INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

CURSO PRCTICO DE MTODOS DE ANLISIS

PRCTICA:

SEPARACIN DE PROTENAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA.

ALUMNA: HUITRN LPEZ CINDY GRUPO: 5QV1 SECCIN: I PROFESOR: RIVAS FARIAS ARTURO FECHA DE REALIZACION: 10 de marzo de 2012 FECHA DE ENTREGA: 16 DE MARZO DE 2012-03-10 SITUACIN ESCOLAR: ALUMNA REGULAR

 INTRODUCCIN. Una molcula con una carga elctrica neta se desplazar en un campo elctrico. Este fenmeno, conocido como electroforesis ofrece un procedimiento para separar protenas y otras macromolculas. La velocidad de migracin (v) de una protena depende de la Fuerza del campo elctrico (E), la carga neta de la protena (z) y el coeficiente de friccin (f) V=Ez/f Las separaciones electroforticas se realizan casi siempre sobre geles porque sirven como tamiz molecular que potencia la separacin. Las molculas ms pequeas que los poros del gel se desplazan ms fcilmente, mientras que las mayores permanecen casi inmviles. La direccin del flujo es vertical descendente. La electroforesis se lleva a cabo en un bloque delgado, vertical de poliacrilamida (Fig 1).

Fig. 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida (A) Aparato de electroforesis en gel (b) La accin de tamizado de un gel poroso separa las protenas de acuerdo con su tamao, movindose la ms pequea

Estos geles son formados por la polimerizacin de la acrilamida entrecruzada por metilenbisacrilamida (Fig 2), son el soporte preferido para la electroforesis porque son inertes qumicamente.

Fig 2. Formacin de un gel de poliacrilamida

Las protenas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares, en condiciones desnaturalizantes. La mezcla de protenas se disuelve en SDS detergente aninico que rompe casi todas las interacciones no covalentes en las protenas nativas. Tambin se aade mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir puentes de disulfuro. Los aniones SDS se unen a la cadena principal a razn de un anin SDS por cada dos residuos de aminocido. El complejo SDS con una protena desnaturalizada tiene una gran carga negativa, que es aproximadamente proporcional a la masa de la protena, y no es muy diferente a la nativa. Estos complejos se someten a electroforesis.

Fig 3. Dodecil sulfato de sodio

Despus se pueden visualizar en gel tindolas con plata o un colorante como azul de coomassie, que revelan una serie de bandas. Cuando se tie con azul de coomassie basta 0.1 g de protena para dar una banda diferenciada y con la de plata, se puede distinguir incluso una cantidad menor. OBJETIVOS. Efectuar una separacin de protenas de tres muestras por electroforesis en gel de poliacrilamida. Determinar cul es el tamao ptico del poro del gel para la mejor separacin de cada una de las muestras.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME.

7.5 %T

10 %T

12.5 %T

Las imgenes son de geles prestados (7.5 y 12.5) por el profesor para observar lo esperado en la prctica y el 10% fue de un grupo de la maana que el profesor tambin en su momento nos enseo, las pongo como representacin y para complementar la prctica. 1. Llenar la siguiente tabla. Tabla 1. Movilidades electroforticas relativas. Movilidad. %T Suero Clara de huevo Yogurt 7.5 0.8056 0.3879 0.6115 10 0.5449 0.2643 0.4446 12.5 0.3271 0.1449 0.2804

2. Complete la tabla 2 con los valores promedio de la distancia recorrida para cada protena y las movilidades electroforticas relativas (M).
Tabla 2. Movilidad electrofortica relativa en log (M*100)

%T 7.5 10 12.5

Movilidad [log(M*100] Suero Clara de huevo Yogurt 1.9061 1.5887 1.7864 1.7363 1.4221 1.6479 1.5146 1.1611 1.4477

Tabla 3. Nmero de bandas.

%T 7.5 10 12.5

Suero 17 17 21

Nmero de bandas Clara de huevo Yogurt 10 5 12 9 13 10

3. Con los valores del logaritmo de la movilidad electrofortica relativa (M) de la protena elegida en cada muestra, construir la grfica de ferguson colocando en el eje de las ordenadas el logaritmo de las movilidades electroforticas relativas y en el eje de las abscisas el %T. Usar un solo grafico para todas las protenas seleccionadas.

Grfica de Ferguson.
2.5

Log (M*100)

1.5

1 Suero y = -0.1958x + 2.1105 0.5 Clara y = -0.2138x + 1.8182 Yogurt y = -0.1694x + 1.966 0 7.5 10 %T 12.5

Grfico 1.- Grfica de Ferguson comparando tamao y movilidad de partcula.

4. Concluya acerca del tamao molecular relativo de las protenas y sus cargas elctricas relativas al pH del regulador de trabajo. El tamao molecular relativo de las molculas lo podemos concluir a partir de las pendientes de las rectas en la grfica de Ferguson. Aunque dichas pendientes tienen valores negativos, tomamos su valor absoluto para poder compararlas. Por lo tanto podemos observar que el suero humano tiene el peso molecular relativo ms grande, seguido por el yogurt y siendo la clara de huevo la protena con peso molecular relativo ms pequeo de las tres muestras trabajadas. Las cargas elctricas relativas de las molculas las podemos comparar a partir de las ordenadas al origen de las rectas en la Grfica de Ferguson. Los valores de la ordenada al origen no corresponden al valor de la carga, slo nos haces referencia de qu molculas tienen ms carga. En el caso de la prctica, sabemos que todas las protenas utilizadas tienen carga negativa debido a que corren hacia el nodo y no se desnaturalizan en el pH trabajado debido a que se encuentran en un rango de pH regulado. Con respecto a las protenas trabajadas, el suero humano es la protena que posee una mayor carga elctrica, seguida por el yogurt y siendo la clara de huevo la protena con menor carga elctrica. 5. Diga cul %T recomienda para la separacin de las protenas de cada muestra, por qu? Muestra %T recomendado Suero sanguneo Leche 12.5 12.5

Clara de huevo

12.5

Consideramos stos %T como el tamao ptimo de poro del gel para cada muestra en base al nmero de bandas que se observaron en el gel. Un mayor nmero de bandas nos indica que tiene un mayor poder de resolucin, por lo tanto, la separacin de las protenas en ste tamao de poro ser ms efectiva. 6. Escriba la reaccin completa para la copolimerizacin de la acrilamida y la bisacrilamida por radicales libres, Qu funcin tiene el TEMED y el persulfato de amonio? La poliacrilamida se forma por copolimerizacin de dos compuestos, la acrilamida y la bisacrilamida (N,N'-metiln-bis-acrilamida), en una reaccin iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formndose as una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reaccin y las concentraciones de los monmeros. Las concentraciones ptimas de persulfato amnico y TEMED dependen de la concentracin de acrilamida. Una concentracin demasiado baja puede traducirse en que parte del monmero no polimerice; por el contrario, un exceso de catalizador origina un nmero elevado de cadenas de acrilamida anormalmente cortas. La polimerizacin se detiene cuando desaparecen los radicales libres del medio; entre los agentes que producen su desaparicin con mayor eficacia se encuentra el oxgeno molecular, por lo que todas las disoluciones se deben desgasificar enrgicamente antes de formar el gel.

Fig.4. Reaccin de copolimerizacin de la acrilamida y la bisacrilamida

7. Mencione una aplicacin de la electroforesis preparativa y una de la electroforesis analtica. a) Electroforesis preparativa Se puede aplicar en la preparacin y purificacin de (por extraccin de bandas del gel) molculas y fragmentos de DNA y RNA

b) Electroforesis analtica Permite realizar algunos tipos de diagnsticos, conocer la composicin de un preparado proteico heterogneo, monitorear un proceso de purificacin, estimar Peso molecular, etc. 8. Defina las velocidades de migracin y movilidad electrofortica. a) Velocidad de migracin En electroforesis, el movimiento de una molcula tiene una determinada velocidad conocida como velocidad de migracin. Dicha velocidad de migracin es un valor caracterstico de la molcula y del campo elctrico. Sus unidades son cm/S. La velocidad de migracin aumentar con la subida del campo elctrico generado por una fuente exterior al sistema (Voltaje). Tambin cabe mencionar que la velocidad de migracin en un sistema electrofortico ser inversamente proporcional a la viscosidad del medio y proporcional a la carga neta de la molcula. b) Movilidad electrofortica () La movilidad electrofortica es la constante de proporcionalidad entre la velocidad del in y la fuerza del campo elctrico.

Velocidad de migracin cm S 1 Fuerza del campo elctrico V cm 1

La movilidad es proporcional a la carga del in e inversamente proporcional al coeficiente de friccin. 9. Defina electroferograma. Cuando se realiza una electroforesis capilar (CE) o electroforesis de zona (ZCE), la separacin se lleva a cabo en el interior de un tubo capilar con un dimetro interno inferior a 0.1nm y una longitud de 50cm a 1m. La tcnica tiene un gran poder de resolucin; adems, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual modo que en una cromatografa en columna. Esto contrasta con la electroforesis en gel, donde se necesitaban etapas separadas para hacer visibles las bandas despus de la separacin. En lugar de esto, ahora obtenemos una grfica de la respuesta en funcin del tiempo. Estos grficos se denominan electroferogramas. Otros nombres son electroforetograma, electro-ferograma y, simplemente, ferograma. DISCUSIN. En la presente prctica realizamos la separacin de protenas por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida. Para poder llevar a cabo dicha separacin tuvimos que preparar el soporte el cual est conformado del gel separador y del gel empacador. Para el gel separador cada equipo prepar un sistema con concentracin diferente de acrilamida (realizando las mediciones de las soluciones de manera cuidadosa debido a que

son sustancias neurotxicas). La razn porque se prepararon diferentes concentraciones de acrilamida se debe a que al mismo tiempo se est variando la concentracin final de bisacrilamida en el medio. Como ya se mencion anteriormente, una alta concentracin de bisacrilamida tiene como resultado que el tamao del poro del gel sea pequeo debido a que hay un mayor nmero de entrecruzamientos entre las cadenas de poliacrilamida. Dicha reaccin fue catalizada por el TEMED (tetrametiletilendiamina) que brinda radicales al medio para que la reaccin de polimerizacin entre acrilamida y bisacrilamida sea ms rpida. En el momento de hacer la mezcla de acrilamidas con el TEMED se tuvo un especial cuidado de no formar burbujas debido a que el oxgeno presente e el aire inhibe la polimerizacin, es por esto que es un paso importante adicionar agua hasta cubrir la superficie del gel cuando ya lo colocamos dentro de su marco para formar una especie de sello que impida el paso del aire. Posteriormente preparamos el gel empacador y lo adicionamos hasta el borde de las placas despus de que el gel empacador hubiera polimerizado, colocando tambin el peine formador de pozos. Cuando el gel empacador polimerizo colocamos las placas en la cmara donde se llevara a cabo la electroforesis cuidando de sellarla perfectamente sin que hubiera ningn tipo de fuga para poder colocar de forma segura la sustancia reguladora, cuidando de que no quedaran burbujas de aire ente sta y el gel. Ya habiendo montado la cmara aplicamos las muestras (25 L) en los pozos formados con el peine. Las muestras ya se encontraban mezcladas con azul de bromofenol, el cual no tie a las protenas, pero nos ayuda a poder observar como van corriendo las protenas conforme transcurre el tiempo de separacin. Conectamos los electrodos a la fuente de poder y a la cmara electrofortica y graduamos el voltaje a 80V mientras las muestras se encontraban en el gel empacador, aumentando el voltaje hasta 180V cuando penetraron al gel separador. Es aqu donde podemos observar la razn de colocar dos geles: el gel empacador permite que las protenas se compacten y entren al mismo tiempo al gel separador y puedan as partir desde un mismo punto para poder despus evaluar su distancia promedio recorrida. Cuando conectamos los electrodos, aunque no podamos observar a simple vista que se estaba llevando a cabo la separacin, podamos comprobarlo debido a que en la cmara hay dos alambres que burbujean al momento de pasar la corriente elctrica, esto es, liberan H 2 y O2 debido a que se produce una electrolisis por el paso de la corriente elctrica. Tambin, podemos deducir en el corrimiento, que las protenas trabajadas tienen cargas negativas debido a que se dirigen hacia el nodo (con carga +) de la cmara electrofortica. Cabe mencionar, que en el momento del corrimiento, aunque sabemos que al aumentar el voltaje aumente la velocidad de migracin de las partculas. Cuando las muestras corrieron aproximadamente 1cm antes del borde inferior del gel, apagamos la corriente elctrica. Inmediatamente retiramos nuestros geles para poder medir las distancia recorridas por el azul de bromofenol. Despus fijamos las protenas separadas por medio del TCA, ya que, aunque ya no hay una corriente elctrica que impulse a las protenas, toda va siguen teniendo cierta movilidad (mnima); dicho TCA las desnaturaliza y brinda un medio cido, pudiendo observar dicho cambio por medio de un cambio de color del azul de bromofenol a un tono amarillo. Cabe aclarar que la gelificacin tardo cuarenta y cinco minutos debido a que los reactivos ya haban prdido ciertas propiedades, o por estar mucho tiempo almacenados, por lo que otro fenmeno no esperado fue el de que se nos form una burbuja y provoc una invaginacin lo que hizo que no corriera un poquito mas, sin embargo si observamos el efecto de separacin de las protenas involucradas asi como sus respectivas bandas. Cuando las protenas ya se encontraban fijas pudimos teirlas con Azul de Coomassie, el cual nos permitira observar el nmero de bandas (o de protenas) separadas. Posteriormente adicionamos un poco de agua destilada para eliminar el exceso de colorante y poder identificar con una mayor claridad las bandas.

Al comparar los geles observamos que en los geles donde el %T era mayor, la distancia recorrida por las protenas haba sido menor debido a que el tamao del poro era pequeo, pero mostraban un mayor nmero de bandas para cada compuesto. A partir de esto pudimos concluir que el mejor tamao de poro para el suero sanguneo corresponde a 12.5%T y siendo para el yogurt 12.5 %T y la clara de huevo 12.5%T; ya que permite que haya una mejor separacin de las protenas. Por medio del clculo de las distancias recorridas pudimos calcular las movilidades electroforticas relativas promedio (M) para poder construir la Grfica de Ferguson. Las movilidades graficadas a cada %T tienen una tendencia lineal con pendiente negativa. Por medio de regresin lineal obtuvimos los valores de la pendiente de cada recta y su valor de ordenada al origen. Llevamos a cabo esto debido a que la pendiente de las rectas nos da una idea del tamao molecular relativo de la protena y la ordenada al origen nos permite comparar la carga total relativa. En nuestro caso determinamos que el suero sanguineo tiene la protena con mayor tamao molecular relativo, al igual que una mayor carga total relativa, seguido por el yogurt y por ltimo la clara de huevo. CONCLUSIONES. Se realiz una electroforesis en gel de poliacrilamida. Se lograron separar las protenas de cada una de las muestras utilizadas. Se realiz una grfica de Ferguson para poder ver que protena tena el mayor tamao. La protena ms grande es la del suero sanguneo, seguido por el yogurt y finalmente por la clara de huevo. Con la grfica de Ferguson tambin se determin sus cargas teniendo la mayor carga el suero humano, seguido por el yogurt y finalmente por la clara de huevo. Se determin el nmero de bandas para cada muestra que pueden ver en la tabla No. 3. Se concluy que el tamao del poro ptimo para la buena separacin de cada una de las protenas es de 12.5 %T Si las protenas estuvieran mezcladas el tamao de poro ptimo para su buena separacin sera de 7.5 %T. El TEMED es un catalizador que brinda radicales libres al medio los cuales permiten que la reaccin de polimerizacin se lleve a cabo de una manera ms rpida.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
http://www.micro.ucr.ac.cr/13_PAGE.pdf http://webpages.ull.es/users/fcorzo/electroforesis/Texto%20htm/08.htm http://fbio.uh.cu/enzimol/Archivos/electroforesis.ppt#266,11,Diapositiva 11 http://www.ing.ula.ve/~analui/Archivos/Electroforesis.pdf http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml#ele Harris, Daniel C. Anlisis Qumico Cuantitativo. Editorial Revert S.A. 2 Edicin; pag. 749 Rubinson, Kenneth A & J.F. Rubinnson. 2001. Anlisis Instrumental. Editorial Prentice Hall. Madrid, Espaa; pag. 722-730