MODULO 1 - Preparacion de Implementos para El Lab Oratorio de Microbiologia

Microbiologa para dispositivos mdicos
PREPARACION DE IMPLEMENTOS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Edgar De Jess Mrquez Celedn

Microbilogo Universidad Libre
PREPARACION DE IMPLEMENTOS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Contenido programtico: Generalidades Materiales de uso general y volumtricos Equipos Cepas de referencias Medios de Cultivos Otros utensilios
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Edgar De Jess Mrquez Celedn Microbilogo Universidad Libre
GENERALIDADES
En laboratorio de microbiologa encontramos mltiples materiales y equipos, los cuales pueden cumplir una sola o varias funciones.
El laboratorio contar con los equipos, instrumentos y medios de medicin, incluyendo sus materiales de referencia, requeridas para el correcto desempeo de los ensayos. Antes de utilizar cada material o equipo se debe recibir una orientacin o instruccin del uso adecuado de este. Utilizar los materiales y equipos con toda seguridad de lo que se va hacer con estos, de lo contrario no utilizarlos. Ubicarlos en sitios en los cuales sea de fcil acceso el obtenerlos e identificar el sitio donde se encuentran, evitar la contaminacin cruzada.
GENERALIDADES
El laboratorio debe estar provisto de todos los equipos y materiales necesarios para la correcta ejecucin del ensayo. Antes de poner en servicio el equipo debe ser verificado o calibrado antes de su uso. Como parte de un sistema de calidad, el laboratorio debe documentar e implementar programas e instructivos para la limpieza-desinfeccin, mantenimiento, calibracin y/o verificacin y esterilidad de los equipos (cuando sea necesario). Debe estar inequvocamente identificado cada equipo, medio de cultivo y reactivo con su soporte lgico utilizado para los ensayos (incluido su estado de calibracin).
Debe haber registros de cada componente del equipamiento (manual del usuario) y su soporte lgico (instructivo de su uso).
CLASIFICACIN
A) Material de uso general: Material de vidrio o plstico (Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.), hisopos, asas de siembra, gradillas, esptula, agitadores, etc. B) Equipos: Estufas, autoclaves, baos termostticos, refrigeradores, congeladores, cabinas de seguridad biolgica, equipos de filtracin, incubadoras, horno, etc. C) materiales volumtricos: pipetas, sembradores en espiral calibrados, bureta, probeta, etc. D) Instrumentos de medida: termmetros, cronmetros, balanzas, medidor de pH, etc. E) Material de uso microbiolgico: Medios de cultivos, cepas de referencia, reactivos, indicadores biolgicos, etc.
Para una correcta realizacin del trabajo de prcticas es necesario familiarizarse con los nombres, manejo, aplicaciones, fundamento del material de laboratorio, etc.
Los materiales o equipos son de distintas naturaleza, al momento de emplear un reactivo, medio de cultivo, etc., en los diversos anlisis o prueba qumica. Debemos de saber que efecto causa esta sustancia al material o equipo a emplear.
Vidrio Madera
Metal
Plstico Porcelana
Otros
MATERIALES
DE LABORATORIO
Ejercen una gran importancia en la calidad de los resultados finales por ello se debe tener en cuenta:
Deben ser Resistentes al calor Deben soportar los cambios bruscos de temperatura, la influencia de los qumicos, y las rupturas. Se deben establecer procedimientos de lavado para que el material este libre de contaminantes o residuos de tipo qumico o biolgico que puedan alterar la confiabilidad de los resultados.
Tubo de ensayo y gradilla
Matraz Erlenmeyer
Vaso de precipitado
Kordack
Agitador Vidrio de reloj Escobilln Soporte universal Asa bacteriolgica Porta objeto y cubre objeto
Cajas de petri y caja de petri kodak
Mechero de alcohol, pinza y encendedor.
Agua destilada
Bolsa Whirl-pak
Probeta Equipo de filtracin y papel milllipore
Mechero Bunsen
MATERIAL DE USO GENERAL Y EQUIPOS

VOLUMTRICOS
Reutilizable
Un solo uso
Vidrio
Cajas Petri Tubos de ensayos tapa rosca Becker Erlenmeyer Pipetas Buretas Probeta
Papel
Papel kraft Papel absorbente Papel microporoso Papel aluminio Millipore Papel filtro
Metal

Plstico

Gradilla Asa en punta o en aro Pinzas (punta garfio, estras, plana) Tijeras Esptula
Cajas de Petri kodak Bolsas whisplas Bolsas ziplock Pipeta Pasteur Bandeja Gradilla
Reutilizable
Un solo uso
Otros

Reactivos
Mechero (alcohol, Bunsen) Tijera para cortar papel Indumentaria personal (bata, pantaln) Guante trmico Cronometro
Agentes qumicos desinfectante
Alcohol 70%
Azul lactofenol Aceite de inmersin
Plstico
Balde Becker Probeta Pinzas
Otros

Los materiales que permitan un proceso de esterilizacin pueden ser reutilizados
Cinta de enmascarar Cinta adhesiva Cinta indicadora fsica y qumica Algodn Gasa Agua destilada Hisopos Gorro y Tapa boca
MATERIAL
REUTILIZABLE
El material que ser reutilizado debe de estar separado y ubicado en un rea, en donde se realizara el proceso para ser usado nuevamente. Todos los materiales antes de ser reutilizados deben de pasar por un proceso que reduzca la carga microbiana.
Lavar
Desinfectar o esterilizar
utilizar
Para definir que proceso sirve para disminuir la carga microbiana, es necesario saber la naturaleza del material para optar por uno.
PROCESOS COMUNES DE REUTILIZACIN DE

MATERIALES
Materiales
Cajas de Petri, pipetas, equipo de filtracin por membrana, Erlenmeyer Tubos de ensayos Tijeras, pinzas Gradillas, esptula Plstico Bandejas, Becker, probeta Cajas de Petri kodak, guantes Otros Indumentaria personal (guante, bata, polainas, pantaln, tapa boca, etc.)
Limpieza
Desinfeccin o Esterilizacin
Vidrio
Agua mas jabn liquido y hipoclorito de sodio Agua mas jabn y hipoclorito de sodio pao hmedo Pao hmedo Agua mas jabn liquido o detergente en polvo ---
Autoclave o horno
Autoclave Alcohol al 70%, autoclave o horno ---
Metal
--Oxido de etileno o U.V.
Agua mas detergente (bata y pantaln)
Oxido de etileno
DESCONTAMINACIN
Es un trmino que se usa para describir los procesos o tratamientos que se realizan para garantizar que un dispositivo, instrumento, equipo o superficie resulte seguro de manejar. Dichos procesos de descontaminacin abarcan desde la esterilizacin hasta las actividades de limpieza con agua y jabn.
LIMPIEZA: Conjunto de operaciones destinadas a eliminar la suciedad adherida a una superficie, sin alterar a sta.
JABON DETERGENTE
DESINFECCIN: Es la reduccin en mayor o menor medida de la poblacin microbiana mediante el empleo de ciertos productos qumicos.
DESINFECTANTES ANTISEPTICOS
ESTERILIZACIN: Es la accin de eliminar todo microorganismo, incluso capaz de eliminar esporas.
AGENTES FSICOS: Calor seco (estufas, hornos), calor hmedo (vapor de agua autoclave), radiaciones ionizantes (rayos gammas, electrones), filtracin por membrana, incineracin. AGENTES QUMICOS: Plasma, gases (perxido/peractico, formaldehido, oxido de etileno)
OBSERVACIONES
Y RECOMENDACIONES
Materiales esterilizables
Envolver el material a esterilizar con un papel que permita una esterilizacin adecuada (no aplica U.V.) (doble envoltura) Nunca esterilizar sin limpiar o desinfectar. antes
Calor hmedo (autoclave) Calor seco (horno) Oxido de etileno Radiaciones ionizantes (U.V.)
Identificar con cinta indicadora el material.

Almacenar el material estril en un lugar que permita mantener esta condicin.
Tener conocimiento sobre el fundamento y funcionamiento del proceso utilizado para esterilizar.
Controlar el esterilizacin proceso de
Los instrumentos de medida nos permiten recolectar datos de forma cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa. Los equipos de laboratorio son aparatos que nos permiten, mantener y variar condiciones ambientales, determinar parmetros de sustancias y metabolitos, entre otras aplicaciones.
Validacin Certificacin
Calificacin
Verificacin Calibracin
Garantizan el buen funcionamiento del equipo o instrumento de medida
CALIBRACIN, CERTIFICACIN/VALIDACIN
Validacin de los mtodos de ensayos
Programa de calibracin
Ensayo biolgico (opcional)
Programa de calibracin
Equipo Producto
Instrumento medidor calibrado
Programa de Mantenimiento
Nacional o internacional
Verificar las condiciones mecanico-electricas y estado fsico, POEs
El laboratorio debe establecer un programa
para la calibracin y/o verificacin de los equipos que tengan una influencia directa en los resultados de los ensayos.
La frecuencia de estas calibraciones y/o

verificaciones se establecer en funcin de la experiencia documentada y se basar en el uso, tipo y resultados previos de las calibraciones de los equipos.
Los equipos bajo el control del laboratorio
que requieren una calibracin deben ser rotulados y identificados de alguna manera para indicar el estado de calibracin, incluida la fecha en la que fueron calibrados por ltima vez y su fecha de vencimiento o el criterio para la prxima calibracin.
DIRECTRICES
Tipo de equipo
Balanza
Calibracin
Requisito Calibracin plenamente trazable Frecuencia anualmente
Puesta en servicio y verificacin

Requisito Ajuste a cero y verificacin con la pesa control a) Verificar estabilidad y uniformidad de la temperatura b) Verificar la temperatura c) Verificar el tiempo Frecuencia Diariamente o con cada uso
Mantenimiento
Requisito a)limpiar b)Revisar Frecuencia a) con cada uso b) Anualme nte Mensual
Autoclave
Termmetro y manmetro: Frente a un patrn de referencia
anualmente
a) Inicialmente , cada 2 aos y luego de una reparacin o modificacin b) Con cada uso. c) semestralm ente
Verificar visualmente la junta, limpiar/dren ar la cmara
Microscopio
Calibracin trazable al micrmetro (cuando sea apropiado)
Inicialmente
Limpieza de objetivo
Semestral
Tipo de equipo
Incubadora, refrigerador, congelador, etc.
Calibracin
Requisito Termmetro : Frente a un termmetro de referencia en punto de congelacin y/o rangos de temperatura de trabajo Manmetro: frente a uno de referencia Filtro hepa U.V. Frecuencia Anualmente
Puesta en servicio y verificacin

Requisito a) Verificar la estabilidad y uniformidad de la temperatura b) Verificar la temperatura Frecuencia a) Inicialmente , cada 2 aos y luego de una reparacin o modificacin b) Diariamente o con cada uso. a) Inicialmente y luego de una reparacin o modificacin b) Mensualmen te.
Mantenimiento
Requisito Limpiar las superficies internas y desinfectar si es necesario Frecuencia Cada 15 das
Cabina de flujo laminar
Anualmente
Radimetro: medir la intensidad
a) Verificar las caracterstic as tcnicas b) Verificar la esterilidad
Revisin /cambio de filtros
Anualmente
EQUIPOS
Dentro del laboratorio de microbiologa diversos equipos que nos permiten:

existen
Preparar material a utilizar en los ensayos. Equipos utilizados para los ensayos. Equipos para realizar diagnsticos.
Autoclave, estufa y horno Balanza
Incubadora, refrigerador y congelador
Equipos de uso frecuente e importantes
LABORATORIO
Cabina de seguridad biolgica y Microscopio pHmetro Contador microbiolgico
CRITERIOS TCNICOS PARA LA ADQUISICIN DE LOS EQUIPOS
Adquirir el equipo o instrumento cuya especificacin determine la funcin que va ha desempear Elegir el proveedor que garantice asistencia tcnica, mantenimiento y existencia de repuestos
Facilidad en la operacin del equipo

Capacidad de acuerdo a volumen de trabajo
Fcil limpieza, ajuste y calibracin

Proveedores de marcas comerciales reconocidas
AUTOCLAVE (CALOR
HMEDO)
Fundamento
El autoclave es un recipiente en el que se consigue exponer el material a esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullicin del agua, gracias a aumentar la presin.
El proceso completo de esterilizacin en un autoclave se compone de diferentes fase:
Fase de purgado Fase de esterilizacin Fase de descarga
Aplicaciones Sirve para la esterilizacin de material de laboratorio, medios de cultivos frescos y contaminados.
Condiciones de esterilizacin
Temperatura: 121 -123C (250-254F) Presin: 15 psi Tiempo de exposicin:
10-15 min instrumentos 20 -30 min caldos-liquidos y agar (menos de 800ml)
El tiempo de exposicin depende de que tan llena este la cmara de la autoclave, muy llena mas tiempo
PROCEDIMIENTO
Agregar agua destilada suficiente dentro de la cmara, la cual debe de cubrir la resistencia, pero no sobrepasar el soporte de la olla. Se carga el autoclave con el material a esterilizar y se aprieta la tapa manteniendo la vlvula de descarga abierta (vertical). Tener mucho cuidado en el momento de cerrar la tapa del autoclave ya que la manguera de la vlvula debe de coincidir con la seal que se encuentra en la parte exterior del autoclave. Se enciende el autoclave y se aumenta la temperatura al mximo. Cuando el agua hierva, fluir el vapor por la vlvula de descarga. Se deja que salgan libremente el aire y el vapor hasta que se haya eliminado todo el aire (se observa la salida de gotas de agua por la vlvula). Cuando se haya alcanzado esta fase, se cierra la vlvula de descarga airevapor.
PROCEDIMIENTO (CONT.)
La presin del vapor se eleva en la cmara hasta 15 psi y al mismo tiempo la carga va alcanzado la temperatura requerida de 121C. Una vez se alcanza estas condiciones, se mantiene la presin segn el tiempo de exposicin considerado. Al termino del periodo de esterilizacin, se apaga el calentador y se deja que el manmetro llegue a 0 y simultneamente se enfra. Cuando el indicador llegue a 0 se deja reposar por 15 min y se abre la vlvula. Se espera que el material se enfre hasta que tenga una temperatura a la cual pueda cogerse con las manos. Nunca se debe dejar enfriar el autoclave por mucho tiempo, ya si no se abre se forma un vaco, el cual puede romper el material estril.
RESUMEN
Fase de purgado
DEL PROCESO
Llenado del autoclave con agua destilada y material a esterilizar. Tapado y encendido de la olla con la vlvula de purgado abierta.
Fase de esterilizacin
Se cierra la vlvula de purgado una vez alcanzado la temperatura de ebullicin (gota en la vlvula) Alcanzada las condiciones de esterilizacin (121C-15psi), se mantiene segn tiempo de exposicin.
Fase de descarga
Finalizada la fase de esterilizacin se apaga el autoclave y se deja que la psi llegue a 0. Cuando el indicador llegue a 0, se abre la vlvula y luego la tapa dejando reposar el material esterilizado antes de sacarlo.
RECOMENDACIONES
Para que la esterilizacin de medios de cultivo sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el lquido.
Los recipientes con cierre hermtico deben ser introducidos en el autoclave sin cerrar totalmente el tapn, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Los recipientes vacos precisan de un tiempo de esterilizacin mayor que los recipientes con lquido en su interior Hay que tener en cuenta que algunas substancias qumicas son termolbiles a las temperaturas de esterilizacin con autoclave. En esos casos es preciso utilizar otros sistemas de esterilizacin, como el filtrado. Colocar cinta indicadora al material a esterilizar.
PRECAUCIONES
Y CUIDADOS
Los autoclaves deben poseer manmetro y termostato, as como vlvula de seguridad, sistema de desconexin rpido y la purga del vapor ha de realizarse a un recipiente estanco y con agua, jams directamente al exterior.
Siempre utilizar equipo de proteccin para las manos y rostro. No abrir jams si el manmetro no est a 0 y la purga no ha sido abierta. Controlar una vez al mes su capacidad de desinfeccin mediante esporas, no siendo suficiente el mtodo qumico. El agua debe ser cambiada regularmente.
No esterilizar solventes o qumicos corrosivos Si se esterilizan lquidos, bajar la presin lentamente y dejar enfriar los recipientes dentro de la autoclave Se esterilizan mejor los lquidos si se dividen en pequeos recipientes que en uno grande (> 1 lt) Una buena esterilizacin por autoclave depende de la eliminacin de todo el aire de la cmara y la carga, Materiales que van a esterilizarse deben colocarse sin apretarse dejando grandes espacios de aire alrededor de cada recipiente. Los artculos limpios pueden ponerse en cestillos de alambre, pero el material contaminado debe estar en un recipiente de fondo slido. Nunca olvide que el equipo es potencialmente peligroso, as que debe de manejarlo con mucho cuidado.
CONTROL
DEL PROCESO DE ESTERILIZACIN
Evaluacin con sterikon

Colocar las ampollas de Sterikon en la autoclave a evaluar. Para evitar contaminacin en caso de ruptura fortuita de la ampolla se recomienda situar esta en un vaso de precipitado. Las ampollas deben colocarse en aquellos sitios donde de acuerdo con la experiencia existan las condiciones de esterilizacin ms desfavorables, es decir, en el espacio inferior y medio de la autoclave Despus de la esterilizacin se toman las ampollas y se incuban a 63C +/-2C durante 24 horas. Como control debe incubarse simultneamente una ampolla no esterilizada.
HORNO (CALOR
SECO)
Fundamento:
La esterilizacin por calor seco produce la destruccin de los microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares y enzimas. Es un equipo que calienta elctricamente el ambiente, controlando mediante termostatos que estn provistos de un gran ventilador circulante, asegurando la uniformidad de la temperatura en todas las partes del contenido.
o Fase de asenso de temperatura (1 hora) o Fase de mantenimiento de temperatura o Fase de enfriamiento (2 horas)
Aplicaciones
Este tipo de esterilizacin se aplica principalmente para todo material de vidrio, metlico (pinzas, tijeras, etc.) Se utiliza para despirogenizar y eliminar toda toxina presente en el material. Permite la esterilizacin de materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas
Condiciones de esterilizacin
Los periodos de mantenimiento a las diferentes temperaturas de esterilizacin recomendadas por el Medical Research Coucil son: 160C 170C 180C 190C
durante durante durante durante
45 minutos, 18 minutos, 7 minutos 1 minutos.
PROCEDIMIENTO
Colocar el material a esterilizar o despirogenizar dentro del horno (nunca colocar el material si esta mojado). Si el material es una pipeta, tijera, pinzas, etc. Envolver con papel para evitar que se contamine. Encender el horno y graduar la temperatura a la deseada, por una hora. Luego de la hora mantener la temperatura por un tiempo determinado. Finalizado el periodo de mantenimiento apagar el horno y dejar reposar por 2 horas.
RECOMENDACIONES
El aire no es buen conductor del calor, por lo que las estufas deben cargarse sin apretar el contenido, de forma que queden abundantes espacios para permitir que circule el aire caliente. Cuando se calculan los tiempos de funcionamiento para el equipo de esterilizacin por aire caliente, deben considerarse tres periodos. El periodo de enfriamiento, que se realiza gradualmente para prevenir la rotura del material de vidrio como consecuencia de un descenso demasiado rpido de temperatura.
PRECAUCIONES
Y CUIDADOS
No deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su fundamento. Usar guantes especiales para protegerse del calor. No esterilizar solventes o qumicos corrosivos Tener siempre presente que este es un equipo de alto riesgo para el personal operador. Al utilizar papel evite aumentar la temperatura mas de 200C. No emplear plsticos dentro del horno, si es altamente necesario desinfectar el material y emplear temperatura de 60C por 4 horas. Emplear papel aluminio si se desea utilizar como tapn para los Erlenmeyer. Limpiar y desinfectar el equipo una vez al mes.
INCUBADORA
Fundamento
Es un equipo cerrado que permite controlar la temperatura, humedad y otras condiciones necesarias para el desarrollo de un cultivo microbiolgico.
Las incubadoras mas simples son cmaras aisladas con temperatura ajustable que tpicamente va de 20C a 45 C.
La mayora de los equipos incluye un temporizador programable, para realizar ciclos de temperaturas variables al igual que de los otros factores ambientales. En microbiologa se emplea para darle condiciones de temperatura a los microorganismos para que estos se desarrollen.
REFRIGERADOR
CONGELADOR
Cmara que permite garantizar un almacenamiento en fri. La temperatura a menos que se especifique otras cosas debe ser de 3C + 2C. La conservacin de muestras de anlisis en donde la temperatura deber ser de 2 C.
Cumple la misma funcin que el refrigerador disminuyendo aun mas la temperatura.

La temperatura que se utiliza es de 0 a -60C, dependiendo de lo que se quiere conservar. Debido a las bajas temperaturas se debe de emplear un guante para sacar las muestras.
Se emplea para el almacenamiento de medios de cultivos no inoculados y reactivos, muestras de anlisis.
RECOMENDACIONES
REFRIGERADOR
CONGELADOR
Un adecuado mantenimiento, limpieza y desinfeccin sistemticos de los aparatos reduce considerablemente los riesgos asociados a su utilizacin.
No deben almacenarse cultivos de microorganismos patgenos por inhalacin en recipientes que no estn convenientemente cerrados. No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos voltiles inflamables (ter etlico, por ejemplo) Anular la lmpara de la luz.
La congelacin es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes infecciosos, de ah un potencial riesgo
Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus riesgos potenciales. El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes, etc. bien cerrados. No se llenarn completamente, para evitar que rebosen por efecto del aumento de volumen tras la congelacin. Descongelar peridicamente, limpiar y desinfectar si fuese procedente.
TEMPERATURAS
DE INCUBACIN
Se recomienda realizar seguimiento de la temperatura diariamente, si es posible 3 veces al da
La limpieza y la desinfeccin, peridicas y sistemticas, son el mtodo recomendable para reducir los riesgos derivados de la contaminacin accidental del personal del laboratorio.
ESTUFA
Aparato que se usa para calentar un producto como lo es los medios de cultivo, ya sea para fundirlos o prepararlos. Tendiendo en cuenta el diseo que posee la estufa de calentamiento, perilla de ajuste de energa, Parrilla y Quemador. Solo en este equipo se lleva a cabo el calentamiento y/o fusin de medios de cultivo, este debe tener la capacidad de calentar el medio de cultivo de una manera controlada manual, sin que este se pierda por la ebullicin o se queme. Emplear guantes trmicos para el manejo del equipo.
BALANZA
Fundamento
Las balanzas analticas elementos bsicos: involucran tres
El objeto a ser pesado que se coloca sobre el platillo de pesaje ejerce una presin que est distribuida de forma aleatoria sobre la superficie del platillo. Mediante un mecanismo de transferencia palancas, apoyos, guas. Se concentra la carga del peso en una fuerza simple que puede ser medida. La integral de la presin sobre el rea permite calcular la fuerza Un transductor de medida, conocido con el nombre de celda de carga, produce una seal de salida proporcional a la fuerza de carga, en forma de cambios en el voltaje o de frecuencia.
Tipos de balanza y basculas

Bascula (mecnica) Balanza elctrica o digital Balanza analtica
Menor precisin.
Mayor precisin.
Aplicaciones
Se pueden utilizar para realizar cualquier pesaje. Basculas para realizar pesajes que no necesitan de una alta precisin (supermercados, tiendas, etc.) Balanzas elctricas se pueden emplear para el pesaje de carga pesada y tiene una mayor precisin que la bascula. Balanza analtica su uso es frecuente en laboratorios donde se desea una alta precisin y confianza en los resultados.
PROCEDIMIENTO
Verificar que el plato de pesaje no presente ningn sucio que pueda interferir con el pesado (si presenta limpiarlo). Encender la balanza analtica. Cuando este en cero la balanza colocar sobre el plato algn soporte (papel, Becker, vidrio de reloj, etc.) para agregar la muestra. Presionar la tecla tare para descontar el peso del soporte. Una vez en cero la balanza agregar la muestra segn lo deseado o anotar el resultado medido. Retire el soporte con la muestra y apagar la balanza.
RECOMENDACIONES Y CUIDADOS
Las pesas y balanzas deben calibrarse a intervalos regulares, demostrando su trazabilidad de acuerdo al uso previsto. Calibrar la balanza con las pesas control cada vez que se desea utilizar. Mantener ubicado en un solo sitio la balanza analtica. Evite ubicarla en lugares donde se presente vibraciones altas y fuertes vientos. Nunca utilice la balanza si la burbuja indicadora se encuentra fuera de su circulo (calibrar una vez ubicada la burbuja) Mantener la balanza limpia en todo momento. No exceder el rango de medida de la balanza.
CABINAS
DE SEGURIDAD
Fundamento
Es una cabina proyectada para ofrecer proteccin (actuando como una barrera de contencin) al usuario y al ambiente, incluso al producto o muestra. Adems, ofrece proteccin de los riesgos asociado al manejo de material infeccioso y otros materiales biolgicos peligrosos, materiales radioactivos, txicos y corrosivos.
Existen diferentes tipos de cabinas:

Campanas de gases o extractoras. Cabinas de flujo laminar o microbiolgicas. Bancos de trabajo limpio (horizontal o vertical). Cabinas de seguridad biolgica.
CABINAS
DE SEGURIDAD BIOLGICA
Electromecnicos Electrnicos Motor, ventilador, filtros, ductos, iluminacin, etc.
Son equipos que han sido diseados para mantener un rea libre de partculas o de probables contaminantes tales como los microorganismos que puedan alterar el producto con el cual se trabaja, afectar la salud del trabajador, o afectar el medio ambiente. La proteccin se logra mediante la combinacin de elementos.
Procesos fsicos
Flujo laminar, diferencias de presiones
CLASES DE CABINA DE SEGURIDAD

BIOLGICAS Dependiendo de su diseo y clasificacin, las cabinas de seguridad biolgica son adecuadas para proteger al:
Trabajador Medio ambiente Producto
Puede variar dependiendo de la case de cabina
Existen tres clases bsicas, conocidas como:

Clase I Clase II (Tipos: A, B1, B2 y B3) Clase III
QU
CABINA ES LA INDICADA PARA MI LABORATORIO?

Dependiendo del riesgo biolgico que se manipula en el laboratorio se escoge la cabina adecuada
GRUPOS
Grupo
DE RIESGO SEGN AGENTE

Caractersticas Ejemplo
B. Subtilis, Naegleria, E. Coli K 12, Saccharomyces sp. Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Shigella sp, Candida sp, Cryptococcus neoformans. Mycobacterium tuberculosis y bovis, Histoplasma capsulatum, Neisseria meningitidis , Coccidioides inmitis, Chlamydia trachomatis.
BIOLGICO
1
Se refiere a aqul que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Es aqul que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Aqul que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a l generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Se refiere a aqul que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a l profilaxis o tratamiento eficaz.
Virus de Lassa, Machupo y Ebola.
CABINAS
DE SEGURIDAD BIOLGICAS
COMPONENTES DE LAS CABINAS DE SEGURIDAD

BIOLGICA
Componente
Extraccin Filtracin
Funcin
Este sistema est compuesto por uno o dos conjuntos motorventilador. Suministra la energa mecnica necesaria para mover el aire desde el exterior a la cabina hasta su extraccin final una vez ha sido filtrado Est conformado por filtros tipo HEPA en donde se llevan a cabo los procesos de retencin de partculas, aerosoles y contaminantes. Est integrado por diversos dispositivos que permiten regular el funcionamiento de los componentes que conforman la cabina. Permite encender o apagar los motores, el sistema de iluminacin y las alarmas que permiten detectar la ocurrencia de situaciones anormales. Est compuesto por la estructura y el conjunto de elementos que conforman las partes exteriores e interiores como la mesa de trabajo, las bandejas colectoras y la ventana frontal junto con sus dispositivos de fijacin. Son un conjunto de dispositivos que permiten que en la cabina de seguridad biolgica se puedan tener instalados servicios tales como vaco, electricidad o elementos usados en los procesos de desinfeccin como la lmpara de luz ultravioleta.
Control
Cuerpo
Accesorio
FILTRO HEPA (HIGH EFFICIENCY PARTICULATE AIR)
Estn diseados para remover partculas >0,3 m (micrmetros) de dimetro, tamao que incluye bacterias, esporas y virus, con una eficiencia de 99,97%. Estn construidos de microfibras de borosilicato, que han sido unidas con un pegante resistente al agua. El medio filtrante ha sido plegado dentro de un marco, con el fin de incrementar la superficie total. Los pliegues se encuentran separados entre s utilizando diversas tcnicas, tales como separadores de aluminio que le permiten al aire entrar hasta el interior del pliegue.
En el interior del medio filtrante las partculas son retenidas por medio de cinco (5) fenmenos bien diferenciados que son:
Intercepcin Impacto inercial
Difusin
Sedimentacin
Atraccin electrosttica
MANMETRO
INDICADOR DE PRESIN
El manmetro permite controlar la presin esttica positiva dentro de los ductos a travs de los cuales circula el aire que es llevado al sistema de filtracin. Cuando se instalan filtros nuevos HEPA las lecturas correspondientes a las presiones estticas del sistema, sern aproximadamente 0,5" de agua 0,1" /H2O (13 mm/H2O 4 mm/H2O) en el manmetro. A medida que la cabina funciona y el filtro HEPA retiene partculas, se notar que la presin esttica empezar a aumentar.
Este tipo de manmetro normalmente dispone de una escala calibrada entre las 0 y 2" de agua, con incrementos de 0,05".
LMPARA
ULTRAVIOLETA
(U.V.)
Es una lmpara que emite radiacin ultravioleta (253,7 nm) que destruye las bacterias y otros microorganismos presentes en el aire o en las superficies que estn directamente expuestas.
La dosis de radiacin requerida para matar las bacterias es el resultado del producto del tiempo T multiplicado por la intensidad I. (menor tiempo mayor intensidad-mayor tiempo menor intensidad), la intensidad se ve afectada a medida que la distancia es mayor.
Debido a que la radiacin UV no puede penetrar las partculas, nunca puede asegurarse que ocurra una descontaminacin completa usando luz UV, se debe de emplear agentes desinfectantes como complemento.
SISTEMA
VENTILADOR
MOTOR
El sistema motor ventilador es el encargado de suministrar la energa cintica requerida para que el aire sea succionado desde el ambiente en el cual se encuentra instalada la cabina, dicha energa igualmente mueve el aire dentro de la cabina, y tambin hacia el exterior de la misma. El motor es elctrico, normalmente de una sola fase, sellado, autolubricado y su velocidad es regulada mediante un control de estado slido.
CABINA
DE SEGURIDAD BIOLGICA CLASE I

I se
Las cabinas de seguridad Clase caracterizan por suministrar proteccin: Al personal Al ambiente
Su mayor desventaja reside en que no ofrecen proteccin al producto. Se usan especficamente para aislar equipos como centrifugadoras, equipos de cultivo o pequeos fermentadores. Igualmente, para airear cultivos, homogeneizar tejidos con potencial para generar aerosoles.
Son adecuadas para trabajar con agentes biolgicos clasificados con niveles de bioseguridad 1, 2 o 3
FUNDAMENTO
El aire de la cabina es extrado a travs de un filtro HEPA (para proteger el ambiente) y mediante un sistema de extraccin entregado al exterior. El sistema de filtracin mencionado es la caracterstica que diferencia esta clase de cabinas de las cabinas de extraccin de vapores qumicos, las cuales carecen del sistema de filtracin.
La proteccin al personal se logra porque el flujo de aire hacia la cabina tiene una velocidad como mnimo de 75 pies lineales por minuto (38,1 cm/s) a travs de la apertura frontal. El aire de la habitacin (sin filtrar) fluye directamente sobre la superficie de trabajo, razn por la que no brindan proteccin al producto.
PROCEDIMIENTO
Planear en detalle el trabajo o los procedimientos a realizar. Previa utilizacin Desinfectar la cabina de flujo laminar Poner en marcha la cabina de seguridad biolgica Cargar/instalar los materiales y equipos Pre purgar la cabina de seguridad biolgica Auto prepararse Desarrollar los procedimientos Pos purgar la cabina de seguridad biolgica Descargar los materiales y equipos Desinfectar la cabina de seguridad biolgica Arreglarse Apagar la cabina de seguridad biolgica
PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA, DESINFECCIN Y SANITIZACIN DERRAMES BIOLGICOS
Para la descontaminacin de la cabina de seguridad biolgica se emplean varios procedimientos, que permitirn cada uno disminuir significativamente la flora microbiana.
Limpieza y desinfeccin con agentes desinfectantes (lquidos). Radiacin (luz ultravioleta) Sanitizacin por vapores o gases (gas formaldehido y el oxido de etileno).
Estos procedimientos sern realizados: Antes de utilizar la cabina y finalizado el uso de la cabina durante el da. cada vez que cambie de muestra que ingresara a la cabina cuando lo crea conveniente.
PROCEDIMIENTO DE DESCONTAMINACIN DE LA
CABINA DE SEGURIDAD
Limpieza y Desinfeccin:

Derrame accidental
Si esta manejando material infeccioso, aplicar desinfectante (hipoclorito o amonio cuaternario) y dejar actuar (definir concentracin y tiempo de exposicin). Colocar sobre el sitio del derrame papel absorbente y recoger el papel (utilizar guante) botarlo en la caneca de riesgo biolgico.
Escoger el o los desinfectante indicados. Definir concentracin y tiempo de exposicin. Aplicacin: Pao hmedo o esparcido con atomizador. Remocin de materia orgnica (limpieza). Aplicar en toda la superficie de la cabina. Prender la luz U.V. por 20 min.
OTRAS
CABINAS DE SEGURIDAD BIOLGICA

Clase II Clase III
Es una cabina que se caracteriza por suministrar proteccin:

Al personal Al ambiente Al producto
Es una cabina que se caracteriza por ser totalmente cerrada. Su construccin es sellada a los gases. Est diseada para trabajar con agentes microbiolgicos clasificados en el nivel de bioseguridad 4. Suministran mxima proteccin al trabajador y al ambiente.
Existen diversos tipos de cabinas de seguridad biolgica, Clase II.

Tipo Tipo Tipo Tipo
A B1 B2 B3
Clase II
Clase III
LOS REGISTROS DEBEN INCLUIR COMO MNIMO
Nombre del fabricante, modelo, nmero de serie u otros datos que lo identifique. Verificacin de la conformidad del equipo con la especificacin. Plan de mantenimiento mantenimiento llevado cabo hasta la fecha y a
Ubicacin del equipo dentro del laboratorio (cuando corresponda) Fecha de adquisicin puesta en servicio. y
Instrucciones del fabricante o la referencia a su ubicacin. Informes de todas las calibraciones (debe contener fecha de calibracin y resultados), fecha prevista de la prxima calibracin, los ajustes, los criterios de aceptacin. Procedimientos e instructivos sobre el manejo y cuidado del equipo.
Todo dao, mal funcionamiento, modificacin o reparacin del equipo. Programa de desinfeccin microbiolgico) Personal manejo cuidado. limpieza y (monitoreo
encargado del del equipo y
MATERIAL
DE REFERENCIA
Definicin:
Material o sustancia que posee valores de una o ms propiedades suficientemente homogneas y bien conocidas para permitir su uso en la calibracin de aparatos, la evaluacin de un mtodo de medicin o la atribucin de valores a estos materiales.
Material de referencia certificado

Material o sustancia acompaado de un certificado, que posee valores de una o ms propiedades, certificados por un procedimiento que establece su trazabibilidad a una realizacin exacta de la unidad en la cual se expresan los valores de dichas propiedades, para el cual cada valor certificado est acompaado por su incertidumbre, con un nivel de confianza establecido.
CEPAS
O CULTIVOS DE REFERENCIA
Requisitos:
Clulas microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD). Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas con instrucciones para su recuperacin.
Se debe tratar de un cultivo puro .(PUREZA). Genticamente estables.( ESTABILIDAD) ( mantenimiento de caractersticas genotpicas y fenotpicas)
POR QU ES NECESARIO UTILIZAR
CEPAS DE REFERENCIA EN EL LABORATORIO?

Para la Evaluacin de la calidad de los medios de cultivo. validacin de mtodos contralor de reactivos, mtodos y procedimientos Realizar controles de calidad interno durante la ejecucin de los ensayos.
Para alcanzar mayor confiabilidad de los datos!!
Pureza: Condicin de ser libre y exento de toda mezcla

Homogeneidad: Condicin de tener composicin y estructura uniforme respecto de uno o ms de sus caracteres dentro de los lmites establecidos Estabilidad de cultivos de referencia: Caractersticas de un cultivo de mantener, por un perodo de tiempo establecido, un valor declarado de sus propiedades dentro de los limites especificados Trazabilidad de cultivos de referencia: se considera que un cultivo de referencia es trazable si cumple con los requisitos taxonmicos definidos para esa especie microbiana y con aquellas caractersticas propias de esa cepa, de forma tal que los resultados de estas evaluaciones puedan ser reproducidos en otros laboratorios de referencia
Los microorganismos de referencia pueden incluir

Cepas positivas robustas con caractersticas tpicas Cepas positivas con crecimiento dbil Cepas bioqumicamente no reactivas (Ej.: aquellas que muestran diferentes reacciones de fermentacin o fluorescencia) Cepas completamente inhibidas
MATERIALES DE
REFERENCIA Y CEPAS DE REFERENCIA ISO 17025, apartado 5.6.3
Las cepas de referencia son microorganismos obtenidos directamente de una coleccin nacional o internacional reconocida, cuando exista alguna. Alternativamente tambin podran utilizarse cepas comerciales siempre que el laboratorio pueda demostrar en el momento de su uso que todas las propiedades relevantes son equivalentes EJ. ATCC
MICROORGANISMOS DE REFERENCIA
Microorganismos con caractersticas fenotpicas y genotpicas definidas que se utiliza en estudios comparativos. Por ejemplo: taxonmicos, serolgicos o en ensayos qumicos o microbiolgicos.
ATCC
PARA DEMOSTRAR LA TRAZABLIDAD DEBEN OBTENERSE DIRECTAMENTE DE:

Una coleccin nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido.
Son microorganismos definidos:

Por lo menos a nivel de gnero y especie. catalogados. muy caracterizados. de origen conocido.
[ISO 11133-1:2000] Se comercializan liofilizadas.
ADQUISICIN DE CEPAS DE REFERENCIA:

1 era opcin: Obtencin directa a partir de una coleccin nacional e internacional reconocida.
2 da opcin: Proveedores comerciales certificados por ISO que 9001.
Comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas en una coleccin reconocida. Generalmente el 3er o 4 repique. Deben mantener sus recipientes originales.
Requerimiento en la recepcin (compra de insumo): certificado de origen donde conste el nmero de repique y el origen entre otros.
PROVEEDORES
Primera opcin: Algunos ejemplos
DE CEPAS DE REFERENCIA:
ATCC
(American Type Culture Collection).
SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmentl Protection)

CECT (Coleccin espaola de cultivos tipos).
CNCM. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) lNSTITUT PASTEUR
Segunda opcin: Algunos ejemplos Proveedores acreditados por ISO 9001 que realizan repiques a partir cepas adquiridas en la coleccin reconocida.
Oxoid Companie
PRESENTACIONES ATCC (LIOFILIZADOS)
Vial con tapn de caucho
Ampolla de Vidrio
Algodn
ATCC
Liofilizado
Slica Gel
Re-hidratacin de acuerdo a lo recomendado por ATCC. Re-hidratacin alterna de acuerdo al microorganismo. 0.5 ml aproximadamente de medio hidratante por vial. Tiempo de re-hidratacin.
REPIQUES
Se considera un repique cada vez que microorganismo es transferido a un medio nuevo.
un
Se pueden realizar hasta 5 repiques.

El quinto repique corresponde a la mxima transferencia del microorganismo en un medio y por lo tanto no se puede volver a repicar (la prueba final debe contarse como repique). Si una cepa se adquiere por cualquier va que no sea la propia coleccin, no se puede mencionar utilizando el nmero que tienen en esa coleccin, sino solamente como derivada de la cepa de coleccin.

CEPA DE REFERENCIA
Reconstitucin (Slo se acepta un nico repique)
*
OBTENCIN DE LAS CEPAS DE RESERVA
*
Se Se (Liofilizacin, nitrgeno lquido, ultracongelacin rpida, etc.) subcultiva subcultiva unauna sola sola Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento vez vez. Descongelacin / reconstitucin
CONSERVACIN MEDIANTE DISTINTOS MTODOS
Esquema de cultivos de referencia:
*
CEPAS DE TRABAJO (Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)
Controles de pureza y pruebas bioqumicas de la cepa.
UTILIZACIN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIN DE MTODOS Y CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD
Identificacin de la cepa.
Gnero y especie del microorganismo

TIPO y N de coleccin.
N de lote.
Fecha de recepcin.
Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO).
Fecha de caducidad de la cepa. Personal responsable.
CONTROL DE CALIDAD DE PUREZA Y VIABILIDAD:

Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGO UN REPIQUE.
Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioqumicos.
Frecuencia de realizacin de este control: para las cepas de reserva almacenadas el laboratorio la establecer en cada caso.
En caso de no presentar las caractersticas establecidas se ejecuta la Acciones correctivas establecida en el procedimiento.
REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD DE PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS CEPAS:
Fecha del control.
Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. TIPO y N de coleccin.
Tipo de cepa (CEPA DE REFERENCIA, RESERVA O TRABAJO).

Pruebas

a realizar (depende del microorganismo):
Coloracin de Gram Caractersticas de las colonias en medios selectivos Pruebas bioqumicas y serolgicas.
CONSERVACIN
MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA obtenidas a partir de cepas de referencia
LIOFILIZACIN.
CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS.
Uso de agentes Crioprotectores
CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS

Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiolgica (esterilizacin por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.

Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol. Glicerol al 10%
Caldo BHI con glicerol 20%.
Proceso de congelacin: Equipamiento o insumos para lograr la congelacin, Congelador o cmara o uso de Nitrgeno lquido.
CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS

Proceso de congelacin Temperatura: Deseable a -70 o -80 C o menores temperaturas.
A temperaturas ms altas como -20 C no es lo ideal pero tal vez sea la nica forma posible. Es preferible a -40 C.

Envases: Uso criovial o tubo estril.

conservar en a temperatura
Producto: se puede congelacin por aos.
Inconveniente: problemas y prdida de las cepas la falta de suministro de energa, falta de insumos o avera del equipamiento.
PASOS
A SEGUIR PARA EL MANEJO DE LOS
CULTIVOS DE REFERENCIA
PROVEEDOR DE CEPA
LABORATORIO
Adquisicin de cepa de referencia (C Ref): Requisitos de compra y Registro de la cepa adquirida.
LABORATORIO
Subcultivo de C Ref: Control de pureza y viabilidad (REGISTRO). Preparacin de la cepa de reserva (Cres) Control de pureza y viabilidad peridicos (REGISTRO). Registro de cada frasco de la nueva cepa de reserva Incorporada al cepario.
LABORATORIO
CONDICIONES CONTROLADAS DE ALMACENAMIENTO DE LA CEPA DE RESERVA
Subcultivo
LABORATORIO
la cepa de reserva (C t): -Control de pureza y viabilidad (REGISTRO). USO PARA CONTROLES DE CALIDAD
MEDIOS DE CULTIVOS
Si se desea recuperar determinados microorganismos de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos, etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de ellos.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.
Se puede emplear un medio de cultivo y condiciones de incubacin (grado de humedad, oxigeno, temperatura, pH, etc.) considerando las caractersticas fisiolgicas y metablicas del microorganismo.
LOS
MICROORGANISMOS
Capacidad para sintetizar sus propios constituyentes a partir de nutrientes que toman del medio externo
Seres vivos
Protenas
Acidos nucleicos
Carbohidratos
Lpidos
Las clulas microbianas, poseen una gran variedad de sustancias como fuente de energa ilimitada
Componentes celulares
IMPORTANCIA: FISIOLOGA Y METABOLISMO BACTERIANO

C o n o c i m i e n t o
Permitir conocer el modo de vida y hbitat de diferentes bacterias
Fisiologa
Aplicaciones prcticas
Permite formular medios de cultivo para el aislamiento e identificacin
Metabolismo
Nos permite conocer y entender el modo de accin de algunos antimicrobianos
CLASIFICACIN
Dado que los requerimientos nutritivos de los microorganismos son muy variables, es imposible formular un medio en el que puedan crecer todos los microorganismos.
Generales Enriquecidos Selectivos Diferenciales De enriquecimiento Pre-reducidos Deshidratado Preparados Para identificacin Caldos Agares Diluyentes
En base a su aplicacin
En base a su Presentacin
Generales: Pueden crecer diferentes microorganismos (agar nutritivo). Enriquecidos: medios bsicos a las que se le aaden ciertas sustancias para favorecer el crecimiento de los microorganismos que se esperan aislar. Selectivos: medios con sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, permitiendo el crecimiento de un solo tipo. Diferenciales: medios con sustancias o indicadores que permiten diferenciar unos microorganismos de otros. De enriquecimiento: Medios lquidos que se utilizan para favorecer el crecimiento de unos microorganismos sobre otros (suelen incorporar sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos). Pre-reducidos: Medios lquidos en cuya preparacin se reduce el oxigeno libre por medio de la adicin de otros gases al medio y de agente reductores (cistena, tioglicolato).
ALGUNOS COMPONENTES
Agar: se usa como agente solidificante. Es un polisacrido gomoso obtenido de ciertas algas marinas. Se disuelve y funde alrededor de 100C y solidifica de 43C. Tampones: se incorporan para mantener el pH en el rango optimo del microorganismo. Fosfato sdico, y potsico, carbonato de calcio se emplean para evitar un pH modificado consecuencia de la produccin de cidos o bases. Peptonas: son mezclan complejas de compuestos orgnicos obtenidas por digestin de tejidos animales y planta, contienen pptidos y aminocidos. Indicadores de pH: se aade un indicador acido-base a medios diferenciales para detectar cambios en la concentracin de iones hidrgenos durante el crecimiento de un organismo.
Agentes reductores: ciertos compuestos qumicos pueden estimular el crecimiento reduciendo el potencial redox en el medio. Agentes selectivos: crystal violet, bile salt, brilliant green, potassium tellurite, sodium azide y antibiticos se pueden emplear en medios selectivos para inhibir o suprimir el crecimiento de ciertos grupos de microorganismos permitiendo el crecimiento de los microorganismos deseados. Extractos: los tejidos de clulas eucariotas (levaduras, musculo, hgado, cerebro, corazn, etc.). Estos extractos se usan frecuentemente como fuente de aminocidos, vitaminas y coenzimas, entre ellos hay factores de crecimientos necesarios para organismos fastidiosos o de difcil crecimiento. Tambin hay presentes elementos trazas y minerales.
PRESENTACIN
DEL PREPARADO
Tipos
Caja de Petri
Agares
Medios de cultivos
Lquidos
Tubo Tubo erlenmeyer
CRECIMIENTO
EN MEDIO LQUIDO
Turbidez
Sedimento
(anaerobias)
(pigmentadas)
Cambio de color
(aerobios)
Nata
Floculacin
MEDIOS
DIFERENCIALES
CRECIMIENTO EN MEDIO SOLIDO
Y SELECTIVOS
EMB MC CONCKEY XLD HECTOEN BAIRD PARKER S.S. BISMUTO SULFITO CETRIMIDE SPS (CLOSTRIDIUM) AGAR Bacillus cereus TCBS LOWESTEIN JENSEN
PREPARACIN
DE MEDIOS DE CULTIVOS
En el laboratorio se debe de establecer un sitio para la preparacin de medios de cultivos, que cuente con lo siguiente:
rea de preparacin y esterilizacin de medios de cultivos rea de esterilizacin rea de desecho y lavado rea de almacenamiento de material, medio de cultivo y reactivo.
MANEJO DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS
El laboratorio debe registrar la fecha de recepcin, de apertura del envase y de caducidad. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. Envases: deben estar hermticamente cerrados. (especialmente en medios deshidratados no deben utilizarse si presentan apelmazamiento o un cambio de color).
Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los medios de cultivo y diluyentes tengan caractersticas adecuadas con respecto a: Recuperacin o supervivencia de los microorganismos de inters (productividad). Inhibicin o supresin de microorganismos no deseados (selectividad).
PREPARACIN
Agares

DE MEDIOS DE CULTIVOS
Lquidos

Leer instrucciones Calcular gramos necesarios para el pesaje y ml H2O a utilizar. Disolver en agua destilada (calentar si es necesario) Ajuste de pH Esterilizar Servir (tubo o caja petri)
Leer instrucciones Calcular gramos necesarios para el pesaje y ml H2O a utilizar. Disolver en agua destilada y servir en los tubos (calentar si es necesario antes de servir en tubos) Ajuste de pH Esterilizar
INSTRUCCIONES

Y CALCULO
Formula: ml de H2O x gr de medio / 1000 ml
Observar el modo de preparacin (gramos por litro). Dependiendo de la cantidad que desea preparar eso es lo que debe de pesar. Sacar calculo
Necesito preparar 20 tubos con 10 ml del medio de cultivo: 20 tubos x 10ml = 200 ml Para 200 ml cuanto medio de cultivo necesito pesar? En el caso de Caldo CASO se preparan 30 gr por un L. Entonces: 200ml x 30 gr / 1000ml (1L) = 6 gr
CANTIDAD
DE AGAR A PREPARAR
Cantidad de liquido para servir
10 ml 15 20 ml Observaciones Generalmente se emplea esta cantidad
Embase o contenedor del medio

Tubos de ensayos Cajas de Petri 90mm Cajas kodack 60mm Cajas millipore Erlenmeyer de 1000ml
10 15 ml
2 5 ml
Dejar solidificar y almacenar boca abajo

Colocar tapn y nunca utilizar mas del 75% de la capacidad si es agar.
500 ml 700 ml
Estas medidas pueden variar segn la tcnica o el procedimiento al que se le dar empleo al instrumento.
DISOLVER
EL MEDIO DE CULTIVO
Adicionar 2/3 partes del volumen de agua destilada o desmineralizada (estril en el caso de aquellos medios que no deben autoclavarse) a temperatura templada sobre las paredes del recipiente para arrastrar el medio deshidratado que haya quedado adherido a las mismas. Agitar y adicionar el contenido restante de agua. Dependiendo del medio de cultivo existen algunos que son altamente solubles en agua, en cambio hay otros que no lo son tanto y necesita del calor para disolverse completamente.
CALENTAMIENTO-EBULLICIN
Este paso se lleva a cabo siempre en constante agitacin y su fin es facilitar la disolucin completa del medio deshidratado. En aquellos medios que no se autoclavan el calentamiento se debe llevar a ebullicin por el tiempo indicado en las instrucciones del medio con el fin de facilitar la formacin del gel y la no destruccin de sus componentes ms termosensibles. Evitar que se queme el medio, los medios ricos en hidratos se queman mas rpido.
AJUSTE
DE PH
Para medir el pH se emplean papeles indicadores, indicadores de pH y pHmetro. El ajuste de pH normalmente se realiza antes de la esterilizacin, pero se puede hacer despus con practicas aspticas. El ajuste del pH se realiza con cidos fuertes como ClH 1N, NaOH 1N (generalmente), tras la esterilizacin puede bajar 0,1-0,2. En los medios slidos la medida se hace a 45-50C (el agar todava no ha gelificado) mientras que en los lquidos se hace a temperatura ambiente. La calidad del agua que se utiliza en su hidratacin, la utilizacin de medios no recientes etc., pueden modificar este parmetro por lo que es aconsejable verificarlo y reajustarlo si fuera necesario.
ESTERILIZACIN
En la etiqueta del medio se indican las condiciones de esterilizacin. Aunque la mas comn es el calor hmedo (autoclave).
Autoclavado Filtracin Tindalizacin
Todos los medios deben esterilizarse de alguna forma, solo el agar marino (rico en sal) no se esteriliza.
CONDICIONES DE ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO

Temperatura: 121 123C (250 254F) Presin: 15 psi
Tiempo: 10 15 min (instrumentos) 20 30 min (Lquidos) 115C 10 20 min (termosensibles)

El tiempo depende de que tan llena este la cmara del autoclave, muy llena mas tiempo. Emplear indicador de vapor para verificar si el material fue expuesto a las condiciones de esterilizacin. Para evaluar el proceso de esterilizar emplear ampolla sterikon (indicador biolgico) Se puede emplear la filtracin (0,45 micrmetros) para la esterilizacin.
ESTERILIZACIN
CON CALOR HMEDO
No colocar recipientes completamente cerrados en la autoclave. El vapor debe entrar en contacto con todo lo que se quiere esterilizar No esterilizar solventes o qumicos corrosivos Si se esterilizan lquidos, bajar la presin lentamente y dejar enfriar los recipientes dentro de la autoclave Se esterilizan mejor los lquidos si se dividen en pequeos recipientes que en uno grande (> 1 lt) los medios que contienen hidratos de carbono, deben esterilizarse temperaturas no superiores a los 116-118C.
SERVIR
MEDIO DE CULTIVO
(AGAR)
Luego de la esterilizacin, se espera a que enfri (42C o hasta que se pueda sostener el recipiente sin quemarse la mano).
Preparar medio H2O + medio
Servir en tubos (15 20ml)
Esterilizar
Servir en las cajas de Petri 90mm
CONSERVACIN
PREPARADOS
DE LOS MEDIOS
Lo ms recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en muchos casos por razones obvias una parte del medio preparado se consume y el resto se guarda como medio preparado. El tiempo de vida del medio preparado depender de la propia naturaleza del medio, de la hermeticidad de los recipientes que lo contienen, de la temperatura de conservacin y de las condiciones medioambientales. Si la hermeticidad es buena y la temperatura baja, 28C, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6 semanas. Se deben evitar las condensaciones ya que el depsito de gotas de agua podr ser causa de una alteracin casi inmediata del medio.
CONSERVACIN DE LOS MEDIOS

DESHIDRATADOS
Como regla general y si no se establecen condiciones particulares los medios deshidratados deben almacenarse en lugar fresco, seco y al abrigo de luz directa del sol. Existen unos medios en concreto, que requieren un almacenamiento entre 2-8C En la manipulacin de los frascos se debe procurar que las aperturas y cierres sean los menos posibles y que el tiempo durante el cual el frasco permanece abierto sea el mnimo. De lo contrario el medio se ir rehidratando, con lo que comenzar a apelmazarse y endurecerse, ya que son generalmente higroscpicos.
Deben almacenarse a temperatura ambiente (entre los 15C a 25C), en ambiente seco y libre de luz, as como boca abajo para evitar la entrada de aire sobre los mismos. Los medios de cultivo preparados deben almacenarse a temperaturas entre los 12C a 15C por 1 o 2 semanas, para prolongar su periodo de uso los medios pueden ser almacenados en refrigeracin cuidando siempre que la temperatura no sea inferior de 0C ya que se desestabiliza el gel. En cualquier caso, deben protegerse de la luz. Si un medio o reactivo cambian de color o se hidratan, se deben dar de baja. No mezclar lotes de producto. Conservar y registrar los resultados de las pruebas control.
REFUNDIDO
DE MEDIOS SLIDOS
Cuando se precisa refundir los medios slidos, preparados y estriles en frascos y tubos, para verterlos en placa, es aconsejable hacerlo en bao mara, en microondas o en autoclave a vapor fluente. En ningn caso debe aplicarse calor directo. Una vez fundidos, debern dejarse enfriar hasta unos 50C para aadir los aditivos, si fuera necesario y para distribuirlos o sembrarlos. Hay que tener en cuenta que los medios refundidos tienen una cierta tendencia al oscurecimiento y precipitacin, que aumenta cuando se mantienen fundidos durante periodos de tiempo prolongados y a temperaturas entre 45-65C y que ello puede suponer una prdida de las caractersticas nutritivas o selectivas del medio, por lo que es aconsejable, no fundirlos ms de una vez y no mantenerlos en el calor largos periodos de tiempo.
DESTRUCCIN
Y DESINFECCIN
Una vez realizados los cultivos, el medio debe ser Autoclavado a 121C durante 30 minutos antes de su desecho definitivo. De igual manera se debe proceder con el material de laboratorio empleado en los cultivos antes de su lavado y nuevo uso. Cuando el cultivo de microorganismos no se pueda esterilizar con autoclave se puede emplear la inactivacin qumica (hipoclorito de sodio), para luego ser incinerado.
CRITERIOS MNIMOS PARA ASEGURAR UN

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVOS
A cada lote se le debe realizar pruebas de funcionalidad del medio preparado para confirmar que es satisfactorio y si cumple con las especificaciones para el propsito sealado. El laboratorio deber tener un criterio serio para la compra de medios de cultivo, as como para su almacenamiento y conservacin. Realizar un procedimiento operativo estandarizado para la preparacin, manipulacin y conservacin de cada medio de cultivo. Desarrollar o implementar mtodos y procedimientos para verificar la esterilidad, pH, capacidad de crecimiento, pruebas de funcionalidad (productividad, selectividad y estabilidad), etc. Seleccionar los microorganismos de prueba (cepas control) de acuerdo con el tipo de medio a evaluar.
Implementar un programa definido para la esterilizacin, eliminacin y disposicin final de los medios de cultivos usados. Todos los lotes deben cumplir con la prueba de esterilidad para verificar que pueden ser usados sin problemas de contaminacin. Cuando no se conozca la fecha de vencimiento de un medio de cultivo lo ideal es descartarlo o destinarlo como de segunda, pero en el caso donde deba ser usado para cualquier ensayo, se debe valorar primero su funcionalidad. Los medios de cultivo deshidratados deben contar con una hoja de registro que contenga mnimo la siguiente informacin: nombre, marca, nmero de lote, fecha de adquisicin, fecha de apertura, fecha de vencimiento, datos de preparacin, indicador biolgico usado para su control, resultados de los controles de calidad, nombre del preparador y observaciones.
CONTROL
CULTIVOS
DE CALIDAD DE MEDIOS DE
Para su control es necesario realizar una prueba de productividad donde se determine el rendimiento, la recuperacin, el crecimiento de un microorganismo que habitualmente se desarrolla en un medio de cultivo y la selectividad o supresin del crecimiento del microorganismo, que se espera sea inhibido en el medio. Normalmente se determina en los controles positivos la productividad y no la selectividad. Para el control de calidad de medios de cultivo se debe usar un agar de referencia que puede ser Agar Infusin Cerebro Corazn (BHI), Agar Tripticasa de Soya (TSA o CASOY) o Agar Estndar para conteo en placa (SPC).
MTODO
ECOMTRICO
Mossel y colaboradores describieron en 1983 un mtodo que permite evaluar la sensibilidad de los medios de cultivo selectivos al desarrollo de un microorganismo deseado y la resistencia a la colonizacin por microorganismos indeseados y la selectividad de los medios no selectivos. Este mtodo utiliza un procedimiento normalizado de siembra en estras para obtener una dilucin progresiva de una suspensin de prueba de un microorganismo en una placa del medio que se est colocando a prueba.
El espesor de la capa de agar debe ser de unos 4 mm y deben estar bien secas (preincubados a 35C por 2 horas o 55C por 10 minutos mximo). Todos los medios de cultivo selectivos utilizados durante el trabajo ordinario deben ir acompaados de:
Control positivo; microorganismo(s) que se desea(n) recuperar o microorganismo(s) deseado(s). Control negativo; microorganismo(s) que se desea(n) inhibir total o parcialmente (llamado interferente).
Los medios no selectivos deben ir acompaados de un control positivo. Todos los medios de cultivo de cada lote adquirido por el laboratorio deben ser probados para demostrar su capacidad de reproductibilidad, selectividad y estabilidad.
PROCEDIMIENTO MEDIOS SLIDOS
Se dividen las placas en cuatro cuadrantes marcados de forma conveniente sobre la base de la caja de petri Depositar el medio de cultivo a evaluar en una capa cuyo grosor deber ser de unos 4 mm. A partir de cada uno de los cultivos en fase exponencial (mantenidos en crecimiento toda la noche o 18 horas de incubacin), tome con una asa calibrada de 1 microlitro y trace sobre la superficie del medio 5 estras paralelas a las lneas dibujadas en cada cuadrante y una estra central, de forma progresiva y sin recargar, retorcer, repisar o esterilizar el asa. Hacer lo mismo con el medio de referencia.
FORMA
DE PASAR LAS ESTRAS
Medio de referencia y medio de anlisis
NDICE
DE CRECIMIENTO ABSOLUTO
Incubar las placas en posicin invertida por el tiempo necesario y a la temperatura apropiada segn el mtodo. Transcurrido el tiempo, efectuar la lectura de las cajas, teniendo en cuenta que cada estra tiene un valor de 0.2 y la estra central de 1.0. Multiplicar por el nmero de estras en las cuales se observa crecimiento, y determinar el ndice de crecimiento absoluto (ICA). Si hay crecimiento en las cinco estras de los cuatro cuadrantes y la estra central (1), el ICA es igual a 5. El ICA es igual al nmero del cuadrante cuando todas las estras de este y de los cuadrantes anteriores muestren un crecimiento completo, mientras no se observe crecimiento en ninguna estra del cuadrante siguiente.
NDICE
DE CRECIMIENTO RELATIVO
Efectuar la misma operacin con el medio de referencia. Una vez obtenida las lecturas en cada medio (ICA), sacar el ndice de Crecimiento Relativo (ICR), comparando el ICA del medio en evaluacin y el medio de referencia
OBSERVACIONES
El ICR deber estar cercano a 1. Para evaluar la productividad de un medio selectivo, se mide teniendo en cuenta que las cepas esperadas (microorganismos deseados) deben dar un ICA no menor a 2.5 3. Para evaluar la selectividad de un medio, se mide teniendo en cuenta que el microorganismo interferente (no esperado) debe dar un ICA no mayor de 2.
Ejemplo: crecimiento en el primer cuadrante de todas las estrias y 3 del segundo ICA: 8 x 0,2 = 1,6
PROCEDIMIENTO
MEDIOS LQUIDOS
Para evaluar el ndice de crecimiento en medios de cultivos lquidos selectivos y no selectivo, se puede emplear el mtodo ecomtrico. Medio no selectivo

Se distribuyen 10 ml de caldo de referencia (Agua peptona 1%) y del que se va a ensayar en tubos taparosca. Se esteriliza en autoclave segn instrucciones del fabricante. A partir de cultivos en fase exponencial (18 horas de incubacin), se siembran los caldos por duplicado con 0.1 ml de cultivo de cada microorganismo que contenga 105 UFC/ml (Fase exponencial 1:100). Se retira 0.1 ml del caldo de anlisis y se coloca sobre la superficie de una caja bien seca que contenga agar no selectivo. Con ayuda de un asa de Hockey se extiende sobre la superficie de la caja.
Incubar caldos y cajas de acuerdo al microorganismo en estudio. A intervalos de tiempo diferentes, se retira una parte de cada caldo con asa calibrada, pipeta o micropipeta, si es necesario se diluye y distribuye sobre cajas de petri que contenga el mismo medio utilizado anteriormente. Es posible evaluar resultados mediante observacin directa o registrando el recuento en funcin del tiempo en una grfica. Se debe analizar cada lote de caldo selectivo adquirido por el laboratorio para verificar el nmero de clulas del microorganismo deseado que permite detectar. Para ello se verifica el desempeo del medio con una mezcla de cultivos deseados e indeseados.
MEDIO
NO
SELECTIVO
Medio de anlisis
0,1 ml
10 ml
Cultivo de referencia
Medio de referencia
0,1 ml
Incubar y reportar

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Microbiologa para dispositivos mdicos

PROCESOS COMUNES DE REUTILIZACIN DE

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Autoclave Alcohol al 70%, autoclave o horno ---

--Oxido de etileno o U.V.

Agua mas detergente (bata y pantaln)

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ESTERILIZACIN: Es la accin de eliminar todo microorganismo, incluso capaz de eliminar esporas.

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Identificar con cinta indicadora el material.

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Garantizan el buen funcionamiento del equipo o instrumento de medida

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Verificar las condiciones mecanico-electricas y estado fsico, POEs

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El laboratorio debe establecer un programa

La frecuencia de estas calibraciones y/o

Los equipos bajo el control del laboratorio

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Puesta en servicio y verificacin

Termmetro y manmetro: Frente a un patrn de referencia

Verificar visualmente la junta, limpiar/dren ar la cmara

Calibracin trazable al micrmetro (cuando sea apropiado)

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Puesta en servicio y verificacin

Cabina de flujo laminar

Radimetro: medir la intensidad

a) Verificar las caracterstic as tcnicas b) Verificar la esterilidad

Revisin /cambio de filtros

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Dentro del laboratorio de microbiologa diversos equipos que nos permiten:

Autoclave, estufa y horno Balanza

Incubadora, refrigerador y congelador

Equipos de uso frecuente e importantes

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CRITERIOS TCNICOS PARA LA ADQUISICIN DE LOS EQUIPOS

Facilidad en la operacin del equipo

Fcil limpieza, ajuste y calibracin

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El proceso completo de esterilizacin en un autoclave se compone de diferentes fase: