apndice C. Diretrizes de Interpretao dos Testes de Sensibilidade In Vitro das Espcies de Candida
Agente Antifngico Fluconazol Itraconazol Flucitosina
*
Suscetvel (S) <8 < 0.125 <4
Sensibilidade DoseDependente (S-DD) 16-32 0.25-0.5 -
Sensibilidade Intermediria (I) 8-16
Resistente (R) 64 1 32
O quadro apresenta os pontos de corte (g/mL) contra os agentes indicados para as espcies de Candida. Quando as CIMs so mensuradas usando uma escala que produz resultados entre uma e outra categoria, a sensibilidade do isolado ser classificada na categoria imediatamente superior. Assim, um isolado com uma CIM de fluconazol de 12,5g/mL seria colocado na categoria S-DD. Notas de Rodap
*
Para fluconazol, estas diretrizes baseiam-se, substancialmente, em experincia com infeces de mucosa, mas so consistentes com as informaes limitadas existentes sobre infeces invasivas por Candida spp. Acredita-se que os isolados de C. krusei so intrinsecamente resistentes ao fluconazol, e que suas CIMs no devem ser interpretadas usando esta escala. Tambm pertinente que o limite superior de 8g/mL para a faixa suscetvel a fluconazol no conhecido com certezaos dados permitiriam a seleo de 4 ou 8g/mL para esse ponto de corte. Para itraconazol, os dados baseiam-se, totalmente, em experincia com infeces de mucosa, e no h dados disponveis que suportem os pontos de corte para as infeces invasivas por Candida spp. A sensibilidade depende de se atingir o nvel sangneo mximo possvel. Para fluconazol, podem ser necessrias doses de 400mg/dia, ou mais, para adultos com funo renal e caractersticas fsicas normais. Para itraconazol, podem ser necessrias medidas para garantir a absoro adequada da droga, podendo ser necessrio alcanar concentraes plasmticas de itraconazol de >0,5g/mL para se obter uma resposta tima. No h certeza quanto sensibilidade destes isolados, sendo que os dados disponveis no permitem sua classificao seja como sensveis seja como resistentes.
Esses pontos de corte foram adotados numa reunio do subcomit realizada em 1o de junho de 1996, em Reston, VA. Esses pontos de corte so considerados tentativos durante um ano e esto abertos a comentrios.
32
Tabela 1. Solventes e Diluentes para a Preparao de Solues Padro de Agentes Antifngicos

Agente Antifngico Solvente (Solues com Concentrao Mxima e Intermediria) DMSO* DMSO* DMSO* DMSO* DMSO* DMSO* gua Diluente (Concentraes Finais) Meio Meio Meio Meio Meio Meio Meio
Anfotericina B Cetoconazol Itraconazol Posaconazol Ravuconazol Voriconazol Fluconazol
Flucitosina
gua
Meio
Estes produtos so potencialmente txicos. Antes de usar quaisquer destes materiais, deve-se consultar as folhas de dados de segurana dos materiais (MSDS), que o fabricante do produto disponibiliza. *Dimetilsulfxido
33
Tabela 2. Esquema de Preparao de Diluies de Agentes Antifngicos Solveis em gua para Uso em Testes de Sensibilidade por Diluio em Caldo
Soluo Antimicrobiana Concentrao (g/mL) 5120 640 640 160 160 160 20 20 20 2,5 2,5 2,5 Fonte + = Concentrao Intermediria (g/mL) 640 g/mL 320 160 80 40 20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 = Concentrao Final de 1:10 (g/mL) 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 Log2
Passo
Volume (mL) 1 mL 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 1,0 0,5 0,5 1,0 0,5 0,5
Meio (mL) 7 1,0 3,0 1,0 1,5 3,5 1,0 1,5 3,5 1,0 1,5 3,5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Padro Passo 1 Passo 1 Passo 3 Passo 3 Passo 3 Passo 6 Passo 6 Passo 6 Passo 9 Passo 9 Passo 9
6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5
34
Tabela 3. Esquema de Preparao de Sries de Diluies de Agentes Antifngicos Insolveis em gua para Uso em Testes de Sensibilidade por Diluio em Caldo
Soluo Antimicrobiana Passo Concentrao (g/mL) 1,600 1,600 1,600 1,600 200 200 200 25 25 25 Fonte Volume (mL) + Meio (mL) = Concentrao Intermediria (g/mL)* 1.600 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,5 3,5 0,5 1,5 3,5 0,5 1,5 3,5 800 400 200 100 50 25 12,5 6,25 3,13 Concentrao Final de 1:100 (g/mL) 16 8.0 4,0 2,0 1,0 0,5 0,25 0.125 0.0625 0.0313 Log2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Padro Padro Padro Padro Passo 4 Passo 4 Passo 4 Passo 7 Passo 7 Passo 7
4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5
* Dimetilsulfxido Concentrao 2x
35
Tabela 4. Limites Recomendados para CIMs de 48 Horas para Duas Cepas de Controle de Qualidade e Quatro Cepas de Referncia para Testes de Diluio em Caldo. (De Pfaller MA, et al. Quality control guidelines for National Committee for Clinical Laboratory Standards
recommended broth macrodilution testing of amphotericin B, fluconazol, and flucytosine. J Clin Microbiol 1995;33:1104-1107; and Rex JH, et al. Quality control guidelines for National Committee for Clinical Laboratory Standards-recommended broth macrodilution testing of ketoconazol and itraconazol. J Clin Microbiol 1996;34:816-817.)
Organismo Candida parapsilosis ATCC 22019 Candida krusei ATCC 6258
Propsito CQ
Agente Antifngico Anfotericina B Fluconazol Itraconazol Cetoconazol 5FC Anfotericina B Fluconazol Itraconazol Cetoconazol 5FC Anfotericina B Fluconazol 5FC Anfotericina B Fluconazol 5FC Anfotericina B Fluconazol 5FC Anfotericina B Fluconazol 5FC
CQ
Candida albicans ATCC 90028 Candida albicans ATCC 24433 Candida parapsilosis ATCC 90018 Candida tropicalis ATCC 750
Referncia Referncia Referncia Referncia
Faixa de CIM* (g/mL) 0,25-1,0 2,0-8,0 0,06-0,25 0,06-0,25 0,12-0,5 0,25-2,0 16-64 0,12-0,5 0,12-0,5 4,0-16 0,5-2,0 0,25-1,0 0,5-2,0 0,25-1,0 0,25-1,0 1,0-4,0 0,5-2,0 0,25-1,0 0,12-0,25 0,5-2,0 1,0-4,0 0,12-0,25
% das CIMs dentro da Faixa 99,1 99,1 99,0 99,0 98,6 99,5 99,1 94,0 100,0 96,8 91,9 97,3 95,0 99,5 95,9 91,9 96,4 98,2 99,5 93,7 95,5 99,5
OBSERVAO: ATCC marca registrada da American Type Culture Collection.
36
Tabela 5. Limites Recomendados para CIMs de 24 e 48 horas para Duas Cepas de Controle de Qualidade para Microdiluio em Caldo. (De Barry AL, et al. Quality control limits for
broth microdilution susceptibility tests of ten antifungal agents. J Clin Microbiol. 2000; 38:3457-3459. Usado mediante autorizao da American Society for Microbiology and AL Barry.)
Faixas de CIM (g/mL) para testes de microdiluio

Organismo Candida parapsilosis ATCC 22019 Agente Antifngico Anfotericina B 5FC Fluconazol Itraconazol Cetoconazol Voriconazol Ravuconazol Posaconazol Anfotericina B 5FC Fluconazol Itraconazol Cetoconazol Voriconazol Ravuconazol Posaconazol Faixa 0,25-2,0 0,06-0,25 0,5-4,0 0,12-0,5 0,03-0,25 0,016-0,12 0,016-0,12 0,06-0,25 0,5-2,0 4,0-16 8,0-64 0,12-1,0 0,12-1,0 0,06-0,5 0,06-0,5 0,06-0,5 24 Horas 0,5 0,12 2,0 0,25 0,06/0,12 0,06 0,06 0,12 1,0 8,0 16 0,5 0,5 0,25 0,25 0,25 % dentro da Faixa 97 99 98 96 98 100 96 97 100 98 100 96 96 98 93 100 Faixa 0,5-4,0 0,12-0,5 1,0-4,0 0,12-0,5 0,06-0,5 0,03-0,25 0,03-0,25 0,06-0,25 1,0-4,0 8,0-32 16-128 0,25-1,0 0,25-1,0 0,25-1,0 0,25-2,0 0,12-1,0 48 Horas 2,0 0,25 2,0 0,25 0,12 0,06 0,06 0,12 2,0 16 32 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 % dentro da Faixa 92 98 99 98 98 100 98 99 100 99 100 100 99 100 100 99
Candida krusei ATCC 6258
OBSERVAO: ATCC marca registrada da American Type Culture Collection.
37
Tabela 6. Composio do Meio RPMI 1640 (com glutamina e vermelho fenol, mas sem bicarbonato)
Constituinte L-arginina (base livre) L-aspargina (anidra) L-asprtico, cido L-cistina 2HCI L-glutmico, cido L-glutamina Glicina L-histidina (base livre) L-hidroxiprolina L-isoleucina L-leucina L-lisina HCI L-metionina L-fenilalanina L-prolina L-serina L-treonina L-triptofano L-tirosina 2Na L-valina g/L de gua 0,200 0,050 0,020 0,0652 0,020 0,300 0,010 0,015 0,020 0,050 0,050 0,040 0,015 0,015 0,020 0,030 0,020 0,005 0,02883 0,020 Biotina D-pantotnico Colina, cloreto de Flico, cido Mioinositol Niacinamida PABA Piridoxina HCl Riboflavina Tiamina HCl Vitamina B12 Nitrato de clico H2O Cloreto de potssio Sulfato de magnsio (anidro) Cloreto de sdio Fosfato de sdio, dibsico (anidro) D-glicose Glutationa, reduzida Vermelho fenol, Na Constituinte g/L de gua 0,0002 0,00025 0,003 0,001 0,035 0,001 0,001 0,001 0,0002 0,001 0,000005 0,100 0,400 0,04884 6,000 0,800 2,000 0,001 0,0053
38
Tabela 7. Modificaes para Circunstncias Especiais *

Droga Anfotericina B Organismo Candida spp Modificao O uso do Meio Antibitico pode auxiliar na deteco de resistncia, mas esse meio no est padronizado, sendo possvel variabilidade substancial entre lotes. O uso de Base Levedura Nitrognio pode destacar o crescimento de C. neoformans e melhorar a relevncia clnica das CIMs dos agentes antifngicos. A suplementao do meio de teste para que contenha uma concentrao final de glicose de 20g/L pode simplificar a determinao do ponto final. Referncia Ver a Seo 3.7.1
,
Todas as drogas
C. neoformans
Todas as drogas
Todos os organismos
Essas modificaes no fazem parte da metodologia formal da Norma M27-A e a utilidade de cada modificao ainda no foi estabelecida. Esta tabela fornecida apenas como referncia para os laboratrios interessados em estudar adaptaes da Norma M27-A que possa aumentar sua utilidade em circunstncias especiais. Lozano-Chiu M, Nelson PW, Lancaster M, Pfaller MA, Rex JH. Lot-to-lot variability of antibiotic medium 3 when used for susceptibility testing of Candida isolates to amphotericin B. J Clin Microbiol. 1997;35:270-272. Pfaller MA, Buschelman B, Bale MJ, et al. Multicenter comparison of a colorimetric microdilution broth method with the reference macrodilution method for in vitro susceptibility testing of yeast isolates. Diagn Microbiol Infect Dis. 1994;19:9-13. Pfaller MA, Grant C, Morthland V, et al. Comparative evaluation of alternative methods for broth dilution susceptibility testing of fluconazol against Candida albicans. J Clin Microbiol. 1994;32: 506-509. Ghannoum MA, Ibrahim AS, Fu Y, Shafiq MC, Edwards JE, Criddle RS. Susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a microdilution technique. J Clin Microbiol. 1992;30:2881-2886. Rodriguez-Tudela JL, Martinez-Suarez JV. Improved medium for fluconazol susceptibility testing of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 1994;38:45-48.
39
Os procedimentos consensuais do NCCLS incluem o processo de recurso descrito, detalhadamente, na Seo 9 dos Procedimentos Administrativos. Para mais informaes, favor contactar os Escritrios Executivos ou visitar nosso website em www.nccls.org.
Resumo dos Comentrios e Respostas do Subcomit

M27-A: Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard Geral 1. Em relao s pginas 6, 7 e 8, a suspenso-padro de inculo de levedura em soluo salina diluda 1:100 e 1:20 ou 1:50 e 1:20 em caldo RPMI 1640, para a macrodiluio e microdiluio, respectivamente. Alternativamente seria mais conveniente, ex., 1:100 ou 1:50 ao invs de caldo RPMI 1640. Nossa comparao no mostra diferena nos valores de CIM usando quaisquer das duas diluies. Concordamos. No h razo para mudar os testes.
2. Em algumas normas do NCCLS, como as normas M7 e M27, h tabelas mostrando como dissolver os diferentes agentes antimicrobianos. Parte do material que est sendo usado como solvente (metanol, DMSO, etanol) pode ser perigoso. O DMSO, por exemplo, considerado um alergnio, uma substncia irritante e, quando aquecido, emite vapores txicos. E, o que mais importante, um produto que absorvido pela pele, levando consigo qualquer substncia nele dissolvida (1). Esses documentos tm uma declarao relativa as Precaues Universais, mas no uma declarao sobre segurana qumica. Sugiro que se inclua uma declarao sobre segurana qumica nesses documentos. Essa declarao, de preferncia, deveria ser includa na seo em que se recomenda o uso do material. A declarao foi acrescentada como nota de rodap na Tabela 1.
40
Resumo dos Comentrios dos Delegados e Respostas do Subcomit

M27-A2: Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved StandardSecond Edition Geral 1. As instrues sobre a determinao dos valores de CIM de fluconazol, itraconazol e 5FC so ambguas. Em um trecho sugere-se que se faa uma diluio para preparar soluo semelhante inibio = 80%, usando o controle de crescimento e, em outro lugar, se diz que a CIM = poo com a queda mais acentuada ou diminuio de crescimento. Na nossa experincia a determinao da CIM como = ao poo com a queda mais acentuada muito mais reprodutvel (tanto internamente quando entre observadores externos). Existem diferenas na determinao dos pontos finais para esses agentes quando testados pelos mtodos de macrodiluio versus microdiluio. O mtodo de macrodiluio pode ser lido como o primeiro tubo de ensaio no qual se v uma inibio de 80% em relao ao crescimento no tubo de controle. No possvel diferenciar entre inibio de 50% e 80% a ''olho nu'' quando se usa o mtodo de microdiluio e, por isso, a redao alternativa de diminuio acentuada.... Essas distines so explicadas no documento. A leitura da CIM na microdiluio para os azlicos e 5FC difcil e, aps muita discusso e investigao, o subcomit chegou descrio de que a melhor aproximao ao ponto final por meio de diminuio acentuada ou bvia do crescimento. Tambm declaramos que essa leitura visual prxima do que se encontra usando uma leitura espectrofotomtrica de inibio de 50%. Essas definies j foram bem descritas na literatura, incluindo numerosas publicaes do subcomit.
Seo 2.2 2. Parece-me estranha essa cifra exata de 182,6mg, a serem retirados alm do necessrio. Por que no arredondar para 182 ou 180? Esse apenas um exemplo e assim foi declarado.
Seo 2.3.2 3. Quando se usa filtragem, seria apropriado indicar qual meio e diluente podes ser usados, com base nas drogas. O subcomit no frisou a filtragem, mas, quando usada, no se exclui qualquer meio, especialmente RPMI , uma vez que o padro
Sees 3.7.3 e 3.7.5 4. A falta de correlao clnica est bem colocada. Entretanto, pode haver uma indicao implcita de que os testes de sensibilidade deveriam ser realizados para candidases orais. No tenho certeza com que freqncia seria recomendvel. O subcomit teve muito cuidado ao descrever as correlaes clnicas, bem como os casos em que os testes podem ser proveitosos. O subcomit acredita que os testes de isolados orais podem ser teis em casos que envolvam resposta subtima terapia.
41
Seo 3.8 5. Os poos nas fileiras de 1 a 10 contm diluies de drogas. Os poos na fileira 11 so usados para os controles de crescimento. Os poos na fileira 12 (no 11) podem ser usados como controles estreis. E os controles de DMSO? O esquema de diluio descrito assegura que haver menos de 1% de DMSO em quaisquer dos poos e, portanto, o DMSO no afetar o crescimento. Diminuio proeminente na turbidez parece arbitrria. Existe alguma maneira eletrnica para medir? Foi colocado que uma diminuio proeminente na turbidez determinada visualmente estar correlacionada com uma reduo de 50% na turbidez determinada por espectrofotmetro.
6.
Seo 4.8.3 7. Em relao "interpretao do ponto final,"h fotografias disponveis que mostrem as vrias pontuaes de inibio, de maneira a minimizar as diferenas de interpretao entre os observadores? Que tal um programa em CD-ROM? O subcomit considerou essa possibilidade, mas decidiu no incluir fotografias na presente edio. Existe um certo nmero de agentes novos para os quais essas fotografias poderiam ser necessrias; esses sero considerados para incluso em edies posteriores.
42
Publicaes Afins do NCCLS*

M2-A7 Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved StandardSeventh Edition (2000). Esta norma revisada contm uma atualizao das tcnicas, dos critrios interpretativos e dos parmetros de controle de qualidade recomendados para os testes de sensibilidade por disco. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved StandardFifth Edition (2000). Esta norma revisada contm uma atualizao dos mtodos usados para determinar as concentraes inibitrias mnimas (CIM) contra bactrias aerbicas mediante macrodiluio , microdiluio e diluio em gar. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved StandardFifth Edition (2001). Fornece mtodos de referncia para determinar as concentraes inibitrias mnimas (CIM) contra bactrias anaerbicas mediante macrodiluio , microdiluio e diluio em gar. Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria and Quality Control Parameters; Approved GuidelineSecond Edition (2001). Discute os dados necessrios e recomendados para a seleo de padres de interpretao e diretrizes de controle de qualidade apropriado para os novos agentes antimicrobianos. Antimycobacterial Susceptibility Testing; Tentative StandardSecond Edition (2000). Este documento contm recomendaes relativas aos meios de cultura mais comuns e padronizao das concentraes de drogas, assim como um mtodo para padronizar as diluies de inculo e pontos finais claramente definidos para os testes de sensibilidade de organismos similares a tuberculose. Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections; Approved GuidelineSecond Edition (2001). Este documento fornece orientao relativa aos riscos de transmisso dos vrus da hepatite e vrus da imunodeficincia humana em qualquer contexto laboratorial e s precaues especficas para prevenir a transmisso laboratorial de infeces transmitidas pelo sangue por instrumentos e materiais de laboratrio; bem como recomendaes sobre a conduta em casos de exposio a microorganismos transmitidos pelo sangue. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard (2002). Este documento trata da seleo de agentes antifngicos; preparao de solues padro e diluies de agentes antifngicos para os testes; implementao e interpretao dos testes; e dos requisitos de controle de qualidade para os testes de sensibilidade dos fungos filamentosos (bolores) que causam infeces fngicas invasivas.
Documentos propostos e tentativos esto sendo apresentados atravs do processo consensual do NCCLS; portanto, os leitores devero se reportar s edies mais recentes.
M7-A5
M11-A5
M23-A2
M24-T2
M29-A2
M38-A
43
ANOTAES
44
NCCLS 940 West Valley Road Suite 1400 Wayne, PA 19087 USA FONE 610.688.0100 FAX 610.688.0700 E-MAIL: exoffice@nccls.org WEBSITE: www.nccls.org ISBN 1-56238-469-4

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M27-A2 Vol. 22 No. 15 Substitui a Norma M27-A Vol. 17 No.

M27-A2 ISBN 1-56238-469-4 ISSN 0273-3099

Norma AprovadaSegunda Edio

ISBN 1-56238-469-4 ISSN 0273-3099

Clinical Microbiology Institute Wilsonville, Oregon NCCLS Wayne, Pennsylvania NCCLS

Lois M. Schmidt, D.A. Oficial de Ligao Tracy Ann Dooley, M.L.T.(ASCP) 2

Gerente do Projeto Patrice E. Polgar Editor Donna M. Wilhelm Editor Assistente

Wayne, Pennsylvania NCCLS Wayne, Pennsylvania NCCLS Wayne, Pennsylvania

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(em 1o de julho de 2002)

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Akershus Central Hospital and AFA (Norway) Albemarle Hospital (NC)

Geisinger Medical Center (PA) Grady Memorial Hospital (GA)

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Clendo Lab (Puerto Rico)

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Enfoque de Sistema de Qualidade

Laboratrio de Patologia Clnica

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750 g/mg (Potncia) = 107,0 mL 1280 g/mL (Concentrao desejada)

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Agentes Antifngicos Insolveis em gua

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As metas do programa de controle de qualidade so monitorar os seguintes elementos:

Os fabricantes so responsveis pelos seguintes elementos:

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ATCC marca registrada da American Type Culture Collection.

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(4) (5) (6) (7)

(5) (6) (7)

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(4) 4.7 4.7.1

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Apndice A. Meio RPMI-1640

Apndice B. Padro de Turbidez de Sulfato de Brio McFarland 0,5

(3) (4) (5) (6)

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Suscetvel (S) <8 < 0.125 <4

Sensibilidade DoseDependente (S-DD) 16-32 0.25-0.5 -

Sensibilidade Intermediria (I) 8-16

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Tabela 1. Solventes e Diluentes para a Preparao de Solues Padro de Agentes Antifngicos

Anfotericina B Cetoconazol Itraconazol Posaconazol Ravuconazol Voriconazol Fluconazol

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Organismo Candida parapsilosis ATCC 22019 Candida krusei ATCC 6258

Referncia Referncia Referncia Referncia

OBSERVAO: ATCC marca registrada da American Type Culture Collection.

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Faixas de CIM (g/mL) para testes de microdiluio

Candida krusei ATCC 6258

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