Lucrare practic numrul 8

Organizarea ultrastructural a celulei eucariote: organitele sintezei i secreiei celulare si organitele generatoare de energie
Citoplasma este format din dou compartimente: 1.Citoplasma nestructurat sau hialoplasma (substana fundamental a citoplasmei), 2.Citoplasma structurat sau morfoplasma, reprezentat de organitele celulare. n afar de organitele celulare, n citoplasm se pot gsi incluziunile celulare, produi de secreie i acumulri de produi exogeni. Clasificarea organitelor celulare dup funcia lor n celul: A. Organitele sintezei i secreiei celulare: -reticulul endoplasmic, -ribozomii, -complexul Golgi. B. Organitele generatoare de energie: - mitocondriile. C. Organitele digestiei celulare: -lizozomii, -peroxizomii. D. Organitele motilitii celulare: -microfilamentele, -microtubulii, -centrul celular. E. Incluziuni celulare - substane proteice, de exemplu hemoglobina; - lipide, sub form de picturi sferice - glicogen- substanele minerale - fier, siliciu

A. ORGANITELE SINTEZEI SI SECRETIEI CELULARE:

1. RETICOLUL ENDOPLASMIC Definiie Localizare Numr Este un organit membranar, reprezentat de un sistem de canalicule i cisteme delimitate de endomembrane trilaminate cu o grosime de 5-6 nm. Comun tuturor celulelor cu excepia hematiei adulte Este prezent n numr mare n celulele angajate n sinteze de proteine, glucide i lipide, fiind bine dezvoltat n celulele secretorii exo- i endocrine. - RE neted in REN este bine reprezentat n celulele care sintetizeaz hormoni steroizi (glanda suprarenal, celulele)nterstiiale din testicul i ovar), glicogen (hepatocite) i pigmeni (melanocite). Este un sistem de canalicule i cisteme delimitate de endomembrane trilaminate cu o grosime de 5-6 nm. - RE rugos (granular) RER este bine reprezentat n celulele glandulare (pancreatice), n hepatocite (unde formeaz corpii Berg), n celulele nervoase (unde formeaz corpii lui Nissl). Este un ansamblu de structuri canaliculare i veziculare membranare, cu diametru de aproximativ 20 nm, pe suprafaa crora se gsesc ataai ribozomi, prin subunitatea mare i care sintetizeaz proteine de export. Este vizibil la microscopul fotonic datorit prezenei ribozomilor Apare sub form de saci aplatizai sau vezicule delimitate de membrane trilamelate care delimiteaz un lumen. Membranele REG se continu cu membrana extern a nveliului nuclear, iar lumenul, cu cisterna perinuclear. (figurile 1, 2) cu hemalaun picro-indigo-carmin (culoare brun), tricromul lui Ramony Cajal (tent roie), RER se evideniaz bine in celulele glandulare (acinii pancreatici), unde ocup o poziie baza1, n celulele nervoase (corpii Nissl), n hepatocite (corpii Berg)

Tipuri: Reprezentare celule

Forma , dimensiuni

Organizare structurala -MO Organizare ultrastructuralaME

Nu este vizibil la microscopul fotonic. Apare ca un labirint de canalicule care comunic cu sacii RER i la nivelul crora nu se ataeaz ribozomi. Membranele REN au aceeasi structura ca si a RER doar ca din loc in loc prezinta fenestrari asemanatoare porilor nucleari. In celula musculara striata, REN, poarta numele de reticul sarcoplasmatic.

Evidentiere

Figura 1. Localizarea RER si REN n celul n raport cu nucleul. a.

b.

c.

Figura 2. Reticul endoplasmic neted si rugos, schema si ME

2. RIBOZOMII sau corpusculii lui Palade (1953) Definitie Localizare Tipuri Ribozomii sunt organite celulare submicroscopice, nemembranare, formate din ribonucleoproteine (ARNr) avnd rol n procesele de sintez a proteinelor. sunt prezeni n citoplasma tuturor celulelor, cu excepia eritrocitelor Pot fi de dou tipuri: - ribozomi liberi n citoplasm -izolai - grupai n poliribozomi (polizomi) -ataai de membranele reticulului endoplasmic i de faa citoplasmatic a nveliului nuclear Numrul ribozomilor variaz n funcie de tipul de celul. Astfel, ei se gsesc n numr foarte mare n celulele secretorii angajate n sinteza de proteine. diametrul este cuprins ntre 15 - 30 nm. ribozomii nu pot fi observai datorit dimensiunilor foarte mici, sub limita puterii de rezoluie. In celulele n care se desfoar procese intense de proteogenez (celulele foliculare din ovar), ribozomii formeaz zone intens bazofile n citoplasm. apar sub form de granule ovalare sau elipsoidale cu diametrul mare de 20-30 nm i diametrul mic de 16-17 nm. Prezint dou subuniti inegale ca dimensiune i diferite ca structur morfologic i biochimic, (figura 3, 4). - subunitatea mic, cu coeficient de sedimentare de 40SV; - subunitatea mare de 60SV, prevzut cu un canal prin care trece lanul peptidic sintetizat

Numar

Dimensiuni Organizare structurala -MO Organizare ultrastructurala- ME

Figura 3. Poliribozomii . Formarea lanturilor sinuoase in care ribozomii sunt uniti intre ei printr-o molecula de ARNmcare are forma unui filament gros.

Figura 4. Ribozomi atasati reticulului endoplasmic, ME. La nivelul poliribozomilor liberi se sintetizeaz proteinele de structur (procese de diviziune i cretere), iar la nivelul ribozomi lor ataai membranelor RE se
sintetizeaz proteine de export (enzime, hormoni, anticorpi).

3. APARATUL GOLGI Definiie Localizare Este un sistem intracitoplasmatic de caviti limitate de citomembrane, Este prezent att n celulele vegetale ct i n celulele animale, cu excepia hematiei adulte. Este diferit n funcie de tipul i activitatea celulei - n neuroni este plasat perinuclear, n celulele secretorii exocrine se afl supranuclear, iar n celulele tiroidiene se deplaseaz ntre cei doi poli ai celulei Reea de canalicule anastomozate si de vacuole de diferite mrimi, dictiozomi(formatiuni izolate sau grupate sub forma de tubuli anastomozati intre ei sau sub forma de cisterne) Corpii Golgi se caracterizeaza ultrastructural prin : -saci turtiti formati din unitatea membranara , aranjati paralel cu extremitatile mai dilatate ce prezinta o fa proximal, de formare, orientat ctre nucleu (cis) si o fa distal, de maturare, orientat ctre plasmalem (trans) (figura 5). -vezicule, situate in extremitatea sacilor , n raport cu faa de maturare, cu diametrul de 25-50 nm -vacuole de 0,5-1micron situate lng faa de formare (pe fata concava) a sacilor paraleli (figurile 6,7,8,9) Poate fi evidentiat in celula proaspata cu colorantul rosu-neutru, iar in celula fixata prin colorare cu saruri de osmiu unde apare ca o retea filamentoasa anastomozata, situata peri sau paranuclear.

Organizare structurala -MO Organizare ultrastructuralaME

Evidentiere

Figura 5. Aparatul Golgi - dictiozomi - formai din cisterne aplatizate i vezicule delimitate de membrane lipoproteice Au rol in formarea de endomembrane, sinteza complexelor de hidrai de carbon, formarea proteoglicani1or i a glicoproteinelor, maturarea lipoproteinelor , formarea lizozomi lor primari.

Figura 6. Aparat Golgi, adenohipofiza, ME

Figura 7. Aparat Golgi, capsula Bowmann rinichi, ME

Figura 8. Aparat Golgi, epididim, ME

Figura 9. Aparat Golgi, Limfocit, ME

B. ORGANITELE GENERATOARE DE ENERGIE:

1. MITOCONDRIILE Definiie Localizare Mitocondriile sunt organite membranare ce conin sisteme enzimatice necesare oxidrii materialelor nutritive, sintezei moleculelor de A TP i cuplarea acestor dou procese (fosforilarea oxidativ). Prezente n toate celulele cu metabolism aerob, cu excepia eritrocitului adult. Sunt rspndite n ntreaga citoplasm, cu predilecie la polii celulei sau perinuc1ear n momentele de intens activitate de sintez. Depinde de gradul activitii celulare, fiind mai numeroase n celulele n care activitatea funcional este intens (ex. hepatocite). Lungimea este de aprox. 7m, iar grosimea de 0,5 m; cu ct o celul este mai activ cu att mitocondriile sunt mai mari. - au o mare plasticitate - alungit n celulele pancreasului exocrin - granular n hepatocite Ia microscopul fotonic n contrast de faz: sub form de granule izolate n citoplasm, granule niruite ca mrgelele sau filamente, (figura 10). Form sferic, formate din dou membrane trilamelare: membrana extern i membrana intern care trimite n interior prelungiri ce formeaz crestele mitocondriale. Spaiul dintre cele dou membrane se numete camera extern, iar ntre membrana intern i crestele mitocondriale se afl camera intern sau matricea mitocondrial Membrana intern este alctuit din particule elementare - unitile tripartite care sunt alctuite dintr-un cap sferic, o tij cilindric i o baz patrulater (figurile 11, 12, 13) Coloraii supravitale cu verde Janus B pentru celulele nefixate i hematoxilin feric Regaud pentru celulele fixate

Numr Dimensiuni Forma Organizare structurala -MO Organizare ultrastructuralaME

Evidentiere

Figura 10. Structura mitocondriei, schema. 1. Membrana externa, 2. Membrana interna ce trimite in interior prelungiri, 3. Cristele mitocondriale, 4. Matricea mitocondriala

Figura 11. Criste mitocondriale, ME

Figura 12. Tubuli mitocondriali, ME

Figura 13. Mitocondrii intermediare, ME

Metode de studiu ale biologiei celulare Fracionarea celular

Fracionarea celular este o tehnic de rupere a esuturilor i celulelor ntr-un mod controlat. Se realizeaz astfel omogenizarea sau destrucia legturilor celulare prin diferite procedee, separarea fraciunilor celulare fcndu-se n funcie de densitate i volum. Tehnica de fracionarea celular are dou aplicaii majore: -extragerea organitelor celulare, separarea lor de mediul normal celular, ntro cantitate suficient i de o mare puritate, pentru a putea fi studiate compoziia chimic i funciile lor; de exemplu: fracionarea celular a fost folosit pentru nelegerea mecanismului fosforilrii oxidative desfurat n mitocodrii, sau a evenimentelor endoplasmatic. -identificarea calizrii intracelulare a unor molecule specifice, alturi de celelalte tehnici de citochimie. Deoarece, morfologia multora dintre organite se modific dup dezbinarea celulei, tehnica fracionrii celulare necesit folosirea unor procedee analitice pentru identificarea fraciunilor celulare, nu doar dup morfologia organitelor din care ele provin, ci i de asemenea, dup constituenii chimiei i enzimatici. Principiile fracionrii celulare Primul pas n extragerea unor cantiti suficiente de organite celulare, l reprezint ruperea membranelor plasmatice, prin diferite procedee mecanice i chimice, urmat de separarea fraciunilor celulare prin centrifugare, n funcie de volum i densitate. Centrifugarea se folosete, pentru o rezoluie ct mai bun a diferenierii organitelor celulare, de diferenele dintre proprietile lor fizice, din care cele mai care rezult ca urmare a legrii ribozomilor la reticulul

importante sunt mrimea i densitatea. Exist numeroase similitudini ntre organite att n ceea ce privete mrimea ct i densitatea lor, ns n general structuri care au un volum asemntor au densiti diferite. Centrifugarea difereniat presupune separarea fraciuni lor celulare fie doar n funcie de mrimea particulelor subcelulare, fie doar dup densitatea lor. Pentru ruperea membrane lor plasmatice, celulele sunt suspendate ntr-o soluie ce conine o sare cu un pH apropiat cu al mediului intracelular, de ex. sucroza- izotonic. Ulterior este necesar agitarea suspensiei celulare la o vitez foarte mare (variaz n funcie de tipul organitului celular care trebuie separat), prin centrifugare, sau prin plasarea sa ntr-un cmp sonie de nalt frecven (ultrasonare) . Izolarea organitelor celulare Procesul de separare a organitelor celulare presupune parcurgere a urmtoarelor etape: -ruperea membranelor celulare, de obicei prin tehnici mecanice; -fraciunile concentrate de organite sunt apoi pregtite pentru separarea prin centrifugarea difereniat; -purificarea tipurilor de organite celulare, bazat pe diferena gradientelor de densitate. Prima etap const n distrugerea membranei celulare, n condiii care s produc afectarea minim a organitelor celulare, se realizeaz folosind un omogenizator mecanic. n funcie de tipul de celule, se cunosc tehnici diferite pentru fragmentarea membranei celulare (omogenizatorul Dounce este de obicei utilizat pentru culturile de celule, omogenizatorul Potter-Elvehjem pentru esuturile fragile -ficat). Omogenizarea celulelor sau a esuturilor cauzeaz de obicei distrugerea parial a unor organite. Dup fracionarea peretelui celular, suspensiile respective sunt centrifugate pentru separarea diferitelor tipuri de organite. Viteza de centrifugare este iniial foarte mare (4000 rot. / min.), pentru cteva ore), timp n care fiecare particul

subcelular migreaz la o poziie de echilibru; n funcie de mrimea lor i de densitate, acestea sunt redistribuite n sediment dup centrifugare, astfel: nuclei, mitocondrii, lizozomi i peroxizomi, RE i aparatul Golgi, i n final ribozomii liberi. n urma centrifugrii fiecare oragnit va rmne la un anumit nivel n eprubet, n funcie de densitatea lui de echilibru, cu formarea unor benzi (faze), ce reprezint fiecare fraciune celular separat. Lizozomii i peroxizomii, care au mrimi i densiti asemntoare, sunt mai greu de separat. De asemenea, fragmentele membranare derivate din REN, complexul Golgi, endozomi i membranele plasmatice sunt recunoscute prin formarea de vezicule cu suprafee netede, dar care frecvent sunt greu de separat. Izolarea unui anumit organit celular poate fi facilitat prin creterea numrului lor. De exemplu, cnd cobaii sunt tratai cu clofibrat, numrul peroxizomilor n celulele hepatice crete considerabil. Creterea numrului de organite celulare, care apare dup administrarea diverilor compui chimici, are ca rezultat mbuntirea purificrii pe tipuri de organite.

Activitate practic: Evidenierea Corpusculilor Nissl cu Violet Cresyl

Fixatori: alcool etilic absolute sau 95%, Carnoy sau formol neutru salin Soluii : 1. Soluia de Cresyl violet : -cresyl violet.0,5g -ap distilat100ml 2. Soluia difereniatoare :

-acid acetic glacial0,25ml -alcool etilic 100ml. Tehnica de colorare: -deparafinare -hidratare -colorare cu Cresyl violet, 10-20 minute -spalare n ap distilat -difereniere n alcool acid 4-8 secunde (pn nu se mai scurge colorant) -trecere scurt prin alcool absolut -difereniere n xilen (control microscopic, la nevoie se reia diferenierea) -montare n balsam de Canada. Rezultate: (figura 14) -corpusculii Nissl i nucleolii apar albastru-nchis -neuronii se coloreaz albastru palid -nucleii se coloreaza albastru deschis.

Figura

14.

Corpi

Nissl,

col.

Violet Cresyl, ob.X40