Esterilizacin Es conveniente, al tratar este tema, dar una definicin clara del trmino y de otros relacionados, ya que a veces

suelen producirse confusiones.

Esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios fsicos, por ejemplo, filtracin, o por muerte de los organismos por calor, productos qumicos u otra va. Esta definicin excluye por lo tanto cualquier tcnica que resulte solamente en un dao a los microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo. La palabra desinfeccin se aplica a la remocin o destruccin por cualquier va de organismos vivos que pueden causar dao particular o infeccin. No significa por lo tanto la destruccin de todos los microorganismos, sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no deseado. Un antisptico es un desinfectante, o sea un agente qumico usado para destruir microorganismos dainos. Se utiliza en general para agentes a ser aplicados en animales o humanos. Asepsia es la exclusin continuada de microorganismos contaminantes. As por ejemplo el cultivo de microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo aspticamente como en muchas fermentaciones industriales. El medio de cultivo es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado con el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en condiciones aspticas. Pasteurizacin es el trmino aplicado al proceso que se utiliza para la destruccinde algunos de los microorganismos posiblemente presentes en materiales sensibles al calor como la leche y cerveza. Consiste en calentar la leche, por ejemplo a 62 C, mantenerla a esta temperatura 30 minutos y despus enfriarla lo ms rpidamente posible. Esta tcnica no es de ninguna manera un procedimiento de esterilizacin. Es solamente un mtodo para destruir organismos patgenosy al mismo tiempo disminuir el nivel de aquellos organismos que ms pueden deteriorar la leche.

La razn fundamental para efectuar la esterilizacin en Microbiologa Industrial es para evitar la competicin por los nutrientes en medios de cultivo y permitir as que el cultivo de microorganismos especficos que se utilizan en un proceso de fermentacin de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos especficos. Mtodos de esterilizacin Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos: a. Por destruccin total de microorganismos; b. Por muerte o inactivacin; y c. Por eliminacin con medios fsicos. Por destruccin total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicacin de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto sta metodologa, aunque es efectiva, est muy restringida en su empleo. La muerte o inactivacin significa la eliminacin de microorganismos sin que exista necesariamente desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por calentamiento, seco o hmedo, por radiaciones o por agentes qumicos. El calor hmedo, generalmente en forma de vapor bajo presin, es muy til y de gran valor en la esterilizacin en el laboratorio, que se efecta en autoclave, o en la industria cuando se

esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentacin. En el caso de los autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmsferas. En escala grande el equipo de produccin es esterilizado con vapor saturado bajo presin, y la presin requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como ocurre tambin en el caso de los autoclaves) porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Despus de la esterilizacin se mantienen las condiciones aspticas, haciendo pasar vapor por las vlvulas y sellos. La eliminacin fsica est restringida a la esterilizacin de gases lquidos, y es fundamentalmente llevada a cabo por filtracin mediante filtros absolutos o filtros fibrosos. Los filtros absolutos son de materiales cermicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan pequeos que la penetracin de los microorganismos no es posible. Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y esteres de celulosa, siendo las fibras de un dimetro variable de 0.5 a 15 micrones. Cintica de la esterilizacin por calor La cintica de la esterilizacin por calor hmedo, que es la nica que consideraremos en sta monografa por su aplicacin a la esterilizacin de medios de fermentacin, est caracterizada bastante aproximadamente por una reaccin cintica de primer orden. Si No es el nmero de organismos viables presentes inicialmente y N es nmero viable al final tendremos que la ecuacin de velocidad de muerte ser:

es la fraccin de organismos viables que sobreviven despus del tratamiento por calor durante el tiempo t y K = constante de velocidad de destruccin, que depende de la temperatura segn la clsica ecuacin de Arrhenius:

donde

A = constante E = energa de activacin R = Constante general de los gases T = Temperatura en grados Kelvin

Si se grfica el In k en funcin de 1/T se obtendr una lnea recta, siendo la inclinacin igual a -E/R y la interseccin de la recta con la ordenada, el valor de la constante de Arrtherius. La ecuacin de velocidad de muerte necesita una aclaracin, ya que la misma no admite una disminucin del nmero de organismos a cero, porque si N es cero, t debera ser infinito. Para resolver este problema supongamos que N = 0.1 y calculemos el valor correspondiente de t. No podemos decir que despus de ese tiempo sobrevivir una dcima parte de un microorganismo, pero si podemos decir que habr slo una probabilidad de 1 en 10 de que sobreviva un microorganismo. Ya veremos que por razones de seguridad podemos fijar el valor de N = 0.001 o sea fijar una probabilidad de 1 en 1000 de sobrevivencia.

La figura 9 muestra una curva tpica de la esterilizacin en "batch" de un medio en un fermentador. La curva AB represen ta la etapa de calentamiento, la parte BC corresponde a la etapa de mantenimiento y CD es la etapa de enfriamiento. Durante la primera y ltima etapa ocurre parte de la destruccin trmica de organismos presentes en el medio debido a que se alcanza temperatura elevada sobre todo en la ltima parte de la curva AB y la primera parte de la curva CD. Se considera que la temperatura a partir de la cual se produce destruccin de esporos es 100 C. Por lo tanto tendremos eliminacin de esporos de 100 a 120 C durante la etapa de calentamiento y de 120 a 100 C durante la correspondienteal enfriamiento. Los tiempos de calentamiento y enfriamiento varan de acuerdo al volumen del equipo. En fermentadores industriales de 60.000 1 por ejemplo esos tiempos estn en el orden de 28-30 min. y 11-14 min. para los perodos de calentamiento y enfriamiento respectivamente. En la prctica de la esterilizacin es necesario tener presente que la calidad nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible, razn por la cual, es imprescindibledisear un ciclo de esterilizacin lo ms efectivo posible pero al mismo tiempo lo ms corto posible. Podremos definir un trmino (V) que representa la magnitud de la disminucin del nmero de organismos viables de manera que:

para el perodo de calentamiento y de enfriamiento con el fin de calcular la cantidad de esporos que se eliminan durante ambos perodos. Conociendo el valor inicial de esporos presentes en el volumen de medio considerado es posible calcular el tiempo de mantenimiento a 120 C para la esterilizacin completa del mismo. Existen datos, en bibliografa, de clculo de tiempo de mantenimiento para la esterilizacin de 45.000 l de medio (con un valor de No = 2 x 107 esp/ml) que demuestra que son necesarios solamente 8.8 min como tiempo de mantenimiento a 120 C. Debe tenerse en cuenta que estas consideraciones son vlidas para el clculo del tiempo de esterilizacin mnimo, a 120 C, en fermentadores industriales del volumen considerado. En el caso del laboratorio cuando utilizamos un autoclave y deseamos esterilizar distintos recipientes con volmenes diversos de medio, el tiempo de calentamiento y de enfriamiento no son generalmente considerados, salvo en el caso de equipos que tengan un perodo de calentamiento y de enfriamiento prolongado, los que por otra parte no son recomendados para su uso en el laboratorio. Lo que es importante en este caso es el tipo de recipiente, su geometra y el volumen de medio a esterilizar. El tiempo de esterilizacin (o sea el tiempo de mantenimiento a 120 C) requerido por ejemplo para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min y para tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de 2000 ml requieren de 30-35 min mientras que si son de 125 ml el tiempo es de 12-14 min. En cambio un frasco pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y una botella de suero de 9000 ml 50-55 min. Estos tiempos aseguran la eliminacin de esporos bacterianos de las especies ms resistentes. Conservacin de la calidad nutriente Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentacin utilizados en la industria son casi siempre complejos y a menudo con slidos en suspensin, de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilizacin pueden ser importantes. A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilizacin.

Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilizacin 50 a 60 min se producen prdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede producir un efecto beneficioso. La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio, durante la esterilizacin por calor, depender no solamente de la naturaleza de los componentes sino tambin de la temperatura, duracin del calentamiento, pH del medio, y de la agitacin. Un ejemplo tpico de interaccin es la reaccin de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los azcares con los grupos amino de protenas, aminocidos, etc. Se forman as productos de condensacin con lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y nitrgeno amnico. Por ese motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados orgnicos. Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se volatiliza. En medios qumicamente definidos se puede observar prdida importante de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitacin de sales poco solubles como MgNH4PO4 , MgKP04 y MgNaP04. Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos. Los aminocidos y factores de crecimiento son muy lbiles al calor. Entre los aminocidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre las vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son las ms susceptibles de sufrir descomposicin. En todos estos casos es aconsejable disolverlas separadamente en pequeos volmenes de H2O y luego esterilizarlas por filtracin.

Como ya dijimos es fundamental, adems de esterilizar correctamente los medios, conservar al mximo la calidad nutriente de los mismos. En la misma forma que la inactivacin de microorganismos puede ser considerada una reaccin cintica de primer orden, tambin la destruccin de algunos compuestos sensibles al calor puede ser tratada en la misma forma. La energa de activacin de tales reacciones est generalmente en el rango de 10.000-30.000 cal.mol-1 mientras que la correspondiente a la destruccin trmica de esporos es superior (65.000-85.000

cal.mol-1 ). Una representacin grfica dara una lnea recta para ambos casos con valores distintos de pendientes segn se aprecia en la Fig. 10. La figura muestra que a medida que la temperatura aumenta, el valor de k para la reaccin con baja E (curva A) aumenta ms lentamente que en el otro caso. Esto significa que un aumento de la temperatura acelera la destruccin de esporos ms que la degradacin de nutrientes. Recordando la ecuacin anterior:

vemos que el tiempo requerido para la destruccin de esporos decrece en proporcin al aumento de k. Por lo tanto si se emplea alta temperatura para la esterilizacin se requiere un tiempo menor, por lo cual se concluye que la esterilizacin llamada de alta temperatura-corto tiempo favorece la conservacin de la calidad nutriente al mismo tiempo que produce la destruccin efectiva de los esporos. Es necesario aclarar que el uso de alta temperatura con tiempos cortos en escala grande implica necesariamente el empleo de un sistema de calentamiento y enfriamiento continuo en lugar de proceso de esterilizacin en batch. En los prximos tres captulos trataremos los aspectos bsicos correspondientes a estequiometra, cintica de crecimiento y formacin de productos, sistemas de cultivo y aspectos generales de biorreactores.

Metabolismo Bacteriano
Las bacterias se encuentran en casi todos los ambientes e intervienen en varios procesos biolgicos. Por ejemplo, pueden producir luz, como en la fosforescencia de los peces muertos y pueden producir combustin espontnea en almiares, pajares y graneros de lpulo. Ciertas formas anaerobias desprenden, por descomposicin de la celulosa, gas de los pantanos en charcas estancadas; otras bacterias favorecen la formacin de depsitos de hierro ocre y manganeso en los pantanos. Las bacterias tambin afectan a la naturaleza y composicin del suelo. Como resultado de su actividad, los restos de sustancias orgnicas de las plantas y los animales se descomponen en partculas inorgnicas. Este mecanismo es una fuente importante de alimento para las plantas. El proceso fotosinttico en que se basan las plantas fue, casi con certeza, desarrollado en primer lugar en las bacterias; el reciente descubrimiento de una bacteria fotosintetizadora denominada Heliobacterium chlorum puede ayudar a la comprensin de este desarrollo fundamental en la evolucin de la vida. Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. A este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran nmero de reacciones qumicas destinadas a transformar las molculas nutritivas en elementos que posteriormente sern utilizados para la sntesis de los componentes estructurales; como pueden ser las protenas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la energa que est contenida en una reaccin qumica en algn proceso que requiera de energa, como puede ser el trabajo o el movimiento. Es evidente que los nutrientes son transformados cuando entran en un organismo, ya que en ningn caso el alimento contiene todas las molculas que una clula requiere. Esto se vio con claridad al observar el crecimiento normal de levaduras en un medio de cultivo que slo contena glucosa como nica fuente de energa. As pues, se pens que la sntesis de todos los componentes celulares se llevaba a cabo en el interior de las levaduras. Hoy sabemos que las transformaciones que sufre la glucosa no ocurren en un solo paso, sino que, por el contrario, se forman varios productos intermedios que en muchas ocasiones no tienen una funcin especfica a no ser la de formar parte

de lo que se conoce como va metablica. La transformacin de los nutrientes en compuestos tiles para la subsistencia de un organismo se lleva a cabo por medio de las reacciones qumicas que realizan unas protenas conocidas como enzimas. Objetivos: Estudiar el metabolismo de tipos bacterianos representativos que reflejan los cambios producidos en la fermentacin de la glucosa, lactosa, manitol, hidrlisis de urea, citrato, produccin de sulfuro de hidrgeno, produccin de indol, y la hidrlisis de protenas (gelatina). Mostrar las vas metablicas que varias especies tienen en comn y que sirven de base para su diferenciacin.

Procedimiento: Disponer los tubos en las gradillas y rotularlos con el nombre del microorganismo. Inocular cada tubo con uno de los cultivos, procurando hacerlo con el asa indicada y de la forma indicada (punta sin mover, superficial, picadura, etc.) Incubar a 37C por 18 hrs. y luego leer los resultados.

Resultados:

Germen S. aureus E. Coli Enterobacter S. Faecalis Proteus vulgaris Salmonella paratyphy Bacillus subtilis Conclusiones:

Glucosa Lactosa Citrato Manitol Indol H2S Gelatina Urea Motilidad + + + + + + + + + con gas + con gas + sin gas + + + + + + + + +/+ + + + + + + + +/+ + -

Como podemos notar en la tabla de resultados todos los microorganismos son tolerantes a la glucosa y son capaces de fermentarla. En la reaccin con lactosa no todos los microorganismos la fermentan, podemos notar que algunos liberan gas que es el hidrogeno. En la prueba del citrato la realizamos tambin para comprobar si los microorganismos podan utilizar el citrato como nica fuente de carbono, provoca alcalinizacin del medio. En la prueba con el agar manitol ya que este presenta rojo fenol que es un indicador de pH solo tendra que reaccionar con Staphylococcus aureus ya que es uno de los microorganismos que fermenta el manitol. En la prueba con el agar urea podemos notar que el nico microorganismo que reacciona es el Proteus vulgaris ya que este produce ureasa que es la enzima que permite hidrolizar la urea.

Esterilizacin y desinfeccin La esterilizacin es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas

esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporas, y virus. Se entiende por muerte, la prdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo. Se trata de un trmino absoluto, donde un objeto est estril o no lo est, sin rangos intermedios. En la desinfeccin se eliminan los agentes patgenos reconocidos, pero no necesariamente todas las formas de vida microbianas. Es un trmino relativo, donde existen diversos niveles de desinfeccin, desde una esterilizacin qumica, a una mnima reduccin del nmero de microorganismos contaminantes. Estos procedimientos se aplican nicamente a objetos inanimados. La antisepsia es el proceso que por su baja toxicidad, se utiliza para la destruccin de microorganismos presentes sobre la superficie cutneo-mucosa. Este trmino tampoco implica la destruccin de todas las formas de vida. Existen agentes como los alcoholes que son antispticos y desinfectantes a la vez. Dado que el tema que se est abordando es: mtodos para controlar o destruir distintas poblaciones bacterianas; es necesario saber previamente la cintica de dicha destruccin, es decir de que modo muere una poblacin, y que parmetros inciden sobre este efecto. Tcnicas de esterilizacin A. Destruccin de microorganismos mediante calor: La energa trmica es la forma ms efectiva de esterilizacin. Esta puede utilizarse como calor hmedo o seco. I. Calor hmedo: Mecanismo de Accin: Al igual que los procesos de desinfeccin, la esterilizacin trmica destruye a los microorganismos en forma gradual; es por esto que no hay un nico mecanismo de accin, sino ms bien la suma de distintos eventos complejos que se van sucediendo a medida que aumenta la temperatura. As, aunque el efecto final de la esterilizacin por calor hmedo a 121C es la desnaturalizacin y coagulacin de las protenas, son importantes otros mecanismos de destruccin, que justifican la utilizacin de calor hmedo a temperaturas inferiores, como veremos ms adelante. El primer efecto letal sera la produccin de rupturas de cadena nica en el ADN que provocaran la muerte celular por activacin o liberacin de enzimas con actividad de endonucleasas. El punto crtico aqu, para la supervivencia de la clula sera su capacidad para reparar la lesin, funcin que depende del estado gentico y fisiolgico de la bacteria. A medida que aumenta la temperatura se agregara la prdida de la integridad funcional de la membrana citoplsmica, lo que producira interferencias en el intercambio con el medio externo, los procesos respiratorios y la sntesis proteica. Por ltimo, las temperaturas ms elevadas activaran ribonucleasas que degradando el ARNr producen la prdida de viabilidad de las clulas expuestas. Las temperaturas a la cual puede usarse el calor hmedo son: Por debajo de 100CPasteurizacin. A 100C Ebullicin y Tindalizacin Por encima de 100C Autoclavado

Pasteurizacin: se utiliza para la destruccin de grmenes patgenos, con resistencia trmica similar o inferior a M. tuberculosis, Brucella y Salmonella. Este no es un mtodo de esterilizacin sino de desinfeccin, donde no se destruyen ni esporas ni virus no lipdicos (por Ej.: HAV). Existen dos mtodos de pasteurizacin: o se calienta a 65C durante 30' o a 72C durante 15". Luego ambas se enfran rpidamente a 10C. Esta tcnica se utiliza fundamentalmente en la descontaminacin de la leche.

Ebullicin: consiste en mantener un objeto o sustancia en un bao a 100C durante 30'. Aplicado as destruye la mayora de las formas vegetativas bacterianas, hongos y virus lipdicos (por Ej.: Herpesvirus y HIV). En cambio no es efectivo para la destruccin de esporos y virus no envueltos. La repeticin de este proceso durante tres das consecutivos, constituye la Tindalizacin. Su fundamento terico est dado por la destruccin de las formas vegetetivas durante los perodos de ebullicin, permitiendo que las esporas germinen durante el reposo volvindose susceptibles al prximo calentamiento. Tampoco aqu se esteriliza.

Autoclavado: utiliza vapor de agua a 121C durante 15'o 20'. Esta temperatura se logra si se obtiene una presin de una atmsfera relativa (dos atmsferas absolutas), ya que el aumento de la presin provoca aumentos proporcionales en el punto de ebullicin del agua. Es el mecanismo de destruccin microbiana ms efectivo, y bien utilizado asegura esterilizacin. El equipo que se utiliza es la autoclave, del cual existen distintos tipos, como ser: 1. Vertical de manejo manual. 2. Que opera por gravedad. 3. De esterilizacin rpida.

I.

Calor seco:

Mecanismo de accin: Es diferente al del calor hmedo. El calor seco provoca desnaturalizacin de protenas, lesiones por oxidacin y efectos txicos por niveles elevados de electrolitos. La accin letal es el resultado del calor trasmitido desde el material con el cual los microorganismos estn en contacto, y no desde el aire caliente que los rodea. Existen tres formas principales de esterilizacin por calor seco: flameado, incineracin y mediante la utilizacin del horno Pasteur, para ello se necesita alcanzar mayor tiempo y temperatura que en el autoclave, debindose mantener un objeto a 160C durante 2hs. El motivo de estos incrementos estaran dados porque la ausencia de agua disminuira el nmero de grupos polares de las cadenas peptdicas, lo que dara mayor estabilidad a las molculas bacterianas, por lo que se requerira mayor energa para abrirlas. Horno Pasteur O Poupinell: consiste en un recinto metlico de doble pared con aislante entre ambas (para evitar la prdida de calor) y una puerta. La fuente de calor suele ser elctrica y est incorporada. Posee un ventilador que facilita la circulacin del aire caliente, para homogeneizar la temperatura. Un termmetro (con alcance mnimo de 200C) visible desde afuera, registra la temperatura del interior del recinto. Por calor seco se pueden esterilizar: materiales de inyectables, vidrios, instrumentos quirrgicos y objetos metlicos, as como aceites, vaselinas y polvos, que como ya se ha dicho son impermeables al vapor. Controles de esterilizacin:

Existen tres tipos: fsicos, qumicos, biolgicos Controles fsicos: estn relacionados al operario que realiza el procedimiento y la vigilancia de ciertos parmetros como: presin, tiempo, temperatura, etc. Controles qumicos: consiste en tiras de papel con una sustancia que cambia de color al ser expuesto a la temperatura correspondiente. La ventaja de este mtodo, es la rapidez con que se sabe el resultado, ya que es inmediato. La gran desventaja es que dice poco sobre el tiempo de exposicin, por lo que no asegura un procedimiento correcto. Estos controles deben utilizarse en todos los ciclos de esterilizacin.

Controles biolgicos: consisten en exponer esporas bacterianos al ciclo de esterilizacin y luego verificar su viabilidad. Son los ms seguros. Dentro de una ampolla se encuentra un medio de cultivo apropiado para el desarrollo de las bacterias en estudio. Por fuera de esta, un tubo plstico, contiene una cinta de papel marcador de pH, impregnado con esporas de bacterias capaces de resistir temperaturas cercanas a los procesos realizados. Se utilizan esporas de Bacillus estearothermophilus en el autoclave y de B. subtilis en la poupinell. Este sistema se coloca dentro del paquete menos accesible ya sea para el calor o el vapor. Finalizado el ciclo de esterilizacin, se rompe la ampolla (por presin manual sobre el tubo), esto pone en contacto el medio con los esporos) y se incuba en un bao (a 60C para Bacillus estearothermophilus y a 37C para B. subtilis) durante ms de 48hs. Si existen microorganismos viables, su metabolismo provocar un cambio de pH que har virar el color del marcador, revelando el fallo del procedimiento, por lo que deber volverse a esterilizar todo. Este tipo de controles debe realizarse peridicamente, o cuando se dude de la efectividad del procedimiento. A. Esterilizacin por radiacin Con este fin pueden utilizarse tanto las radiaciones ultravioletas (UV) como las ionizantes y rayos infrarrojos. Con respecto a la naturaleza de la luz se acepta una combinacin entre la teora cuntica y la electromagntica. Es decir, que existe una partcula indivisible (denominada cuanto) constituida por un fotn que se desplaza a travs del espacio describiendo una trayectoria ondulatoria. La energa de un fotn es inversamente proporcional a la longitud de onda de la radiacin, sabiendo que longitud de onda es la distancia que existe entre dos puntos correspondientes de la trayectoria ondulante. Parte de esta energa absorbida por los sistemas biolgicos cuando estos son expuestos a las radiaciones. La fraccin de energa absorbida directamente proporcional a la intensidad de la radiacin, al tiempo de exposicin a la misma y a un coeficiente de absorcin que es caracterstico de cada material. Veremos qu sucede a nivel molecular cuando las radiaciones interactan con la materia. Cuando la radiacin incidente tiene energa suficiente puede elevar el nivel energtico de los electrones, hasta el punto de arrancarlos de su orbital (producindose ionizaciones). Si la energa es menor, los electrones aumentan su nivel de energa pero slo temporalmente, volviendo a su estado inicial luego de un perodo de tiempo. Este estado elevado de energa se denomina estado excitado. La molcula excitada podr transferir ese exceso de energa otras, en forma de energa vibratoria (producindose calor); o disiparla en forma de radiacin electromagntica. Debido a la relativamente baja cantidad de energa que son capaces de transmitir los rayos UV, slo afectan a los electrones de los tomos perifricos de las molculas, producindose solo estados de excitacin. Las radiaciones ionizantes son las que pueden extraer electrones de sus orbitales. Los rayos infrarrojos slo pueden provocar energa vibratoria, por lo que slo generan calor. Hablaremos a continuacin solamente de las radiaciones UV ya que son las ms utilizadas en nuestros laboratorios. Se sabe que las radiaciones ionizantes son cada vez ms utilizadas en los laboratorios como tcnicas de esterilizacin de rutina, ya que los adelantos tecnolgicos han simplificado estos equipos y su

manipulacin. Se utilizan para la esterilizacin de materiales descartables como jeringas, agujas, materiales para vas, etc.

Radiaciones UV: Mecanismo de accin: el principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorcin por el ADN y el resultante dao de este. As provocan la formacin de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formacin de dmeros de pirimidina de tipo ciclobutano. Esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibicin de la sntesis de ADN y secundario a esto, inhibicin del crecimiento y la respiracin. Aplicaciones: estas radiaciones pueden producirse artificialmente con lmparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para Gram(+) y Gram(-). Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no penetran en slidos y lo hacen pobremente en lquidos. B. Esterilizacin por medios mecnicos: Filtracin Es el mtodo usado en el laboratorio para esterilizar lquidos termolbiles. Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa, de vidrio, de cermica y de steres de celulosa o membranas. Las membranas estn compuestas por steres de celulosa biolgicamente inertes. Los poros varan desde 0.025 m. a 25 m. de dimetro, siendo los de 0.22m. los ms utilizados ya que son lo suficientemente pequeos para detener a todas las bacterias. Con este mtodo se esterilizan: azcares, urea, sueros, antibiticos, etc. Los filtros de membrana tambin se utilizan en Microbiologa para otros propsitos. Dado que son inertes, proporcionan un buen medio para recoger microorganismos, por ejemplo para cultivar bacterias que se encuentran en bajas concentraciones en un gran volumen de lquido. El mecanismo de accin es bastante simple: detienen todas las partculas que posean un tamao mayor que los poros. En realidad los "poros" quedan formados por los espacios que resultan de la superposicin de las fibras de las distintas capas que forman la membrana. As, algunas partculas de menor tamao son retenidas por otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por suma de partculas retenidas previamente, etc. por lo cual "el tamao del poro" es un valor virtual definido por el tamao de la partcula retenida, ms que por un dimetro real medible.

Aplicacin de calor hmedo Objetivo: Mostrar la efectividad del calor hmedo en la esterilizacin de cultivos bacterianos. Comprobar el efecto de las diferentes temperaturas en los cultivos bacterianos.

Procedimiento: Rotular las placas con agar nutritivo y los tubos de Thioglicolato de acuerdo al diseo grfico indicando los tiempos y temperaturas a los que sern expuestos. Inocular 2 a 3 gotas del cultivo bacteriano escogido en el tubo Thioglicolato N 9, a partir del cual inocular el cuadrante 0 de la placa N 1 e igualmente los 4 tubos correspondientes para la exposicin a 55C. Colocar los tubos en el bao Mara de 55C, e iniciar el conteo del tiempo de accin del calor hmedo; inoculando a los 5, 10 y 30 minutos los cuadrantes de la placa correspondiente. De igual manera proceder con la placa N 2 y los tubos que sern expuestos a 100C.

Colocar las placas N 1 y N 2 y los tubos inoculados en la incubadora a 37C entre 18 24 horas. Despus de este perodo realizar la lectura del desarrollo microbiano en los cuadrantes de las placas y los tubos.

Resultados:

Microorganismos E. Coli T 55C t 0' 5' 10' 30' 100C 0' 2' 5' 10' P + + + + + + +/+/T + + + + + + + + S. aureus P + + + + + + + T + + + + + + + + Pseudomonas P + + + + + + +/T + + + + + + + + B. subtilis P + + + + + + +/+/T + + + + + + + +

El signo positivo (+) indica que si hubo crecimiento, por el contrario el signo negativo (-) significa que no hubo crecimiento.

Placa N 1 expuesta a 55C

Placa N 2 expuesta a 100C

Conclusiones: El hecho de que haya crecimiento se debe a la tolerancia de cada microorganismo al calor.

El crecimiento en la placa no es igual al crecimiento que se da en el tubo. El primer efecto letal a la exposicin al calor hmedo es la produccin de rupturas de cadena nica en el ADN que provocan la muerte celular por activacin o liberacin de enzimas con actividad de endonucleasas. Las bacterias podrian sobrevivir dependiendo de su capacidad para reparar la lesin, esta funcin depende del estado gentico y fisiolgico de la bacteria. A medida que aumenta la temperatura se agrega la prdida de la integridad funcional de la membrana citoplsmica, lo que producira interferencias en el intercambio con el medio externo, los procesos respiratorios y la sntesis proteica.

Aplicacin del calor seco Objetivo: Mostrar la efectividad del calor seco como mtodo de esterilizacin de material contaminado.

Procedimiento: Rotular cada tubo estril, con la temperatura y el tiempo de exposicin correspondiente. En cada uno de los 8 tubos colocar papel filtro impregnado. El 9 disco de papel filtro impregnado colocarlo en el 9 tubo de Thioglicolato y en el 10 tubo, coloque un disco de papel filtro sin impregnar. Una vez identificados los discos y en posicin correlativa se les expone al calor seco a 150C y 175C respectivamente a diferentes perodos de tiempo. Terminada la exposicin a las temperaturas y tiempos indicados se extraen los tubos del horno esterilizador y se vierte en ellos el caldo Thioglicolato correspondiente. Incubar a 37C por 18 24 horas y anotar los resultados obtenidos al da siguiente en la tabla de resultados.

Resultados:

Microorganismos E. Coli T 150C t 0' 10' 25' 50' 175C 5' 10' 15' 20' Conclusiones: T + B. Subtilis T + + + + Pseudomonas T -

El calor seco provoca desnaturalizacin de protenas, lesiones por oxidacin y efectos txicos por niveles elevados de electrolitos. Es un error ver crecimiento de E. Coli ya que este microorganismo no soporta temperaturas elevadas. B. subtilis es ms resistente que el resto de microorganismos debido a que es esporulado y la espora es termorresistente.

Aplicacin de la Luz UV Objetivos: Demostrar la efectividad y limitaciones de la luz ultravioleta.

Procedimiento: Sembrar en la superficie de las placas petri con agar Tripticase, los microorganismos indicados, empleando para ello el hisopo estril, dejar secar. Para la siembra en Pour Plate utilizar los tubos con agar licuado e inocular en cada uno 100 L del cultivo seleccionado, mezclar por rotacin y verter el contenido en cada una de las placas petri rotuladas con el nombre del cultivo utilizado y dejar solidificar. Dividir las placas de siembra en superficie y las de Pour Plate en cuatro cuadrantes y rotular cada cuadrante con los tiempos de exposicin siguiendo el sentido de las agujas del reloj: 30 seg. , 2 y 5 minutos. Exponer las placas a la luz UV de acuerdo al tiempo rotulado en cada placa cubriendo las partes de la placa que no deben de ser expuestas. Incubar 18 24 horas a 37C y luego anotar los resultados.

Resultados:

Superficie Tiempo Microorganismo S. aureus E. Coli B. subtilis 0' + ++++ ++++ 30'' + +++ +++ 2' + + ++ 5' + +/-

Placa Vertida

0'

30''

2'

5'

+ ++++

+ ++++

+ ++++

+ ++++

El nmero de signos indica el volumen de crecimiento del microorganismo.

Conclusiones: En el caso de la placa en donde solo se sembro en la superficie la luz UV mat a los microorganismos. En la placa vertida o Pour Plate debido a que la luz UV no atraviesa superficies no pudo matar a aquellos microorganismos que se encontraban ms profundos. El principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorcin por el ADN y el resultante dao de este. As provocan la formacin de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina (timina) adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formacin de dmeros de pirimidina de tipo ciclobutano, esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibicin de la sntesis de ADN y secundario a esto, inhibicin del crecimiento y la respiracin.

Desinfeccin qumica Objetivos:

Comparar la efectividad de varios compuestos qumicos in vitro sobre diferentes tipos de bacterias y diferentes diluciones.

Procedimiento: Colocar el desinfectante y los tres tubos con agua, rotularlos como N1, N2 y N3, colocarlos en una gradilla. Preparar diluciones de 1:5, 1:25 y 1:125 del desinfectante transfiriendo 1 ml. del desinfectante al tubo de agua N1, luego de mezclar transferir de este tubo 1 ml. al tubo de agua N2, luego de mezclar transferir 1 ml. de este tubo al tubo de agua estril N3 descartando 1 ml. del ltimo tubo. Pipetear 0.5 ml. del cultivo a cada uno de los tubos anteriores. Despus de 5 y 15 minutos de exposicin, extraer 300 l. de cada uno de los tubos preparados en el paso anterior y colocar en tubos de caldo Thioglicolato; rotular cada tubo de acuerdo a la dilucin y el tiempo al que corresponden. Luego incubar a 37C por 24 horas y luego anotar los resultados en las tablas de anotacin.

Resultados: Diluciones Escherichia Coli

Tiempo 5' 15' Desinfectante Yodo 2% Alcohol 95%

Concentrado E. coli R X S. aureus S X

1:5 P. aeruginosa X X

1:25 B. subtilis X R

1:125 + + S. viridans X X

Savlon 1:1001 Fenol 5% Merthiolate Conclusiones:

X X X

X R X

X X R

X X X

S X X

Puede concluir que en diluciones ms altas hay mayor crecimiento bacteriano, debido a que el desinfectante a mayor dilucin pierde su eficacia.

Cuestionario 1. Comparar la eficacia del calor seco y del calor hmedo como medios de esterilizacin. En ambos casos la utilizacin del calor y su eficacia dependen de dos factores: el tiempo de exposicin y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. Calor Hmedo: Produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se debe principalmente a dos razones: - El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas son producidas por reacciones que eliminan agua - El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. Ventajas: Rpido y sencillo ya que el vapor penetra rpidamente en los materiales porosos. Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo. No es txico ni deja residuos. Hay un bajo deterioro del material expuesto. Precios bajos del producto final. Desinfeccin, la esterilizacin trmica destruye a los microorganismos en forma gradual; es por esto que no hay un nico mecanismo de accin, sino ms bien la suma de distintos eventos complejos que se van sucediendo a medida que aumenta la temperatura. Mayor gama de productos a esterilizar que con calor seco material textil, materiales duros, jeringas y agujas, vidrios, lquidos hidrosolubles.

Desventajas: No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua. Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos. Temperaturas elevadas. Altera ciertos materiales como plsticos y caucho. Corrosin de objetos metlicos con deterioro de filos. Imposibilidad de esterilizar polvos, aceites y grasas.

Calor seco: El calor seco produce desecacin de la clula, es esto txicos por niveles elevados de electrolitos, fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja. Ventajas del calor seco: No es corrosivo para metales e instrumentos.

Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no voltiles. El calor seco (o desecacin en general) provoca desnaturalizacin de protenas, lesiones por oxidacin y efectos txicos por niveles elevados de electrolitos. La accin letal es el resultado del calor trasmitido desde el material con el cual los microorganismos estn en contacto, y no desde el aire caliente que los rodea. Se aplica a lquidos y sustancias liposolubles e hidrfugas (aceites, parafinas, vaselinas, cremas etc.) Se aplica a instrumentos cortantes (bisturs, tijeras, etc.)

Desventajas: Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja penetracin del calor.

1. Comparar la resistencia al calor de las clulas vegetativas con las esporas bacterianas. El DNA de una clula procariote sufre lesiones espontneas debido a la depurinizacin, desaminacin, alquilacin y oxidacin de los nucletidos o al efecto de la radiacin UV. Sin embargo, en las clulas vegetativas estos daos son rpidamente reparados por efectivos sistemas enzimticos. En cambio, las esporas bacterianas no presentan actividad enzimtica pero son resistentes gracias al bajo contenido de agua que retarda o altera las reacciones qumicas que afectan al DNA. Este menor contenido de agua disminuye la tasa de depurinizacin y ka fotoqumica del DNA frente al UV respecto a las de una clula vegetativa. El DNA de la espora se encuentra unido a unas protenas denominadas alfa/beta-SASP que disminuyen el dao trmico del DNA. La termorresistencia de las endsporas es una de sus principales caractersticas. Mientras que las bacterias o las formas vegetativas de las bacterias esporuladas sometidas a 80 C durante diez minutos (pasteurizacin) mueren, las endsporas sobreviven e incluso soportan un calentamiento superior. Para eliminarlas son necesarias tcnicas de esterilizacin. 2. Establecer la diferencia entre los trminos: punto trmico letal y tiempo trmico letal. El punto trmico mortal o letal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado, el tiempo de referencia empleado es de 10 min. El tiempo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensin a una determinada temperatura. 3. Enumerar las principales condiciones que influyen en la actividad antimicrobiana de los agentes qumicos. Actan sobre microorganismos en cualquier estado metablico (en multiplicacin o no). Se caracterizan por actuar inclusive sobre los esporos bacterianos (forma ms resistentes dentro de los microorganismos), produciendo una esterilizacin qumica si el tiempo de accin es el adecuado. Los desinfectantes de alto nivel actan modificando en forma irreversible grupos funcionales de protenas y/o cidos nucleicos. Entre otros efectos, esto provoca inhibicin enzimtica, lo que lleva a la muerte celular. Los agentes que predominan en este grupo son los Alquilantes (Oxido de etileno, formaldehdo, glutaraldehdo). Buena tolerancia local para la piel humana, las mucosas y la superficie de heridas. Accin rpida. Lesionan la membrana celular. Inactivan irreversiblemente la protena. Lesionan cidos nucleicos. Eficaz en materia orgnica. Poder de penetracin conveniente en las grietas de los tejidos. Solubilidad y estabilidad.

1. Comparar la capacidad germicida del fenol con la de otros desinfectantes de tipo fenlico. COMPUESTOS FENOLICOS: Actan rpidamente, se combinan con las protenas, coagulndolas a altas concentraciones (accin germicida), actuando en forma inespecfica como un veneno protoplasmtico, producen un desordenamiento estructural de la membrana citoplsmica, que interfiere con su funcionamiento normal. Esto provoca la prdida de pequeos metabolitos del medio intracelular y dificulta tanto el transporte activo como el metabolismo energtico, la activacin en forma irreversible de las oxidasas y deshidrogenasas que se encuentran unidas a la membrana. El fenol (cido carblico) como tal, ya no es utilizado ms que como patrn para comparar otros desinfectantes. Esto es debido a

su alta toxicidad, carcinogenicidad y su poder corrosivo. La sustitucin de uno de los hidrgenos del ncleo fenlico por grupos funcionales tales como alquilo, difenilo, fenil y cloro, disminuye notablemente los efectos adversos y aumenta la actividad antibacteriana de estos compuestos. La unin de estos fenoles modificados a jabones aumentan an ms su accin, a la vez que los hidrosolubilizan. Dentro de las sustituciones ms utilizadas se encuentran los alquilo fenoles (cresoles) y los compuestos difenlicos (hexaclorofenol). Los compuestos fenlicos utilizados en las concentraciones adecua-das y con el tiempo suficiente son: bactericidas, virucidas y fungicidas; por Ej: el HIV es inactivado por una solucin fenlica al 0.5%, mientras que se necesita una solucin al 2% para inactivar hongos. Por lo general la concentracin utilizada oscila entre 2 y 5%. CRESOLES: Se los divide en tres grupos: orto meta y paracresol, aunque suele utilizarse una mezcla de los tres denominada tricresol. Derivados de la destilacin del alquitrn de hulla son mezclados con jabn y se comercializan por Ej.: como Creolina. Esta se utiliza para desinfeccin ambiental por Ej.: paredes, pisos, etc. HEXACLOROFENOL: Es un derivado halogenado con gran accin bactericida, fundamentalmente sobre bacterias Gram (+), sobre todo estrepto y estafilococos. Posee accin persistente, hasta el punto que su mxima accin bactericida se manifiesta luego de varios das de uso consecutivo. 2. Cmo podra demostrar la actividad antimicrobiana de una pomada antisptica? Existen tres mtodos para demostrar la actividad antimicrobiana de una pomada antisptica. La primera es usando la tcnica de diluciones del agente qumico. Tambin se puede usar la tcnica del coeficiente fenlico que es una tcnica estandarizada que se utiliza para comparar el poder antisptico de un agente qumico frente al del fenol. Es una modificacin de la tcnica de dilucin en tubo. Finalmente se puede hacer uso de la tcnica de la placa de agar en donde se inocula una placa que contenga medio de cultivo slido con el microorganismo utilizado como prueba. El agente qumico se coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibicin (crecimiento) alrededor del agente qumico. Una modificacin de esta tcnica es la incorporacin del agente qumico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento microbiano llevando a lo que se realizo en el laboratorio, se utiliz como mtodo de demostracin la introduccin de un hisopo en el caldo tripticase con una de las bacterias que contena una concentracin bacteriana equivalente al tubo, luego sta fue diseminada uniformemente sobre la superficie de la placa con agar. Con pinzas se coloc los discos con pomada antisptica en la placa, se incub a 37C de 18 a 24 horas. Finalmente se observara si hubo o no crecimiento bacteriano lo que indicara el poder del agente antisptico sobre la bacteria. Antibiticos Los antibiticos, o agentes antimicrobianos, son sustancias (obtenidas de bacterias u hongos, o bien obtenidas de sntesis qumica) que se emplean en el tratamiento de infecciones. La eleccin de uno u otro antibitico en el tratamiento de una infeccin depende del microorganismo (obtenido por cultivo o supuesto por la experiencia), de la sensibilidad del microorganismo (obtenida por un antibiograma o supuesta por la experiencia), la gravedad de la enfermedad, la toxicidad, los antecedentes de alergia del paciente y el costo. En infecciones graves puede ser necesario combinar varios antibiticos. La va de administracin puede ser oral (cpsulas, sobres), tpica (colirios, gotas, etc.) o inyectable (intramuscular o intravenosa). Las infecciones graves suelen requerir la va intravenosa. Los antibiticos actan a travs de 2 mecanismos principales: Matando los microorganismos existentes (accin bactericida), e impidiendo su reproduccin (accin bacteriosttica). Su mecanismo de accin predominante los divide en 2 grandes grupos: Bactericidas Beta-lactmicos (Penicilinas y cefalosporinas)

Glicopptidos (Vancomicina, teicoplanina) Aminoglucsidos (Grupo estreptomicina) Quinolonas (Grupo norfloxacino) Polimixinas

Bacteriostticos Macrlidos (Grupo eritromicina) Tetraciclinas Cloramfenicol Clindamicina, Lincomicina Sulfamidas

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infeccin a uno o varios antibiticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibitico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones teraputicas individuales. El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiolgico, a escala de un servicio, un centro de atencin mdica, una regin o un pas, es como puede adaptarse la antibioterapia emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos de los antibiticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevencin en los hospitales. Hay pues un doble inters: Teraputico y epidemiolgico. Susceptibilidad antibitica Objetivo: Mostrar in vitro la susceptibilidad de diferentes bacterias a ciertos antibiticos.

Procedimiento: Introducir el hisopo estril en el tubo que contiene la bacteria en este caso Pseudomonas, diseminar uniformemente sobre la superficie del agar Mueller Hinton. Proceder igual para los otros cultivos bacterianos. Rotular las placas trabajadas con el nombre de la cepa de la bacteria usada. Con la ayuda de una pinza colocar los discos de antibiticos en forma adecuada y similar para cada cepa. La distancia de separacin entre cada disco no debe ser menor a 2 cm. Incubar a 37C durante 18 24 horas. Luego realizar la lectura con ayuda de una regla milimetrada, midiendo el dimetro del halo de inhibicin presente alrededor del disco de cada antibitico.

Resultados: Microorganismo Pseudomonas CL R P 16 mm S NA 22 mm S MET 25 mm S E 28 mm S AM 30 mm S

Conclusiones: Podemos notar que la Pseudomona es resistente al cloranfenicol. Se puede comprobar que la resistencia y la susceptibilidad del microorganismo al antibitico esta relacionado al halo que se forma.

Autor: Chriss Malca Bautista