Fundamentos da Tcnica de PCR Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao servio da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califrnia, recebeu o prmio

Nobel da Qumica pelo desenvolvimento de um mtodo que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta tcnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a reas como o diagnstico de doenas, medicina forense, entre muitas outras para alm da Investigao em Biologia. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction - reaco em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicao de DNA que ocorre in vivo. Durante o PCR so usadas elevadas temperaturas de forma a separar as molculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo ento a ligao de oligonucletidos iniciadores (primers), tambm em cadeia simples e geralmente constitudos por 15 a 30 nucletidos, obtidos por sntese qumica. Para amplificar uma determinada regio so necessrios dois iniciadores complementares das sequncias que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuao da DNA polimerase durante a sntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar (figura 1).

Para realizar PCR so necessrias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampo salino contendo a polimerase, oligonucletidos iniciadores, os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura submetida a vrios ciclos de amplificao que consistem em:

Desnaturao do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 90-95C), de modo a separar as duas cadeias Hibridao dos primers - associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associao, a mistura de reaco arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar) Elongao - extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72C)

O processo envolvendo estes trs passos, pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura 2). Em teoria, se for possvel levar a cabo 25 ciclos de

amplificao seguidos, a concentrao de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prtica, devido a alguma ineficincia no processo de amplificao, esse aumento fique por um milho de vezes.

Como na tcnica de PCR se encontram envolvidos vrios ciclos de amplificao, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contnua e automatizada, os vrios ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizvel, as DNA polimerases utilizadas devero ser termoestveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termoflica Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase), que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reaco. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado aps electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparao com padres lineares de DNA. Vantagens e limitaes O segredo do sucesso da PCR reside na capacidade de amplificar uma sequncia precisa de DNA aliada sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade. No necessrio isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que se encontre misturado com DNA de outras espcies), uma vez que a especificidade da PCR dada pelos primers. uma tcnica rpida, barata e segura. Contudo, a PCR tambm tem limitaes, como a necessidade de conhecer a sequncia de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers especficos. Outras desvantagens so a relativa facilidade com que ocorre contaminao da amostra por DNA estranho (uma vez que se trata de uma tcnica muito sensvel) e a limitada extenso da sequncia que possvel amplificar ( difcil aplicar a PCR a sequncias maiores do que 5kb). Pode tambm ocorrer incorporao errada de bases durante a replicao.

Aplicaes Os resultados da PCR so teis no diagnstico, prognstico, determinao da terapia a ser utilizada, e at mesmo na avaliao da susceptibilidade a doenas. A PCR frequentemente utilizada na deteco de polimorfismos, mutaes pontuais e infeco por microorganismos bacterianos ou virais antes da exteriorizao patolgica da sua presena. particularmente importante na deteco da SIDA, pois consegue detectar o vrus HIV nas primeiras semanas aps a infeco e mais rapidamente do que o mtodo normalmente utilizado, o teste ELISA. A PCR procura directamente pelo DNA do vrus enquanto que o teste ELISA mais indirecto, pois procura anticorpos que o organismo possa ter produzido contra o vrus. Outro exemplo de aplicao da PCR no DPI (diagnstico pr-implantatrio) e no DPN (diagnstico pr-natal). A PCR pode ser usada em DPN em idades gestacionais to precoces como as 9 semanas, permitindo, por exemplo, a deteco de clulas de um feto masculino em circulao no sangue materno, ainda que exista em quantidades muito reduzidas, e averiguar a compatibilidade entre o grupo sanguneo da me e do feto. Permite ainda a deteco de vrias anormalidades cromossmicas como a trissomia 21. Este exame ao diagnosticar previamente certas doenas, possibilita que os pais e equipa de sade decidam antecipadamente a melhor atitude a tomar em relao a cada caso.

Importancia do controlo positivo e negativo Sempre que utilizada esta tcnica de ampliao realiza-se sempre um controlo negativo e se possvel um positivo. A amostra de controlo negativo realizada com a mesma mistura que a amostra em anlise com excepao do DNA molde, de modo a controlar a ocorrncia de contaminaes nas solues utilizadas. O controlo positivo permite confirmar a eficincia da metodologia. Fundamentos da Tcnica de PCR Tiago Para realizar PCR Minhota Vantagens e limitaes Rafa Aplicaes - Muhammad