Bactriologie des eaux

Bactriologie des eaux Plan I. Les mthodes gnrales de prlvement et analyses II. Dnombrement des germes tmoignant dune pollution fcale: II.1 Coliformes totaux II.2 Coliformes fcaux II.3 Streptocoques fcaux II.4 Clostridiums sulfito-rducteurs III. Recherche et dnombrement des germes pathognes IV. Principaux maladies transmission hydrique

Bactriologie des eaux Introduction :

Lobjectif de lanalyse bactriologique dune eau nest pas deffectuer un inventaire de toutes les espces prsentes, mais de rechercher soit celle qui sont susceptibles dtre pathognes, soit celles qui sont indicatrices de contamination fcales. Lanalyse dbute par lacte de prlvement qui doit mettre en uvre des mthodes assurant labsence de contamination et la survie bactrienne. Sont indiques ensuite les mthodes gnrales dexamen bactriologique des eaux suivies des recherches de bactries indicatrices de pollution et defficacits de traitement puis des bactries spcifiques pathognes.

I.mthodes de prlvement :
I.1 Matriel de prlvement : flacon en verre (borosilicat de prfrence) de 250 1000 ml. flacon en plastique usage unique striliss par le fabriquant. Appareils de prlvement : Plongeur et canne prlvement : utilis en cas de prlvement d une eau dun puits, au centre dun cours deau, en profondeur dans un lac. I.2 Mode de prlvement En fonction de la nature des eaux analyses et celle des micro-organismes recherchs, les normes fixent des conditions respecter (volume de lchantillon, agent neutralisant, qualit du matriel dchantillonnage..) Lobjectif est dobtenir un chantillon aussi reprsentatif que possible de leau examiner, sans contaminer ni modifi lchantillon. Des prcautions doivent tre prises trois niveaux: Le matriel de prlvement Le mode de prlvement

Le transport la conservation des chantillons

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II. Mthodes gnrales de dnombrement : II.1 Mthodes de dnombrement en milieu solide II.1.1 Mthode par incorporation : Principe : Lchantillon deau analyser est mlang au milieu de culture solide pralablement fondu et refroidi une T proche de la T de solidification. Aprs incubation, les colonies qui se dveloppent la surface et lintrieur du milieu sont comptes. Mode opratoire :
3) faire un mouvement de rotation

2) Incorporer le milieu en surfusion 1) volume d'eau ensemencer ( 1ml)

Incuber Faire le dnombrement des colonies dveloppes la surface et lintrieur du milieu de culture. II.1.2 Mthode par talement : Principe: Lchantillon deau analyser est tal la surface dun milieu glos sans trace dhumidit: aprs incubation, les colonies qui se dveloppent la surface sont dnombres. Mode opratoire :
Etaleur strile (rteau)

Volume d'eau ensemencer :0.1 ml

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Incuber Dnombrer les colonies dveloppes la surface. II.1.3 Mthode par filtration : Principe : Lchantillon deau analyser est filtr Travers une membrane qui retient les micro-organismes. La membrane est ensuite place sur un milieu glos. Durant lincubation, des colonies se forment la surface de la membrane.

II.2 mthodes de dnombrement en milieu liquide Principe gnrale : Les prises dessais de lchantillon deau ou de ses dilutions sont incorpores dans un milieu liquide conu Pour permettre la croissance dun microorganisme ou de groupe de microorganismes. La croissance se traduit par lapparition dun trouble du milieu et, ventuellement, une modification visible (virage dun indicateur de pH color). II.2.1 Mthode du nombre le plus probable : Principe : Cette mthode est une estimation statistique du nombre de micro-organisme supposs distribus dans leau de manire parfaitement alatoire. Lestimation de la densit bactrienne est obtenue par application du principe de vraisemblance, partir de rponses positives observes pour une ou plusieurs dilution successives de la suspension bactrienne originelle. Il sagit dune mthode quantique et non pas numratif.

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Mode opratoire : On ensemence des dilutions successives de leau analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) raison de 3 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution (jusqu 96 puits en cas de manipulation en micro plaque). On notera le nombre de tubes inoculs prsentant une culture visible indiquant la prsence dau moins dun micro-organisme. Il doit tre tenu compte que si labsence de culture correspond labsence de micro-organisme, plus dun micro-organisme peut tre responsable dune culture positive. Les tables, en fonction du nombre caractristique (nombre de puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance). III. Dnombrement des germes tmoignant dune pollution fcale: Notion dindicateur : Il nest pas actuellement possible de rechercher systmatiquement tous les germes pathognes susceptibles dtre prsents dans leau, tant donn leur varit et lirrgularit de la prsence ; ainsi qui la diversit et le cout des analyses quil convient de mettre en uvre pour les dtecter. Nanmoins, comme lorigine de la plupart des micro-organismes pathognes vhiculs par leau est fcale, le principe du contrle de la qualit de leau repose sur la dmonstration que leau distribue ne contient pas de germes provenant de contamination fcale. Pour cela, on recherche des indicateurs de contamination fcale, appels aussi germes tmoins de contamination fcale. On parle galement dindicateurs de traitement qui permettent dvaluer lefficacit des diffrents traitements de potabilisation mis en uvre vis--vis de diffrents germes. Ces indicateurs doivent rpondre des exigences de nature : Epidmiologique : il doit exister une relation entre un indicateur et lapparition dinfection dans une population. Ecologique : il doit tre spcifique dune contamination fcale : systmatiquement rencontr lorsquil y a prsence de fces danimaux sang chaud et toujours absent dans les milieux non pollus. Il doit tre sensible : il doit tre mis en vidence dans leau lorsque des pathognes sont prsents, et ce en grand nombre.

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Bactriologique : il ne doit pas se multiplier dans leau. Technique : il doit tre facile et rapide dtecter, et ce, moindre cout. III. 1 Dnombrement des micro-organismes revivifiables : Dfinition : Bactries, Levures, Moisissures se dveloppant en arobiose, lorsque lessai est effectu selon la mthode spcifie. Le principe consiste mettre en vidence les bactries Qui se dveloppent 20C favorisant ainsi les germes spcifiques de leau Et celles qui se dveloppent 37C favorisant ainsi les germes issus de lhomme et des animaux sang chaud. Intrt : Le dnombrement des germes revivifiables est utilis comme indicateur de pollution : dans les milieux de trs bonne qualit microbiologique pour contrler une possible contamination bactrienne. Ce sont essentiellement des eaux souterraines des nappes profondes qui seront contrles. Dans lusine de potabilisation, il permet de contrler lefficacit des diffrentes tapes du traitement. dans les rseaux : une augmentation de la concentration bactrienne aprs la station de traitement peut tre le signe dune multiplication bactrienne dans le rseau ou dune intrusion de bactries lintrieur de celui-ci. Dans les rservoirs et chteaux deau, on suit les effets du stockage et de la stagnation sur la qualit de leau et sur la reviviscence des germes III.2 Dnombrement des coliformes totaux et fcaux : Dfinitions : Les coliformes totaux : correspondent des bacilles Gram ngatif, non sporul, oxydase ngatif, arobie et anarobie facultatifs, capables de se multiplier en prsence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de dacide et de gaz en 48h une temprature de 35- 37C.

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Ils se rpartissent en fait en deux catgories : Les germes dorigine fcale stricte : Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia. Les germes provenant dautre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella terrigena. Les coliformes fcaux ou thermotolrants : prsentent les mmes proprits mais qui ils se dveloppent 44C dont lorigine fcale est plus nette. Escherichia coli prsum : correspond des coliformes thermotolrants qui produisent de lindole partir du tryptophane 44C.cet indicateur est le plus spcifique dune contamination fcale. Intrt : Dans leau, ils perdent leur viabilit plus lentement que la majorit des bactries pathognes et intestinales et constituent donc un bon indicateur de contamination fcale de leau de premire importance. De plus, leur rsistance aux agents dsinfectants, et notamment au chlore, est voisine de la rsistance des bactries pathognes ; ils vont donc constituer de bons indicateurs defficacit de traitement. Recherche et dnombrement des coliformes totaux 37C cet examen est intressant pour juger de lefficacit de la dsinfection dune eau est dun intrt moindre pour dceler une contamination fcale sure La recherche et le dnombrement des coliformes thermotolrants ou fcaux 44C : la prsence de coliformes thermotolrants signe lexistence quasi certaine de la contamination fcale. La recherche et le dnombrement des seules Escherichia coli ou prsums : parmi les coliformes thermotolrants, Escherichia coli est lespce la plus reprsente dans la flore intestinale de lhomme et des animaux. III.3 Recherche et dnombrement des streptocoques fcaux ou Entrocoques Dfinition : bactries Gram positif, sphriques ou ovodes, formant des chainettes, non sporules, catalase ngative, possdant lantigne D,

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cultivant en anarobiose 44C, et pH 9.6, et capables dhydrolyser lesculine en prsence de bile. Ils se rpartissent en deux genres streptococcus et enterococcus. Intrt : Lapport des entroques par rapport aux coliformes consiste en leur plus grande rsistance dans les eaux naturelles ; leur prsence serait donc le signe dune contamination fcale de leau plus ancienne. La rsistance des entrocoques aux agents dsinfectant est galement plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes, et est comparable celle des entrovirus. cette proprit pourrait permettre aux entrocoques de mieux reprsenter la contamination virale dune eau. Par contre une partie des espces est peu spcifiques des contaminations fcales. On retrouve par exemple Streptococcus feacalis var liquefaciens dans lenvironnement, sur les vgtaux ou sur des sols non contamins. III.4 Recherche et dnombrement des spores de bactries des anarobies sulfitorductrice et de clostridium sulfitorducteurs Dfinitions : Spores de bactries anarobies sulfitorductrices : formes de rsistance de micro-organismes se dveloppant en anarobiose 37C 1 en 24h et ou 48h en glose viande foie et donnant des colonies typiques rduisant le sulfite de sodium. Spores de clostridium sulfitorducteurs : mme dfinition que la prcdente pour des bacilles Gram positif, ne possdant pas de catalase et ayant laspect morphologique des clostridium.

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INTERET : Les bactries anarobies sulfito-rductrices ou les clostridium sulfito-rducteur voire encore Clostridium perfringens ne sont pas tous des indicateurs de contamination fcale. Clostridium perfringens bien queffectivement prsent dans les matires fcales, est un germe assez ubiquiste. Lintrt de la recherche de tels indicateurs rside dans la proprit qu'ils sporuler, ce qui les rend particulirement rsistant aux traitements de dsinfection. Ils sont actuellement considrs comme de bons indicateurs de lefficacit des traitements vis--vis des parasites et en particulier de Cryptosporidium. Mthode de dnombrement des germes de contamination fcale et defficacit de traitement : (voire tableau)
analyse Volume de Milieu PE utilis -organismes Incorporation 1ml Glose revivifiables en milieu lextrait de solide levure Coliformes filtration 100ml Glose totaux lactose au TTC Coliformes filtration 100 ml Glose fcaux lactose au TTC Streptocoques filtration 100 ml Glose fcaux Slanertz et Bartely Colstridium Incorporation 20 ml Glose sulfitorducteurs en milieu tryptone solide sulfite au cyclosrine technique T dincubation 37C ET 20C confirmation -

37C

Colonies typique OXColonies typiques Colonies typiques +Litsky Colonies typiques

44C

37C

37C

IV. recherche des germes pathognes : IV.1 Recherche de salmonella Dfinition : Les Salmonelles sont: Des bacilles Gram ngatifs

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(x) la temprature de 36 2C en 24 48 h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses contours rguliers, pigmentes en vert ou en bleu vert centre noir. Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoidiques (Hautement pathognes) et les non typhoidiques. (voir cours). Mthode de recherche : (voir schmas)

Pr-enrichissement

Enrichissement primaire

Enrichissement secondaire

Lecture et interprtation : Reprer les colonies caractristiques. Faire une identification biochimique base essentiellement sur ONPG, TSI, Ure -Indole, LDC Si ncessaire faire une identification antignique base essentiellement sur lagglutination laide des srums de groupe OMA et OMB ou bien sadresser au laboratoire de rfrence. IV.2 Recherche de Vibrion cholirrique : Dfinition : Les Vibrionacae sont : Bacille Gram ngatif droits ou incurvs, Trs mobiles,

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Oxydase (+), AAF, Fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S, Hautement pathognes. Mthode recherche :(voir schmas)

IV.3 Recherche de Staphylocoques coagulase positive : Dfinition : On entend par Staphylocoques coagulase (+): Cocci Gram (+) Isoles ou en grappes de raisin, Catalase (+) et coagulase (+) (x) en 24 48 h 36 2C sur un milieu slectif Chapman au mannitol. Lespce type du genre est Staphylococcus aureus. Elle est pathogne et trs redoute.

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Mthode de recherche : (voir schmas)

IV. 4 Recherche de Pseudomonas aeruginosa Dfinition : Pseudomonas aeruginosa est: Un bacille Gram ngatif Oxydase (+) Capable de produire de lammoniac partir de lactamide. Pseudomonas aeruginosa, est galement une bactrie hautement pathogne et rsistante plusieurs antibiotiques.

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Mthode de recherche : ( voir schmas)

V. Critres microbiologiques dune eau potable

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VI .Principaux maladies transmission hydrique :