Introduction

La bactriologie fait partie de la microbiologie, cest une science qui tudie les microorganismes (bactries). Invisible lil nu elles sont de lordre du micromtre, il est donc ncessaire de les tudier au microscope photonique (objectif immersion x 1000) mais elles peuvent tres observes par microscopie lectronique ( balayage ou transmission) pour la recherche. Les bactries font partie du rgne des monomres, ce sont des procaryotes (opposs au eucaryotes qui ont un noyau) ayant un ADN circulaire. Elles peuvent vivres de faon isole dans lenvironnement (eau, sol, aire) mais aussi dans des milieux extrmes (hautes tempratures, concentration en NaCl ou Soufre trs leve ). Mais on en trouve aussi vivant de faon symbiotique (Commensable) ou pathogne (exemple Bacilles de Koch : maladie du charbon). Elles sont utilises aussi dans des domaines comme la pharmacologie, lagro-alimentaire (yaourt), les recherches gntiques. Nous avons effectu trois sances de travaux pratiques qui ont pour but de nous familiariser aux diffrentes techniques ncessaires une identification dun mlange bactrien (numrot 7). Nous allons donc adopter une dmarche didentification proche des laboratoires danalyses mdicales sur notre mlange.

II.

Mthodes

1) Repiquage de la culture Le repiquage des bactries est ncessaire pour obtenir un nombre de bactrie correcte pour les analyses. Le repiquage se fait par la culture de bactries dans un milieu nutritif 37 C pendants 24 heures. Cette tape na pas t effectue par nos soins lors de ses sances de travaux pratiques. 2) Observations microscopiques La premire tape est lobservation microscopique, elle se fait en deux temps. Il y a tout dabord lobservation microscopique ltat frais (objectif immersion x 1000), les bactries sont vivantes, on peut alors dterminer des caractres tel que la morphologie gnrale, la mobilit et le groupement (bacille ou coque) ainsi que le type de colonies. Mais pour mieux les caractriser nous allons effectuer une coloration de Gram, cette coloration diffrentielle est base sur la paroi des bactries qui peuvent avoir une couche de pectidoglycane mince ou paisse. Si la bactrie possde une couche de pectidoglycanne paisse elle va fixer le violet de gentiane-lugol et donc avoir une paroi colore en violet elle est dite de Gram +. Par contre si elle possde une couche de pectidoglycanne mince elle va fixer la fuchsine elle sera donc colore en rose elle est dite Gram -. Les manipulations doivent tre faites dans des conditions de strilisation optimales (atmosphre strile autour du bec benzne, strilisation des ustensiles, et lavage des mains) pour viter toute infection dautres espces bactriennes non tudies. 3) Isolement des bactries Aprs lidentification au microscope des diffrents types bactriens, on cherche isoler les bactries du mlange pour permettre de les identifier. Pour cela nous allons utiliser la technique disolement par strie sur glose coule dans des boites de ptris (la mthode disolement par puisement de la semence cf. schmas 1).
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Nous allons coupler cette technique disolement des bactries lutilisation de milieux de culture slectif des groupes de bactries. Nous allons utiliser trois milieux slectifs prsentant des caractristiques diffrentes et un milieu non slectif qui nous permettra lobservation macroscopique de toutes les colonies. Milieu non slectif qui est une Glose Nutritive Ordinaire (GNO): il est utilis pour lobservation macroscopique des diffrentes colonies de la semence, on va pouvoir dcrire les colonies, le nombre despces du mlange correspond au nombre de colonies diffrentes prsentent dans le milieu non slectif. Toutes les colonies se dveloppant hors des stries disolements serraient une contamination possible. Milieu de glose losine et au bleu de mthylne (EMB) : ce milieu permet le dveloppement des entrobactries, le bleu de mthylne inhibe les bactries Gram +, et grce losine (indicateur de pH) on peut dterminer si les entrobactries prsentent peuvent dgrader le lactose suivant les modalits suivantes : - Colonies violettes ou noires : Lactose + - Colonies de couleur claire : Lactose - Colonies violets ples avec atmosphre : faible Lactose +. Milieu de Chapman : ce milieu est slectif pour les bactries halophiles cest dire les staphylocoques ou les microcoques. Lutilisation du mannitol par les bactries est marque par une coloration jaune autour des colonies Mannitol + et une coloration rouge autour des colonies Mannitol , du lindicateur de pH du rouge de phnol. Milieu D-coccosel (DC) : milieu slectif pour les coques Gram+, mais on lutilise pour lisolement des streptocoques, entrocoques, bactries capables de provoquer des infections urinaires. Lutilisation par les entrocoques de lesculine (glycide) donne une coloration noirtre du milieu avoisinant les colonies. Cette coloration est spcifique des streptocoques du groupe D. Les boites de ptris sont places dans une tuve 37C pendants 24 heures et sont ensuite places au rfrigrateur en attendant lobservation durant une semaine. Lisolement des bactries dans le milieu non slectif va nous permettre dobserver les diffrentes colonies et de dterminer les caractristiques tel que : leur forme, leur opacit, leur taille, leur couleur et laspect de surface. Ainsi nous pourrons savoir le nombre despces prsentes dans le tube N7. Les diffrentes colonies seront ensuite observes au microscope (frais et coloration de Gram) afin de vrifier s'il y a la prsence dun seul type de bactries par colonie, mais aussi si nous avons les mmes bactries que lors de la premire observation. Pour affiner nos recherches didentification des types bactriens, on va rechercher des caractristiques Biochimiques. Pour cela nous avons recourir des testes biochimiques tel que lAPI20E pour les entrobactries, DNAse, Cogulase catalase pour les staphilocoques aureus. Mais pour ce TP, on va chercher le type respiratoire du cocci de notre mlange par le test Viande-Foie et nous ferons ensuite un test de rsistance aux antibiotiques du bacilles. 4) Test Viande Foie Ce test permet de dterminer le type respiratoire des bactries prsentes dans notre mlange bactrien N7. Ce test est ralis sur les bactries type cocci qui ont t prleves dans le milieu slectif appropri prcdemment (Chapman). Ce test seffectue dans un tube prsentant de la glose Viande-Foie (VF), on y introduit la semence avec une pipette pasteur en effectuant un mouvement spiral de bas en haut. Les bactries arobies strictes se

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dveloppent proche de la surface du tube tandis que les aroanarobie se dveloppent dans tout le tube. 5) Test de rsistance au antibiotiques Nous allons par la suite tester lefficacit dantibiotiques sur les bacilles de notre mlange. Pour cela nous allons utiliser une glose Mueller Hinton (MH) dans une boite ptris ensemence par les bacilles prlevs dans le milieu EMB (pralablement dilu dans de leau strilise) on disposera alors des pastilles dantibiotiques diffrents (6 pour une boite de ptris) suivant la disposition du schmas II. Aprs tuvage 37 C pendants 24 heures nous pouvons obtenir des diamtres sans bactrie (zone dinhibition) autour des pastilles dantibiotique. Si ce diamtre est infrieur au d annonc par le fabricant de lantibiotique la bactrie est dite rsistante celui ci, par contre si le diamtre est suprieur au D elle est dite sensible, entre d et D la bactrie est dite intermdiaire.

III.

Rsultats

1) Observation microscopique Technique Etat frais Coloration Gram Type bactrien I Bacilles immobiles Bacilles Gram- bouts ronds - Coloration bipolaire - Pas de spores - Groupement par 1 ou 2 (diplobacilles) 50 % Type bactrien II Cocci immobiles Coques Gram+ - en amas irrguliers (quelquesuns un en grappes de raisins) - Ovodes 50 %

Proportion

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2) Isolement des bactries sur milieu slectif Observation de lisolement des bactries sur le milieu non slectif GNO : Colonies type I Colonies type II Caractristiques de - Forme circulaire - Forme circilaire laspect - Couleur Beige - Couleur blanche macroscopique des - Opacit translucide - Opacit opaque colonies - Taille 1 2 mm - Taille 1 1.5 mm - Aspect brillant - Aspect brillant - Relief convexe - Relief plat Coloration de Gram - Bacilles - Coques de chaques colonies - Gram - Gram + - A bouts ronds - Amas irrguliers - Par 2 - Ovode - Pas de spores - Petite taille - Coloration bipolaire Test milieu slectif Observation de colonies viollettes EMB de petites tailles, la prsence de la colonie et la couleur violette permet de dire que cette bactrie est une enthrobactrie, et quelle utilise le lactose donc Lactose +. Test milieu slectif Prsence de petites colonies, le Chapman milieu est orang, il ny a pas eu de virage au jaune donc pas de Mamnitol (Mamnitol -) Test milieu slectif Pas de colonie sur ce milieu donc D-C pas streptocoques 3) Test Viande Foie Lobservation du test viande foie nous montre un dveloppement important des bactries proches de la surface du tube, mais une observation plus pousse du tube montre la prsence de quelques colonies sur toute la surface du tube ce qui nous laisse penser que les coques que nous avons sont aeroanarobie ( dominance arobie). 4) Test rsistance au antibiotiques Rsultats : Antibiotique Diamtre mesur d Ttracycline 10 mm 17 mm Amplicilline 15 mm 11 mm Kanamycine 28 mm 15 mm Acide 28 mm 15 mm Nalidixique Rifampicine 21 mm 14 mm Streptomycine 19 mm 13 mm

D 19 mm 17 mm 17 mm 20 mm 19 mm 15 mm

Sensibilit Rsistante Intermdiaire Sensible Sensible Sensible sensible

On remarque que le bacille est rsistant un seul antibiotique (Ttracycline) et sensible aux autres antibiotiques except lAmplicilline qui a une position intermdiaire.
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IV.

Interprtations

La premire observation microscopique que nous avons ralis avant les autres tudes nous a permis didentifier deux groupes de bactries : un bacille Gram et une coque Gram +. Le bacille que nous avons dans le mlange se prsente en groupement de un ou deux (diplobacilles), lobservation aprs coloration de Gram rvle que ces bacilles sont Gram et prsentant une coloration bipolaire. Lobservation microscopique des colonies se dveloppant sur le milieu EMB (qui est propre aux bacilles Gram -) est identique celle effectue lors de la premire observation, et le fait que ces bacilles aient une couleur violette nous indique que nous avons un entrobactrie synthtisant du lactose donc Lactose + ce qui est confirm par le fait que les entrobactries sont des bacilles Gram -. IL est donc vident que nous avons l une entrobactrie lactose + qui est sensible 4 antibiotiques sur les 6 tests (Ttracycine, Kanamycine, Acide nalidixique, Rifanpicine et Streptomycine) si ce bacille tait pathogne on utiliserait un de ces antibiotiques. Si lidentification du bacille et relativement simple celle du cocci lest beaucoup moins. La bactrie que nous avons l est une coque Gram , et daprs les observations microscopiques la dtermination du groupe ou de la famille en est plus difficile. On sait que ce coque nest pas un streptocoque car il ne se dveloppe pas sur le milieu slectif DC, qui permet seulement le dveloppement des streptocoques D. Il reste alors deux solutions, nous avons donc la possibilit entre un microcoque o un staphylocoque. Lobservation microscopique ne permet pas de les diffrentier car nous avons une rpartition irrgulire et une rpartition en grappe de raisin qui correspondent aux deux types de bactries que nous envisageons. De plus le test de Viande-Foie aurait pue nous permettre de trancher la question mais le test est ambigu nous avons un dveloppement important au niveau suprieur mais on remarque la prsence de colonies (en faible quantit) dans tout le tube. Si le coque en question et arobie stricte alors cest un microcoque mais si le coque est anaroarobie cest un staphylocoque. La culture sur milieu slectif Chapman est elle aussi ambigu le virage du milieu au jaune nest pas net et ne nous permet pas de trancher sur la question. Cette ambigut peut tre due au temps o les cultures sont stockes au rfrigrateur, ce qui pourrait alterner ou altrer les couleurs (malgr les basses tempratures) issue de la culture. Des tests supplmentaires tels que la DNase , la coagulase ou galerie API staph permettraient didentifier ce coque Gram +. Mais si nous considrons que le teste de Viande-Foie montre un coque anaroaroabie et que nous considrons aussi que le virage du jaune a t atteint (donc Mamnitol +) nous pouvons dire alors que nous avons un staphylocoque.

Conclusion
Dans notre mlange bactrien, nous avons une souche bactrienne de type bacille Gram -: une entrobactrie lactose + , et un coque Gram + de la famille des micrococcaceae. Lentrobactrie lactose + est aussi appele coliformes, elles sont les tmoins dune contamination humaine dans les produits alimentaires. Lutilisation dun des antibiotiques don nous avons test la sensibilit lors de ce TP permettrait de contrer une infection, le fait que notre bacille soit sensible quatre des six antibiotiques est intressant dans le cas o le bacille tolrerait un de ces antibiotiques. Cest travaux pratiques nous ont donc permis de comprendre les mthodes utilises dans les laboratoires danalyse pour dterminer les bactries lorigine des infections ou des intoxications.

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