These OC

THESE
Prsente devant
LUNIVERSIT DE BRETAGNE OCCIDENTALE
U.F.R. Sciences et techniques
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE LUNIVERSIT
DE BRETAGNE OCCIDENTALE
Mention Microbiologie
Par
Olivier COUVERT
PRISE EN COMPTE DE LINFLUENCE DU PH DANS
LOPTIMISATION DES TRAITEMENTS THERMIQUES
Soutenue le 2 avril 2002 devant la commission dexamen :
A. BINET Professeur, Universit de Bretagne Occidentale
P. DANTIGNY Matre de confrence, Universit de Dijon
I. LEGUERINEL Matre de confrence, Universit de Bretagne Occidentale
P. MAFART Professeur, Universit de Bretagne Occidentale
Y. PEIGNE Responsable Qualit, Saupiquet
L. ROSSO Directeur adjoint de la programmation des laboratoires (AFSSA)
M. ZWIETERING Ingnieur de recherche, Danone Vitapole
REMERCIEMENTS
Les travaux de recherches prsents dans ce manuscrit ont t raliss au
Laboratoire Universitaire de Microbiologie Applique de Quimper (LUMAQ) dirig
par le Professeur Adrien BINET, et en collaboration avec lentreprise Saupiquet.
Toute ma reconnaissance va au Professeur Pierre MAFART, mon Directeur de
thse, qui durant ces trois annes, a support et orient mon travail avec patience et
dvouement. Je tiens lui exprimer toute ma gratitude pour mavoir fait dcouvrir ds
mon DEA, les agrments et les charmes de la modlisation. Son exprience et ses
critiques mont permis dviter bien de cueils. Pour cela, je le remercie sincrement et
lui exprime tout mon respect.
Ma reconnaissance va galement au Docteur Laurent ROSSO, directeur
adjoint de la programmation des laboratoires au comit de direction de lAFSSA, et au
docteur Philippe DANTIGNY, matre de confrence luniversit de Bourgogne
davoir accept la charge de rapporteur. Je leur sais gr de mavoir accord une partie
de leur temps pour juger ce travail.
Je remercie galement le Docteur Marcel ZWIETERING, ingnieur de
recherches (Danone vitapole), et Yannick PEIGNE, responsable qualit (Saupiquet), et
Adrien Binet, professeur luniversit de Bretagne Occidentale, pour avoir accept
dexaminer ce travail.
Je tiens galement remercier le Docteur Ivan LEGUERINEL pour le temps
consacr et les conseils quil ma apports dans diffrents domaines.
Ma reconnaissance va galement M. Laurent VENAILLE, Directeur R&D
Saupiquet, de mavoir permis dintgrer son quipe. Je remercie plus particulirement
Mme Vronique VOISSE, Mme Liliane GUELLEC et M. Jean-Luc DOUADY pour
lintrt avec lequel ils ont suivi le droulement de cette tude.
Les connaissances statistiques que Nicolas SAVY a pues mapporter mont
souvent t dun grand secours. Je lui en suis extrmement reconnaissant.
Pareillement, je souhaiterais remercier chaleureusement tous les membres du
laboratoire qui mont, chacun leur manire, soutenu, aid et encourag dans ce
travail, en particulier Anne-Gabrielle MATHOT, Stphane GAILLARD, Yannick
FLEURY et Louis COROLLER.
Enfin, ces remerciements vont mon amie Maryam et ma famille qui mont
toujours soutenu, ainsi quaux plongeurs, quakeurs et assimils pour leur soutien
moral. Cette thse leur est ddie.
TABLE DES MATIERES
Introduction......
Chapitre 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE..........
1.1. Gnralits sur les spores bactriennes......
1.1.1. lendospore bactrienne.
1.1.2. Morphologie et structure...
1.1.3. Stabilit et rsistance aux tempratures leves....
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1.2. Historique et rappel des bases classiques du calcul des traitements
thermiques....
1.2.1. Effet du temps dexposition la chaleur.
1.2.1.1. Cas gnral : cintique de destruction dordre un
1.2.1.2. Cas particuliers de destruction non logarithmique..
1.2.2. Effet de la temprature sur les paramtres des modles primaires.
1.2.3. Quantification des traitements thermiques..
1.2.3.1. Nombre n de rductions dcimales..
1.2.3.2. Notion de valeur strilisatrice (F).
1.2.3.3. Notion de valeur de destruction biologique (VDB).
1.2.3.4. Relation avec la dure de rduction dcimale......

1.3. Effet du pH sur la thermorsistance.....
1.3.1. Le facteur pH de traitement
1.3.1.1. Influence de lacidification du milieu de traitement....
1.3.1.2. Influence de la nature de la matrice.
1.3.1.3. Influence de la nature de lacidifiant...
1.3.1.4. Interaction entre les facteurs temprature et pH..
1.3.2. Le facteur pH de recouvrement...
1.4. Modles multifactoriels intgrant le pH..
1.4.1. Modles intgrant le pH de traitement
1.4.2. Modles intgrant le pH de recouvrement..
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Chapitre 2
MATERIEL ET METHODES....
2.1. Acquisition des donnes.....
2.1.1. Matriel biologique...
2.1.1.1. Choix des souches..
2.1.1.2. Prparation des suspensions de spores...
2.1.1.2.1. Spores de Clostridium sporogenes..
2.1.1.2.2. Spores de Bacillus
2.1.2. Traitement thermique
2.1.3. Confection des milieux..
2.1.3.1. Milieu de suspension lors du traitement thermique
2.1.3.2. Milieu de rcupration des spores (recouvrement).
2.1.4. Plans exprimentaux..
2.2. Traitement des donnes exprimentales....
2.2.1. Ajustement des modles
2.2.1.1. Modles primaires..
2.2.1.1.1. Modle de Rodriguez et al. (1988).....
2.2.1.1.2. Modle de Mafart et al. (2002)
2.2.1.2. Modles secondaires...
2.2.1.2.1. Modle de Bigelow (1921)...
2.2.1.2.3. Modle de Couvert et al. (1999)..
2.2.2. Evaluation des modles.
2.2.2.1. Critre quantitatif dajustement global...
2.2.2.2. Examen des rsidus
2.2.2.2.1. Htrocdasticit.
2.2.2.2.2. Test de normalit.
2.2.2.2.3. Test dautocorrlation.
2.2.2.3. Projection des rgions de confiance...
2.2.3. Tirage alatoire dune matrice possdant la mme structure de corrlation
quune matrice exprimentale
2.3. Validation sur un produit industriel...
2.3.1. Mesure des variations de la valeur des facteurs au cours de la strilisation et
du stockage.
2.3.1.1. Facteur temprature
2.3.1.1.1. Suivi de la temprature au cours de la strilisation
2.3.1.1.2. Modlisation du suivi de temprature
2.3.1.1.3. Intervalle de confiance des paramtres du modle de Ball.
2.3.1.2. Facteur pH..
2.3.1.2.1. Suivi du pH au cours du traitement.
2.3.1.2.2. Suivi du pH aprs la strilisation (stockage)...
2.3.1.2.3. Rgions de confiance dune droite de rgression
2.3.2. Mesure du temps minimum de strilisation..
2.3.2.1. Prparation et inoculation des boites..
2.3.2.2. Strilisation.
2.3.2.3. Mise en vidence de la strilit des boites..
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Chapitre 3
VALIDATION DU CHOIX DES MODELES PRIMAIRES..
3.1. Souches aux courbes de survie log-linaires.
3.1.1. Collecte de donnes exprimentales..
3.1.2. Evaluation de la qualit dajustement...
3.2. Souches aux courbes de survie non log-linaires.
3.2.1. Courbe de survie de C. sporogenes Pasteur 79.3..
3.2.1.1. Estimation des paramtres..
3.2.1.2. Evaluation de la qualit dajustement et examen des rsidus.
3.2.1.3. Projection des rgions de confiance...
3.2.2. Courbe de survie de Bacillus pumilus origine industrielle....
3.2.2.2. Evaluation de la qualit dajustement.
3.2.2.2.1. Reprsentation de lajustement global
3.2.2.2.2. Examen des rsidus..
3.2.2.2.3. Projection des rgions de confiance
3.3. Discussion..
3.3.1. Le modle de Rodriguez et al. (1988) ..
3.3.2. Le modle de Mafart et al. (2002).
3.3.3. Effet global du pH sur les paramtres de thermorsistance..
Chapitre 4
MODELISATION SECONDAIRE....
4.1. Effet de la temprature.....
4.1.1. Estimation de la valeur des paramtres du modle de Bigelow
4.1.2. Evaluation de la qualit dajustement...
4.1.3. Analyse des rsidus...
4.2. Effet du pH...
4.2.1. Effet du pH du milieu de traitement..
4.2.1.1. Choix du modle.
4.2.1.2. Estimation des paramtres du modle linaire...
4.2.1.3. Analyse des rsidus et rgions de confiance..
4.2.2. Effet du pH du milieu de recouvrement..
4.2.2.1. Vrification de leffet ltal du pH de recouvrement...
4.2.2.2. Modlisation de cet effet sur la thermorsistance..
4.2.2.4. Evaluation de la qualit dajustement et analyse des rsidus.
4.2.2.5. Simplification du modle
4.2.2.6. Estimation des paramtres du modle simplifi
et analyse des rsidus..
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4.3. Modle global...
4.3.1. Estimation globale des paramtres
4.3.2. Analyse des rsidus...
4.4. Interactions entre les facteurs......
4.4.1. Interactions entre temprature et pH de traitement...
4.4.1.1. Influence du pH sur z
T
4.4.1.2. Influence de la temprature sur z

pH
4.4.1.3. Analyse de variance

4.4.2. Interactions entre pH de traitement et pH de recouvrement..
4.4.2.1. Influence du pH de traitement sur z
pH
...
4.4.2.2. Influence du pH de recouvrement sur z
pH
.
4.5. Discussion..
4.5.1. Le modle de Bigelow...
4.5.2. Modlisation de leffet du pH de traitement.
4.5.3. Modlisation de leffet du pH de recouvrement
4.5.4. Modle global et interactions
4.5.5. Extension des concepts classiques
4.5.5.1. Extension de la mthode de Bigelow.
4.5.5.2. Extension de la mthode de Ball
4.5.5.3. Combinaison des mthodes de Ball et de Bigelow
Chapitre 5
APPLICATION DES MODELES A UN PRODUIT INDUSTRIEL..
5.1. Recueil de donnes et rsultats.
5.1.1. Etude des variations des facteurs du produit aux points critiques.
5.1.1.1. Le facteur temprature
5.1.1.2. Le facteur pH..
5.1.1.2.1. Saladire Western
5.1.1.2.2. Saladire Mexicana.
5.1.1.3. Localisation du point dfavorable..
5.1.2. Validation..
5.1.2.1. Construction dune feuille de calcul de barme.
5.1.2.2. Application au produit Saladire
5.1.2.3. Rsultats..
5.1.2.3.2. Saladire Mexicana.
5.1.3. Dtermination des barmes pour les deux Saladires...
5.1.3.1. Les calculs standards..
5.1.3.2. Les calculs personnaliss
5.1.3.3. Paramtres propres au process
5.1.3.4. Proposition de barmes...
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5.1.4. Simulations par la methode de Monte Carlo.
5.1.4.1. Principe de la mthode de Monte Carlo.
5.1.4.2. Estimation de la valeur des parametres et de leur loi de rpartition...
5.1.4.3. Programmation informatique du calcul..
5.1.4.4. Rsultats..
5.2. Discussion..
5.2.1.Caractrisation du produit..
localisation du point critique
suivi du pH au cours du traitement thermique
Le pH de recouvrement
5.2.2. Validation et optimisation des barmes.
Interprtation des carts entre barmes prdits et barmes observs
Optimisation des barmes des Saladires Western et Mexicana
Simulation et volution du process
Conclusion et perspectives
Nomenclature...
Rfrences bibliographiques....
Articles et communications..
Annexes..
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INTRODUCTION
Selon les documents les plus anciens, les hommes pratiquaient la dsinfection
bien avant que lexistence des micro-organismes ne fut connue. Les Egyptiens
utilisaient le feu et des dsinfectants pour embaumer les corps, tandis que la loi
mosaque commandait aux Hbreux de brler tout vtement suspect dtre contamin
par la lpre.
Pour accrotre la dure de conservation de la nourriture, de nouveaux moyens
de conservation tels que le fumage ou lajout de sel taient utiliss pour protger la
viande et le poisson de la putrfaction. Ds 3000 av. J.C., des productions de
fromages, de laits caills ou encore de vin voyaient le jour au Moyen-Orient.
En dpit dune longue tradition defforts pour empcher la dtrioration de la
nourriture, ce nest quau XIX
e
sicle, avec les travaux de Nicolas Appert (1809),
quune nouvelle mthode de conservation tait mise au point : la strilisation des
aliments en bouteilles scelles. Mais il faudra attendre les travaux de Pasteur (1861 -
1864) pour la comprendre, et le XX
e
sicle pour moderniser la technologie, intensifier
la production et amliorer la qualit. Ce nest quau dbut des annes 1920 quune
modlisation couplant des cintiques de destruction thermique des spores bactriennes
et les transferts de chaleur, permettra les premires simulations et les premires
optimisations de traitements.
De nos jours, lindustrie de la conserve na cess de chercher se diversifier et
faire voluer ses produits. Les industriels nont pas manqu dimagination pour
mettre au point des gammes de produits trs varis allant de la conserve de fruits et
lgumes au plat mijot traditionnel. Cependant, le dveloppement de ce procd de
conservation des aliments se trouve confront une limite qui est la base mme de son
existence : le traitement thermique. Ce traitement physique responsable de
llimination totale des micro-organismes entrane nanmoins bon nombre de
dommages sur la qualit du produit lui-mme. La destruction des micro-organismes
par la chaleur se fait souvent au dtriment des qualits nutritives et organoleptiques de
laliment. Les vitamines et les protines sont peu stables aux fortes tempratures et des
gots de cuit et des modifications de la texture peuvent apparatre. Ces effets
2
secondaires du traitement thermique font de la conserve un produit de moins en moins
attrayant pour le consommateur, au bnfice des produits frais malgr leur dure limite
de consommation rduite. La volont actuelle des conserveurs est de tendre vers une
rduction des barmes de strilisation pour amliorer la qualit finale de leurs produits,
tout en maintenant la scurit microbiologique. Cette optimisation des barmes de
strilisation revient donc, dans une premire phase, dterminer le traitement
thermique minimal appliquer au produit pour atteindre le taux de rduction
microbienne souhait. La valeur strilisatrice ainsi dtermine, la seconde phase
consiste calculer les modalits optimales dapplication de cette valeur strilisatrice
(couple temps et temprature en conditions isothermes ; couple barme de strilisation
et temprature de lautoclave en conditions dynamiques).
Depuis le dbut du sicle, les connaissances et les mthodes utilises pour
dtruire les micro-organismes ont volu. Les recherches menes notamment dans le
domaine de la thermo-rsistance permettent de mieux comprendre le comportement
dune population bactrienne pendant un traitement thermique, ainsi que sa capacit
se dvelopper dans laliment aprs avoir subi ces dommages thermiques. Cest alors
quil devient ncessaire dtablir des modles mathmatiques afin de faciliter
lapplication dans le domaine industriel.
Lintroduction de la microbiologie prvisionnelle remonte aux annes 1920
avec notamment les travaux de Bigelow sur les destructions thermiques. A cette
poque, les modles sont bass sur des cintiques de destruction dordre un et sur des
modles ne prenant en compte que la temprature (modles dArrhnius et de
Bigelow). Un regain dintrt pour la microbiologie prvisionnelle est apparu la fin
des annes 70, avec lutilisation de modles de croissance, et de modles secondaires
multifactoriels prenant en compte dautres facteurs environnementaux que la
temprature, dont un des principaux est le pH.
Les barmes actuellement appliqus pour la strilisation sont tablis en grande
partie daprs lexprience de lentreprise. Ils sont dtermins partir de la valeur de
thermorsistance la plus leve rencontre dans la littrature ou le cas chant, partir
dune valeur dtermine sur un micro-organisme, ayant caus dans le pass un
accident de strilisation. Le modle de Bigelow qui permet de dcrire leffet de la
temprature, est prfr celui dArrhnius dans le domaine de lindustrie alimentaire.
Quant la prise en compte du pH, seules des donnes bibliographiques, dont une
exploitation directe par lentreprise reste difficile, ainsi que des donnes historiques de
lentreprise permettent de moduler empiriquement les barmes. Dans ces conditions, le
3
nombre de rductions dcimales atteint est difficilement calculable et par consquent,
loptimisation reste difficile.
Lobjectif de ce travail est de raliser une tude complte de la destruction des
micro-organismes soumis un traitement thermique, en prenant en compte la
temprature et la dure du traitement, ainsi que linfluence du pH de laliment agissant
sur la vitesse de destruction pendant et surtout aprs le traitement thermique, tape
jusqualors nglige. Les connaissances acquises permettront dapprocher encore un
peu plus de loptimisation des barmes de strilisation. Lobjectif final est la mise au
point dune mthode de calcul permettant destimer les barmes de strilisation,
conduisant prcisment au nombre de rductions dcimales souhait. Le calcul ne doit
pas survaluer le barme afin de prserver au mieux les qualits nutritives et
organoleptiques du produit, mais ne doit pas non plus le sous estimer afin de respecter
la scurit microbiologique impose par lentreprise.
Le premier chapitre sera consacr un tat des lieux du sujet dans le contexte
de la microbiologie prvisionnelle actuelle. Laspect biologique de la destruction sera
dabord rapidement prsent. Le vif du sujet sera abord par une prsentation de
lvolution suivie par la microbiologie prvisionnelle pour arriver aux modles actuels,
exprimant leffet de la temprature et du pH sur la thermorsistance des micro-
organismes.
Aprs un chapitre dtaillant les matriels et mthodes mis en uvre dans ce
travail, lensemble des donnes exprimentales collectes (effets de la temprature et
du pH sur la thermorsistance) seront examines. Les rsultats seront exprims sous la
forme dun modle primaire adapt chaque souche.
Le quatrime chapitre analysera les donnes issues de la modlisation primaire
afin dtablir un modle secondaire global interprtant en plus de la temprature, le pH
du milieu de traitement et le pH du milieu de recouvrement, tant entendu que ces
deux milieux simulent en ralit un seul milieu constitu par laliment, appertis puis
stock.
Enfin, un dernier chapitre sera consacr lapplication des rsultats obtenus et
au dveloppement dune nouvelle mthode de calcul pour lestimation des barmes.
Une validation sur un produit industriel sera prsente.
5
Chapitre 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. Gnralits sur les spores bactriennes
1.1.1. Lendospore bactrienne
Dans la seconde moiti du XIX
e
sicle, Tyndall, Cohn et Koch mettent en
vidence le fait que certaines espces de bactries peuvent passer une partie de leur vie
sous forme de structure cellulaire dormante, connue aujourdhui sous le nom
dendospore (Prescott et al., 1995). Ces bactries Gram-positives qui ont le pouvoir de
se transformer en petites units ovales ou sphriques, sont doues dune rsistance
extrmement leve. Lendospore n'est pas un mode de reproduction. Une bactrie
produit une seule spore qui redonnera une bactrie. Il s'agit d'un tat de "dormance",
dpourvu dactivit mtabolique, dans lequel va entrer la bactrie lorsque les
conditions physico-chimiques de son environnement vont devenir hostiles sa survie.
LInstitut Pasteur dmontre leur exceptionnelle rsistance en prlevant des spores
lintrieur de momies embaumes depuis plusieurs millnaires ; en quelques heures
dincubation 37C dans un milieu favorable, la germination puis la croissance de ces
spores conduisent dabondantes cultures (Leclerc et al., 1995).
Les endospores se dveloppent partir de cellules vgtatives de cinq genres
bactriens : Alicyclobacillus, Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus et
Sporosarcina (Meyer et al., 1991 ; Wisotzkey et al., 1992). Ces structures sont doues
dune rsistance extraordinaire aux agressions de lenvironnement telles que la
chaleur, les radiations ultra violettes, les dsinfectants chimiques et la dessiccation.
Les endospores sont dune grande importance en microbiologie industrielle
alimentaire du fait dune part de leur rsistance, et dautre part du caractre pathogne
de certaines souches (ex : Clostridium botulinum).
La rsistance thermique des spores varie fortement en fonction de lespce.
Chez Bacillus, la rsistance est lie la temprature optimale de croissance de la
forme vgtative (Gombas, 1983). Les spores de thermophiles seront gnralement
plus rsistantes la chaleur que celle de msophiles.
6
1.1.2. Morphologie et structure
Selon Henriques et Moran (2000), larchitecture de base de lenveloppe des
endospores est probablement conserve en fonction des espces. La figure I.1
schmatise la structure de lenveloppe sporale.
Figure I.1 : A. Photo de microscopie lectronique dune coupe dune endospore de Bacillus subtilis.
B. Reprsentation schmatique de la photo. Cr : Cur sporal ; IFM : Inner Forespore Membrane ;
PGCW : Primordial Germ Cell Wall ; Cx : Cortex ; OFM : Outer Forespore Membrane ;
UC : Undercoat ; IC : Inner coat ; OC :Outer Coat ; SL : Surface Layer. Echelle (0,2 m) - Schma selon
Henriques et Moran (2000). Bar = 0,2 m.
Le cur de la spore (Core) contenant notamment le chromosome, est dlimit
par une membrane interne (IFM), elle-mme recouverte dun mince mur cellulaire
(PGCW). Cette structure de base est ensuite enveloppe des couches protectrices.
Les enveloppes constitues autour de la membrane sporale ont des structures
et des compositions varies :
- La paroi sporale PGCW (ou mur cellulaire), contenant le peptidoglycane
normal, qui deviendra aprs germination de la spore, la paroi de la cellule
vgtative ;
- Le cortex Cx, qui reprsente 10 20% de lensemble, est une couche
paisse daspect monomorphe, trs transparente aux lectrons ; il est form
dun peptidoglycane inhabituel avec beaucoup moins de liaisons internes et
trs sensible aux lysozymes. Il contient une forte proportion de dipicolinate
7
de calcium. Son autolyse constitue une tape dterminante de la
germination ;
- Les tuniques interne Ic et externe Oc, reprsentent 20 35% de
lensemble ; elles sont composes dune protine de type kratine riche en
liaisons disulfures. Impermables, elles sont responsables de la rsistance
aux agents chimiques ;
- Lexosporium SL (couche la plus externe) est une membrane
lipoprotique contenant 20% de sucres. Il nest pas essentiel la survie de
la spore.
1.1.3. Stabilit et rsistance aux tempratures leves
Les endospores bactriennes sont doues dune rsistance thermique
exceptionnelle. Ds 1951, Sugiyama montre que leur faible teneur en eau est
probablement la base de cette trs forte rsistance. Les spores chauffes dans un milieu
compos dacides gras ont une thermo-rsistance suprieure celles chauffes dans un
milieu aqueux. De plus, si le milieu de sporulation contient des acides gras, les spores
verront leurs membranes et parois enrichies en lipides, et par consquent resteront
moins permables leau. Il en rsulte une augmentation de la rsistance de ces spores
aux fortes tempratures.
La forte teneur en calcium doit galement intervenir sur la structure spatiale
des molcules en liant les groupes chargs ngativement.
R R
C C
O O O O
Ca
Figure I.2 : Stabilisation de la structure spatiale des macromolcules par les ions Ca
2+
.
Par le mme mcanisme, le calcium peut relier deux groupes chargs
ngativement sur la mme chane peptidique, replie sur elle-mme, ce qui lui confre
une meilleure rsistance aux dformations engendres par les traitements thermiques.
Ceci constituerait galement une meilleure rsistance thermique des spores (Meyer et
al., 1991).
8
Aujourdhui encore, on ne sait pas de faon prcise pourquoi les endospores
sont aussi rsistantes la chaleur et autres agressions extrinsques. Cependant, cette
thermorsistance est en rapport avec la prsence dun constituant chimique spcifique,
absent des cellules vgtatives : lacide dipicolinique DPA (acide pyridine-2-6-
dicarboxilique).
Figure I.3 : Formule chimique de lacide dipicolinique
Lacide dipicolinique, constituant prs de 15 % du poids sec de la spore, est
form exclusivement au cours de la sporulation partir de lacide diaminopimlique. Il
se trouve complex des ions calcium, et serait en partie responsable de la stabilit des
composs comme lADN (Prescott et al., 1995). Cependant, dautres mcanismes de
rsistance entrent en jeu puisque des mutants rsistant la chaleur et dpourvu dacide
dipicolinique ont t isols. Un autre constituant, lacide N-succinyl-glutamique,
inexistant dans les cellules vgtatives et synthtis ds les premiers stades de la
sporulation, est galement susceptible de jouer un rle dans la thermorsistance.
Ltat dshydrat des constituants cytoplasmiques, et limpermabilit des
enveloppes semblent jouer le rle le plus important. Le contenu en eau de la spore est
extrmement bas, entre 15 20% du poids, alors que celui de la cellule vgtative est
denviron 80%. Il a t montr que la temprature de dnaturation de protines et des
acides nucliques augmente avec le niveau de dshydratation du milieu dans lequel
elles sont chauffes. Le maintient de la pression osmotique interne serait assur par
lacide dipicolinique (par fixation des ions calcium) ncessaire la conservation de
ltat de dshydratation du cur sporal. En rsum, la rsistance de la spore la
chaleur serait due plusieurs facteurs :
la protection des acides nucliques grce au complexe acide dipicolinique Ca
++
la stabilisation de la structure spatiale des protines par ltat de dshydratation
une stabilit accrue des protines cellulaires chez les bactries thermophiles.
9
La sporulation
La spore qui prend naissance lintrieur mme de la cellule vgtative est
une cellule entirement nouvelle et diffrente du point de vue structure, composition
chimique et enzymatique. Le phnomne de sporulation est dclench par
lpuisement des ressources nutritives dans un contexte physico-chimique qui peut tre
variable suivant les espces (Leclerc et al., 1995).
La germination
Les conditions de culture pour le dnombrement des spores sont imposes par
les exigences particulires qui se manifestent pendant la transformation de la spore en
nouvelle cellule vgtative, c'est--dire la germination. Cette dernire comprend 2
phases :
La germination proprement dite, pendant laquelle la spore se rhydrate (elle
perd alors sa thermo-rsistance) et remet en fonction la machinerie des
synthses des acides nucliques et protines ;
L'mergence de la cellule hors de lenveloppe de la spore, et la croissance
de la cellule jusqu'au stade de la premire division.
La germination non spontane des spores exige l'apport de composs de faibles
poids molculaires et plus ou moins spcifique de l'espce et de la souche, tels que le
glucose, certains acides amins dont la L-alanine, des nuclotides (Leclerc et al.,
1995 ; Meyer et al., 1991). Le milieu de culture utilis pour le dnombrement des
spores doit contenir ces agents de germination, condition qui est gnralement remplie
du fait de la composition complexe des milieux habituellement utiliss. Le temps exig
pour la germination complte varie d'une spore l'autre : il peut atteindre plusieurs
jours plusieurs semaines. Il est frquent que la vitesse de germination ainsi que le
taux de spores germes augmentent la suite d'un chauffage modr (on parle alors
d'activation par la chaleur). Cette activation est apporte lors de lappertisation.
10
1.2. Historique et rappel des bases classiques du
calcul des traitements thermiques
Les traitements thermiques sont utiliss en industrie alimentaire pour matriser
la conservation, et en particulier la qualit sanitaire des produits. Ils peuvent tre
qualifis de pasteurisation lorsque leur rle est limit llimination des formes
vgtatives des germes pathognes et la plupart des non pathognes, ou de
strilisation lorsque le traitement limine toute entit viable. Ces traitements de
strilisation appliqus des doses trop faibles par souci dconomie ou pour prserver
la qualit organoleptique des produits, peuvent conduire une destruction incomplte
des micro-organismes. Aprs une lente rcupration au sein de laliment, certaines de
ces cellules pourront se dvelopper et tre la cause dintoxication alimentaire ou
daltration du produit. Il est donc important pour lindustriel de connatre et de
comprendre ces phnomnes dendommagement infligs aux micro-organismes, afin
den tenir compte dans lapplication des barmes de traitements en usine.
Cest au dbut du XIXe sicle, avec les travaux de Nicolas Appert que de
nouveaux procds de conservation des aliments voient le jour. Encore mal matrise,
cette nouvelle mthode entrana de nombreuses intoxications alimentaires graves.
Motive par un grand nombre de dcs dus la consommation de toxines botuliques
dbute une course pour mieux comprendre et matriser lexceptionnelle rsistance
thermique de Clostridium botulinum, autrefois appel Bacillus botulinus. Les
premires investigations remontent la fin du XIXe sicle. Mais cest la suite des
travaux de Bigelow et de ses collaborateurs (1920) que perce vritablement la
microbiologie prvisionnelle, avec lapplication de ces tudes dans ltablissement des
barmes de strilisation.
Les premiers travaux dans ce domaine mesuraient la rsistance thermique
dune suspension bactrienne en terme de temps de traitement une temprature
donne ncessaire pour inactiver cette suspension. On parle alors de Thermal Death
Point . La procdure usuelle pour dterminer le Thermal Death Point de spores
bactriennes est de soumettre une suspension en tubes scells une temprature ltale
donne pendant diffrents temps de traitement. Une subculture permet ensuite de
mettre en vidence les tubes devenus striles, et par consquent le temps ncessaire
pour atteindre la destruction totale (Bigelow et al., 1920 ; Weiss, 1921 ; Esty et
Williams, 1924 ; Williams, 1929).
11
1.2.1. Effet du temps dexposition la chaleur
1.2.1.1. Cas gnral : cintique de destruction dordre un
La dcouverte de la destruction dordre un est souvent attribue Madsen et
Nyman (1907). Le travail de Chick (1910) sur les cellules vgtatives de diffrentes
espces soumises des traitements thermiques ou des dsinfectants chimiques, ainsi
que les travaux de Esty et Meyer (1922), ont universellement accrdit cette loi de
destruction exponentielle des micro-organismes, dcrite par lquation :
Equation I.1
O N
0
est la taille de la population initiale traite, N celle de la population
survivante au temps t, et k la constante de vitesse de destruction.
Larticle de Esty et Williams (1924) montre nettement que la destruction de la
population est progressive. On peut suivre lvolution de la destruction en dnombrant
le pourcentage de tube positif aprs diffrents temps de traitement. De plus, un nombre
connu de spores est introduit dans les tubes scells. De cette manire, ces auteurs
mettent en vidence le fait que la destruction dune population soit exponentielle, et
quil est thoriquement impossible de dtruire compltement les micro-organismes
dun chantillon, mme par un traitement thermique prolong.
Cependant, il faut attendre 1943 pour que Katzin et al. introduisent la notion de
Decimal Reduction Time , encore note DRT, et enfin 1957 pour que Ball et Olsen
notent dsormais cette dure de rduction dcimale par la lettre D, qui sera
universellement adopte. De ce fait, lquation log-linaire est aujourdhui mieux
connue sous cette forme dcimale :
Equation I.2
Cette dernire forme reste actuellement la plus populaire pour au moins deux
raisons :
La forme logarithmique a pour double avantage de rendre lquation linaire
(Estimation des paramtres N
0
et D par simple rgression linaire) et de
stabiliser la variance.
Le choix de la forme dcimale offre lavantage dengendrer un paramtre de
thermorsistance D ayant la dimension dun simple temps et immdiatement
interprtable : temps de traitement conduisant une rduction de la
population survivante dun facteur 10.
kt
e N N

= .
0
D
t
N N =
0
log log
12
Les paramtres D et k sont lis par la relation :
Equation I.3
Aujourdhui, les rsultats concernant la destruction des micro-organismes par
un traitement ltal sont trs souvent reprsents sur graphique semi-logarithmique, et
appels courbes de survies. Linverse de la pente (en valeur absolue) est alors appele
temps de rduction dcimale et note D. Or, cette destruction semi-logarithmique
implique que la dure de rduction dcimale reste constante au cours du traitement ce
qui ne sapplique pas tous les cas de figure.
1.2.1.2. Cas particuliers de destruction non log-linaires
Dans de nombreux cas, on observe des dviations ce modle. Les
populations composes de micro-organismes aux thermo-rsistances variables ne
suivront plus la destruction dordre un. En 1977, Cerf met en garde contre une
utilisation abusive des quations I.1 et I.2 pour lestimation de barmes de strilisation
en entreprises alimentaires ou pharmaceutiques.
Figure I.4 : Les diffrents profils de destruction de populations
bactriennes par la chaleur daprs Cerf (1977), en log CFU en fonction du
temps de traitement thermique (en min).
k
D
10 ln
=
0
1
2
3
4
5
6
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
t e m p s d e t r a ite m e n t
l
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s A
B
C
D
E
F
13
Les cintiques rencontres Figure I.4 laissent gnralement apparatre un dlai
en dbut de destruction, voire une activation (cintiques A & B). On dit alors que la
cintique forme un paulement. A linverse, on observe parfois une queue, encore
appele trane, o le taux de destruction diminue au cours du traitement thermique
(cintiques E & F). Il sagit dun ralentissement de la vitesse de destruction au cours
du traitement thermique. Enfin, ces deux phnomnes peuvent tre rencontrs sur une
mme cintique. La courbe prend alors une allure sigmodale (cintique C).
Par la suite plusieurs auteurs se sont intresss ces courbes de survie non
linaires et quelques modles nouveaux ont vu le jour. On ne prsentera ici que les
modles primaires utiliss dans le cadre de ce travail.
T Lactivation thermique
La figure I.5 montre que le profil de destruction de cette souche nest pas
linaire au cours des premires minutes du traitement. Ceci sexplique par le fait que
pour permettre leur germination, certaines spores ncessitent une activation qui peut
tre engendre par un choc physique ou chimique, tel que le choc thermique ou
osmotique. Un traitement thermique inflig une population de spores pourra avoir,
dans un premier temps, deux effets simultans : Une activation thermique des spores
couple une destruction. Les auteurs ayant modliss ces cintiques se sont appuys
sur des raisonnements mcanistes. Le modle le plus simple (Schull et al., 1963)
Figure I.5 : cintique de destruction dun Bacillus stearothermophilus 113C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
0 10 20 30 40 50 60
temps de traitement (en min)
l
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s

(
C
F
U
)
14
suppose que la population de spores dormantes ne peut tre dtruite quaprs avoir t
active. Rodriguez et al. (1988, 1992) suppose que les spores dormantes, tout en tant
thermiquement actives, subissent un mme taux de destruction que les spores actives.
Le modle le plus complet est celui de Sapru (1993) qui ne diffre du prcdent que
par un taux de destruction des spores actives diffrent du taux de destruction des
spores dormantes.
Le modle scrit :
Equation I.4
o X
0
et Y
0
sont respectivement les populations initiales de spores actives et
dormantes, h est le taux dactivation, k
1
et k
2
sont respectivement les taux de
destruction des populations actives et dormantes.
T Les populations htrognes
Ltude de la thermorsistance de la souche de Bacillus cereus B
2
ac par
Rajkowski (1987) a conduit des profils de destruction en deux parties distinctes. La
cintique de destruction 102,5C est reprsente figure I.6. Il sagit dune souche
dont la cintique laisse apparatre une cassure de pente. Ceci est interprt par une
sporulation conduisant deux familles de spores qui possdent chacune une
thermorsistance propre. Nous pouvons alors dterminer une dure de rduction
dcimale pour chacune des deux sous-populations.
( )
t h k t k t k
e e
h k k
h
Y e X N
). (
1 2
0 0
2 1 1
.
+
+
+ =
15
Figure I.6 : Cintique de destruction de Bacillus cereus B
2
ac 105,5C (Rajkowski, 1987)
T Les populations htrognes avec activation thermique
Il sagit dune combinaison des deux cas prcdents. La courbe de survie
laisse apparatre deux sous-populations de spores, mais la plus thermorsistante ne suit
pas une destruction log-linaire, et ncessite une activation thermique. Rodriguez et al.
(1988) reprennent lquation 4 et lui ajoutent un terme correspondant la destruction
log-linaire de la population thermosensible. Lquation devient :

Equation I.5
o - Z
0
est le nombre de spores de la population thermosensible initiale
- X
0
est le nombre de spores actives de la population thermorsistante
- Y
0
est le nombre de spores inactives de la population thermorsistante
- k1 est la constante de destruction de la population thermosensible
- k2 est la constante de destruction de la population thermorsistante
- h est la constante de vitesse laquelle les spores Y sactivent en X.
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
0 2 4 6 8 10 12
l
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s

(
C
F
U
)
( )
t h k t k t k t k
e e Y e X e Z N
). (
0 0 0
2 2 2 1
. .
+
+ + =
16
Lorsque les deux sous-populations suivent une destruction log-linaire (figure
I.6), cest--dire sans activation thermique ncessaire (h = 0), le modle devient :
Equation I.6
T Lpaulement et la trane
Lpaulement ou la trane sont caractriss par une thermorsistance qui varie
au cours du traitement thermique.
La figure I.7 reprsente une cintique de destruction de Clostridium botulinum
une temprature de traitement de 90C (Stringer, 1996). On observe une trane,
cest dire une destruction beaucoup plus lente en fin de traitement. Ceci traduit une
distribution trs htrogne de la thermo-rsistance au sein de la population.
Figure I.7 : Cintique de destruction de Clostridium botulinum (Stringer, 1996)
LHaridon et Cerf (1978) proposent un modle simple pour dcrire la
cintique de type paulement ou trane :
Equation I.7
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60
temps de traitement 90C (en min)
l
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s

(
C
F
U
)
a
D
t
N + = log
t k t k
e X e Z N
2 1
. .
0 0

+ =
17
O lordonne lorigine a correspond la population initiale virtuelle que
lon obtiendrait par extrapolation de la droite vers lorigine. Mais ce modle se limite
la partie linaire de la cintique, qui nest pas toujours bien dfinie.
Anderson et al. (1996) tudient la destruction dune population de Clostridium
botulinum 213B des tempratures de traitement variant de 101 121C. Ils montrent
pour chaque temprature teste, que les courbes de survie divergent de la forme
logarithmique prvue par le modle traditionnel dordre un. Ces rsultats suggrent
que toutes les spores de la population ne possdent pas une thermorsistance identique.
Dans le cas de lpaulement ou de la trane, les individus de la population traite
nont pas une thermo-rsistance identique, et ces diffrences sont permanentes.
Postulant que la distribution des valeurs de thermo-rsistance au sein dune
population sont htrognes, certains auteurs (Fernandez, 1999 ; Peleg et Cole, 1998 et
2000) mettent en vidence une distribution des thermo-rsistances de Weibull, dont
lintgration correspondrait la population survivante en fonction du temps de
traitement :
Equation I.8
O k et p sont deux paramtres empiriques caractrisant la distribution des
thermo-rsistances.
Peleg et Cole (1998) prsenteront ce modle sous sa forme logarithmique.
Lintrt de ce modle est de ne comporter que de trois paramtres.
Mafart et al. (2002) vont plus loin en reparamtrant lquation afin de donner
une signification physique chacun des paramtres :
Equation I.9
o remplace la traditionnelle valeur D. Il sagit de la dure de la premire
rduction dcimale de la cintique. Le paramtre p reflte la rpartition des thermo-
rsistances au sein de la population. La valeur de p est trs stable et varie peu en
fonction de la temprature et des autres facteurs environnementaux. Pour une
population donne, p peut alors tre fix quelles que soient les conditions
environnementales.
Lintrt de ce modle est de sadapter facilement de nombreuses cintiques
de destruction non linaire. De faon gnrale, les courbes convexes sont ajustes par
un p>1, et les courbes concaves par un p<1. Quand la destruction est linaire, p prend
p
kt
e N N

= .
0
p
t
N N

0
log log
18
la valeur de 1, conduisant au modle classique log-linaire ( = D). Ainsi il a t
vrifi que obit la relation de Bigelow, au mme titre que D.
Un grand nombre de modles autres que ceux prsents ci-dessus ont t
proposs. La plupart sont mcanistes ou pseudo-mcanistes. Citons pour conclure la
revue exhaustive de Geeraerd et al. (2000) reprenant lensemble de ces modles.
Cependant aujourdhui encore, les cycles de strilisation des industries
alimentaires ou pharmaceutiques sont bass sur la loi de destruction exponentielle.
Dans les cas o la dure de rduction dcimale diminue au cours du traitement, la
rduction effectue sera suprieure celle prvue par le modle linaire. Mais si la
dure de rduction dcimale augmente au cours du traitement (Fig I.4, courbes C et E),
la destruction effectue devient infrieure lestimation, pouvant alors engendrer des
accidents de strilisation. Anderson (1996) va mme plus loin en montrant que les
cintiques concaves telles que la courbes E (fig I.4) vont tendre vers une
asymptote, et quil devient impossible datteindre le minimum botulinum cook
correspondant aux 12 rductions dcimales. Ainsi, le travail prsent prdit quun
traitement de 3 min 121,1C sur la souche de Clostridium botulinum utilise
engendre seulement 7 rductions dcimales, ce qui prouve que dans ce cas le
botulinum cook nest pas respect.
1.2.2. Effet de la temprature sur les paramtres des
modles primaires
Pendant longtemps, la modlisation secondaire est reste au stade
monofactoriel, o seule la temprature de traitement tait prise en compte. Deux
modles, pourtant incompatibles entre eux, prsentent la mme qualit dajustement
remarquable :
Le modle dArrhenius (1889)
Lquation dcrit leffet de la temprature sur la valeur de la constante de
destruction k :
Equation I.10
O T est la temprature absolue de traitement, E
a
lnergie dactivation, R la
constante des gaz parfaits, et B une constante empirique.
RT
E
a
e B k

= .
19
Linconvnient de ce modle est que B na aucune signification physique, et
un ordre de grandeur difficile concevoir. Cest pourquoi le modle est souvent
reparamtr sous la forme :
Equation I.11
O k* reprsente alors le taux de destruction la temprature de rfrence T*.
Le modle de Bigelow (1921)
Cette quation repose sur lobservation selon laquelle le logarithme de la
dure de rduction dcimale volue de faon linaire en fonction de la temprature.
Il scrit sous la forme :
Equation I.12
O D* reprsente la dure de rduction dcimale la temprature T*, tandis
que z reprsente lcart de temprature induisant une variation de D dun facteur dix.
Contrairement leurs apparences trs diffrentes, il est difficile de dpartager
ces deux modles tant leurs qualits dajustement sont proches. Le premier caractrise
la thermosensibilit dun micro-organisme partir des paramtres E
a
et k*, tandis que
le second exprime la thermorsistance par les paramtres D* et z. Dans les milieux
agroalimentaires, le modle de Bigelow est pourtant prfr, compte tenu de son
paramtre z plus tangible que lE
a
du modle dArrhenius.

=
*
1 1
. *
T T R
E
a
e k k
z
T T
D D
*
* log log

=
20
1.2.3. Quantification des traitements thermiques
1.2.3.1. Nombre n de rductions dcimales
La manire la plus directe de quantifier un traitement thermique est de
caractriser celui-ci par son efficacit sur une souche cible donne, cest--dire par le
taux de rductions atteint (N/N
0
) aprs le traitement. Cette efficacit est souvent
exprime par le taux de rduction dcimal not n et dfini par :
Equation I.13
1.2.3.2. Notion de valeur strilisatrice (F)
La valeur strilisatrice est un concept rpandu dans lindustrie de la
pasteurisation et de lappertisation. Elle est utilise pour quantifier un traitement
thermique indpendamment de la cible vise. Elle correspond tout traitement
entranant le mme taux de destruction quun traitement la temprature de rfrence
(121,1C) pendant t minutes :
Equation I.14
Lorsque le traitement est ralis une temprature diffrente de 121,1C, le
temps ncessaire pour atteindre la valeur strilisatrice F souhaite est, selon la relation
de Bigelow :
Equation I.15
O t est le temps de traitement la temprature T pour atteindre la valeur
strilisatrice F
121,1
.
La valeur de z est conventionnellement fixe dix (en rfrence la valeur
relative Clostridium botulinum).
C
t F

=
1 , 121
z
T T
T
F t
*
*
10 .

=
N
N
n
0
log =
21
1.2.3.3. Notion de valeur de destruction biologique (VDB)
On dfinit la valeur de destruction biologique, note L
T
, par le rapport entre la
fragilit des spores la temprature T et la fragilit des mmes spores la temprature
de rfrence T* :
Equation I.16
Par consquent, selon la relation de Bigelow,
Equation I.17
Les traitements thermiques sont gnralement raliss en conditions
dynamiques, cest--dire des tempratures variant du dbut la fin du traitement. La
valeur strilisatrice devient alors :
Equation I.18
1.2.3.4. Relation avec la dure de rduction dcimale
Par dfinition, la dure de rduction dcimale D
T
est le temps de traitement
la temprature T ncessaire pour rduire une population dun facteur 10. On peut alors
crire :
Equation I.19
O n est le nombre de rductions dcimales appliqu. On en dduit :
Equation I.20
=
f
t
t
T T
dt L F
0
.
*
n
D
t
N
N
T
= =
0
log
T T
D n t . =
D
D
D
D
L
T
*
*
1
1
= =
z
T T
T
L
*
10

=
22
Lquation I.20 devient dans les conditions standards de temprature :
Equation I.21
1.3. Effet du pH sur la thermorsistance
La rsistance thermique d'un micro-organisme varie en fonction des conditions
physiologiques et physico-chimiques dans lesquelles il se trouve avant, pendant et
aprs le traitement thermique. Les facteurs modifiant ventuellement l'allure de la
destruction thermique des micro-organismes sont :
- des facteurs intrinsques : thermo-rsistance variable selon les espces,
les individus, les formes vgtatives ou sporules, l'ge, ltat physiologique
- des facteurs environnants : pH, lactivit de leau, prsence de lipides
et de protines, pression osmotique, les sels minraux.
Pour chaque facteur physique ou chimique du milieu de traitement jouant un
rle sur la thermo-rsistance des micro-organismes, on peut mettre en vidence deux
effets distincts. Dune part, on observe un effet sexerant sur les spores au moment du
traitement thermique. Dautre part, la germination et la recroissance qui suit le
traitement thermique sont galement influences par la composition physico-chimique
du milieu.
Notre travail est consacr ltude complte dun de ces facteurs : le pH.
Linfluence du pH est tudie dune part au cours du traitement thermique, et dautre
part aprs ce traitement, que lon dsignera par recouvrement. Ces deux effets peuvent
tre indpendants et constituent deux facteurs distincts. La prsentation ci-aprs
dissociera leffet du pH de traitement de celui du pH de recouvrement.
1.3.1. Le facteur pH du milieu de traitement
1.3.1.1. Influence de lacidification du milieu de traitement
Sur la multitude de facteurs pouvant influencer la rsistance thermique des
micro-organismes, quils soient physiques, chimiques ou biologiques, certains se
distinguent par leur effet prpondrant. Parmi eux, le pH du milieu est probablement le
* * *
.
T T T
D n F t = =
23
facteur concernant le plus lindustrie alimentaire, compte tenu de lacidit dune
grande majorit des produits alimentaires et de son effet substantiel sur les spores
bactriennes chauffes.
Leffet du pH a t mis en vidence trs tt. Les premires donnes publies
sur cette influence sur les cintiques de destruction thermique remontent prs dun
sicle. Souvent, linfluence du pH est illustre indirectement par des tudes effectues
sur des jus acides (ex : jus de fruits). Dickson (1919) qualifie de remarquable leffet
produit par lajout de jus de citrons sur la rsistance thermique de suspensions de
spores.
En 1920, Bigelow et Esty font varier progressivement le pH de leur milieu de
traitement de 4,5 6,5. Le Thermal Death Point est valu diffrents pH pour cinq
souches thermophiles. Malgr une forte htrognit des valeurs de thermorsistance,
la mme tendance est mise en vidence pour toutes les souches.
Figure I.8 : Influence du pH sur le temps ncessaire pour dtruire des spores de cinq souches
thermophiles diffrentes chauffes 120C, daprs Esty et Bigelow (1920).
Leffet dune acidification sur la thermorsistance des spores est clairement
illustr par la figure I.8. Des temps de traitement de 4 minutes pH 6,1 entranent un
mme taux de destruction quun traitement dune minute pH 4,6 pour la souche
1373. Si lon considre la souche 1503, un traitement de 18 minutes pH 6,1 est rduit
5 minutes pH 4,6. Autrement dit, pour toutes ces souches, lacidification du milieu
de 1,5 units de pH rend les traitements thermiques quatre fois plus efficace en termes
de destruction microbienne.
24
Esty et Meyer (1922) dterminent le Thermal Death Point dans deux
milieux diffrents des pH variant de 3,5 9. Les variations de thermorsistance
engendres par les acidifications ou alcalinisation sont particulirement nettes. De
plus, on observe dj une valeur de pH pour laquelle la thermo-rsistance est optimale.
Ce pH provoquant la destruction bactrienne la plus lente se situe prs de la neutralit.
La figure I.9 illustre linfluence du pH du milieu sur le Thermal Death Point, avec une
valeur de pH de thermo-rsistance optimale voisine de 7.
Figure I.9 : Influence du pH (en abscisse) sur le Thermal Death Point (en ordonne, exprime en
mn) daprs Esty et al. (1922)
Sur les deux graphiques, nous pouvons lire quun traitement thermique
effectu pH 4,5 inactive compltement une population bactrienne en 10 fois moins
de temps quun mme chauffage opr dans un milieu pH 6,5.
Contrairement au traitement en milieu phosphate, le traitement dans linfusion
de veau laisse apparatre une linarit trs nette entre le temps dinactivation et le pH
du milieu.
Lanne prcdente, Harry Weiss obtenait des rsultats similaires sur une
souche de Clostridium botulinum traite des pH variant de 1,5 11,5. Le pH
optimum de thermo-rsistance tait encore une fois proche de la neutralit.
25
Puis, cette observation a ensuite t confirme de nombreuses reprises
(tableau I.1). Schmidt (1957) rapporte que la rsistance thermique maximale pour les
spores se situe gnralement entre 6 et 8.
Tableau I.1 : exemple bibliographique de pH optimum de thermo-rsistance
souches pH optimum rfrence
Clostridium botulinum 7,2 Weiss (1921)
Clostridium tetani 7 Murray et Headlee (1931)
Bacillus anthracis 8 Murray (1931)
Clostridium perfringens 5 Headlee (1931)
Bacillus cereus 7 Vas et Proszt (1955)
Bacillus cereus 7,5 Gaillard et al. (1998b)
Bacillus cereus 7,15 Couvert et al. (1999)
Les nombreuses tudes qui ont suivi, portant sur linfluence du pH sur la
thermorsistance, sont unanimes : lacidification du milieu de traitement entrane une
diminution notable de la dure de rduction dcimale des micro-organismes chauffs
(Cook et Gilbert, 1968 ; Lowik et Anema, 1971 ; Lynch et Potter, 1988 ; Silla Santos
et al., 1992, 1993, 1995 ; Lopez et al., 1994, 1996 ; Fernandez et al., 1996).
1.3.1.2. Influence de la nature de la matrice
Des tudes menes sur le pH se dgagent limportance de la nature des matrices
alimentaires sur trois souches de Bacillus cereus (Mazas et al., 1998). La souche 4342
voit sa thermorsistance varier en fonction de la nature de laliment dans lequel elle est
chauffe (figure I.10). Prs dun demi log spare les valeurs de D dtermines dans un
tampon de Mac Ilvaine celles dtermines dans un bouillon de riz. On a galement
observ que les variations de D en fonction du pH sont identiques, quelle que soit la
nature de la matrice. Les effets du pH et de la matrice sont priori indpendants.
Mais ces effets restent particuliers une seule des trois souches de Bacillus
cereus tudies par ces auteurs. Pour les deux autres souches, aucun effet de la matrice
nest mis en vidence. Il sagit donc dun effet propre certaines souches et ne peut
priori tre gnralis.
26
Figure I.10 : Influence du pH et du milieu de suspension sur la thermorsistance de spores de Bacillus
cereus (Mazas et al., 1998). Valeurs de D exprime en min.
1.3.1.3. Influence de la nature de lacidifiant
Lajout dun acide dans le milieu de traitement va engendrer, en plus de
lacidification par libration de protons, une modification de la composition du milieu
par apport de sa base conjugue. La base conjugue pourra tre minrale ou organique.
Silla Santos (1992, 1995) compare les effets de lacidification dune pure dasperge
par de la glucono-lactone et de lacide citrique sur la thermorsistance dune
suspension de Clostridium sporogenes PA 3679. La comparaison des valeurs de D
obtenues selon le type dacidifiant montre que lacide citrique rduit plus fortement la
dure de rduction dcimale que la glucono-lactone un mme pH. Dautres
auteurs ont galement mis en vidence cet effet du type dacide (Lynch et Potter,
1988 ; Brown et Martinez, 1992).
Legurinel et Mafart (2001) publient les rsultats dune tude comparant leffet
de neuf acides organiques diffrents sur la valeur de D dune souche de Bacillus
27
cereus. Chaque acide, par son acidification, va entraner une diminution de la valeur de
D. Mais pour une mme valeur de pH, deux acides diffrents ne vont pas conduire la
mme valeur de D. Ces auteurs montreront quil existe une relation linaire entre le
pKa de lacide et son incidence sur D : Plus le pKa de lacide est lev et plus son effet
sur la thermo-rsistance est important (Anderson et al., 1949 ; Leguerinel et Mafart,
2001 ; Pontius et al., 1998).
1.3.1.4. Interaction entre les facteurs temprature et pH
Silla Santos et al. (1993) remettent en cause linfluence du pH aux fortes
tempratures (>130C). Selon ces auteurs, une acidification de la pure dasperge par
lacide citrique entrane une nette rduction des valeurs de D 121C. Mais cet effet
devient moins marqu lorsque le traitement est effectu des tempratures suprieures
130C.
Ces rsultats font ressortir la prsence dinteractions entre les facteurs pH et
Temprature. Dautres auteurs exposent des rsultats similaires : les effets des facteurs
pH et Temprature tendent sattnuer lorsque leurs valeurs sloignent des conditions
favorables la survie des micro-organismes. (Anderson et Friesen, 1974). De mme,
Rodrigo et al. (1993) observe que le pH na pas deffet sur la thermorsistance de
spores de Bacillus stearothermophilus et Clostridium sporogenes quand elles sont
chauffes en HTST (High Temperature Short Time). Ces mme rsultats sont
confirms par Ocio et al. (1994) et Fernandez et al. (1994) sur Bacillus
stearothermophilus, puis par Mazas et al. (1998) sur Bacillus cereus.
Cependant, Clostridium sporogenes semble faire exception cette rgle puisque
plusieurs auteurs rvlent que pour cette espce, la valeur de z nest pas influence par
le pH (Silla Santos et al.,1995 ; Cameron, 1980). De plus, les rsultats de ces derniers
auteurs semblent montrer que Clostridium sporogenes est plus sensible leffet du pH
aux tempratures les plus leves.
Daprs les travaux de Silla Santos et al. (1992), lacidification dune pure
dasperge par de lacide citrique ou de la glucono--lactone entrane une diminution de
la dure de rduction dcimale pour Clostridium sporogenes PA 3679. Cependant,
leffet du pH sur D diminue lorsque la temprature de traitement augmente. A 118C
et 121C, cet effet devient ngligeable lorsque lacide citrique est utilis. Par ailleurs,
leffet de la glucono--lactone se maintient partiellement aux fortes tempratures.
Cette action de la temprature sur leffet du pH semble donc dpendre de
lacide utilis. Ceci est confirm par les rsultats de Lowik et Anema (1972) obtenus
sur une souche de Clostridium sporogenes traite dans de la viande hache. Leur
28
domaine dtude stend de 110 120C, et de pH 4,8 6. De mme, linfluence du
pH est plus accentue aux basses tempratures.
Toutes ces donnes bibliographiques nous montrent que les deux facteurs
appliqus simultanment tendent souvent sattnuer mutuellement. En dautres
termes, leurs effets simultans sont infrieurs la somme de leurs effets tudis
indpendamment. Ces interactions ont videmment des consquences pratiques qui
doivent tre prises en compte.
1.3.2. Le facteur pH du milieu de recouvrement
Mallidis (1986) rapporte que les spores survivantes un traitement thermique
sont souvent plus exigeantes dun point de vue nutritionnel que les spores non traites.
La nature du milieu de recouvrement peut alors affecter significativement le taux de
survivants un traitement thermique.
Les premires tudes concernant le facteur pH furent menes en tubes
thermoscells. Le milieu de traitement ajust au pH tudi, puis inocul par une
suspension de spores, tait introduit dans des tubes, scells la flamme, et ports la
temprature de traitement souhaite dans des bains thermostats. En fin de traitement
thermique, les tubes taient incubs en ltat. Le recouvrement se faisait donc dans le
mme milieu et au mme pH que le traitement. Les tubes positifs taient ensuite
rvls.
Ce nest quen 1950 que Olsen et Scott ralisent des traitements thermiques
sur des spores de Clostridium botulinum suspendues dans un tampon phosphate pH7.
A lissu du traitement, les spores sont mises en incubation dans diffrents milieux
nutritifs ajusts des pH variant de 5 9. On observe alors un taux de spores qui varie
avec le pH de recouvrement, bien quayant subi des traitements thermiques
rigoureusement identiques (figure I.11). Le pH du milieu post traitement joue donc un
rle sur la thermo-rsistance apparente des spores bactriennes.
29
Figure I.11 : reprsentation du nombre de spores viables de deux souches de Clostridium
botulinum en fonction du pH de recouvrement dans deux milieux (selon Olsen et Scott
(1950). Cercle : souche 1 ; Carr : souche 2 ; Noir : milieu 1 ; Blanc : milieu 2.
Malgr leffet considrable du pH du milieu post-traitement sur le
recouvrement des spores, peu darticles reprennent ce sujet pendant les dcennies
suivantes.
Cook et Brown (1965) prcisent quune diffrence de 0,5 units de pH affecte
significativement le recouvrement de spores traites. Ils observent galement une
diffrence entre les spores traites et non traites. Ainsi, le taux maximum de
germination de spores de Bacillus stearothermophilus non traites est obtenu dans un
milieu pH voisin de 6,5 alors que les spores ayant subi un traitement thermique
germent plus abondamment des pH compris entre 7 et 7,3. Ces observations
traduisent une rorientation du mtabolisme chez les spores devant rparer des
dommages endurs lors dun passage des tempratures ltales.
Feeherry (1987) confirme ces rsultats sur des spores de Bacillus
stearothermophilus. Le taux de spores capables de germer et de prolifrer pH 5,8 par
rapport au pH optimum de 6,9 est de 1%. Cet effet du pH de recouvrement savre
donc encore plus drastique que celui du pH de traitement, do le grand intrt de le
prendre en compte dans les tudes de strilisations de produits caractre acide.
30
Depuis, de nombreuses publications ont dcrit cet effet du pH du milieu de
recouvrement sur la thermorsistance (Mallidis et Scholefield, 1986 ; Sanchez et al.,
1995 ; Fernandez et al., 1994 ; Silla Santos et al., 1995 ; Gonzales et al., 1995 ; Santos
et Zarzo, 1996 ; Lopez et al., 1997 ; Couvert et al., 1999 ; Legurinel et al., 2000).
Le recouvrement dans un milieu dont le pH est infrieur au pH optimum
(gnralement voisin de 7) rduit le taux de survie du nombre de micro-organismes
que Mafart et Legurinel (1997) qualifient dapparent, et quils notent N. De mme,
ces auteurs notent D la dure de rduction dcimale apparente dtermine des pH de
recouvrement diffrents du pH pour lequel le taux de survie est maximal. Par
consquent :
Equation I.22
Les derniers auteurs cits ont montr que D et , taux de viabilit N/N,
taient lis selon lquation :
Equation I.23
Figure I.12 : Reprsentation du logarithme de N (taille de la population survivante)
en fonction du temps de traitement (en min). La dure de rduction dcimale est
note D pour un recouvrement au pH optimum, et D pour un pH diffrent.
'
0
10 . '
D
t
N N

=
0
1
2
3
4
5
0 0.5 1 1.5 2 2.5
temps de traitement thermique
l
o
g

N
'
pH'opt
pH' < pH'opt
Pente = -1/D
Pente = -1/D
C
C
D
F
D
D
=
1 , 121
1 , 121
1
'
log
31
Palop (1999) souligne limportance de leffet du milieu dans lequel sont
recueillies les spores aprs un traitement thermique. Il est vrai que la destruction des
micro-organismes assure la scurit alimentaire et la stabilit microbiologique de
laliment dans le temps, mais il en rsulte souvent une application de traitement
thermique trop soutenu entranant une perte des qualits du produit. Or, dans la plupart
des cas, la destruction totale bactrienne nest pas ncessaire pour que laliment soit
sain, car la croissance des spores survivantes peut tre inhibe par des facteurs
environnementaux. Dans ce cas, les micro-organismes survivants peuvent tre
incapables de se dvelopper, permettant des traitements de strilisation moins
drastiques. Ces facteurs environnementaux sont principalement les basses
tempratures de stockage, les basses activits de leau et les pH acides.
1.4. Modles multifactoriels intgrant le pH
La microbiologie prvisionnelle ne se limite pas ltude qualitative des effets
des facteurs environnementaux sur la thermorsistance. Son principal objectif consiste
en une description quantitative de ces effets et en leur mise en quations. Les qualits
recherches lors de llaboration dun modle sont essentiellement :
La qualit dajustement : lcart entre les valeurs exprimentales et les
valeurs calcules selon le modle doit tre minimal. Un des critres quantitatifs
permettant de tester la qualit dajustement est la moyenne des carrs des carts entre
les valeurs observes et calcules. Les coefficients de dtermination ou de corrlation
peuvent galement tmoigner de la qualit dajustement ;
Lhomocdasticit, la normalit et lindpendance des rsidus : la
rpartition des rsidus doit tre alatoire et suivre une loi normale.
La parcimonie : Elle se traduit par un nombre de paramtres minimum.
Linterprtabilit des paramtres, quelle soit physique, chimique ou
biologique ;
La robustesse : un modle robuste est un modle qui, tabli sur un jeu de
donnes exprimentales, sadapte aussi bien aux points issus dune autre manipulation.
La robustesse est gnralement lie la parcimonie. En gnral, plus un modle est
complexe, meilleure est sa qualit dajustement sur le jeu de donnes ayant servi
ltablir, au dtriment de sa robustesse ;
Labsence de corrlation structurelle : les paramtres ne doivent pas tre
corrls entre eux. Lindpendance des paramtres assure une meilleure stabilit et
amliore la robustesse ; une autocorrlation marque entre les paramtres dun modle
peut tre le signe dune surparamtration.
32
Ce nest que dans les annes 80 que les modles ont progressivement intgr
plusieurs facteurs, ajoutant la temprature, le pH, puis la
w
, etc
Les modles prsents dans la littrature sont de trs rares exceptions prs
(Reichart et al., 1994) linaires et assimilables des modles polynomiaux. On peut
systmatiquement les classer selon les trois catgories suivantes :
les modles quadratiques complets
Lajustement de ces modles est souvent trs bon, mais le manque de
robustesse du la surparamtration, est leur principal dfaut. Citons titre dexemple
le modle quadratique de Fernandez (1996) appliqu Bacillus stearothermophilus et
Clostridium sporogenes, dcrivant le taux de destruction k en fonction du pH et de la
temprature :
Equation I.24
O T et pH sont les deux facteurs
a, b, c, d, e et f sont les paramtres estims
k est le taux de destruction
les modles polynomiaux rduits
Il sagit des modles prcdents auxquels ont t supprims les termes non
significatifs. A titre dexemple, le modle de Davey et al. (1978), puis celui de Cerf et
al. (1996) peuvent tre considrs comme des modles polynomiaux rduits
dbarrasss des termes non significatifs et des termes dinteractions.
les modles reparamtrs
Les modles prcdents sont remanis afin de remplacer les coefficients des
polynmes par des paramtres signification physique ou biologique. En contrepartie,
de tels modles ne sont plus linaires vis vis de leurs paramtres. A titre dexemple,
on citera le modle de Mafart et Legurinel (1998) o chaque paramtre est
interprtable (quation I.26).
1.4.1. Modles intgrant le pH de traitement
Outre les modles polynomiaux quadratiques (Fernandez et al., 1996 ; Tejedor
et al., 2001), peu de modles dcrivant linfluence du pH ont t prsents. Davey et
( )
2 2
log pH f T e pH T d pH c T b a k + + + + + =
33
al. (1978) sont les premiers proposer un modle exprimant le taux de destruction du
modle primaire dordre un en fonction des facteurs temprature et pH. Le modle est
prsent comme une extension de lquation dArrhnius :
Equation I.25
Il sagit dun modle quadratique tronqu des termes 1/T et interaction pH-
temprature que les auteurs estiment ngligeables. Lintrt de ce modle vient de la
simplification suivante : il ne met en jeu que quatre paramtres (mais sans signification
physique) pour deux facteurs. De plus, son ajustement est possible par rgression
linaire multiple, et sa qualit dajustement, satisfaisante dans la plupart des cas,
traduit une bonne robustesse.
Cependant, Mafart (1999) dmontre que ce modle reste surparamtr, en
raison de ses paramtres C
2
et C
3
troitement corrls. Paralllement, Mafart et
Legurinel (1998) proposent un autre modle driv du modle de Bigelow, tabli
partir de jeux de donnes emprunts la littrature :
Equation I.26
O T* et pH* sont respectivement les valeurs de rfrence de la temprature
(121,1C) et du pH (pH7). D* reprsente la dure de rduction dcimale la
temprature et au pH de rfrence. Les paramtres z
T
(classique du modle de
Bigelow) et z
pH
(par analogie au prcdent), expriment les carts de temprature ou de
pH (par rapport pH*) induisant une variation de la dure de rduction dcimale D
dun facteur 10.
Comme le modle de Davey, le modle de Mafart et Legurinel est linaire, et
par consquent ajustable par rgression linaire multiple. Son atout est quil ne
possde plus que trois paramtres (D*, z
T
, z
pH
).
Un point faible de ce modle est pourtant discut dans un article de Mafart et
al. (2001) : le modle attribue en effet une relation quadratique entre le log D et le pH.
Or plusieurs auteurs ont mis en vidence une relation linaire simple (Esty et al.,
1922 ; Jordan et Jacob, 1948 ; Fernandez et al., 1996 ; Mazas et al., 1998 ; Pirone et
al., 1987). Lexposant du troisime terme du modle peut donc osciller entre 1 et 2
selon les populations microbiennes tudies, ce qui porterait le modle quatre
2
3 2
1
0
ln pH C pH C
T
C
C k + + + =
2
* *
* log log

=
pH T
z
pH pH
z
T T
D D
34
paramtres et entranerait la perte de linarit du modle. Les auteurs ont dons pris le
parti de conserver la version trois paramtres, quitte la dcliner en une forme du
premier degr et une forme du second degr.
Cependant tous ces modles ne prennent en compte que linfluence des
facteurs environnementaux au cours du traitement thermique, supposant que les spores
bactriennes se retrouvent aprs traitement dans un milieu propice la recroissance,
ignorant ainsi linfluence du milieu de recouvrement sur la viabilit. Or, si lon
considre la strilisation dun produit alimentaire, les facteurs physico-chimiques de
laliment restent les mme pendant et aprs le traitement thermique.
Ds 1950, Olsen et Scott montrent un effet du milieu de culture post-
traitement thermique sur le taux de spores capables de germer et de prolifrer. La
thermo-rsistance apparente est alors directement affecte puisque le taux de
survivants varie selon le milieu glos utilis pour le dnombrement, bien que les
suspensions de spores aient rigoureusement subi le mme traitement, dans les mme
conditions.
Cet effet peut tre interprt comme une tape supplmentaire que les spores,
dj endommages par un traitement thermique, doivent subir lors de la germination et
de la recroissance.
Il est tonnant de constater le dsintrt de la microbiologie prvisionnelle vis-
-vis des facteurs environnementaux post-traitement thermique.
1.4.2. Modles intgrant le pH de recouvrement
En 1999, Couvert et al. supposent un effet du pH de recouvrement pouvant
sajouter celui du pH de traitement dj dcrit par le modle de Mafart et Legurinel
(1998). Ce dernier peut scrire sous la forme condense:
Equation I.27
O D* est la dure de rduction maximale obtenue un pH de rfrence.
Leffet du pH de recouvrement peut tre dcrit de la mme faon :
Equation I.28
O D est la dure de rduction dcimale apparente au pH (pH de
recouvrement).
( ) * D pH f D =
( )D pH f D ' ' ' =
35
Si on admet un effet multiplicatif des deux facteurs, on obtient :
Equation I.29
La fonction f(pH) scrit selon le modle de Mafart et Legurinel (1998) :
Equation I.30
Compte tenu de la similitude des courbes de survie observes entre le
logarithme de D en fonction du pH de traitement et le logarithme de D en fonction du
pH de recouvrement, les auteurs proposent une valeur de f(pH) btie sur le mme
modle que f(pH) :
Equation I.31
O le pH est le pH du milieu de recouvrement, et pH
opt
le pH de
recouvrement pour lequel est observe la dure de rduction dcimale la plus leve,
gnralement voisin ou gal 7. Le paramtre z
pH
reprsente lcart de pH par
rapport pH
opt
qui conduit une rduction de D dun facteur 10.
Un modle global prenant en compte la fois linfluence du pH de traitement
et le pH de recouvrement sur la dure de rduction dcimale peut alors tre propos :
Equation I.32
Etabli sur une souche de Bacillus cereus, ce modle a t valid selon des
donnes bibliographiques obtenues sur Bacillus stearothermophilus (Lopez et al.,
1996, 1997). Il nglige les ventuelles interactions entre ces deux facteurs que sont le
pH de traitement et le pH de recouvrement.
Lquation I.32, qui nest quune extension du modle de Mafart et
Legurinel, ne comporte que quatre paramtres ajusts (D*, z
pH
, z
pH
, pH
opt
) qui
possdent tous une signification physique ou biologique.
( ) ( ) * ' ' ' D pH f pH f D =
( )
2
*
10

=
pH
z
pH pH
pH f
2 2
'
' '
*
10 . 10 . *

=
pH
opt
pH
z
pH pH
z
pH pH
D D
( )
2
'
' '
10 ' '

=
pH
opt
z
pH pH
pH f
36
Lajustement se fait par rgression linaire multiple et prend en compte un
facteur environnemental de plus que le modle de Mafart et Legurinel pour seulement
deux paramtres supplmentaires. Ce terme relatif au pH de recouvrement considre
que le logarithme de D volue de faon quadratique en fonction du pH. Dans le cas o
les paramtres pH* et pH
opt
sont estims, le modle perd sa linarit et doit alors tre
ajust par minimisation de la somme des carrs des carts.
Il sagit aujourdhui du seul modle permettant destimer la thermorsistance
apparente des spores en fonction du pH du milieu de recouvrement. Pourtant, le pH du
milieu post-traitement a le plus souvent une importance plus grande que le pH de
traitement, en croire les valeurs de z
pH
gnralement plus faible que celles de z
pH
.
Couvert et al. (1999) dterminent pour une souche de Bacillus cereus, un z
pH
de 2,57
et un z
pH
de 2,03. En dautres termes, ces valeurs signifient quun cart de pH de
traitement de 2,57 (par rapport au pH*) est ncessaire pour rduire la valeur de D par
10, alors quun cart de pH de recouvrement de 2,03 suffit pour le mme rsultat.
Citons titre dexemple des valeurs de z
pH
et z
pH
dtermines partir de
rsultats obtenus sur Bacillus stearothermophilus, daprs Lopez et al. (1996, 1997) :
Tableau I.2 : valeurs de z
pH
et z
pH
estimes selon les
donnes bibliographiques de Lopez et al. (1996, 1997)
sur Bacillus stearothermophilus (Couvert et al., 1999).
souche z
pH
z
pH
12980 3,82 3, 06
7953 3,97 3,80
15951 3,45 3,21
15952 4,12 2,94
37
Chapitre 2
MATERIEL ET METHODES
2.1. Acquisition des donnes
La premire partie de ltude a consist en la collecte de donnes
exprimentales sur les variations de thermorsistance de spores bactriennes en
fonction de la temprature et de pH.
2.1.1. Matriel biologique
2.1.1.1. Choix des souches
Dans loptique dune application ultrieure des produits appertiss
relativement acides, les souches bactriennes slectionnes pour cette tude auront
pour certaines une rsistance thermique leve tandis que dautres prsenteront une
meilleure rsistance aux bas pH.
En tte des espces bactriennes thermorsistantes les plus rpandues arrive
Bacillus stearothermophilus. Espce rfrence dans ltablissement des barmes des
produits appertiss, nous ne pouvions lcarter de notre tude. Une souche de rfrence
(ATCC 12980) ainsi quune souche isole de produits industriels ont t choisies.
Pour ce qui est des espces certes moins rsistantes aux fortes tempratures,
mais dune meilleure tolrance aux pH acides, nous avons retenu deux espces
sporules acidophiles. La premire, Bacillus coagulans, est capable de se dvelopper
des pH acides (4,5) et forme des spores dune rsistance qui selon les espces, peut
tre qualifie de moyenne. La seconde, Alicyclobacillus acidoterrestris, reste
beaucoup plus rare. Ce thermophile a retenu notre attention par son acidophilie
remarquable et ses rcentes implications dans des accidents de strilisation de jus de
fruits acides (Splittstoesser et al., 1998 ; Walls et Chuyate, 1998). Cette espce forme
des spores dune thermorsistance qui peut dpasser celle de Bacillus
stearothermophilus lorsque le pH est infrieur 4.
Toutes les espces cites prcdemment ne sont cependant ni pathognes, ni
toxinognes. Or le contexte est diffrent lorsquon aborde les espces pathognes,
38
telles que Clostridium botulinum. Cette dernire ncessite une attention particulire
tant sa toxine est puissante. L'introduction de Clostridium botulinum dans notre tude
aurait pu savrer trs intressante. Mais compte tenu des normes qui rgissent sa
manipulation, Clostridium sporogenes a t choisi en remplacement comme germe
sporul anarobie stricte et thermorsistant.
Enfin, Bacillus pumilus tant une espce couramment rencontre dans les
ingrdients Saupiquet, a t ajout la liste de nos souches afin dlargir la gamme des
espces tudies.
Tableau II.1 : Souches tudies et leurs provenances
souche source
Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 Collection de lInstitut Pasteur
Bacillus stearothermophilus Saupiquet Isol de produit industriel
Bacillus coagulans ATCC 7050 Collection de lInstitut Pasteur
Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025 Collection de lInstitut Pasteur
Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 Collection de lInstitut Pasteur
Clostridium sporogenes Saupiquet Isol de produit industriel
Bacillus pumilus Saupiquet Isol de produit industriel
2.1.1.2. Prparation des suspensions de spores
2.1.1.2.1. Spores de Clostridium sporogenes
Le protocole propos par Goldoni et al. (1980) est suivi (milieu base de cur
de buf). Il permet de produire une suspension bactrienne en milieu liquide avec un
fort rendement de sporulation.
Rcolte des spores
Le milieu de croissance des spores est filtr aseptiquement. Le filtrat est
transfr dans des tubes centrifuger de 50 mL, remplis au 3/4. Les tubes sont
centrifugs 4C, pendant 10 mn 8000 rpm (10 400 Relative Centrifugal Force,
centrifugeuse Bioblock scientific : SIGMA 3K30).
Le surnageant est limin et les culots contenant les spores sont remis en
suspension dans un tampon phosphate strile pH 7 une concentration de 0,07
molaire. Les contenus des tubes sont rassembls.
L'opration est rpte encore 2 fois pour laver les culots. Les culots de spores
sont remis en suspension dans un tampon phosphate et transfrs dans des tubes
eppendorfs pour le stockage 4C.
39
La concentration en spores est dtermine par dnombrement des colonies en
milieu glos aprs activation des spores par choc thermique. Les cultures sont
incubes 7 jours 25C en jarres anarobies.
2.1.1.2.2. Spores de Bacillus
Les spores sont mises en culture dans un bouillon cur-cervelle, 24 heures la
temprature de 55C par les souches de Bacillus stearothermophilus, 45C pour la
souche de Alicyclobacillus acidoterrestris, 37C pour Bacillus coagulans et 25C pour
Bacillus pumilus. Des boites de glose nutritive seront ensemences en surface partir
de la prculture obtenue et mises incuber 5 jours aux mmes tempratures que la
prculture en BHI. Les spores sont rcupres par lavage de la surface de la glose,
puis sont mises en suspension dans deux tubes centrifuger contenant chacun 20 ml de
tampon phosphate.
Une premire centrifugation de 10 mn 8.000 rpm est ralise. Les culots de
spores sont remis en suspension dans un tampon phosphate (pH7, 0,07M) et lavs 3
fois. Une centrifugation dans les mmes conditions est effectue. Les culots sont repris
par un mlange Tampon phosphate thanol (50% - 50%) et placs 4 C pendant 12
heures afin dliminer les cellules vgtatives.
Les tubes sont nouveau centrifugs, le culot est ensuite lav trois fois par un
tampon phosphate pH7 strile dans les mmes conditions de centrifugation. Enfin, les
culots de spores sont remis en suspension dans un volume minimum de tampon
phosphate et transfrs dans des tubes eppendorfs pour le stockage 4C.
La concentration en spores est dtermine par dnombrement en milieu glos
aprs avoir activ les spores par choc thermique.
2.1.2. Traitement Thermique
Le traitement thermique est ralis partir de la suspension de spores
prcdemment obtenue, dilue au 1/50
e
dans le milieu de traitement tudi. 10L de
cette solution sont ensuite introduits dans des tubes capillaires calibrs, dune longueur
de 125 mm et dun diamtre interne de 0,73 mm. Les extrmits des tubes sont
soudes la flamme. Ces tubes capillaires sont plongs dans un bain glycrol-eau
(50% - 50%) thermostat la temprature tudie. Les tubes sont refroidis
immdiatement dans un bain deau glace pendant 30 secondes.
Les extrmits de ces tubes sont rayes laide dune scie verre,
flambes, puis casses. Le contenu des tubes est chass par 1 ml de milieu de dilution
40
(1% tryptone - 1% NaCl) vers un tube contenant 9 ml du mme milieu, laide dune
seringue strile munie dune aiguille (TERUMO 1ml). Des dilutions successives de
1/10
e
pourront alors tre ralises pour le dnombrement sur boite de ptri sur un
milieu de recouvrement dont le pH aura t ajust la valeur souhaite.
Dnombrement des survivants
Le dnombrement des spores viables est ralis par ensemencement sur
glose en boites de ptri 90 mm. 0,5 ml des solutions dilues recueillies aprs le
traitement thermique sont alors dposes dans une boite de ptri o de la glose est
coule pour un ensemencement dans la masse.
Les boites sont incubes une temprature et pendant le temps indiqu dans
le tableau II.2. Les anarobies sont places dans des jarres hermtiques contenant un
absorbeur doxygne Anaerocult (Merck). Le nombre de colonies par boite doit tre
compris entre 30 et 300 pour tre pris en compte.
Tableau II.2 : conditions dincubation des souches tudies
souche temprature temps oxygne
Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 55C 2 jours +
Bacillus stearothermophilus Industrielle A36 55C 2 jours +
Bacillus coagulans ATCC 7050 37C 3 jours +
Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025 45C 4 jours +
Clostridium sporogenes ATCC 19404 25C 7 jours -
Clostridium sporogenes Industrielle A27 25C 7 jours -
Bacillus pumilus Industrielle A40 25C 3 jours +
2.1.3. Confection des milieux
2.1.3.1. Milieu de suspension lors du traitement thermique
Le milieu de base utilis pour suspendre les spores lors du traitement thermique
sera compos de :
- 1 % de Tryptone (10g / L)
- 1% de NaCl (10g / L)
Ce milieu permettra de maintenir une pression osmotique faible, mais non
nulle. La tryptone tamponne sensiblement le milieu permettant de stabiliser le pH lors
de l'tude de l'acidit, afin de rendre inutile lajout de tampon salin susceptible de jouer
un rle indsirable sur la thermorsistance. Le pH de ce milieu sera ajust par :
- acide fort (H
2
SO
4
)
- base forte (NaOH)
41
2.1.3.2. Milieu de rcupration des spores (recouvrement)
dnombrement de Clostridium ssp
Le milieu de base, propos par Grischy et al. (1983) est constitu de
- 1 % de Tryptone (Biokar)
- 0.2% d'amidon soluble (Sigma)
- 0.2% de K
2
SO
4
(Fisher)
- 0.2 % d'extraits de levure (Biokar)
- 1.5 % d'agar type E (Biokar)
dnombrement de Bacillus ssp
Le milieu utilis est une glose nutritive (Biokar).
dnombrement de Alicyclobacillus acidoterrestris
La croissance est obtenue sur un milieu glos base de pomme de terre : potato
dextrose agar (Biokar).
Le pH de ces milieux de base sera ajust laide de :
- acide fort (H
2
SO
4
)
- base forte (NaOH)
2.1.4. Plans exprimentaux
Pour chacune des souches, les facteurs tudis sont :
- la temprature de traitement thermique
- le pH du milieu de traitement
- le pH du milieu de recouvrement
Un plan monofactoriel est effectu par facteur et par souche. Afin de dtecter
dventuelles interactions, ces plans sont complts par des plans factoriels complets
deux facteurs dans les cas suivants :
Plan multifactoriel entre la temprature et le pH de traitement pour la
souche de Bacillus coagulans ATCC 7050, et les souches industrielles de Bacillus
stearothermophilus et Clostridium sporogenes.
Plan multifactoriel entre le pH de traitement et le pH de recouvrement pour
les souches de Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 et Bacillus coagulans ATCC
7050.
42
2.2. traitement des donnes exprimentales
2.2.1. Ajustement des modles
2.2.1.1. Modles primaires
2.2.1.1.1. Modle de Rodriguez et al. (1988)
Ce modle est appliqu pour lajustement de courbe de survie de populations
htrognes prsentant deux sous populations de thermorsistances diffrentes : une
population thermosensible X
0
et une thermorsistante Y
0
.
Cette dernire ncessite une activation thermique pour tre dnombre sur
glose. Le passage de spores inactives Y en spores actives Z suit une constante de
vitesse h. La population N dnombre sur glose correspond alors la somme des
populations X et Z. Les constantes de vitesse de destruction des populations
thermosensible et thermorsistante sont respectivement k
1
et k
2
.
Equation II.1
Lajustement du modle est effectu par minimisation de la somme des carrs
des carts sous Matlab 6.1 par la fonction lsqcurvefit.
Extension de lapplication du modle
Dans certaines conditions de traitement thermique, la phase dactivation de la
population thermorsistante est masque par la courbe de destruction de la population
thermosensible. Lallure des cintiques se rapproche alors fortement de deux segments
de droite. Dans ce cas, on peut supposer que lactivation thermique nexiste plus, et
que lensemble des spores de la population thermorsistante se trouve initialement
sous forme active (Y
0
= 0). Le paramtre h sannule avec, par voie de consquence, le
dernier terme de lquation. Le modle sajuste alors avec seulement quatre
paramtres.
( )
( )
t h k t k t k t k
e e Y e Z e X N
.
0 0 0
2 2 2 1
. . .
+
+ + =
43
Equation II.2
Deux variantes de ce modle peuvent tre proposes :
Ajustement avec un paramtre p variable
Le paramtre p est jug a priori dpendant des conditions de traitement. Il est
alors restim pour chaque cintique. Les trois paramtres sont estims par
minimisation de la SCE sous Matlab 6.1 par la fonction lsqcurvefit.
Ajustement avec un paramtre p constant
Le paramtre p reflte la distribution des thermorsistances au sein de la
population microbienne selon la distribution de Weibull.
Le paramtre p a t jug a posteriori indpendant des conditions de
traitement. Sa valeur doit tre la mme pour toutes les cintiques. Son estimation est
effectue en prenant en compte lensemble des cintiques.
Lajustement est effectu par minimisation de la SCE de lensemble des j
cintiques comprenant chacune n points laide de la fonction fmincon sous Matlab :
SCE
globale
=

= =

31
1 1
2
0
log log
j
n
i
p
j
i
j ij
t
N N
Equation II.3
2j+1 paramtres sont estims simultanment.
Les paramtres en entre de la fonction fmincon sont tirs alatoirement selon
une loi uniforme et la minimisation de la SCE est ritre 5000 fois afin de dtecter
dventuels minima locaux.
p
t
N N

0
log log
44
2.2.1.2. Modles secondaires
2.2.1.2.1. Modle de Bigelow (1921)
Le modle est ajust par rgression linaire (fonction polyfit, Matlab 6.1) o la
variable est T-T* et la rponse le logarithme de D estim partir des modles
primaires. Les paramtres D* et z
T
sont directement lis lordonne lorigine et la
pente :
Comme pour le modle prcdent, lajustement est effectu par rgression linaire
(fonction polyfit, Matlab 6.1) o cette fois, la variable est pH*-pH :
2.2.1.2.3. Modle de Couvert et al. (1999)
T Estimation des paramtres
Equation II.4
Il sagit dun modle pouvant tre dvelopp sous la forme linaire :
a pH + b pH + c = log D
o
Les paramtres sont estims par rgression linaire (fonction polyfit, Matlab 6.1).
origine ord
D
.
10 * =
pente
z
T
1
=
2
'
' '
' log ' log

=
pH
opt
opt
z
pH pH
D D
2
'
1
pH
z
a =
2
'
*
2
pH
z
pH
b =
2
'
*
* log
pH
z
pH
D c =
origine ord
D
.
10 * =
pente
z
pH
1
=
45
T Simplification du modle
Le pH optimum de thermorsistance pH
opt
estim reste voisin de 7 dans la
plupart des cas. Ce paramtre peut alors tre fix cette valeur. Le paramtre pH
opt
scrit alors pH* (pH de rfrence), et D
opt
devient D*. Le modle ne comporte alors
plus que deux paramtres qui seront estims par rgression linaire (fonction polyfit,
Matlab 6.1) o la rponse est le log D et la variable est (pH-pH*).
T Choix du modle le plus adapt
Un test statistique permet de vrifier si la qualit dajustement engendre par
la suppression dun paramtre dun modle est justifie (Bates et Watts, 1988 ; Rosso,
1995). Ce test rvle la surparamtration dun modle compte tenu de la qualit du jeu
de donnes.
Le surcrot de complexit du modle nest pas justifi vis vis de la qualit
dajustement si linquation II.5 est vrifie :
Inquation II.5
O n est le nombre de points dcrivant la cintique, p
c
et p
p
sont les nombres respectifs
de paramtres des modles complet et partiel,
c
SCE
min
et
p
SCE
min
sont les sommes des
carrs des carts minimales obtenues aprs ajustement des modles complet et partiel.
Enfin, le premier membre de linquation correspond une valeur seuil issue de la
table de Fisher dont les degrs de libert sont p
c
- p
p
et n - p
c
et la probabilit de 95%.
origine ord
D
.
10 * =
pente
z
pH
1
' =
c
c p
p c
c
p n p p
SCE
SCE SCE
p p
p n
F
c p c
min
min min
) 05 , 0 ; ; (

=
46
2.2.2. Evaluation des modles
2.2.2.1. Critre quantitatif dajustement global
Le critre du R
ajust
permet destimer la qualit globale de lajustement, en
tenant compte du nombre de paramtres et du nombre de points du jeu de donnes.
Plus la valeur du coefficient est proche de 1 et meilleur est lajustement du modle.
Equation II.6
2.2.2.2. Examen des rsidus
2.2.2.2.1. Htrocdasticit
Lhtrocdasticit traduit une htrognit de la variance des rsidus, et peut
sestimer visuellement sur la reprsentation graphique des valeurs rsiduelles
normalises en fonction des valeurs prdites. En cas dhtrocdasticit, on observe
une dispersion croissante ou dcroissante des rsidus en fonction des valeurs prdites.
2.2.2.2.2. Test de normalit
Les rsidus sont supposs suivre une loi normale. Le test de Shapiro-Wilk
permet de vrifier la normalit des rsidus, et est particulirement adapt pour les
petits chantillons (<50).
Les rsidus doivent tre tris par ordre croissant. La valeur calcule par le test
est donne par :
Avec k = n / 2 si n est pair
k = (n-1) / 2 si n est impair
Les coefficients a
j
sont lus dans une table (annexe 10) et les coefficients d
j
sont dfinis par : d
j
= x
n+1-j
x
j
j = 1,, k
La prise de dcision est effectue par comparaison deux valeurs seuils W
1
et
W
2
fournie par la table (annexe 10). La population suit une loi normale si
W
1
< W
c
< W
2
.
totale
rsiduelle
ajust
SCE
SCE
p n
n
R
=
1
1
2
( )
( )
=
=
=
n
i
i
j j
k
j
c
x x
d a
W
1
2
2
1
47
2.2.2.2.3. Test dautocorrlation
Les rsidus doivent tre indpendants. Le test usuel mettant en vidence
lautocorrlation de la distribution des rsidus est celui de Durbin-Watson. La fonction
discriminante de ce test est donne par :
Equation II.7
Sous lhypothse H
0
selon laquelle les rsidus sont indpendants, la loi de D
c
est connue et tabule. Cette table fournit deux valeurs seuil d
1
et d
2
. Les conclusions
sont :
si d
c
< d
1
, on rejette H
0
au risque de 5%,
si d
c
> d
2
, on accepte H
0
au risque de 5%,
si d
1
< d
c
< d
2
, on ne peut pas conclure
Le test ncessite un chantillon dau moins 15 valeurs. Pour les petits
chantillons, ce test est substitu par une analyse graphique. Il y a autocorrlation
lorsque lon peut mettre en vidence un lien entre les valeurs de Y et la distribution des
carts positifs et ngatifs par rapport au modle de rgression.
2.2.2.3. Projection des rgions de confiance
Lestimation des intervalles de confiance des paramtres, ainsi que la
corrlation structurelle des paramtres est tudie. Selon Beale (1960), un vecteur de
paramtres dun modle se trouve dans la rgion de confiance la probabilit sil
vrifie linquation :
Inquation II.8
O n est le nombre de points exprimentaux, p le nombre de paramtres, F la
distribution de Fisher pour le niveau p et n-p degrs de libert, la SCE
est la
somme des carrs des carts calcule avec le vecteur de paramtre .
La dtermination des rgions de confiance est dfinie selon la mthode de
Lobry et al. (1991). Les vecteurs vrifiant linquation II.8 constituent un
+
, , min
1
p n p
F
p n
p
SCE SCE
( )
=
=

=
n
i
i
n
i
i i
c
e
e e
d
2
2
2
2
1
48
hypervolume dont le nombre de dimension correspond au nombre de paramtres. Les
intervalles de confiance des paramtres sont indiqus par les limites de lhypervolume.
La projection de lhypervolume sur plan permet de mettre en vidence
dventuelles corrlations structurelles entre les paramtres. A un risque fix, plus les
paramtres sont corrls, plus leurs valeurs se compensent entranant des intervalles de
confiance tendus, voire infinis.
Dtermination de lhypervolume
Lhypervolume est dtermin par un programme informatique effectuant des
tirages de vecteurs de paramtres alatoires dans un hypercube dont la dimension est
suprieure celle de lhypervolume dterminer. Chaque vecteur de paramtre
satisfaisant linquation II.8 entre dans la constitution de lhypervolume. Cest
lensemble de ces points qui va dcrire lhypervolume.
Le nombre de points ncessaires la constitution de cet hypervolume dpend
la fois de la rpartition des points et du nombre de dimensions dans lequel il est dcrit.
Cas particulier du modle de Mafart et al. (2002)
Le modle primaire dcrivant la cintique de destruction de la souche Bacillus
pumilus est constitu de trois paramtres, dont deux ( et N
0
) varient en fonction des
conditions de traitement thermique (temprature, pH), et un troisime (p) fixe pour
lensemble des cintiques. Ce troisime paramtre dpendant de toutes les cintiques
implique un calcul global faisant entrer tous les jeux de donnes de la souche en mme
temps. Dans notre cas, nous disposons de 31 cintiques de destruction, soit 31 valeurs
de , 31 valeurs de No et une valeur de p, soit un total de 63 paramtres. La rgion de
confiance dcrit alors un hypervolume dans un espace 63 dimensions. La mthode
consistant mesurer lhypervolume par tirage alatoire des paramtres nest plus
ralisable en raison du temps de calcul informatique quun tel programme
demanderait. Par consquent, nous adopterons une mthode selon laquelle les rgions
de confiance des valeurs des paramtres de chaque cintique sont dtermines
individuellement tel que :
Equation II.9
+
231 ; 63 ; 95 , 0 min
63 294
63
1 F SCE SCE
i
49
O
i
est un vecteur de paramtres (N
0
, , p) de la i
m me e
cintique (sur 63), et SCE
min
la
somme des carrs des carts minimale entre les valeurs observes et les valeurs
calcules par le modle ajust sur lensemble des jeux de donnes. Il en rsulte i
rgions de confiance pouvant tre reprsentes dans un espace trois dimensions. Les
rgions de confiance pour la valeur des paramtres sont matrialises par projections
sur les plans dans lespace des paramtres.
2.2.3. Tirage alatoire dune matrice possdant la mme
structure de corrlation quune matrice exprimentale
La mthode que nous allons considrer consiste reproduire une matrice par
tirage alatoire de chaque paramtre selon une loi normale (N
,
) en conservant les
mme structures de corrlation que le jeu de donnes initial. Cette mthode sinspire
de lACP (Analyse en Composante Principale) :
Le but est de crer une matrice (4 x 100 000) par tirage alatoire, conservant la
mme structure de corrlation que la matrice de donnes initiale (4 x 20).
Il est facile, en utilisant des logiciels mathmatiques (Matlab) de gnrer des
sries de valeurs indpendantes. Malheureusement, vue la structure de corrlation des
donnes exprimentales X (tableau 1), cela pose un problme et il serait excessif de
vouloir ngliger la corrlation entre les variables comme le montre le tableau 2.
La rpartition des marginales de la loi de (Fh, Jh corr, Fc, jc) laisse pressentir
une rpartition Normale en 4 dimensions de cette variable (tableau 5). Nous
supposerons cette hypothse satisfaite ce qui est tout fait raisonnable.
La question centrale est maintenant de gnrer des valeurs ayant la mme
structure de covariance que les valeurs exprimentales (tableau 1 et 2). Pour ce faire,
nous allons utiliser lanalyse en composantes principales sous un angle un peu
particulier : il est en effet connu que les composantes principales sont des variables
indpendantes.
La dcomposition en composantes principales nous fournit une matrice P dite
de passage et telle que
C = P Z
50
Matrice initiale X Matrice Z
(donnes exprimentale) (Donnes centres
rduites)
Valeurs dpendantes
4 x 20 valeurs 4 x 20 valeurs
matrice P (4 x 4)
Matrice C des Matrice gnre C
Composantes gnration alatoire
Principales de valeurs indpendantes
selon une loi normale matrice P
-1
Valeurs indpendantes Valeurs indpendantes
4 x 20 valeurs 4 x 100 000 valeurs
Matrice Z Matrice X
Valeurs dpendantes Valeurs dpendantes
4 x 100 000 valeurs
4 x 100 000 valeurs De mme structure de
Corrlation que X
(Tableau 2)
Figure II.1 : Schma explicatif de la mthode drive de lACP
i
i j i
j i
s
x X
Z

=
,
,
- Matrice de passage P
Analyse Composante Principale
- Les valeurs propres
i i j i j i
x s Z X + = . ' '
, ,
51
Avec C la matrice des composantes principales et Z la matrice des donnes
centres rduites
Z = R ( X M)
Avec R la matrice ayant les inverses des carts-type sur la diagonale et M la
matrice ayant toutes les lignes (20) gales (m1,m2,m3,m4) les moyennes des
diffrentes variables.
Remarque : Les matrices C et P sont donnes par le logiciel Matlab.
La matrice C a pour matrice de corrlation une matrice diagonale ayant sur la
diagonales les valeurs propres issues de lACP. Il suffit alors de gnrer 100 000
valeurs selon une loi normale centre et de variance les diffrentes valeurs propres
(4 x 100 000). Cest la matrice C des composantes principales gnres . Il suffit
ensuite de restitues les donnes centres rduites au moyen de P
-1
:
Z = P
-1
C
Remarque : Linversion de P se fait au moyen de Matlab.
Et enfin les valeurs gnres sont donnes par :
X = R
-1
Z + M
Avec M la matrice ayant toutes les lignes (100 000) gales (m1,m2,m3,m4) les
moyennes des diffrentes variables.
2.3. Validation sur un produit industriel
Le produit choisi pour lapplication et la validation de notre tude en conditions
industrielles est un produit complexe dans le sens o il est labor partir de matire
premire trs varie, aux pH initiaux extrmement disperss. Il sagit de deux salades
composes : les Saladires Western et Mexicana de marque Saupiquet. Ces salades
sont composes dune galette de thon pose au fond de la boite, recouverte dune
sauce acide de type vinaigrette et complte dun mlange de lgumes. Ltude se
limitera au format de boite 1/3, type bol (fond arrondi).
52
2.3.1. Mesure des variations de la valeur des facteurs au
cours de la strilisation et du stockage
En ce qui concerne les cintiques de destructions bactriennes, le point
critique est le point qui prsentera les paramtres environnementaux les plus
favorables la survie bactrienne : temprature la plus basse et/ou pH le plus lev. La
premire tape de ltude consiste localiser ce point et mesurer lvolution de la
valeur des facteurs ce niveau.
2.3.1.1. Facteur temprature
2.3.1.1.1. Suivi de la temprature au cours de la strilisation
Les sondes, dun diamtre de 1 mm, sont places dans un doigt de gant afin
dassurer ltanchit. Le contenu de la boite tant trs htrogne, les sondes de
temprature sont places diffrents niveaux afin de dterminer le point froid. Nous
distinguons alors quatre niveaux :
mesure au niveau de la galette de thon
mesure cur de la boite
mesure au tiers haut de la boite
mesure en surface
Figure II.2 : Schmatisation du contenu Saladire format 1/3 type bol avec lemplacement des sondes de
temprature.
La boite bol format 1/3 prsente une hauteur de 49 mm et dune longueur de
105 mm. La sonde de temprature note n1 pntre dans la boite par lopercule. La
longueur de cette sonde est de 43 mm. Les trois autres sondes notes n2, 3 et 4
53
pntrent la boite par le fond. Leurs longueurs respectives sont de 26, 33 et 43 mm.
Les sondes sont relies un enregistreur Elab connect au logiciel TPRO qui recueille
une mesure toutes les 30 secondes.
2.3.1.1.2. Modlisation du suivi de temprature
Le modle de Ball (1923), rappel en annexe, est utilis. Le chauffage
sappuie sur lquation :
Equation II.10
O T
et T
0
sont respectivement la temprature de palier dans lautoclave et la
temprature initiale du produit. Les facteurs t et T sont respectivement le temps de
traitement et la temprature au temps t. les paramtres f
h
et j
h
caractrisent eux seuls
la cintique de monte en temprature.
La phase de refroidissement est dcrite par lquation :
Equation II.11
O T
g
et T
c
sont respectivement la temprature de fin de phase de chauffage et la
temprature de leau refroidissement. Les paramtres f
c
et j
c
caractrisent la phase de
refroidissement.
2.3.1.1.3. Intervalle de confiance des paramtres du
modle de Ball
Quatre chantillons de valeurs f
h
, j
h
, f
c
et j
c
sont dtermins sur plusieurs suivis
de temprature. Pour chaque chantillon, un intervalle de confiance est estim. On doit
poser lhypothse que notre chantillon est reprsentatif de la population, note . On
le considre comme rfrence. La normalit de lchantillon est vrifie par le test de
Shapiro-Wilk. Par consquent, si est la moyenne de lchantillon et son cart type,
la population suit une loi normale N (,).
h
h
j t
f T T
T T
log
1
log
0
=
c
c c
c g
j
f
t
T T
T T
log log + =
54
N ( ;) par consquent,

U

= N (0 ;1)
U est tabule. Pour un donn, la table donne deux valeurs u
1
et u
2
telles que :
On a donc deux valeurs
1
et
2
telles que P (
1
< <
2
) = 1 -
1
= + u
1

2
= + u
2

Et pour = 0,05 on a u
1
= -1,96 et u
2
= 1,96
2.3.1.2. Facteur pH
2.3.1.2.1. Suivi du pH au cours du traitement
Les mesures de pH pendant la strilisation ne sont pas ralisables dans de telles
conditions de temprature et de pression. Les mesures ont donc t ralises
temprature ambiante. Les boites suivent un cycle de strilisation classique . Les
montes et descentes en temprature du strilisateur sont identiques celles dun cycle
de strilisation appliqu en usine. Seul le temps de palier varie. En fin de cycle, les
boites sont immdiatement ouvertes et le pH mesur.
Des mesures prliminaires ont montr que le process de prparation des
lgumes (mlange, pressage) fait que tous les lgumes possdent un pH identique au
moment de lembotage. Par consquent, les lgumes seront considrs comme un
compos homogne en pH. Seule leur localisation dans la boite jouera sur leur pH.
Les mesures sont ralises immdiatement aprs la sortie du pilote de
strilisation sur cinq zones de la boite : la galette de thon ainsi que la sauce
reprsentent les deux premires. Les trois autres zones correspondent des tranches
55
transversales du mlange de lgumes : deux tranches suprieures (de 40 grammes
environ) et la tranche la plus basse en contact avec la sauce (80 grammes).
Figure II.3 : Schma de la subdivision de la boite en cinq zones de suivi de pH
En fin de cycle de strilisation, les boites sont immdiatement ouvertes, les cinq
zones de mesure sont spares et places sur des tamis. Les lgumes couverts de sauce
sont rincs rapidement leau courante. Chaque zone est mixe au broyeur rotatif, puis
le pH est mesur.
2.3.1.2.2. Suivi du pH aprs la strilisation (stockage)
Le pH post traitement est important compte tenu de son influence sur le
recouvrement des spores bactriennes, et indirectement de son action sur la
thermorsistance.
Les boites strilises sont stockes dans la mme position que lors de la
strilisation (opercule en haut). Des mesures de pH de chacune des cinq zones
schmatises figure II.2 sont ralises intervalles de temps rguliers jusqu
lquilibre total du pH dans la boite.
2.3.1.2.3. Rgions de confiance dune droite de rgression
Le suivi de pH de la Saladire au cours de la strilisation peut tre assimile
une loi linaire. Une rgion de confiance sera dtermine de part et dautre de cette
droite.
Lintervalle de confiance au risque dune valeur seule correspondante la
valeur x
0
de X est donne par :
+

0 0 0
y Y y
56
Avec :
Equation II.12
Equation II.13
2.3.2. Mesure du temps minimum de strilisation
Lobjectif de cette tape est de mesurer le temps minimum de chauffage pour
rduire une population de spores bactriennes de concentration connue dans une boite
moins de une spore survivante par boite. Autrement dit, on dtermine le temps de
traitement thermique ncessaire pour atteindre un nombre n de dure de rduction
dcimale connue (n = log de la population initiale / population finale). On peut le
comparer au nombre de rduction dcimal calcul.
2.3.2.1. Prparation et inoculation des boites
La contamination initiale des boites doit tre connue. Etant donn que lon ne
peut striliser pralablement les ingrdients en raison des modifications physico-
chimiques quun tel traitement pourrait engendrer, les boites sont trs fortement
inocules afin de pouvoir ensuite ngliger la contamination apporte par les aliments.
Le taux de contamination choisi slve 10
5
spores de souches thermorsistantes par
gramme de produit, soit 2,5.10
7
spores par Saladire. La contamination est rpartie le
plus uniformment possible dans la boite. Pour cela, un inoculum de 5.10
6
spores par
mL deau distille est prpar et rparti de la faon suivante :
Thon : le thon est rduit en fines miettes. 1,02 mL de l'inoculum est rparti sur
le maximum de surface des 51 g de fines miettes. Les miettes sont ensuite compactes
en galettes.
Sauce : L'inoculum est directement ajout la sauce hauteur de 0,88 mL pour
44g de sauce.
Lgumes : 3,16 mL de l'inoculum est ajout aux 157 g de lgumes d'une boite.
Une moiti de l'inoculum est dpos en surface alors que l'autre moiti est injecte au
+ + =
k
i
i
resid
n
x x
x x
n
S t y y
1
2
2
0 ) 2 (
2
0 0
) (
) ( 1
1

=
+
+ + + =
k
i
i
resid
n
x x
x x
n
S t y y
1
2
2
0 ) 2 (
2
0 0
) (
) ( 1
1

57
cur dune vingtaine de lgumes choisis au hasard l'aide d'une seringue monte
d'une aiguille.
Au total, prs de cinq millilitres de suspension sont rpartis de cette faon dans
chaque boite prpare
En parallle, des boites tmoin non inocules sont prpares. Elles permettront
de montrer que les boites non striles sont bien lies la souche inocule, et non la
contamination initialement prsente sur les ingrdients entrant dans la composition de
la boite.
2.3.2.2. Strilisation
Ces boites sont introduites dans un pilote de strilisation (Multiprocess
Barriquand). Le cycle choisi garde pour toutes les strilisations, la mme monte en
temprature et le mme refroidissement. Seul le temps de palier varie.
Pour chaque temps de strilisation, trois boites inocules ainsi que deux boites
tmoins non inocules sont traites.
2.3.2.3. Mise en vidence de la strilit des boites
Aprs le cycle de strilisation, les boites sont incubes 10 jours la
temprature optimale de croissance de la bactrie inocule.
Au terme de la phase dincubation, le contenu total de la boite est introduit
dans un sac strile auquel est ajout 250 mL de Tryptone sel. Le sac est plac dans un
broyeur Stomacher et broy 2 min. Un millilitre de ce broyat est dpos en boite de
ptri, coul en glose et incub la temprature optimale de croissance de la bactrie
recherche. La non strilit est dtecte par la croissance de colonies.
59
Chapitre 3
VALIDATION DU CHOIX DES MODELES PRIMAIRES
Les sept souches tudies ne prsentent pas toutes le mme type de cintique
de destruction. Par consquent, un modle primaire est ajust pour chaque souche en
fonction de lallure de sa courbe de survie parmi les modles primaires prsents dans
la partie bibliographique.
Le profil des courbes de survie est souvent linaire. Cependant, les exceptions
cette rgle ne sont pas rares. Cela a t le cas pour deux des sept souches que nous
avons tudies : Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 pour laquelle on observe une
cintique biphase et Bacillus pumilus qui prsente une cintique curviligne.
3.1. Souches aux courbes de survie log-linaires
Il sagit de lallure de courbe de survie la plus couramment rencontre dans le
monde bactrien. Cest le cas de cinq de nos sept souches : Bacillus
stearothermophilus ATCC 12980, Bacillus stearothermophilus A36, Bacillus
coagulans, Clostridium sporogenes A27 et Alicyclobacillus acidoterrestris.
3.1.1. Collecte des donnes exprimentales
Lensemble des donnes est obtenu par ralisation de traitements thermiques
dans diffrentes conditions environnementales (temprature, pH de traitement et pH de
recouvrement), prsent dans la partie matriel et mthodes. Nous disposons au total
de 351 cintiques avec une moyenne de 6,8 points chacune (tableau III.1).
60
Tableau III.1 : Quantit de jeux de donnes pour les cinq souches prsentant une destruction log-linaire
Souche Nb de cintiques Nb de points par cintique
Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 130 7,7
Bacillus stearothermophilus A36 56 6,5
Bacillus coagulans 47 6,9
Clostridium sporogenes A27 63 6,4
Alicyclobacillus acidoterrestris 55 6,4
3.1.2. Evaluation de la qualit dajustement
Les paramtres N
0
et D sont estims par rgression linaire. Lobservation des
R
ajust
moyens de lensemble des souches montre un bon ajustement gnral du
modle log linaire. Une analyse des R
ajust
de chaque cintique de destruction est
effectue et donne les valeurs moyennes, minimales, maximales ainsi que lcart type.
Nous illustrons graphiquement ce bon ajustement en traant les valeurs estimes en
fonction des valeurs observes :
Bacillus stearothermophilus ATCC 12980
Analyse des R
ajust
(par courbe de survie)
R
ajust
moyen 0,938
R
ajust
min 0,334
R
ajust
max 1,000
Ecart type 0,102
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 1 2 3 4 5
Valeurs de log N observes
V
a
l
e
u
r
s

d
e

l
o
g

N

e
s
t
i
m
e
s
1000 points
R = 0,987
61
Bacillus stearothermophilus A36
Analyse des R
ajust
R
ajust
moyen 0,957
R
ajust
min 0,758
R
ajust
max 0,999
Ecart type 0,050
Bacillus coagulans
Analyse des R
ajust
R
ajust
moyen 0,950
R
ajust
min 0,796
R
ajust
max 0,997
Ecart type 0,047
Clostridium sporogenes A27
Analyse des R
ajust
R
ajust
moyen 0,969
R
ajust
min 0,825
R
ajust
max 1,000
Ecart type 0,032
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 1 2 3 4 5
V
a
l
e
u
r
s

d
e

l
o
g

N

e
s
t
i
m
e
s
362 points
R = 0,990
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 1 2 3 4 5
V
a
l
e
u
r
s

d
e

l
o
g

N

e
s
t
i
m
e
s
323 points
R = 0,985
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
0 1 2 3 4 5 6
V
a
l
e
u
r
s

d
e

l
o
g

N

e
s
t
i
m
e
s
402 points
R = 0,993
62
Alicyclobacillus acidoterrestris
Analyse des R
ajust
R
ajust
moyen 0,966
R
ajust
min 0,789
R
ajust
max 0,999
Ecart type 0,043
Ces reprsentations graphiques des valeurs estimes en fonction des valeurs
observes confirment la trs bonne qualit dajustement du modle log-linaire,
validant lutilisation de ce modle. Ceci sexplique dun point de vue biologique par
une rpartition homogne des thermorsistances entre les diffrents individus de la
population bactrienne considre.
3.2. Souches aux courbes de survie non log-linaires
3.2.1. Courbe de survie de C. sporogenes Pasteur 79.3
3.2.1.1. Estimation des paramtres
Les profils de destruction (figure III.1) indiquent que notre souche comprend
deux sous populations : une premire thermosensible rapidement dtruite et une
seconde thermorsistante.
La population thermosensible suit une loi de destruction dordre un, tandis que
la thermorsistante ncessite une activation avant sa destruction galement dordre un.
La partie de courbe correspondant la phase dactivation de la population
thermorsistante napparat sur le graphique que lorsque la destruction de la population
thermosensible est rapide, cest--dire haute temprature. Cest le cas des cintiques
obtenues des tempratures de traitement de 101, 104, 107 et 110C. Dans tous les
autres cas, la courbe correspondant la destruction de la population thermosensible
masque cette phase dactivation. Lallure gnrale du graphique ne correspond alors
plus qu deux segments de droite.
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
0 1 2 3 4 5 6
V
a
l
e
u
r
s

d
e

l
o
g

N

e
s
t
i
m
e
s
354 points
R = 0,993
63
Figure III.1 : Cintique de destruction de la souche de Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 104C
( gauche) et 98C ( droite).
Sur lensemble des courbes de survie ralises, nous pouvons en fait observer
trois profils de destruction diffrents :
Un premier profil (figure III.1, graphique de gauche), observable
temprature de traitement leve, lorsque la destruction rapide de la population
thermosensible laisse apparatre une activation de la population thermorsistante (cas
des cintiques ralises 101, 104, 107 et 110C). Le modle de Rodriguez (1988) est
ajust. On suppose que la population thermorsistante se trouve entirement sous sa
forme inactive au dbut du traitement thermique.
Equation III.1
o N est le nombre de spores dnombr (active)
X
0
est la population thermosensible initiale
Y
0
est la population thermorsistante inactive initiale
k
1
est le taux de destruction de la population X
k
2
est le taux de destruction de la population Y
h est le taux dactivation de la population Y
Un second profil (figure III.1, graphique de droite) ne laissant apparatre
que deux segments de droite correspondant une destruction log-linaire de chacune des
deux sous populations. Une variante du modle de Rodriguez (1988) est adopte. Le
paramtre correspondant la vitesse dactivation de la population thermorsistante est
supprim (h = 0).
( )
( )
t h k t k t k
e e Y e X N
+
+ =
2 2 1
. .
0 0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5
temps de traitement (min)
L
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12 14 16
temps de traitement (min)
L
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s
64
Tableau III.2 : Valeurs des paramtres D (en min) propres chaque sous population ajustes par
minimisation de la somme des carrs des carts (D
1
: population sensible ; D
2
: population rsistante). Les
intervalles de confiance 95% sont indiqus entre parenthses. INF : infinis.
Plan monofactoriel Temprature (pH et pHneutre)
temprature nb points D
1
D
2
R
ajust
90 9 52,77 (42,38 - 69,88) --- 0,951
92 9 25,30 (19,01 37-88) --- 0,914
95 12 1,71 (0,79 2,98) 8,35 (6,82 12,52) 0,992
98 12 0,81 (0,55 1,16) 5,85 (4,58 8,12) 0,994
101 8 0,23 (0,16 0,34) 4,77 (2,89 16,96) 0,994
101 10 0,19 (INF) 2,66 (INF) 0,964
104 17 0,090 (INF) 1,07 (INF) 0,967
107 14 0,068 (INF) 0,47 (INF) 0,963
110 10 0,0065 (INF) 0,22 (INF) 0,923
113 5 --- 0,11 (INF) 0,994
116 5 --- 0,066 (INF) 0,939
Plan monofactoriel pH de traitement (T = 95C ; pH neutre)
pH nb points D
1
D
2
R
ajust
3,56 3 --- 1,42 (INF) 0,924
4,02 5 --- 1,45 (1,26 1,70) 0,995
4,03 3 0,074 (INF) --- 0,943
4,23 13 0,071 (0,038 0,16) 2,70 (2,06 4,00) 0,973
4,25 11 0,078 (0,050 0,13) 3,19 (2,07 8,12) 0,980
4,5 4 --- 1,58 (0,85 10,57) 0,945
4,54 4 0,089 (0,051 0,39) --- 0,954
5,04 5 --- 2,85 (INF) 0,789
5,08 8 0,15 (INF) 5,73 (INF) 0,944
5,08 4 0,17 (0,13 0,26) --- 0,991
5,24 12 0,21 (0,16 0,29) 9,08 (6,06 13,39) 0,991
5,25 10 0,27 (0,22 0,34) 5,03 (3,20 14,68) 0,996
5,5 10 0,16 (0,10 0,34) 6,38 (INF) 0,963
6 10 0,40 (0,25 0,63) 4,41 (2,44 33,87) 0,988
6 7 0,40 (0,19 0,90) 4,01 (INF) 0,988
6,06 6 --- 5,68 (4,84 6,86) 0,989
6,2 9 0,77 (0,57 1,02) 4,42 (INF) 0,995
6,24 16 0,48 (0,29 0,86) 4,97 (3,79 7,74) 0,979
6,5 9 0,88 (0,43 1,43) 9,46 (INF) 0,985
6,79 11 1,25 (0,79 2,01) 8,54 (7,05 11,25) 0,996
7 8 1,24 (0,64 2,16) 6,48 (5,02 10,48) 0,996
7,5 8 2,23 (0,75 7,27) 11,08 (9,01 15,64) 0,994
8 9 2,87 (0,081 7,93) 14,12 (12,07 18,99) 0,996
Plan monofactoriel pH de recouvrement (T = 95C ; pH neutre)
pH nb points D
1
D
2
R
ajust
5,74 5 --- 0,32 (0,23 0,52) 0,970
5,85 6 --- 0,27 (0,21 0,38) 0,969
6,14 6 0,64 (INF) 2,12 (INF) 0,998
6,55 8 0,59 (0,27 1,21) 3,50 (2,52 6,46) 0,993
6,55 14 0,49 (0,32 0,49) 3,35 (3,53 13,65) 0,979
6,85 11 1,73 (0,51 3,37) 7,57 (6,11 11,06) 0,991
7 7 1,78 (INF) 6,33 (INF) 0,993
7 17 1,38 (0,73 2,30) 11,91 (7,79 29,34) 0,961
7,45 15 9,87 (8,06 12,74) --- 0,914
7,48 6 --- 5,34 (3,95 8,28) 0,965
7,5 9 --- 7,28 (5,75 9,91) 0,943
7,85 16 11,22 (9,01 14,87) --- 0,891
65
Un troisime o seulement une droite peut tre distinctement identifie en
raison de points mal rpartis ou en faible nombre. Le modle log-linaire est ajust.
Le tableau III.2 indique les valeurs de lensemble des paramtres. Afin de
garder une cohrence avec les souches prcdentes, les constantes de cintique de k du
modle de Rodriguez seront donnes sous forme de dure de rduction dcimale D.
Nous noterons D
1
et D
2
les dures de rduction dcimale respectives des
populations sensibles et thermorsistantes.
3.2.1.2. Evaluation de la qualit dajustement
& Examen des rsidus
Figure III.2 : Reprsentation graphique de la qualit dajustement du
modle de Rodriguez (1988) sur les courbes de survie de Clostridium
sporogenes Pasteur 79.3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8
V
a
l
e
u
r
s

d
e

l
o
g

N

e
s
t
i
m
e
s
k
Ln
D
10
=
66
Figure III.3 : Reprsentation de lajustement du modle de Rodriguez sous sa forme initiale cinq
paramtres ( gauche, 104C pH7), et sous sa forme 4 paramtres ( droite, 95C pH 4,25).
Figure III.4 : Reprsentation des rsidus standardiss en fonction du temps de traitement (en min)
La qualit dajustement est acceptable. Le R
ajust
moyen est de 0,966 avec un
cart type de 0,038. La reprsentation graphique (figure III.3) illustre cette qualit
dajustement.
Le test de Shapiro-Wilk indique que les rsidus de la quasi-totalit des jeux de
donnes sont gaussiens. Le test de Durbin-Watson usuellement appliqu pour mettre
en vidence lautocorrlation ncessitant plus de points, nous nous limiterons
lanalyse graphique. Les reprsentations graphiques 4 et 5 sont trs reprsentatives de
lensemble des rsultats. Dune part, nous ne mettons en vidence aucune
htrocdasticit. Dautre part, une autocorrlation importante des rsidus apparat sur
le graphique de gauche (figure III.4). Ceci se ritre pour les quatre jeux de donnes
o le modle de Rodriguez 5 paramtres est utilis.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5
temps de traitement
L
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s
-2
-1
0
1
2
0 1 2 3 4 5
temps de traitement
r
s
i
d
u
s

s
t
a
n
d
a
r
d
i
s
s
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4
temps de traitement
L
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s
-2
-1
0
1
2
3
0 1 2 3 4
temps de traitement
r
s
i
d
u
s

s
t
a
n
d
a
r
d
i
s
s
67
3.2.1.3. Projection des rgions de confiance
La projection des rgions de confiance indique que le modle de Rodriguez
5 paramtres prsente des corrlations structurelles trs fortes, avec des rgions de
confiance stendant linfini. Les intervalles de confiance pour la valeur de
paramtres ne peuvent donc pas tre dtermins pour les cintiques en question
(temprature de traitement de 101, 104, 107 et 110C).
Le modle de Rodriguez rduit quatre paramtres perd ces intervalles de
confiance stendant linfini (figure III.5). Cependant, il conserve des corrlations
structurelles assez forte entre les paramtres X
0
et D
1
dune part, et entre Y
0
et D
2
dautre part, traduites par les formes allonges des rgions de confiance.
Figure III.5 : projection des rgions de confiance pour la valeur des paramtres du modle de Rodriguez
quatre paramtres (cintique 95C pH4,25). Les populations X
0
et Y
0
sont exprimes sous leur forme
logarithmique.
68
3.2.2. Courbe de survie de Bacillus pumilus
Le modle primaire ajust sur les courbes de survie de Bacillus pumilus est le
modle de Peleg et al. (1998) reparamtr par Mafart et al. (2002).
Equation III.2
O N
0
est la population initiale
est la dure de la premire rduction dcimale
p est un paramtre empirique
Lestimation des paramtres N
0
, et p est effectu pour chaque cintique par
minimisation de la somme des carrs des carts. Lalgorithme ne rencontre aucun
problme de convergence.
Nous observons que la valeur de p ne varie que trs peu en fonction des
conditions environnementales. Le coefficient de corrlation calcul entre le paramtre
p et les facteurs temprature, pH de traitement et pH de recouvrement sont
relativement faibles (respectivement, le r est gal 0,828 0,761 et 0,716). Mais selon
la table de Fisher et Yates, ces coefficients sont significatifs 95%.
La figure III.6 reprsente les valeurs de p ainsi que ses intervalles de confiance
en fonction des 3 facteurs environnementaux. Nous pouvons noter que 5 intervalles de
confiance sont trs importants et ne peuvent tre reprsents sur la zone de graphique.
Nous pouvons visualiser la faible corrlation entre le p et les trois facteurs
environnementaux, malgr une lgre tendance dcroissante de la valeur de p en
fonction de la temprature, et croissante en fonction du pH. De plus, leurs rgions de
confiance encadrent dans 29 cas sur 31 la valeur de p moyen. Nous en concluons que
les facteurs temprature et pH ont peu dinfluence sur le paramtre p.
La projection des rgions de confiance dtermines sur 31 cintiques de
destruction indique une corrlation structurelle importante entre les paramtres
(notamment p et ), traduite par une forme elliptique trs allonge des rgions de
confiance. La figure III.7 reprsente la projection des rgions de confiance des trois
paramtres dtermines selon la mthode de Lobry et al. (1991). La forme des rgions
de confiance de la cintique reprsente (101C, pH7) caractrise lensemble des
observations ralises sur les autres cintiques.
p
t
N N

0
log log
69
Figure III.6 : Reprsentation du paramtre p en fonction des facteurs environnementaux (temprature,
pH de traitement et pH de recouvrement) ainsi que ses indices de confiance 95% dtermins par la
mthode de Lobry et al. (1991). La moyenne des valeurs de p est trace.
Figure III.7 : Projection des rgions de confiance des paramtres N
0
, et p
(temprature de traitement : 101C, pH7). La population N
0
est exprime sous sa forme
logarithmique.
Temprature de traitement (C)
88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
v
a
l
e
u
r

p
0
2
4
6
8
pH de traitement
4 5 6 7
v
a
l
e
u
r

p
0
2
4
6
8
pH de recouvrement
5 6 7 8 9
v
a
l
e
u
r

p
0
2
4
6
8
70
Compte tenu de la faible variabilit de p en fonction des facteurs, ainsi que de
la forte corrlation structurelle avec , ce paramtre qui reflte la distribution des
thermo-rsistances au sein de la population, peut donc tre fix pour toutes les
cintiques de cette souche de Bacillus pumilus. Le modle sajuste alors avec
seulement deux paramtres, et de surcrot devient linaire. Les corrlations
structurelles sont supprimes.
Ceci nous conduit un nouvel ajustement du modle o deux paramtres
varient en fonction des facteurs environnementaux, et un troisime fixe pour
lensemble des cintiques. En raison de ce troisime paramtre que lon peut
considrer en premire approximation comme caractristique de la souche, et
indpendant de la temprature et du pH, lajustement doit tre ralis en une seule
rgression sur lensemble des 31 cintiques, en imposant une valeur de p fixe (matriel
et mthodes).
Cet ajustement est ralis par minimisation de la somme des carrs des carts.
Compte tenu du grand nombre de paramtres ajuster simultanment, le risque que
lalgorithme converge vers un minimum local est important. Afin de le vrifier, le
calcul de minimisation est rpt 5000 fois partir de paramtres initiaux tirs
alatoirement. Lalgorithme converge dans une trs grande majorit des tirages vers
une somme des carrs des carts unique, avec des paramtres ajusts identiques dans
tous les cas. La valeur de p est alors de 2,03. Les valeurs estimes des paramtres sont
prsentes dans le tableau III.3.
71
Tableau III.3 : Estimation des paramtres du modle de Mafart et al. (2002) sur les cintiques obtenues
sur Bacillus pumilus. Les intervalles de confiance 95% sont indiqus entre parenthses pour chaque
paramtre. INF : infini.
temprature nb points en min log N
0
(en CFU) R
ajust
89 8 42,71 (31,68 85,79) 4,25(3,24 5,25) 0,971
92 9 17,29 (12,78 37,43) 3,92 (2,93 4,89) 0,983
95 18 9,24 (7,52 12,18) 4,20 (3,58 4,83) 0,992
98 12 3,70 (2,84 6,24) 4,09 (3,23 4,95) 0,984
101 10 1,46 (1,08 3,18) 3,97 (3,06 4,87) 0,985
104 7 0,55 (0,42 0,90) 4,08 (3,01 5,17) 0,985
pH trait
ment
nb points en min log N
0
(en CFU) R
ajust
3,94 9 2,10 (1,49 11,40) 3,25 (2,38 4,12) 0,779
4,10 10 1,92 (INF) 3,38 (INF) 0,311
4,10 6 1,57 (INF) 3,15 (INF) 0,286
4,70 9 2,74 (1,95 9,56) 3,33 (2,38 4,28) 0,826
5,10 12 4,07 (3,09 7,16) 3,52 (2,63 4,42) 0,902
5,15 5 3,26 (INF) 3,83 (INF) 0,596
5,20 8 2,91 (2,19 5,20) 3,52 (2,61 4,44) 0,907
5,80 8 3,98 (3,04 6,77) 3,94 (2,93 4,95) 0,988
6,10 6 5,60 (3,98 19,13) 4,12 (2,65 5,58) 0,960
6,10 10 5,23 (4,01 8,54) 3,99 (3,07 4,90) 0,932
7,60 8 10,52 (INF) 4,04 (INF) 0,981
pH recouv
nt
nb points en min log N
0
(en CFU) R
ajust
5,27 10 1,51 (1,14 2,68) 3,58 (2,63 4,53) 0,912
5,55 7 2,68 (2,00 5,26) 4,03 (2,84 5,23) 0,989
5,82 12 3,34 (2,55 5,58) 3,91 (3,07 4,76) 0,977
6,03 8 4,50 (3,26 11,17) 4,10 (3,09 5,10) 0,986
6,04 13 5,66 (4,25 10,72) 4,07 (3,25 4,89) 0,993
6,26 13 4,63 (3,54 7,79) 3,80 (2,90 4,70) 0,977
6,50 7 5,32 (3,89 11,81) 3,85 (2,27 5,43) 0,904
6,51 6 5,70 (4,25 10,78) 4,01 (2,86 5,16) 0,987
6,52 11 6,05 (4,40 14,68) 4,00 (3,13 4,87) 0,993
7,15 12 7,72 (5,98 12,22) 3,94 (3,14 4,74) 0,987
7,83 11 8,37 (6,47 13,23) 3,97 (3,14 4,82) 0,990
7,84 5 7,53 (INF) 4,02 (INF) 0,969
8,25 12 6,99 (2,24 12,76) 3,83 (2,85 4,81) 0,932
8,82 12 5,20 (4,00 8,54) 3,84 (2,90 4,78) 0,917
p global : 2,03 IC
95%
: 1,78 2,23
72
3.2.2.2. Evaluation de la qualit dajustement
3.2.2.2.1. Reprsentation de lajustement global
Analyse des R
ajust
R
ajust
moyen 0,899
R
ajust
min 0,286
R
ajust
max 0,993
Ecart type 0,180
Figure III.8 : reprsentation de lajustement du modle
de Mafart et al. (2002) sur lensemble des cintiques
obtenues sur Bacillus pumilus
Les reprsentations graphiques de la qualit dajustement sur les figures III.3 et III.8
sont satisfaisantes. La valeur moyenne du R
ajust
est de 0,892 avec un cart type de
0,182.
3.2.2.2.2. Examen des rsidus
Lanalyse graphique (figure III.9.B) tmoigne dune rpartition alatoire des
rsidus et met en vidence une bonne homocdasticit. Le test numrique de Shapiro-
Wilk atteste que la rpartition des rsidus est gaussienne pour 27 cintiques sur 31.
Seules les cintiques ralises 98C et celles ralises pH de traitement 4,70, 5,20
et 7,60 ne rpondent pas ce critre.
La mise en vidence dautocorrlation est effectue graphiquement, car le
faible nombre de points ne permet pas dappliquer le test usuel de Durbin-Watson qui
requiert un minimum de 15 points. Pour certaines cintiques, lobservation graphique
laisse apparatre une autocorrlation des rsidus, cest--dire que ces derniers ne sont
pas totalement indpendant du temps de traitement. Ceci peut tre expliqu par le fait
de la fixation du paramtre p pour lensemble des jeux de donnes. Pour certaines
cintiques, cette valeur de p fixe est lgrement sous ou surestime crant une partie
de la rponse non explique par le modle.
294 points
R = 0,976
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 1 2 3 4 5
V
a
l
e
u
r
s

d
e

l
o
g

N

e
s
t
i
m
e
s
73
A.
B.
C.
Figure III.9 : A. ajustement du modle de Mafart et al. (2002) sur la cintique de
destruction ralise 95C et pH neutre. B. rpartition des rsidus.
C. Projection des rgions de confiance pour la valeur des paramtres sur plans.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 5 10 15 20
temps de traitement (mn)
l
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s
-0.2
-0.15
-0.1
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0 5 10 15 20
temps de traitement (mn)
r
s
i
d
u
s
74
Nous choisissons de reprsenter graphiquement la cintique compose du plus
grand nombre de points, dont les conditions de traitement sont 95C et pH 7 (figure
III.9).
3.2.2.2.3. projection de la rgion de confiance
La dtermination des rgions de confiance des 63 paramtres (31 valeurs de
N
0
, 31 valeurs de et une valeur de p) a t effectue par la mthode de Lobry et al.
(1991). Compte tenu du trs grand nombre de paramtres, la mthode de calcul de
lhypervolume par tirage alatoire de lensemble des paramtres demande un temps de
calcul trop long pour pouvoir tre ralis par les outils informatiques dont nous
disposons. Une mthode dtourne est alors adopte o le tirage alatoire ne seffectue
que sur un seul un triplet de paramtre (N
0
, et p) appartenant une mme cintique,
pendant que tous les autres paramtres sont fixs leurs valeurs (cest--dire aux
valeurs o la somme des carrs des carts est minimale). Le temps de calcul devient
alors plausible pour 20000 points tirs par cintique (cf matriel et mthodes). Les
projections des rgions de confiance sur plan sont reprsentes figure III.9.C pour la
cintique ralise 95C.
3.3. Discussion
La plupart des populations de spores exposes la chaleur suivent une
destruction log-linaire. Sur les sept souches tudies, cinq suivent ce profil de
destruction. Notre choix du modle log-linaire est largement justifi par les valeurs de
R
ajust
relativement leves.
Mais dautres souches se distinguent en suivant des cintiques de destruction
particulires. Cest le cas des souches de Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 et
Bacillus pumilus dorigine industrielle. Ces souches ncessitent des modles plus
labors, comportant gnralement plus de paramtres. Les modles surparamtrs
offrent gnralement une meilleure qualit dajustement, au dpend de la robustesse.
Le choix des modles sest alors orient vers ceux offrant le meilleur compromis entre
qualit dajustement et robustesse.
75
3.3.1. Le modle de Rodriguez (1988)
La courbe de survie de Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 prsente deux
parties distinctes correspondant chacune des deux sous populations. Deux modles
indpendants sont associs pour dcrire cette cintique. Le premier est le modle log-
linaire classique. Le second est un modle dcrivant une activation des spores en
dbut de traitement, associe une destruction log-linaire. Ce dernier modle a
dabord t propos sous sa forme la plus simple par Schull (1963), selon lequel la
population ne peut tre dtruite quaprs avoir t active. Pour Rodriguez (1988), les
spores dormantes, tout en tant actives, subissent une destruction thermique selon le
mme taux de destruction que les spores actives. Le modle le plus complet est
propos par Sapru (1992) pour qui le taux de destruction des spores actives est
diffrent de celui des spores dormantes, ncessitant ainsi un paramtre supplmentaire.
Nous avons prfr le modle de Rodriguez, moins paramtr que celui de Sapru, sans
perte de qualit dajustement.
Pourtant le modle de Rodriguez reste fortement paramtr. Pas moins de six
paramtres entre dans sa constitution initiale prsente en 1988 :
Equation III.3
o Z
0
est la population thermosensible initiale, X
0
et Y
0
sont respectivement les spores
actives et non actives de la population thermorsistante, k
1
et k
2
sont les constantes de
destruction respectives des populations thermosensible et thermorsistante, tandis que
h est la constante de vitesse laquelle les spores sactivent.
La projection des rgions de confiance laissent apparatre de fortes
corrlations structurelles. De plus, lalgorithme de minimisation converge souvent vers
un des nombreux minima locaux. Ce problme peut tre biais par suppression des
paramtres jugs inutiles. En supposant que lintgralit de la population
thermorsistante se trouve sous sa forme inactive en dbut de traitement, X
0
est nul.
Lalgorithme de minimisation converge alors toujours vers la mme valeur. La qualit
dajustement reste satisfaisante, mais les corrlations structurelles demeurent trs
importantes : les intervalles de confiance peuvent tendre vers linfini.
( )
t h k t k t k t k
e e Y e X e Z N
). (
0 0 0
2 2 2 1
. .
+
+ + =
76
Exemple
Si la destruction dune population tend vers linfini, elle est alors considre
comme inexistante. La seconde va compenser en sajustant sur tous les points. On
observe alors graphiquement une simple droite (fig III.10) dont la SCE vrifie
linquation de Beale (Inquation II.8). Et par dfinition, les valeurs des paramtres de
cette droite entrent alors dans lintervalle de confiance 95%.
X
0
0
D
1

h
Y
0
et D
2
forment une droite
vrifiant lquation II.8
Figure III.10 : exemple des fortes corrlations
structurelles du modle de Rodriguez.
Cas de la figure III.3 (graphique de droite)
Sur ce profil de destruction, la phase dactivation de la population
thermorsistante napparat pas. On peut alors rduire le modle dun nouveau
paramtre : en supposant que la population thermorsistante est immdiatement
active, le paramtre h disparat. Le modle ne comportant plus que quatre paramtres
perd alors les corrlations structurelles.
Compte tenu des difficults auxquelles nous sommes confronts lors de
lajustement dun tel modle, nous pouvons nous interroger sur lintrt de modliser
entirement la courbe de survie. Dans le cadre de notre tude, seule la population la
plus thermorsistante est rellement intressante. Sur cette dernire population, la
phase dactivation na gure d'importance. Nous concluons que lintrt dun tel
modle reste limit en raison dune part des fortes corrlations structurelles quil
prsente, et dautre part de la porte limit dans notre tude. Une modlisation de la
partie linaire suivant la phase dactivation de la population thermorsistante serait
alors suffisante, encore faut-il que cette partie linaire soit suffisamment nette pour
tre exploite.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5
L
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s
77
3.3.2. Le modle de Mafart et al. (2002)
La courbe convexe de destruction de Bacillus pumilus nous a conduit dans un
premier temps au modle de LHaridon et Cerf (1978) qui consiste dterminer la
dure de rduction dcimale sur la partie linaire de la cintique et en dterminer
lordonne lorigine. Or cette partie linaire est souvent difficile dlimiter. Nous
nous sommes alors intresss un autre type de modle postulant une dispersion des
thermorsistance au sein de la population suivant une distribution de Weibull dont la
forme cumulative scrit :
Equation III.4

O N reprsente le nombre de survivants au temps t de traitement, N
0
est le
nombre initial dindividus composant la population. k et p sont deux paramtres de la
distribution.
Peleg et Cole reparamtrent le modle sous sa forme logarithmique dcimale :
Equation III.5
Le paramtre b de ce modle ne revt aucune signification physique et nest
pas immdiatement interprtable. Nous prfrons reparamtrer ce modle en :
Equation III.6
O n reprsente le nombre de rduction dcimale. Le paramtre reprsente
un temps, correspondant la dure de la premire rduction dcimale, cest--dire le
temps pour lequel N = N
0
/10 . Le paramtre p reste un paramtre sans signification
directement interprtable, mais correspond un facteur de forme.
Ces modles permettent dajuster de faon gnrale des courbes de survie
concaves ou convexes, sans plage linaire. Ce dernier modle a t ajust avec succs
sur les cintiques de destruction de la souche de Bacillus pumilus.
Fixation de la valeur de p
Comme nos rsultats lindiquent (fig III.6), la valeur de p dcrot lgrement
avec la temprature, et augmente avec le pH. Il semble donc que globalement, p
augmente avec lhostilit du milieu. Le choix de fixer p pour une souche donne
(comme nous lavons fait) semble donc priori nuire la qualit dajustement. La
p
kt
e N N

= .
0
p
t b
N
N
. log
0
=
p
t
N
N
n

= =
0
log
78
figure III.11 compare graphiquement les deux ajustements. La valeur de p du premier
modle est estime sur lensemble des 31 cintiques, tandis que le second est ajust sur
la cintique considre.
Figure III.11 : comparaison graphique des deux ajustements du modle. En rouge, ajustement du
paramtre p sur lensemble des jeux de donnes. En bleu, ajustement du paramtre p sur le jeu
indpendamment des autres.
La valeur de p estime sur la cintique 89C est particulirement loigne de
la valeur de p globale (p
89
= 2,87 ; p
glogal
= 2,03). La consquence immdiate est une
qualit dajustement nettement moins bonne, traduite par le coefficient de
dtermination diminuant de 0,998 0,979, mais restant satisfaisant. Cependant, la
plupart des cintiques se rapprochent du second cas prsent ( droite, fig III.11),
cest--dire des ajustements de modles pour lesquels les valeurs de p ne diffrent pas
de faon significative dun modle lautre.
Les avantages tirs de la fixation de p pour une souche compensent largement
les inconvnients cits prcdemment. Lorsque p est estim cintique par cintique, on
observe une forte corrlation structurelle entre les paramtres p et (fig III.7), ce qui
est le signe dune surparamtration justifiant la fixation de p.
Enfin, lajustement des deux autres paramtres et N
0
peut seffectuer par
rgression linaire du log N en fonction du t
p
.
Dtermination de la valeur de p
Dans le cadre de notre tude, p a t ajust par minimisation de la SCE sur
lensemble des jeux de donnes collects dans les diffrentes conditions de traitement
0
1
2
3
4
0 20 40 60 80
temps de traitement 89C (mn)
l
o
g

s
u
r
v
i
v
n
a
n
t
s
p global
p ajust
0
1
2
3
4
0 5 10 15
temps de traitement 95C (mn)
l
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s
p global
p ajust
79
et de recouvrement. Cette mthode permet dobtenir une valeur moyenne tenant
compte de lensemble des rsultats exprimentaux.
Dans ces conditions, la dtermination de ce paramtre demande une quantit
de rsultats exprimentaux importante, difficile mettre en uvre. Une mthode plus
rapide peut tre propose : si on postule que le paramtre p est indpendant des
facteurs environnementaux, sa valeur peut thoriquement tre fixe sur une cintique
effectue dans une seule condition environnementale (choisie dans la zone mdiane de
la gamme des facteurs tudie. Ex : pH 6 pour une gamme dtude entre 5 et 7).
La qualit de la cintique sur laquelle est estime la valeur de p est capitale
quant la qualit dajustement du modle, et par consquent la manipulation demande
tre ralise plusieurs fois. Nous prconisons cinq rptitions dune mme cintique
de destruction pour une estimation correcte de la valeur du paramtre p.
Intrts du modle
Le traditionnel D est remplac par le nouveau paramtre dont la signification
reste voisine du concept de dure de rduction dcimale. Les proprits de ce modle
divergent du modle log-linaire par lexposant p, pouvant tre qualifi de paramtre
rgissant la courbure de la cintique. Lorsque p > 1, la courbe est convexe. Ceci traduit
une augmentation de la vitesse destruction au cours du traitement thermique. Lorsque
p < 1, on observe linverse. Enfin le modle de destruction log-linaire se retrouve
lorsque p = 1. est alors note D.
Dans la seconde partie de ce manuscrit, un autre avantage remarquable de ce
modle sera mis en vidence : le paramtre obit, au mme titre que D, la relation
de Bigelow en fonction de la temprature (loi du z).
Inconvnient du modle
Le principal inconvnient concerne son application aux calculs de valeurs
strilisatrices. Dans le cadre de ce modle, ces dernires ne sont plus additives,
invalidant les mthodes de calcul classique (mthode de Bigelow, mthode de Ball). Si
lon considre deux traitements thermiques successifs dont les VS sont F
1
et F
2
, la VS
globale F devient :
Equation III.7
p p p
F F F
2 1
+ =
80
3.3.3. Effet global du pH sur les paramtres de thermo-
rsistance
Au cours du traitement thermique ralis sur une population N
0
, une
acidification du milieu va augmenter la vitesse de destruction en dstabilisent la
structure de ldifice sporal. A lissu du traitement, une partie des spores constituant la
population initiale est morte (inactivation irrversible). Les spores survivantes auront
t endommages par la chaleur. Elle constitue la population N
1
.
Si la cintique suit le modle log-linaire
ou
Si la cintique suit le modle de Mafart et al. (2002)
Ces spores survivantes sont fragilises et sont plus exigeantes vis--vis du
milieu pour germer et prolifrer. Le milieu de recouvrement, et notamment le pH, va
alors jouer un rle slectif sur ces spores endommages. Plus le milieu sera hostile, et
plus le nombre de spores survivantes capables de prolifrer sera faible. Il sagit de la
population N
2
(figure III.12).
ou
D
t
N
N
=
0
1
log
p
t
N
N
0
1
log
'
log
0
2
D
t
N
N
=
p
t
N
N
=
'
log
0
2
81
N
0
: population initiale
Destruction thermique Facteurs dinfluence :
- Temprature
- pH du milieu
N
1
: Population survivante endommage
Recouvrement
post traitement
Facteurs dinfluence :
- Temprature
- pH milieu
N
2
: Population capable de prolifrer
Figure III.12 : Schmatisation de linfluence des facteurs du milieu de suspension sur des spores bactriennes
soumises un traitement thermique.
influence du milieu de traitement sur la
thermorsistance
pente= -1 / D*
pente = -1 / D
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4
Temps de traitement (min)
L
o
g

s
u
r
v
i
v
a
n
t
s
milieu optimum
Valeur D* maximale
milieu inconfortable
D < D*
influence du milieu de recouvrement sur la
capacit des spores prolifrer
pente = -1 / D
pente = -1 / D'
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4
Temps de traitement (min)
L
o
g

c
o
l
o
n
i
e
s
milieu optimum
Valeur D maximale
milieu inconfortable D'
< D
83
Chapitre 4
MODELISATION SECONDAIRE
4.1. Effet de la temprature
4.1.1. Estimation de la valeur des paramtres du modle
de Bigelow
Les paramtres indiqus dans le tableau IV.1 sont estims partir de plans
dexprience monofactoriels. Le pH des milieux de traitement et de rcupration est
fix 7 pour toutes les souches, sauf Alicyclobacillus acidoterrestris (pH 5,6).
Tableau IV.1 : Valeurs des paramtres estims du modle de Bigelow (1921). Les intervalles de confiance
95% sont indiqus entre parenthses.
souches Nombre
valeurs
Gamme
de T (C)
D* ou *
(en min)
z
T
R
aj
B stearoth. ATCC 12980 8 104 - 125 D
121,1
= 1,02 (0,69 1,52) 8,33 (7,24 9,81) 0,985
B stearoth. A36 8 104 - 125 D
121,1
= 0,38 (0,30 0,48) 7,51 (6,97 8,15) 0,996
B coagulans ATCC 7050 6 91 - 109 D
100
= 3,17 (2,74 3,68) 8,92 (8,18 9,79) 0,997
A. acidoterrestris 5 89 - 101 D
100
= 0,56 (0,25 1,26) 6,32 (4,82 9,54) 0,977
C. sporogenes A27 11 94 - 106 D
100
= 3,33 (2,44 4,55) 6,40 (5,30 8,42) 0,936
C. sporogenes P 79.3 (pop 1) 9 90 - 110 D
100
= 0,48 (0,25 0,91) 5,48 (4,41 7,23) 0,952
C. sporogenes P 79.3 (pop 2) 9 95 - 116 D
100
= 3,30 (2,26 4,81) 9,09 (7,71 11,08) 0,973
B. pumilus A40 6 89 - 104
100
= 1,91 (1,56 2,35) 8,03 (7,20 9,07) 0,995
84
4.1.2. Evaluation de la qualit dajustement
Nous observons par lintermdiaire des coefficients R
ajusts
un bon ajustement
du modle. La reprsentation (figure IV.1) confirme la qualit de lajustement.
Figure IV.1 : Reprsentation de la qualit dajustement du modle de Bigelow pour toutes les souches
tudies (X) Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 (Q) Bacillus stearothermophilus ATCC 12980
(O) Alicyclobacillus (9) Bacillus coagulans (V) Bacillus stearothermophilus A36
(+) Bacillus pumilus (X) Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 (pop 1) Clostridium sporogenes
Pasteur 79.3 (pop 2).
4.1.3. Analyse des rsidus
Ce modle trs utilis dans le monde de la pasteurisation et de la strilisation
confirme une fois de plus sa qualit. Lanalyse des rsidus ne laisse apparatre aucune
htrocdasticit ni autocorrlation. Leur rpartition est normale.
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Valeurs observes
V
a
l
e
u
r
s

a
j
u
s
t
e
s
85
4.2. Effet du pH
4.2.1. Effet du pH du milieu de traitement
4.2.1.1. Choix du modle
Laspect quantitatif a t trait par plusieurs auteurs, qui ont pu modliser
lvolution de la valeur de D en fonction du pH de traitement. Parmi les modles
prsents dans le chapitre 1, nous avons choisi dexprimer nos rsultats par le modle
de Mafart et Legurinel (1998). En effet, il sagit du modle le plus adapt notre
tude en raison de sa robustesse, sa parcimonie et de la signification physique ou
biologique de ses paramtres.
Mais ce modle, sous sa forme originelle, suppose une relation quadratique
entre le log de D et le pH. Or, pour les sept souches tudies, le logarithme de D
volue linairement en fonction du pH du milieu de traitement. On appliquera donc la
forme du premier degr du modle (Mafart et al., 2001) :
Equation IV.1
o pH* correspond au pH neutre, et D* la dure de rduction dcimale ce
pH*. La valeur z
pH
reprsente lcart de pH qui engendre une rduction de la dure de
rduction dcimale dun facteur dix.
Il convient cependant de noter que la linarit entre le logarithme de D et le
pH ne se maintient que pour une zone de pH limite, infrieure un pH optimum de
thermorsistance. Au-del de cette valeur, la dure de rduction dcimale dcrot
rapidement. Cependant, dans tous les cas observs cette valeur optimale de pH se situe
en zone alcaline. Le pH des aliments est de rares exceptions prs (jaune duf,
crustacs) infrieurs 7. Par consquent, lquation IV.1 dcrit de manire
satisfaisante leffet du pH sur la thermorsistance dans les aliments. La comparaison
des deux formes de modle (version originale du second degr et version modifie du
premier degr) a fait lobjet dune discussion (Mafart et al., 2001).
Les paramtres D* et z
pH
sont dtermins partir de jeux de donnes issus de
plans monofactoriels o seul le pH de traitement varie. Les valeurs des autres facteurs
(fixes) sont indiques dans le tableau IV.2.
pH
z
pH pH
D D

=
*
* log log
86
Tableau IV.2 : Valeurs des facteurs Temprature et pH de recouvrement lors de ltude de leffet du pH
de traitement.
Facteurs autres que le pH de traitement dfinissant D*
Temprature pH de recouvrement
B. stearothermophilus ATCC 12980 113 C 7
B. stearothermophilus A36 113 C 7
B. coagulans ATCC 7050 95 C 7
A. acidoterrestris ATCC 49025 95 C 5,6
C. sporogenes A27 100 C 7
C. sporogenes Pasteur 79.3 (pop 1) 95 C 7
Bacillus pumilus A40 95 C 7
4.2.1.2. Estimation des paramtres du modle linaire
Les rsultats sont prsents dans le tableau IV.3. Les valeurs de z
pH
varient
largement en fonction des souches. Elles voluent de 1,42 5,17.
Tableau IV.3 : Valeurs des paramtres estims du modle de Mafart et al. (2001). Les intervalles de
confiance 95% sont indiqus entre parenthses.
souches Nombre
valeurs
Gamme
de pH
D* (en min)
conditions tableau IV.2
z
pH
R
aj
B stearoth. ATCC 12980 9 3,48 8,07 11,59 (9,33 14,40) 3,23 (2,79 3,82) 0,980
B stearoth. A36 12 3,00 8,50 5,56 (4,29 7,22) 3,56 (3,00 4,38) 0,955
B coagulans ATCC 7050 9 4,10 6,95 16,58 (13,29 20,69) 2,53 (2,18 3,02) 0,978
A. acidoterrestris ATCC 49025 11 3,00 7,00 12,25 (7,62 19,69) 3,45 (2,60 5,12) 0,887
C. sporogenes A27 9 5,91 7,50 3,42 (2,76 - 4,23) 1,42 (1,18 1,77) 0,967
C. sporogenes Pasteur 79.3 (pop1) 18 4,03 8,00 1,24 (1,01 1,51) 2,26 (2,02 2,56) 0,969
C. sporogenes Pasteur 79.3 (pop2) 21 3,56 8,00 8,34 (6,10 11,39) 5,17 (3,69 8,65) 0,679
Bacillus pumilus A40 11 3,94 7,60 7,99 (6,30 10,12) 4,75 (3,82 6,25) 0,936
4.2.1.3. Analyse des rsidus Rgion de confiance
Ltude de la rpartition des rsidus montre une distribution relativement
homogne, laissant apparatre une bonne homocdasticit, sauf pour la souche de
Bacillus pumilus. Le test de Shapiro-Wilk conclue une distribution gaussienne des
rsidus. Lanalyse graphique ne prsente pas dautocorrlation.
87
La dtermination des rgions de confiance par la mthode de Lobry et leur
projection sur plan dvoilent des formes elliptiques traduisant une lgre corrlation
structurelle entre les deux paramtres du modle.
En exemple, les reprsentations graphiques de la souche Clostridium
sporogenes A27 sont indiques figure IV.2.
A.
B.
C.
Figure IV.2 : A. Ajustement du modle de Mafart et al. (2001) sur les jeux de donnes de la souche de
Clostridium sporogenes A27. B. rpartition des rsidus entre les valeurs observes et les valeurs thoriques.
C. rgion de confiance 95% pour la valeur des paramtres sur plan.
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
5.8 6.3 6.8 7.3
pH de traitement
l
o
g

D
-2
-1
0
1
2
3
5.8 6.3 6.8 7.3
pH de traitement
r
s
i
d
u
s

s
t
a
n
d
a
r
d
i
s
s
88
4.2.2. Effet du pH du milieu de recouvrement
A linverse du pH de traitement, peu de travaux ont port sur laspect
quantitatif de leffet du pH de recouvrement, et aucun modle nest couramment utilis
comme peuvent ltre celui de Bigelow pour leffet temprature, et peu peu ceux de
Davey ou de Mafart et Legurinel pour leffet du pH de traitement. Ltude que nous
porterons sur le pH de recouvrement tentera de quantifier son effet sur la
thermorsistance des spores bactriennes.
4.2.2.1. Vrification de leffet ltal du pH de recouvrement
Le pH est un des facteurs du milieu de rcupration jouant un rle important
sur la germination et la prolifration des spores aprs le traitement. Mais avant de
commencer toute investigation, la premire question se poser est de vrifier quelle
est la vritable action du pH de recouvrement sur des spores bactriennes
endommages par un traitement thermique. En effet, linfluence des bas pH joue-t-elle
un rle de destruction dfinitive des spores bactriennes endommages par le
traitement thermique ou bien un simple rle dinhibition de croissance, auquel cas un
retour des spores un pH plus confortable permettrait nouveau la croissance.
Pour vrifier la perte dfinitive de viabilit de spores soumises un pH acide
aprs traitement thermique, une exprience a t mene sur Bacillus
stearothermophilus ATCC 12980.
Deux lots de spores sont traits 10 min pour lun, 30 min pour lautre, 113C
dans un milieu Tryptone 1% - NaCl 1% pH7. Un troisime lot tmoin nest pas soumis
la chaleur. Ces trois lots sont incubs 55C en bouillon nutritif au pH minimum de
croissance (pH 5,3). La viabilit des spores de chacun des lots est suivie au cours du
stockage sur plusieurs jours par dnombrement sur glose nutritive pH 7 55C. Les
rsultats sont prsents dans le tableau IV.4.
Tableau IV.4 : Evolution de la viabilit de spores stockes un pH acide aprs traitement thermique (en CFU)
Temps de traitement 113C temps de stockage
dans le bouillon nutritif pH 5,3 0 min 10 min 30 min
15 min 780 310 15
3 heures 184 4
6 heures 770 227 3
24 heures 830 161 7
2 jours 660 57 1
3 jours 790 27 2
5 jours 800 13 0
8 jours 4 0
15 jours 830 0 0
89
Le stockage en bouillon nutritif acide naffecte aucunement la viabilit des
spores de Bacillus stearothermophilus non traites thermiquement. Cependant, les
spores ayant subies les dommages dun traitement thermique voient leur viabilit
chuter rapidement pendant le stockage en milieu acide.
Laction du pH de recouvrement est ici clairement mise en vidence. Comme
pour le pH du milieu de traitement, lacidit du milieu de recouvrement va augmenter
la vitesse dinactivation apparente des spores bactriennes ayant subies un traitement
thermique. Cette inactivation nest pas rversible par retour un pH optimum de
croissance de 7.
4.2.2.2. Modlisation de cet effet sur la thermorsistance
Lvolution du logarithme de la dure de rduction dcimale (log D) en
fonction du pH de recouvrement prsente une allure commune pour les sept souches.
Les graphiques prsents figure IV.3 montrent ces variations du log D en fonction du
pH dtermines pour quatre de nos souches. Dans tous les cas, llvation du pH
entrane une augmentation progressive du log D jusqu une valeur maximale voisine
du pH neutre. Au-del de ce pH (not pH
opt
), le log D diminue. On peut observer une
symtrie approximative selon un axe vertical passant par loptimum. Cette allure peut
tre caractrise par trois valeurs, dont deux sont graphiquement interprtables,
savoir la valeur maximale atteinte par le log D, ainsi que le pH optimal de thermo-
rsistance. Une troisime valeur correspondant au degr de sensibilit des spores au
pH peut tre ajoute pour complter la caractrisation de ces courbes.
Lallure gnrale ainsi que la symtrie par rapport au pH
opt
rappelle celle
observe par Mafart et Legurinel (1998) et Gaillard et al. (1998) concernant leurs
tudes sur leffet du pH du milieu de traitement. Un modle parabolique analogue au
prcdent peut donc tre envisag :
Equation IV.2
O le pH
opt
est le pH auquel la thermorsistance est maximale, D
max
reprsente la dure de rduction dcimale cette valeur de pH
opt
, tandis que z
pH
exprime lcart de pH par rapport pH
opt
induisant une rduction de D dun facteur
10. Ce modle a fait lobjet dune publication (Couvert et al., 1999).
2
max
'
' '
' log ' log

=
pH
opt
z
pH pH
D D
90
Figure IV.3 : Evolution du log de D en fonction du pH du milieu de recouvrement pour quatre souches
diffrentes. A. Bacillus pumilus. B. Bacillus stearothermophilus A36. C. Bacillus stearothermophilus
ATCC 12980. D. Clostridium sporogenes A27.
La linarit est un des avantages de ce modle (cf 2.2.1.2.3). Une simple
rgression linaire permet son ajustement. Les rgions de confiance sont dtermines
par la mthode de Lobry et al. (1991).
Les paramtres sont dtermins partir dun plan dexprience monofactoriel
o le pH de recouvrement est le facteur variable. Tous les autres facteurs sont fixes.
Les valeurs de temprature et de pH de traitement sont indiqus dans le tableau IV.5.
Les valeurs des paramtres estimes sont prsentes dans le tableau IV.6.
A
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
5 6 7 8 9
pH de recouvrement
l
o
g

D
'
B
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
5.8 6.3 6.8 7.3 7.8
pH de recouvrement
l
o
g

D
'
C
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
pH de recouvrement
l
o
g

D
'
D
-1.6
-1.1
-0.6
-0.1
0.4
5.5 6 6.5 7 7.5
pH de recouvrement
l
o
g

D
'
91
Tableau IV.5 : Valeurs des facteurs temprature et pH de traitement fixes pour ltude du pH de
recouvrement
souches temprature pH de traitement
B stearothermophilus ATCC 12980 113 C 7
B stearothermophilus A36 107 C 7
B coagulans 95 C 7
Alicyclobacillus acidoterrestris 95 C 4,6
Clostridium sporogenes A27 100 C 7
Bacillus pumilus 95 C 7
Tableau IV.6 : Valeurs des paramtres estims selon le modle de Couvert et al. (1999) pour chacune des
souches tudies. Les intervalles de confiance 95% sont indiqus entre parenthses. INF : infini.
souches D
max
Z
pH
pH
opt
B stearothermophilus ATCC 12980 D
113
= 13,71 (10,50 25,76) 2,13 (1,69 3,18) 7,98 (7,57 9,27)
B stearothermophilus A36 D
107
= 33,97 (24,28 57,04) 1,64 (1,40 2,06) 7,88 (7,57 8,52)
B coagulans D
95
= 15,15 (INF) 1,35 (INF) 6,73 (INF)
Alicyclobacillus acidoterrestris D
95
= 54,84 (INF) 9,25 (INF) 15,66 (INF)
Clostridium sporogenes A27 D
100
= 3,33 (INF) 1,41 (INF) 7,56 (INF)
C. sporogenes Pasteur 79.3 (pop 2) D
95
= 8,02 (4,78 21,93) 1,14 (0,88 2,18) 7,14 (6,88 8,56)
Bacillus pumilus D
95
= 8,22 (7,00 9,64) 2,76 (2,39 3,42) 7,54 (7,34 7,87)
Tableau IV.7 : Indication sur les jeux de donnes utiliss pour estimer les valeurs du modle de Couvert et
al. (1999). La qualit dajustement est reprsent par le coefficient R
aj
.
souches Nombre
valeurs
Gamme de pH
tudie
R
aj
B stearothermophilus ATCC 12980 11 5,92 8,00 0,976
B stearothermophilus A36 13 5,42 8,15 0,981
B coagulans 5 5,00 7,00 0,987
Alicyclobacillus acidoterrestris 9 3,65 - 7 0,948
Clostridium sporogenes A27 15 5,65 7,43 0,931
C. sporogenes Pasteur 79.3 (pop 2) 10 5,74 7,50 0,928
Bacillus pumilus 14 5,27 8,82 0,936
92
4.2.2.4. Evaluation de la qualit dajustement - Analyse des
rsidus
Comme le montrent les valeurs de R
ajust
dtermins pour chaque ajustement
du modle, la qualit dajustement reste trs bonne (figure IV.4.A et IV.5.A). Le
R
ajust
minimum rencontr est de 0,928 (Nous notons que les paramtres du modle
nont pas t estims pour la population 1 de la souche Clostridium sporogenes
Pasteur 79.3. Sa grande sensibilit au pH a rendu la zone tudie trop troite pour que
lajustement soit correct). On remarque cependant que malgr un bon ajustement du
modle, la signification des paramtres nest pas conserve pour la souche
dAlicyclobacillus acidoterrestris.
Lanalyse graphique des rsidus (figures IV.4.B et IV.5.B) ne prsente aucune
dhtrocdasticit, ni autocorrlation, quelle que soit la souche tudie. Le test de
Shapiro-Wilk appliqu aux diffrents jeux de donnes, tmoigne de la rpartition
normale des rsidus au risque de 5%.
La projection des rgions de confiance (figures IV.4.C et IV.5.C) indique une
corrlation entre le pH
opt
et le z
pH
. Cette corrlation saccentue fortement lorsque la
gamme de pH tudie est faible et ne dpasse pas la valeur du pH
opt
. Dans ce cas, les
points forment une ligne peu courbe, engendrant un intervalle de confiance du pH
opt
qui augmente fortement puis une compensation des autres paramtres. Pour trois des
six souches tudies, les rgions de confiance tendent vers linfini, et ne sont donc pas
dterminables.
4.2.2.5. Simplification du modle
Ce modle prsente toutefois linconvnient de comporter trois paramtres
dajustement. Or nous remarquons que la valeur de pH
opt
reste relativement voisine de
7. Nous pouvons proposer un modle simplifi, ne comportant plus que deux
paramtres, en fixant le pH
opt
7. Au prix dune perte de qualit dajustement, la
suppression de paramtre entrane un gain de robustesse et lapplication en milieu
industriel demande alors moins de connaissance de paramtres. Linconvnient est que
ce modle simplifi o la valeur de thermo-rsistance maximale est considre pour un
pH 7, suppose que la thermorsistance diminue au-del de ce pH, ce qui ne se vrifie
pas pour la plupart de nos souches o le pH
opt
est lgrement suprieur 7. Pour lever
ce problme, nous devons imposer au modle simplifi la contrainte de ne pouvoir tre
appliqu quaux pH infrieurs 7 (pH de la majorit des aliments).
93
A.
B.
C.
Figure IV.4 : A. Ajustement du modle de Couvert et al. (1999) sur les jeux de donnes de la souche
de Bacillus stearothermophilus A36. B. rpartition des rsidus entre les valeurs observes et les
valeurs thoriques. C. rgion de confiance 95% pour la valeur des paramtres sur plan.
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
5 5.5 6 6.5 7 7.5 8
pH de recouvrement
l
o
g

D
'
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
5 5.5 6 6.5 7 7.5 8
pH de recouvrement
r
s
i
d
u
s

s
t
a
n
d
a
r
d
i
s
s
94
A.
B.
C.
Figure IV.5 : A. Ajustement du modle de Couvert et al. (1999) sur les jeux de donnes de la souche
de Bacillus pumilus. B. rpartition des rsidus entre les valeurs observes et les valeurs thoriques.
C. rgion de confiance 95% pour la valeur des paramtres sur plan.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
5 6 7 8 9
pH de recouvrement
l
o
g

D
'
-2
-1
0
1
2
3
5 6 7 8 9
pH de recouvrement
r
s
i
d
u
s

s
t
a
n
d
a
r
d
i
s
s
95
Le test statistique de Bates et Watts (1988) permet de trancher pour un modle
entre sa forme complte et sa forme partielle laquelle on a retir un ou plusieurs
paramtres considrs comme superflu. Pour chacune des souches tudies, le test de
Bates et Watts indique que le surcrot de complexit apport par le paramtre pH
opt
nest pas justifi vis--vis de la qualit dajustement.
Le paramtre correspondant la dure de rduction dcimale de rfrence du
modle, dtermine au pH de rfrence alors fix 7, ne correspond plus la dure de
rduction dcimale maximale de la souche. Nous ne pouvons plus lappeler D
max
.
Nous le noterons alors D*.
4.2.2.6. Estimation des paramtres du modle simplifi
& Analyse des rsidus
On remarque par lintermdiaire du R
ajust
que lajustement reste trs bon
lorsque la valeur du paramtre pH
opt
est fixe 7, et ceci mme pour les souches de
Bacillus stearothermophilus ou dAlicyclobacillus pour lesquelles le pH
opt
ajust tait
trs lev.
Tableau IV.8 : Valeurs des paramtres estims du modle de Couvert et al. (1999) simplifi. Les
intervalles de confiance 95% sont indiqus entre parenthses.
souches D* (en min) z
pH
R
ajust
B. stearothermophilus ATCC 12980 D
113
= 7,17 (5,90 8,72) 1,28 (1,14 1,48) 0,947
B. stearothermophilus A36 D
107
= 10,83 (6,23 18,85) 1,16 (1,02 1,40) 0,937
B. coagulans D
95
= 17,08 (8,96 32,57) 1,55 (1,35 1,88) 0,979
95
= 5,96 (3,96 8,97) 3,81 (3,21 4,93) 0,877
100
= 1,61 (0,99 2,63) 1,06 (0,95 1,23) 0,901
95
= 7,27 (4,08 12,96) 1,04 (0,89 1,28) 0,925
Bacillus pumilus D
95
= 6,62 (5,40 8,11) 2,23 (1,94 2,69) 0,922
Les valeurs de D* sont rduites par rapport au D
max
du modle 3
paramtres, car ne correspondent plus au pH optimum de thermorsistance. De mme,
les valeurs de z
pH
diminuent, car la courbure graphique du modle est augmente.
Dune part, ltude numrique des rsidus par le test de Shapiro-Wilk indique
que la distribution des rsidus suit dans cinq cas sur six une rpartition normale.
Dautre part, lanalyse graphique prsente dans tous les cas une rpartition
dapparence alatoire, sans htrocdasticit apparente. Cependant, une
autocorrlation vidente des rsidus ressort pour les deux souches de Bacillus
stearothermophilus. Les limites de cette simplification du modle apparaissent ici pour
les deux souches dont le pH optimum de thermorsistance est le plus loign de 7.
96
4.3. Modle global
Les auteurs de modles de type modulaire considrent gnralement que
linfluence des facteurs environnementaux est multiplicative. Le modle de croissance
de Ratkowsky et al. (1982) ne prenant en compte que la temprature, est complt par
ajout multiplicatif des effets du pH et de la
w
(Mc Meekin et al., 1993 ; Wijtzes et al.,
1995). De mme, Zwietering et al. (1992) construit son concept sur cet effet
multiplicatif des facteurs.
Dans le domaine des courbes de survies, Davey et al. (1978), puis Mafart et
Legurinel (1998) btissent leurs modles sur ce mme concept en multipliant les
effets de la temprature et du pH. Un an plus tard, Gaillard et al. (1998) montrent que
leffet du facteur a
W
(Activit de leau) est galement multiplicatif. Enfin, Coroller et
al. (2000) parviennent la mme conclusion pour les facteurs a
w
de traitement et a
w
de
recouvrement.
Si nous mettons lhypothse que nos trois facteurs temprature, pH de
traitement et pH de recouvrement sont aussi multiplicatifs, un modle global peut alors
scrire :
Equation IV.3 :
O T* est la temprature de rfrence, pH* et pH* sont les pH de rfrence
respectivement pour le traitement et le recouvrement (pH neutre), les paramtres z
T
,
z
pH
et z
pH
correspondent aux carts par rapport T* et pH* entranant une diminution
de D* dun facteur dix. D* correspond la dure de rduction dcimale la
temprature T* et aux pH* et pH*.
2
. .
. .
.
'
'* ' * *
* log log
4 43 4 42 1
43 42 1
3 2 1
nt recouvreme pH effet
pH
traitement pH effet
pH
e tempratur effet
T
z
pH pH
z
pH pH
z
T T
D D

=
97
4.3.1. Estimation globale des paramtres
Le modle est ajust par minimisation de la somme des carrs des carts. Les
rsultats sont prsents dans le tableau IV.9.
Tableau IV.9 : Valeurs des paramtres du modle global estims par minimisation de la somme des carrs
des carts. Les intervalles de confiance 95% sont indiqus entre parenthses.
souches D* ou *
(en min)
nombre de
points
R
ajust
B stearothermophilus ATCC 12980 D
121,1
= 1,01 (0,72 1,41) 26 0,968
B stearothermophilus A36 D
121,1
= 0,49 (0,26 0,92) 28 0,981
B coagulans D
100
= 3,64 (2,91 4,57) 20 0,977
100
= 2,58 (1,04 6,46) 25 0,871
100
= 2,83 (2,15 3,77) 34 0,939
100
= 2,86 (2,26 3,62) 35 0,938
Bacillus pumilus
100
= 1,83 (1,49 2,23) 26 0,973
souches z
T
z
pH
z
pH
B stearothermophilus ATCC 12980 8,36 (7,31 9,73) 3,62 (2,94 4,69) 1,14 (1,01 1,37)
B stearothermophilus A36 8,77 (7,20 11,49) 4,08 (2,96 6,50) 1,05 (0,93 1,23)
B coagulans 8,38 (7,31 9,80) 2,76 (2,24 3,59) 1,60 (1,47 1,77)
Alicyclobacillus acidoterrestris 6,32 (4,62 10,04) 3,97 (2,72 7,34) 4,25 (3,25 8,05)
Clostridium sporogenes A27 6,17 (4,76 8,60) 1,59 (1,10 3,10) 0,95 (0,88 1,06)
C. sporogenes Pasteur 79.3 (pop 2) 10,10 (8,74 11,99) 6,63 (4,24 15,71) 0,99 (0,90 1,13)
Bacillus pumilus 8,12 (7,21 9,29) 4,98 (4,20 6,17) 2,07 (1,86 2,39)
4.3.2. Analyse des rsidus
Lanalyse graphique des rsidus ne laisse apparatre aucune htrocdasticit.
Dune part, ltude numrique par le test de Shapiro-Wilk montrent que la rpartition
des rsidus suit une loi normale ; dautre part, le test de Durbin-Watson met en
vidence une autocorrlation pour une des sept souches (Bacillus stearothermophilus
A36).
La projection des rgions de confiance ne met en vidence aucune corrlation
importante entre les paramtres (figure IV.6).
98
A.
B.
C.
Figure IV.6 : A. Ajustement du modle global sur les jeux de donnes de la souche de Bacillus coagulans
B. rpartition des rsidus entre les valeurs observes et les valeurs thoriques. C. rgion de confiance
95% pour la valeur des paramtres sur plan.
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
-0.5 0 0.5 1 1.5 2
valeurs observes
V
a
l
e
u
r
s

e
s
t
i
m
e
s
-2
-1
0
1
2
3
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2
Valeurs ajustes
r
s
i
d
u
s

s
t
a
n
d
a
r
d
i
s
s
99
4.4. Interaction entre les facteurs
Les paramtres z ci-dessus ont t dtermins suivant des plans monofactoriels.
Lavantage de ce type de plan est une estimation du paramtre avec peu de
manipulations. Cependant, les interactions ventuelles entre facteurs ne peuvent tre
mises en vidence, cest pourquoi plusieurs plans factoriels complets ont t raliss
pour valuer limportance de ces interactions.
4.4.1. Interactions entre temprature et pH de traitement
Nombreux sont les auteurs avoir montr une dpendance du z
T
par rapport au
pH du milieu de traitement, mais aucun modle caractrisant ces interactions na t
propos. Afin de mieux cerner leur importance quantitative, trois plans factoriels
complets ont t mens sur trois souches diffrentes : Bacillus stearothermophilus
Saupiquet, Bacillus coagulans et Clostridium sporogenes Saupiquet.
4.4.1.1. Influence du pH sur z
T
Nous remarquons que lacidification du milieu rduit linfluence dune
augmentation de temprature sur D pour deux des trois souches. La valeur de z
T
passe
de 7 11 pour les deux souches de Bacillus lorsque le pH est rduit de 7 4 (figure
IV.7). Cependant, aucune variation du z
T
en fonction du pH de traitement nest mise
en vidence pour la souche de Clostridium sporogenes.
4.4.1.2. Influence de la temprature sur z
pH
Comme prcdemment, linfluence de la temprature de traitement sur le z
pH
nest sensible que pour les deux souches de Bacillus.
Graphiquement, on nobserve aucune influence de la temprature sur le z
pH
pour la souche de Clostridium sporogenes. Mais pour les deux autres souches, leffet
est sensible puisque le z
pH
de Bacillus coagulans double et celui de Bacillus
stearothermophilus triple lorsque la temprature augmente de 15C.
100
Figure IV.7 : Interactions du pH de traitement sur la valeur du z
T
, de haut en bas, chez Bacillus
coagulans, chez Bacillus stearothermophilus A36 et chez Clostridium sporogenes A27.
Figure IV.8 : Influence de la temprature de traitement sur la valeur du z
pH
.
Clostridium sporogenes - 6 Bacillus coagulans - Bacillus
stearothermophilus
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
88 93 98 103
Temprature de traitement
l
o
g

D
pH 4,1
pH 5,1
pH 6,1
pH 6,95
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
100 105 110 115 120
l
o
g

D
pH 4,08
pH 5,08
pH 6,13
pH 7,07
0
1
2
3
4
5
6
7
90 95 100 105 110 115 120
temprature de traitement
z
p
H
-3
-2
-1
0
1
2
3
88 90 92 94 96 98 100 102 104 106 108
l
o
g

D
pH 4,05
pH 5
pH 5,8
pH 6,7
pH 7,47
pH de traitement
4 5 6 7
Z
T
4
6
8
10
12
14
16
pH de traitement
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
Z
T
6
8
10
12
14
16
18
pH de traitement
3 4 5 6 7 8
Z
T
3
4
5
6
7
8
101
Lanalyse de variance prsente dans le tableau IV.10 montre pourtant que
leffet des interactions est ngligeable par rapport leffet des facteurs : seulement
moins de 2% de la SCE est attribue aux interactions.
Tableau IV.10 : Analyse de variance. Valeur de la SCE (somme des carrs des carts) attribue chaque
facteur, et son % par rapport la SCE totale.
B. stearothermophilus B. coagulans C. sporogenes
Facteurs SCE % dexpli SCE % dexpli SCE % dexpli
Totale 7,09 100 10,29 100 19,96 100
Temprature 5,63 79,5 7,14 69,4 10,63 53,3
pH de traitement 1,27 17,9 2,89 28,1 8,87 44,4
Interaction (T x pH) 0,12 1,6 0,20 2,0 0,00 0,0
rsiduelle 0,07 1,0 0,058 0,6 0,453 2,3
De plus, lvolution des paramtres z
T
et z
pH
en fonction respectivement des
facteurs pH de traitement et temprature prsentent des allures diffrentes pour les
trois souches. Par consquent, il semble difficile de proposer un modle applicable
toutes ces souches avec peu de paramtres pour ne pas alourdir notre modle global.
Une modlisation tertiaire ne ferait que nuire la robustesse du modle. Nous nous
limiterons donc signaler ces interactions.
4.4.2. Interactions entre les pH de traitement et de
recouvrement
Ces interactions sont values sur deux souches bactriennes (Bacillus
stearothermophilus ATCC 12980 et Bacillus coagulans) pour lesquelles un plan
factoriel complet t ralis entre les facteurs pH de traitement et pH de
recouvrement.
4.4.2.1. Influence du pH de traitement sur le z
pH
La reprsentation graphique (figure IV.9) de lvolution du z
pH
en fonction du
pH de traitement ne laisse pas apparatre de tendance marque. Le z
pH
varie de 1,55
2,10 pour le Bacillus coagulans et de 1,57 2,05 pour le Bacillus stearothermophilus.
Linfluence du pH de recouvrement, caractris par le z
pH
, est donc relativement
constante quel que soit le pH de recouvrement.
102
Figure IV.9 : Reprsentation des variations du z
pH
en fonction du pH de traitement chez Bacillus
coagulans ( droite) et Bacillus stearothermophilus ( gauche). Les intervalles de confiance des pH 6,10 et
6,96 ( droite) ne sont pas reprsents car ils dpassent largement lchelle du graphique.
4.4.2.2. Influence du pH de recouvrement sur z
pH
La reprsentation du log de D en fonction du pH de traitement montre, dans le
cas de Bacillus coagulans, que la pente des droites de rgression varie en fonction du
pH de recouvrement. Or la pente de ces droites est directement lie la valeur du z
pH
(figure IV.10). La valeur de z
pH
(cart de pH induisant une variation de D dun facteur
10) atteint mme une valeur de 24 pH de recouvrement trs acide chez Bacillus
coagulans. En revanche, chez Bacillus stearothermophilus, leffet du pH de
recouvrement sur le z
pH
semble peu marqu.
Figure IV.10 : Reprsentation du log de D (min) en fonction du pH de traitement, diffrents pH de
recouvrement pour les souches de Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 ( gauche) et de Bacillus
coagulans ATCC 7050 ( droite).
pH de traitement
4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
z
'
p
H
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
pH de traitement
4 5 6 7 8
z
'
p
H
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
-0.3
0.2
0.7
1.2
1.7
4 5 6 7 8
pH de traitement
l
o
g

D
5.4
5.8
6.05
6.35
6.55
6.9
-0.7
-0.5
-0.3
-0.1
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7
pH de traitement
l
o
g

D
pH 4,99
pH 5,51
pH 6,01
pH 6,44
pH 6,88
103
Figure IV.11 : Evolution de la valeur du paramtre z
pH
en fonction du pH de recouvrement pour les
souches de Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 ( gauche) et de Bacillus coagulans ATCC 7050
( droite). Les intervalles de confiance des deux pH de recouvrement les plus acides sortent de la zone
de graphique.
Afin de vrifier les conclusions tires de lobservation graphique, une analyse
de variance est effectue et prsente dans le tableau IV.11. Seulement moins de 4%
de la somme des carrs des carts ne sont attribus aux interactions.
Tableau IV.11 : Analyse de variance. Valeur de la SCE (somme des carrs des
carts) attribue chaque facteur, et son % par rapport la SCE totale.
B. stearothermophilus B. coagulans
Facteurs SCE % dexpli SCE % dexpli
Totale 8,77 100 7,22 100
pH de traitement 5,57 63,5 0,84 11,6
pH de recouvrement 1,98 22,6 5,99 83,0
Interaction (pH
T
x pH
R
) 0,07 0,8 0,26 3,6
rsiduelle 1,15 13,1 0,13 1,8
Compte tenu du faible poids des interactions, nous ne les intgrerons pas
notre modle global. La perte de robustesse ne serait compense que par un faible gain
de qualit dajustement.
pH de recouvrement
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
z
p
H
0
2
4
6
8
10
pH de recouvrement
4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
z
p
H
0
5
10
15
20
25
30
104
4.5. Discussion
4.5.1. Le modle de Bigelow
Le modle de Bigelow propos ds 1921, traduit la relation log-linaire entre
la dure de rduction dcimale et la temprature. Il fut depuis, confort et valid de
nombreuses reprises. Une fois de plus, nous confirmons la trs bonne qualit
dajustement sur une gamme de souches pour lesquelles le modle sajuste avec des
coefficients de dtermination oscillant entre 0,936 et 0,997.
En se rfrant aux sept souches tudies, la valeur de z varie de 6,32 9,09.
Leur attribuer la valeur conventionnelle de dix engendrerait une erreur dans
lestimation de la dure de rduction dcimale une temprature T.
La figure IV.12 reprsente graphiquement lerreur engendre par une valeur
de z fixe dix sur lestimation de la dure de rduction dcimale de Clostridium
sporogenes A27 en fonction de la temprature.
Exemple : Clostridium sporogenes A27
D
100
= 2,83 min
z
T
= 6,17
Figure IV.12 : reprsentation de lerreur sur lestimation du log D entre
la valeur de z relle (z = 6,17, en bleu) et la valeur conventionnelle
(z = 10, en rouge).
Dans la plupart des cas rencontrs, la valeur de z estime est infrieure la
valeur de z conventionnelle. Par consquent, les calculs de D des tempratures
infrieures la temprature T* de rfrence sous-estiment la thermo-rsistance.
-1
0
1
2
3
90 95 100 105 110
temprature de traitement (en C)
l
o
g

D

(
e
n

m
i
n
)
105
4.5.2. Modlisation de leffet du pH de traitement
Nous avons dabord tent dajuster nos donnes sur le modle de Mafart et
Legurinel (1998). Mais la qualit dajustement est faible, remettant en question le
caractre quadratique de lvolution du log D en fonction du pH du modle initial
(Mafart et al., 2001). Lexposant du modle fix 2 par les auteurs serait en fait
variable selon les souches bactriennes. Le modle pourrait alors tre gnralis en :
Equation IV.4
Le modle de Mafart et Legurinel (1998) serait alors gnralis par
ladjonction dun paramtre supplmentaire, perdant de sa parcimonie, ainsi que sa
linarit. Mafart et al. (2001) indiquent que la valeur de estime sur neuf souches,
varie de 0,9 2,35. Cette dispersion nest pas seulement due la nature des souches,
mais galement la surparamtration du modle et la corrlation structurelle entre
z
pH
et .
Afin de conserver la parcimonie et surtout la linarit, nous avons pris le parti
de ne pas estimer , mais de le fixer 1 ou 2.
4.5.3. Modlisation de leffet du pH de recouvrement
Le test statistique de Bates et Watts dmontre, daprs les jeux de donnes
collects sur chaque souche, que la diffrence de qualit dajustement entre les deux
modles ne justifie pas lajustement du paramtre pH
opt
. Ces diffrences de qualit
dajustement sont exprimes par intermdiaire du R
ajust
et de la SCE (tableau IV.12).
pH
z
pH pH
D D
*
* log log

=
106
Tableau IV.12 : comparaison des qualits dajustement entre le modle de Couvert et al. (1999) et le
modle simplifi. Les modles sont ajusts sur les valeurs de D dtermins aux pH infrieurs 7.
Modle Couvert et al. (1999) Modle simplifi
souches SCE R
ajust
SCE R
ajust
B. stearothermophilus ATCC 12980 0,009 0,975 0,023 0,947
B. stearothermophilus A36 0,122 0,944 0,161 0,937
B. coagulans ATCC 7050 0,013 0,987 0,030 0,979
B. pumilus A40 0,016 0,934 0,021 0,922
A. acidoterrestris ATCC 49025
0,031 0,953 0,093 0,877
C. sporogenes A27 0,159 0,948 0,558 0,832
C. sporogenes Pasteur 79.3 (pop 2) 0,140 0,925 0,170 0,925
Le tableau IV.12 indique une certaine perte de qualit dajustement due la
simplification du modle. Mais les contaminations des aliments sont souvent
dorigines diverses, et les industriels ne disposent que dinformations trs vagues sur
les paramtres de thermorsistance des micro-organismes prsents dans ses produits.
Parmi les modles disponibles, le choix sorientera souvent vers les modles plus
simples, peut tre moins prcis, mais demandant moins destimation de paramtres.
Avec seulement deux paramtres, la qualit dajustement du modle reste convenable.
De plus, les corrlations structurelles entre les paramtres z
pH
et le pH* de rfrence
sont supprimes, stabilisant ainsi lensemble du modle.
Validation du modle simplifi partir de donnes bibliographiques :
La qualit dajustement du modle simplifi est vrifie sur des jeux de
donnes extraits de la littrature (tableau IV.13).
Tableau IV.13 : Estimation de la valeur des paramtres du modle simplifi selon les donnes
bibliographiques de Lopez et al. (1997) obtenues sur quatre souches de Bacillus stearothermophilus. Les
valeurs de D sont estimes cinq valeurs de pH, de 5 7. La qualit dajustement est exprime par
lintermdiaire du R
ajust
.
souches D
120C
(en min) z
pH
R
ajust
ATCC 12980
2,41 3,06 0,978
ATCC 7953
2,19 3,80 0,993
ATCC 15951
2,35 3,21 0,993
ATCC 15952
1,67 4,12 0,993
On observe des valeurs de z
pH
trs leves par rapport celle releves sur nos
souches de Bacillus stearothermophilus. Lexplication peut venir des souches elles-
107
mmes, ainsi que du milieu de recouvrement diffrent de celui que nous avons utilis
(ex : ajout de Ca
2+
, acidification par HCl).
4.5.4. Modle global et interactions
La modlisation successive des trois facteurs temprature, pH de traitement et
pH de recouvrement telle que nous lavons prsente ne peut tre applique que
lorsquun seul facteur du milieu varie (tude monofactorielle). De plus, ces modles
successifs et indpendants intgrent un paramtre commun : le D* de rfrence. Il
sagit de la valeur de D estime dans des conditions standards de temprature et de pH.
En thorie, les valeurs de D* obtenues par chaque modle monofactoriel doivent tre
identiques. Or ces valeurs restent voisines, mais diffrentes.
Lestimation globale des paramtres conduit des valeurs proches des valeurs
dtermines lors de ltude facteur par facteur. Dans chaque cas, les intervalles de
confiance des paramtres sont estims par les deux modles (mono ou tri factoriel)
prsentent des rgions communes. Ceci montre que le plan dexprience suivi est
valide et qu priori, aucune interaction entre les facteurs nest perceptible.
Afin de vrifier cette absence apparente dinteraction, plusieurs plans
factoriels complets ont t raliss entre dune part, la temprature et le pH de
traitement, et dautre part entre le pH de traitement et le pH de recouvrement.
Les dterminations des valeurs de z dans les diffrentes conditions
environnementales semblent mettre en vidence dimportantes interactions entre les
facteurs. En effet, les valeurs de z peuvent doubler en fonction des autres facteurs
(figures IV.7, IV.8, IV.9, IV.10 et IV.11). Lexemple le plus marquant est
laugmentation de z
pH
de 2,44 24,08 lorsque le pH de recouvrement est acidifi de
6,92 4,93.
Malgr ces fortes variations, lanalyse de variance ne laisse aux interactions
quune part relativement faible ne dpassant pas les 3,6% dexplication estims entre
les pH de traitement et de recouvrement.
Ces rsultats sont en accord avec les donnes bibliographiques (Lopez et al.,
1996 ; Silla Santos et al., 1992, 1993 ; Anderson et al., 1974 ; Fernandez et al., 1994).
Lajustement de nos modles monofactoriels sur les valeurs de D dtermines par sur
quatre souches de Bacillus stearothermophilus (Lopez et al., 1996) montrent les z
T
et
z
pH
varient respectivement en fonction du pH de traitement et de la temprature
108
(Tableaux IV.14 et IV.15). Comme pour nos rsultats, z
T
augmente lorsque le pH
diminue et z
pH
augmente quand la temprature augmente. En dautres termes, plus un
facteur est hostile la survie, et moins linfluence de lautre est marque.
Tableau IV.14 : valeur de z
pH
en fonction de la temprature, selon les donnes de Lopez et al. (1996)
collectes sur quatre souches de Bacillus stearothermophilus.
Souches de Bacillus stearothermophilus
Temprature ATCC 7953 ATCC 12980 ATCC 15951 ATCC 15952
115C 3,71 3,41 3,08 2,30
120C 4,18 4,42 3,38 3,00
125C 4,20 4,36 3,79 2,84
130C 6,38 5,05 4,28 3,27
135C 7,11 7,86 6,19 10,19
Tableau IV.15 : Valeurs de z
T
(en C) en fonction du pH de traitement, selon les donnes de Lopez et al.
(1996) collectes avec quatre souches de Bacillus stearothermophilus.
pH ATCC 7953 ATCC 12980 ATCC 15951 ATCC 15952
7 8,16 7,58 7,74 7,77
6 9,84 9,20 8,94 8,51
5 9,83 8,89 9,29 8,97
4 10,02 9,37 9,55 9,62
Malgr ces variations sensibles des valeurs de z
T
et z
pH
, limportance des
interactions estime par analyse de variance reste faible. Le tableau IV.16 indique le
pourcentage dexplication de chacun des termes.
Tableau IV.16 : Analyse de variance sur lajustement du modle global (daprs les donnes de Lopez et
al. , 1996).
terme ATCC 7953 ATCC 12980 ATCC 15951 ATCC 15952
T T* 90,12 90,69 87,25 86,20
pH* - pH 8,69 7,91 11,11 10,62
(T-T*) x (pH*-pH) 0,46 0,44 0,51 0,84
rsiduelle 0,73 0,96 1,13 2,34
109
Tableau IV.17 : Valeurs de paramtres estimes sur le modle global (daprs les donnes de Lopez et al.,
1996). D* est dtermin 121,1C, pH7. Le pH de recouvrement est neutre.
souches D* z
T
z
pH
R
ajust
ATCC 7953 1,54 8,55 4,26 0,991
ATCC 12980 1,75 7,94 4,12 0,989
ATCC 15951 1,74 8,00 3,50 0,987
ATCC 15952 1,69 7,75 2,75 0,982
Une modlisation tertiaire de type z
T
= f (pH) ou z
pH
= f (T) rendant compte
des interactions serait thoriquement possible. Compte tenu du poids relativement
faible de ces interactions et compte tenu du fait que la nature de ces interactions varie
sensiblement dune espce lautre, nous pensons quune telle modlisation
prsenterait peu dintrt.
4.5.5. Extension des concepts classiques
Par dfinition, la VDB est la valeur de destruction biologique quantifiant le
degr de ltalit du facteur appliqu. Lunique facteur actuellement pris en compte
dans cette notion est la temprature. Or, le pH a galement un effet sur la
thermorsistance des spores, et par consquent peut tre intgr dans la notion de VDB
au mme titre que la temprature.
La VDB peut tre dfinie comme :
Equation IV.5
O D* et D sont respectivement les dures de rduction dcimale la
temprature T* (121,1C) et la temprature T. Par consquent, daprs le modle de
Bigelow :
Equation IV.6
D
D
L
T
*
=
T
z
T T
T
L
*
10

=
110
Suivant le modle que nous avons tabli, la VDB, dans son acception largie,
scrit :
Equation IV.7
Les valeurs D* et D sont alors respectivement les dures de rduction
dcimale aux pH et temprature de rfrence (121,1C, pH 7) et aux pH et
tempratures tudis (T, pH).
La VDB globale rsulte donc de trois VDB partielles :
Equation IV.8
Ce qui conduit la dtermination de la valeur strilisatrice F sous la forme
suivante :
Equation IV.9
Cette intgration nest valable que pour les souches dont les courbes de survies
sont log-linaires (cas de B. stearothermophilus). Dans le cas contraire, les valeurs
strilisatrices ne sont plus additives et ne peuvent tre intgres de la sorte.
Nous pouvons alors distinguer deux cas. Le cas gnral o le pH nvolue pas
au cours de la strilisation, et le cas particulier o lon observe une variation du
pH (ex : Saladire Western) :
Cas le plus courant o le pH est constant tout au long de la strilisation. Par
consquent, on a pH = pH = constante, et le seul facteur variable est la temprature.
Les valeurs de destruction biologique relative au pH (L
pH
et L
pH
) sont
constantes en fonction du temps. On peut donc crire :
Equation V.10
2
'
' 7 7 *
' , ,
10
*

= =
pH pH T
z
pH
z
pH
z
T T
pH pH T
D
D
L
' ' , ,
. .
pH pH T pH pH T
L =
dt dt L F
pH pH
t
t
T
t
t
pH pH T
f f
. . . .
' ' , ,
0 0

= =
dt F
f
t
t
T pH pH
. .
0
'
=
111
La valeur strilisatrice corrige F est alors :
Equation V.11
Cas particulier o lon observe une variation de pH au cours de la
strilisation. Le pH de recouvrement reste constant, mais la valeur de destruction
biologique L
pH
doit tre intgre en fonction du temps. La valeur strilisatrice corrige
F devient :
Equation V.12
4.5.5.1. Extension de la mthode de Bigelow
La mthode de Bigelow permet destimer la valeur strilisatrice F applique
partir dun suivi de temprature en valuant la valeur de lintgrale :
Equation V.13
La mthode consiste incrmenter le traitement en t. Lquation V.13 scrit
alors :
Equation V.14
Cette mthode peut tre tendue afin de prendre en compte leffet du pH au
cours de la destruction. On distingue de nouveau les deux cas prsents ci dessus :
Cas le plus courant o le pH est constant tout au long de la strilisation.
Equation V.15
=
f
t
t
T
dt F
0
.
t F
f
t
t
iT
=
.
0
= =
f
t
t
T
pH pH
dt
F
F
0
.
.
'
'

= =
f
t
t
pH T
pH
dt
F
F
0
. . '
'

= =
f
t
t
T
pH pH
dt
F
F
0
.
.
'
'

112
ce qui quivaut :
Equation V.16
Le facteur variable est la temprature T. Cette temprature est suivie au cours
du temps. Une mesure est effectue toutes les 30 secondes. Par incrmentation, on
obtient :
Equation V.17
Ce qui revient la mthode de base de Bigelow.
Cas particulier o lon observe un glissement de pH au cours de la
strilisation. Cette fois, deux facteurs variables doivent tre intgrs.
Equation V.18
Par incrmentation, on obtient :
Equation V.19
On considre un t
i
de 30 secondes, ce qui implique une mesure de
temprature et de pH toutes les 30 secondes.
La mthode est adapte sur un tableur informatique (Excel 97) de la faon suivante :
- colonne 1 : temps de traitement (incrment de 30 secondes)
- colonne 2 : Temprature au point froid de la boite au t
i
- colonne 3 : pH selon le modle ajust, au t
i
- colonne 4 : VDB au t
i
- colonne 5 : Valeur strilisatrice F cumule entre t
0
et t.
dt
nD
F
f
T
pH pH
t
t
z
T T
z
pH
z
pH
. 10
10
*
'
0
2
*
'
' 7 7

= =
i
t
t
z
T Ti
t F
f
T
=

. 10 '
0
*
= =
f
t
t
pH T
pH
dt
F
F
0
. . '
'

i
z
pH
t
t
z
T T
z
pH
t
nD
F
pH
i
f
T
i
pH
= =

. 10 . 10
10
*
'
7
*
' 7
0
2
113
Cette mthode permet de calculer le nombre de rductions dcimales
appliques pour un barme donn dont on connat le suivi de temprature. Ceci
implique de raliser le suivi pour tous les barmes pour lesquels on souhaite connatre
le nombre de rduction dcimale engendr. Mais cette mthode ne peut pas tre
utilise lenvers , cest--dire dterminer le barme de strilisation appliquer
pour atteindre un nombre de rductions dcimales pralablement choisi.
4.5.5.2. Extension de la mthode de Ball
La mthode de Ball consiste calculer F de faon semi-analytique laide
dun changement du facteur temprature qui devient alors une fonction du temps.
Comme prcdemment, on distingue deux cas :
Cas le plus courant o le pH est constant tout au long de la strilisation.
A pH de traitement constant, le calcul de F suit la mthode de base de Ball.
Equation V.20
La temprature T est une fonction du temps modlise par :
au cours du chauffage :
Equation V.21
Lisolement de la temprature donne :
Equation V.22
o - T
p
est la temprature de palier
- T
0
est la temprature initiale
- f
h
et j
h
sont les paramtres estims du modle
dt
nD
F
f
T
pH pH
t
t
z
T T
z
pH
z
pH
. 10
10
*
'
0
2
*
'
' 7 7

= =
h
h p
p
h
j t
f T T
T T
log
1
log log
0
=
=
( )
h
f
t
P h P
T T j T T

= 10 .
0
114
au cours du refroidissement :
Equation V.23
Lisolement de la temprature donne :
Equation V.24
o - T
g
est la temprature du produit en dbut de refroidissement
- T
c
est la temprature de leau froide du refroidissement
- f
c
et j
c
sont les paramtres estims du modle
Avec ce changement de variable, Ball dtermine alors, partir dun seul suivi
de temprature, les valeurs des quatre paramtres caractristiques des variations de
temprature au point froid du produit. Ces quatre paramtres vont permettre de simuler
des suivis de temprature nimporte quel barme.
Cas particulier o le pH volue au cours de la strilisation. Cette fois, le
facteur pH est fonction du temps et doit tre intgr :
Equation V.25
Soit :
Equation V.26
Le calcul de F est une intgration du produit de deux fonctions du temps
probablement difficile rsoudre analytiquement.
c
c c
c g
c
j t
f T T
T T
log
1
log log =
=
( )
c
f
t
c g c c
T T j T T

+ = 10 .
dt
nD
F
pH
f
T
pH
z
pH
t
t
z
T T
z
pH
. 10 . 10
10
*
'
7
*
'
' 7
0
2

= =
= =
f
t
t
pH T
pH
dt
F
F
0
. . '
'

115
4.5.5.3. Combinaison des mthodes de Ball et de Bigelow
La mthode de Bigelow permet de rsoudre de manire numrique
lintgration des valeurs de destruction biologique relatives la temprature et au pH.
Cependant, la mthode ncessite dtre ralise partir dun suivi exprimental de
temprature. Par consquent, il nest pas possible dutiliser cette mthode
lenvers , cest--dire de dterminer un barme (et donc un suivi de temprature) en
partant dun nombre de rduction dcimal que lon souhaite imposer (sauf dans le cas
particulier o la temprature cur atteint celle du palier de lautoclave).
Pour rsoudre ce problme, cette mthode de Bigelow peut tre modifie de
sorte que lon nutilise non plus dun suivi exprimental de temprature, mais dune
simulation de ce suivi laide du modle de Ball. Ds lors que les paramtres de Ball
sont dtermins (un seul suivi de temprature suffit), lavantage de cette modlisation
est quil est possible de dterminer par le calcul les cintiques de temprature, quel que
soit le barme.
117
Chapitre 5
APPLICATION DES MODELES
A UN PRODUIT INDUSTRIEL
La microbiologie prvisionnelle repose gnralement sur des bases de donnes
obtenues en laboratoire partir de milieux de suspension et de culture dont les facteurs
physico-chimiques sont matriss. Lapplication des modles de thermorsistance
tablis dans ces milieux standards vers des milieux alimentaires ncessite une tape de
validation.
Dans le cadre de notre tude, nous avons choisis de raliser ces validations sur
un produit complexe par sa composition varie et lhtrognit du pH de ses
ingrdients. Il sagit de la gamme Saladire produite par Saupiquet. Ce produit est
compos de thon, de lgumes et dune sauce acide de type vinaigrette. Chacun de ces
trois composants principaux possde lembotage, un pH propre qui va voluer au
cours du temps de chauffage. La complexit de ltude vient donc du fait que nous
nous trouvons ici dans des conditions dynamiques o la strilisation sera accompagne
de variations de temprature et de pH. Deux recettes de Saladires seront tudies : la
Western et la Mexicana.
5.1. Recueil de donnes et rsultats
5.1.1. Etude des variations des facteurs du produit aux
points critiques
Une simulation de la destruction des micro-organismes au cur dun tel
produit ncessite une connaissance prcise des volutions de temprature et de pH au
cours du process de strilisation.
La premire tape consiste mettre en vidence le(s) point(s) de la boite
au(x)quel(s) les conditions de pH et de temprature restent les plus dfavorables la
destruction microbienne, puis de suivre lvolution de ces facteurs au cours de la
strilisation. Bien entendu, si les points dfavorables de temprature et de pH sont
118
localiss deux endroits diffrents, ltude doit se faire simultanment sur ces deux
points afin de dterminer ensuite quel sera le plus propice la survie bactrienne.
5.1.1.1. Le facteur temprature
Dans un produit homogne (ex : compote), le point froid se trouve
approximativement au centre gomtrique de la boite. Pour le produit htrogne que
nous tudions, la recherche du point froid doit tre effectue en plaant des sondes de
temprature diffrents niveaux. Les enregistrements (figure V.1) permettent de
comparer les suivis et de mettre en vidence le point o la temprature reste la plus
basse pendant tout le traitement. Il sagit dun point se situant au tiers haut de la boite.
Nous considrons ce point comme la zone o la destruction microbienne par la
temprature est la plus faible.
Plusieurs rptitions de suivis sont effectues. Les paramtres du modle de
Ball sont estims et prsents dans les tableaux V.1 et V.2. Leurs carts type reste
faible. Les intervalles de confiance 95% sont galement indiqus.
Les diffrentes phases du cycles de strilisation sont prsents tableau V.3.
Figure V.1 : Suivi de la temprature dans une boite Western. Le schma de la boite indiquant les
diffrents niveaux est reprsent p.50 (figure II.1).
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
temps de strilisation (en min)
t
e
m
p
r
a
t
u
r
e

(
C
)
thon
cur
1/3 haut
lgume sup
ambiance
119
Tableau V.1 : Paramtres estims du modle de Ball sur les suivis de temprature effectus au point froid
de la Saladire Western (tiers haut). La moyenne, lcart type et lintervalle de confiance 95% sont
indiqus pour chaque paramtre.
n de suivi f
h
j
h
corr f
c
j
c
1 33,80 0,81 82,39 1,08
2 33,67 0,82 74,51 1,08
3 34,40 0,79 73,67 1,10
4 31,72 0,70 74,60 1,05
5 30,35 0,85 65,88 1,01
6 31,74 0,74 79,31 1,10
7 34,99 1,03 75,08 1,07
8 34,16 0,92 69,79 1,13
9 34,78 0,84 73,45 1,07
10 31,44 0,73 69,68 1,08
11 32,46 0,83 71,35 0,94
12 33,13 0,81 73,75 1,00
13 34,90 1,03 75,48 1,05
14 33,74 0,81 73,83 1,09
15 35,04 0,83 79,05 1,06
16 33,35 0,82 72,47 1,08
17 31,96 0,73 71,43 1,11
18 31,65 0,73 72,10 1,06
19 33,98 0,80 73,14 1,08
20 34,00 0,93 70,40 1,13
moyenne 33,26 0,83 73,57 1,07
cart type 1,39 0,091 3,70 0,045
Interv. Conf. 95% 30,36 36,16 0,64 1,02 65,82 81,32 0,98 1,16
Tableau V.2 : Paramtres estims du modle de Ball sur les suivis de temprature effectus au point froid
de la Saladire Mexicana (tiers haut). La moyenne, lcart type et lintervalle de confiance 95% sont
indiqus pour chaque paramtre.
n de suivi f
h
j
h
corr f
c
j
c
1 30,63 0,69 61,27 1,04
2 34,84 0,84 67,20 1,07
3 35,59 0,91 69,85 1,09
4 33,62 0,69 67,44 1,10
moyenne 33,67 0,78 66,44 1,07
cart type 2,18 0,11 3,65 0,03
Interv. Conf. 95% 29,1 38,2 0,55 1,01 70,4 77,2 1,05 1,10
Tableau V.3 : phases de chauffage et de refroidissement du cycle du pilote de strilisation (Multiprocess
Barriquand). La dure B correspond au barme appliqu (seule variable).
n phase Temprature
(strilisateur)
Dure phase
(min)
Dure totale
(min)
1 40C 1 1
2 80C 4 5
3 100C 6 11
4 110C 9 20
5 114C 4 24
6 116C 2 26
7 116C B 26 + B
8 100C 2 28 + B
9 80C 2 30 + B
10 60C 3 33 + B
11 50C 4 37 + B
12 30C 15 52 + B
13 15C 5 57 + B
120
5.1.1.2. Le facteur pH
5.1.1.2.1. La Saladire Western
Les pH initiaux des ingrdients schelonnent de 2,7 (sauce) prs de 9
(Olives) comme lindique le tableau V.4. Des variations de pH peuvent tre observes
partir du moment o les ingrdients sont mis en contact et avant mme la monte en
temprature. Ainsi, les lgumes coups en morceaux sont pralablement mlangs et
presss pour liminer le surplus deau. Cette opration montre que le pH de chaque
lgume atteint un pH dquilibre proche de 7 avant le dbut du traitement thermique.
Tableau V.4 : pH initiaux des ingrdients entrant
dans la composition de la Saladire Western
Ingrdients pH initiaux
Sauce 2,7
Thon 5,9
Mas 7,6
Carottes 6,6
Pois 6,8
Poivrons 5,2
Oignons 5,9
Olives 8,9
Cornichons 4,5
Persil 5,8
Mlange lgume 7
Aprs la mise en boite des ingrdients, un gradient de pH stablit entre le
fond de la boite (prsence de la sauce acide) et la surface. Le suivi du pH au cours du
traitement thermique indique une acidification progressive de lensemble de la boite
par la sauce. Ces volutions de pH sont suivies cinq niveaux diffrents,
correspondant des couches horizontales (figure II.2, p.52) :
- la galette de thon
- la sauce
- la couche infrieure de lgumes (proche de la sauce)
- la couche intermdiaire de lgumes
- la couche suprieure de lgumes
Ces suivis indiquent clairement que la zone la plus dfavorable la destruction
microbienne (pH le moins acide) est la couche de lgumes suprieure, zone la plus
loigne de la sauce acide. Par consquent, des mesures ont t ritres afin de suivre
lvolution du pH dans cette zone (figure V.2).
121
Figure V.2 : Evolution du pH de la couche suprieure de lgumes en fonction du temps de chauffage
(en min). A gauche, modlisation polynomiale au 3
e
degr. A droite, modlisation rduite la partie
linaire avec sa rgion de confiance 95%
La priode intressante du suivi, cest--dire lorsque la temprature atteint des
valeurs ltales (aprs 30 min de chauffage) peut tre en premire approximation
assimile une loi linaire. Nous nous limiterons donc ce modle linaire pour
exprimer lacidification de la couche suprieure de lgumes pour des temps de
traitement compris entre 30 et 98 min. Les paramtres de cette droite sont :
O t est le temps de traitement en minutes.
Mais cette volution de pH nest en fait quun suivi diffr : la valeur de
pH nest pas mesure au temps indiqu, mais aprs un cycle de refroidissement de 31
min afin que les conditions de temprature et de pression permettent la mesure.
Les mesures de pH en temps rel (comme pour la temprature) nest pas
possible techniquement. La taille dmesure des sondes supportant ces conditions de
mesure ne permet pas un suivi local. Par consquent, nous ne pouvons prendre en
compte les volutions de pH au cours de traitement. Pour les calculs de barmes de
strilisation, nous navons le choix quentre deux valeurs mesures : le pH initial de
traitement et le pH final. Nous choisissons le moins acide, qui dans notre cas, est le pH
initial (pH 6,95).
Les mesures de pH tant ralises en fin de cycle de refroidissement, le suivi
ralis correspond lvolution du pH de recouvrement en fonction du barme
appliqu.
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
0 20 40 60 80 100
temps de traitement
p
H

d
e

l
a

c
o
u
c
h
e

s
u
p
r
i
e
u
r
e
56 , 7 028 , 0 + = t pH
122
Evolution post-traitement thermique
Nous avons montr que le pH continue dvoluer aprs le traitement
thermique jusqu ce que tous les ingrdients atteignent un mme pH dquilibre
(figure V.3). Cet quilibre nest atteint quau bout de quelques semaines.
Figure V.3 : Suivi du pH au cours du stockage post traitement thermique.
Saladire Western
Compte tenu de lvolution trs lente du pH aprs le traitement thermique, le
pH de recouvrement pris en compte dans le modle correspondra au pH de fin de
strilisation.
5.1.1.2.2. La Saladire Mexicana
La prsentation gnrale de cette seconde Saladire est identique la Western.
Seule la composition de la sauce et du mlange de lgume diffre.
Contrairement la Saladire prcdente, le pH de la Mexicana squilibre trs
vite. La zone critique est constitue par la couche de lgume suprieure dont le pH
atteint rapidement 5,5 en dbut de traitement, puis reste stable. Le pH de recouvrement
sera alors indpendant du temps de strilisation. Quel que soit le barme, le pH de
recouvrement sera de 5,5. En raison du faible nombre de suivis raliss, la rgion de
confiance na pu tre dtermine. Dautres suivis devront ce titre tre raliss.
Le pH de traitement correspondra au pH dfavorable initial, soit le pH du
mlange de lgume gal 6,3.
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
5
5.1
5.2
5.3
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
temps de stockage (en jour)
p
H
thon
sauce
lgumes
123
5.1.1.3. Localisation du point dfavorable
Dans le cas des Saladires, la zone critique est la mme, aussi bien pour le pH
que pour la temprature. La Figure V.4 permet de situer la rgion tudier.
Figure V.4 : Schma dune coupe transversale dune boite Saladire format bol. Localisation en rouge du
point critique (zone o destruction bactrienne est la plus lente, selon les facteurs temprature et pH).
Un gradient de temprature et de pH stablit. Il sexplique dune part, par le
mlange gazeux de surface jouant le rle disolant thermique. Lchauffement se fait
en majorit par le fond et par les cots de la boite. Dautre part, la sauce acide se
trouvant au fond de la boite, va lentement acidifier lensemble des lgumes, de bas en
haut.
Des suivis de temprature et de pH au niveau du point critique permettront de
simuler par la suite, la destruction bactrienne laide du modle global (Equation
IV.3, p.94).
5.1.2. Validation
5.1.2.1. Construction dune feuille de calcul
Dans le but dautomatiser le calcul de dtermination de barme en tenant
compte de la temprature et du pH, une feuille de calcul est construite sur le logiciel
Excel 97. Les calculs sont bass sur lassociation des mthodes de Bigelow et de Ball
( 4.5.5.3.).
124
Cette feuille demande en paramtres dentre :
Les paramtres relatifs au suivi de temprature : f
h
, j
h
, f
c
, j
c
, T
p
, T
0
, T
c
Les paramtres relatifs au suivi de pH : pente et ordonne lorigine lorsquil
sagit dune droite (cas de la Saladire Western)
Les paramtres de thermorsistance de la souche considre : D*, z
T
, z
pH
, z
pH
Le nombre de dures de rduction dcimale vis.
Les calculs de F pendant le chauffage et pendant le refroidissement sont
dissocis lun de lautre et nots respectivement F
1
et F
2
.
Calcul de F
1
(Chauffage) :
Le calcul est rparti sur cinq colonnes :
~ 1
re
colonne : temps de strilisation
Cette colonne dbute au temps zro et est incrment en t de 30 secondes.
~ 2
e
colonne : suivi de temprature
La valeur de temprature est recalcule chaque t par application du modle
de Ball tel que :
Equation V.1
~ 3
e
colonne : suivi de pH
La valeur de pH est recalcule chaque t laide du modle de suivi
dtermin pralablement. Pour la Saladire Western, il sagit dune dcroissance
linaire du pH au cours du temps de strilisation de la 30
e
la 98
e
minute. Dans le cas
de la Saladire Mexicana, aucune variation de pH nest observe au cours de la
strilisation.
~ 4
e
colonne : Valeur de destruction biologique (VDB)
A chaque t
i
, la VDB varie avec la temprature et le pH tel que :
Equation V.2
pH
i
T
i
i i
z
pH
z
T T
pH T
L

+
=
7 *
,
10
( )
h
f
t
P h P
T T j T T

= 10 .
0
125
~ 5
e
colonne : Calcul cumul de F
1
A chaque t est recalcul le F correspondant lincrment de 30 secondes et
est cumul aux valeurs prcdentes :
Equation V.3
Calcul de F
2
(Refroidissement) :
Seul le calcul de la temprature (colonne 2) diffre du calcul de F
1
.
Lquation devient :
Equation V.4
Lorigine du temps (t = 0) correspond alors au temps de fin de palier (= dbut
du refroidissement). De mme :
Equation V.5
Principe du calcul du barme
La valeur de F (dfinie au paragraphe 4.5.5.) correspond la somme des
valeurs F
1
et F
2
. Le calcul repose donc sur la recherche du temps de chauffage du
strilisateur qui satisfera cette galit. Cette recherche est automatise sur le tableur.
On en dduit le barme B (temps de palier du strilisation) en tant le CUT de
26 min du temps de chauffage.
La feuille de calcul est reprsente p.126, fig IV.5.
5 , 0 '
1
, 1
x L F
n
i
pH T
i i
=
=
( )
c
f
t
c g c c
T T j T T

+ = 10 .
5 , 0 '
'
, 2
x L F
n
n i
pH T
i i
=
=
126
Paramtres du suivi de temprature paramtres de thermorsistance
fh 34 D* 2.3
Jh
corr
2.57 z
T
8.4
fc 70.4 z
pH
3.5
jc 1.06 z'
pH
1.6
To (C) 16.5 T* 121.1
Tp (C) 116
Tc (C) 20
Paramtres du suivi de pH paramtres de la strilisation
pente -0.028 CUT (min) 26
origine 7.56 n 5
Calcul des fonctions utiles paramtres variables divers
LpH' 4.16 pH' 5.74
F' 2.77 g 3.24
F' chauffage 2.01 Tg 112.76
F' refroidiss. 0.76
Barme 38.5 en min
test 38.5
Chauffage Refroidissement
temps T(t) pH(t) LTi,pHi F'1 temps T(t) pH(t) Lti,pHi F'2
0 -139.72 6.95 0.00 0.00 0 112.76 5.74 0.23 0.12
0.5 -131.20 6.95 0.00 0.00 0.5 112.76 5.74 0.23 0.23
1 -122.97 6.95 0.00 0.00 1 112.76 5.74 0.23 0.35
1.5 -115.01 6.95 0.00 0.00 1.5 112.76 5.74 0.23 0.47
2 -107.32 6.95 0.00 0.00 2 112.10 5.74 0.19 0.56
2.5 -99.89 6.95 0.00 0.00 2.5 110.60 5.74 0.13 0.63
3 -92.70 6.95 0.00 0.00 3 109.13 5.74 0.09 0.67
3.5 -85.75 6.95 0.00 0.00 3.5 107.69 5.74 0.06 0.70
4 -79.03 6.95 0.00 0.00 4 106.27 5.74 0.04 0.72
4.5 -72.54 6.95 0.00 0.00 4.5 104.87 5.74 0.03 0.73
5 -66.26 6.95 0.00 0.00 5 103.49 5.74 0.02 0.74

39 97.77 6.46 0.00 0.01 39 47.46 5.74 0.00 0.76
39.5 98.38 6.45 0.00 0.01 39.5 47.01 5.74 0.00 0.76
40 98.97 6.43 0.00 0.01 40 46.58 5.74 0.00 0.76

99 115.69 4.77 0.99 22.78
99.5 115.70 4.75 1.00 23.28
100 115.71 4.74 1.01 23.78
Fig V.5 : Reprsentation de la feuille de calcul permettant lestimation rapide dun barme de
strilisation en tenant compte de la temprature et du pH.
127
5.1.2.2. Application au produit Saladire
Les Saladires Western et Mexicana sont inocules uniformment par 10
5
spores par gramme dune souche sporule dont les paramtres de thermorsistance
sont connus (Matriel et Mthodes 2.3.2).
Le principe de cette validation est de dterminer dune part par le calcul, et
dautre part par lexprience, le barme de strilisation ncessaire pour rduire la
population inocule 0,5 spore survivante par boite (soit une boite sur deux non
strile).
> Dtermination du barme par le calcul
Le produit est inocul un taux de 10
5
spores par gramme, soit 2,52.10
7
spores par boite. Le nombre de rductions dcimales n raliser pour atteindre 0,5
spore survivante par boite est :
Lestimation du barme thorique est effectue partir de la feuille de calcul
Excel (p.126). Les paramtres de thermorsistance sont ceux estims par ajustement
du modle global (tableau IV.9, p.95).
Les valeurs des paramtres du modle de Ball sont les valeurs moyennes
obtenues sur plusieurs suivis (tableau V.1 et V.2, p.119). De mme, les paramtres du
suivi de pH ont t dtermins par lexprience ( 5.1.1.2.). Le calcul, bas sur les
caractristiques de la zone critique, nglige donc les gradients de temprature et de pH,
de sorte quil sous-estime en principe le taux de destruction, ce qui revient surestimer
les barmes appliquer.
> Dtermination du barme par lexprience
Les boites inocules (Matriel et Mthodes 3.2.) sont strilises selon le
cycle classique (tableau V.3, p.120). Les phases de chauffage et de refroidissement
sont identiques pour tous les cycles. Seul le temps de palier du strilisateur (Barme)
est modifi dun cycle lautre. Les boites ainsi traites sont incubes dix jours la
temprature optimale de la souche tudie afin quelles se trouvent dans les mmes
7 , 7
5 , 0
10 . 52 , 2
log log
7
0
= = =
N
N
n
128
conditions optimales de temprature que lors des tudes de thermorsistance en milieu
contrl de laboratoire.
A lissu de cette incubation, la strilit des boites est vrifie par
ensemencement sur milieu glos ( 2.3.2.3.).
Afin de mettre en vidence linfluence du pH dune manire exprimentale,
des Saladires Western sont confectionnes partir dingrdients dont le pH est
rajust 7. De mme que pour les boites au pH naturel, ces salades sont inocules
puis strilises diffrents temps de traitement afin de mettre en vidence le temps
ncessaire pour rduire linoculum 0,5 spore survivante par boite.
5.1.2.3. Rsultats
Les rsultats bruts des analyses bactriologiques (croissance ou non
croissance) aprs incubation montrent que le passage de la strilit la non strilit
nest pas franc, et stale souvent sur plusieurs minutes. Pour dterminer un temps
unique, nous avons recours la rgression logistique. La rponse est donne sous
forme binomiale (croissance = 1 ; non croissance = 0). La fonction permet de
dterminer le temps statistique o la rponse est 0,5, cest--dire le temps thorique
auquel 50% des boites sont striles. La fonction logistique se linarise de la faon
suivante (Falissard, 1998) :
Equation V.6
O t est le temps de chauffage
p est la probabilit dun rsultat positif au temps t
a et b sont deux paramtres estims
Par dveloppement mathmatique, une fonction dcrivant la probabilit p en
fonction du temps est obtenue :
Equation V.7
Les paramtres a et b sont estims par minimisation de la somme des carrs
des carts par la fonction lsqcurvefit sous Matlab.
b at
p
p
Ln + =
1
( ) b at
e
p
+
+
=
1
1
129
En exemple, la dtermination par rgression logistique du temps auquel 50%
des boites sont striles, est reprsent figure V.6 pour la souche de Bacillus
stearothermophilus A36 sur la Saladire Western.
Figure V.6 : Dtermination par rgression logistique du temps de chauffage permettant datteindre une
probabilit de 50% de boites striles. Rsultats obtenus sur Bacillus stearothermophilus A36. La taille du
point est proportionnelle au nombre de boites exprimant la rponse :
+ 6 boites
+ 3 boites
+ 1 boites
Le temps auquel la probabilit de strilit est gale 0,5 est donne par :
a
b
t =
0
1
40 50 60 70 80 90 100
temps de chauffage (min)
r
p
o
n
s
e
130
Les barmes dtermins par le calculs et par lexprience sont regroups dans
les tableaux V.5 pour les Saladires confectionne au pH naturel, et V.6 pour celles
confectionnes pH neutre. La reprsentation de la figure V.7 illustre ces rsultats.
Tableau V.5 : Saladires confectionnes au pH naturel. Les valeurs des barmes calculs et observs sont
indiques.
Souche Barme en min
Estim Observ
B. stearothermophilus ATCC 12980 32,5 36,2
B. stearothermophilus A36 27,5 43,6
B. coagulans ATCC 7050 16,5 15,9
C. sporogenes A27 14,0 12,9
C. sporogenes Pasteur 79.3 14,0 13,8
Alicyclobacillus ATCC 49025 16,0 10,0
Tableau V.6: Saladires confectionnes partir dingrdients dont le pH est ajust 7. Les valeurs des
barmes calculs et observs sont indiques. Le barme observ pour la souche de Bacillus
stearothermophilus ATCC 12980 na pas t dtermin car toutes les boites sont restes positives jusqu
84 min, temps le plus long ralis.
Souche Barme en min
Estim Observ
B. stearothermophilus ATCC 12980 69,5 > 84
B. coagulans ATCC 7050 18,0 22,3
131
Figure V.7 : Comparaison graphique de lensemble des temps de strilisation calculs et observs
Lgende
S1 S7 : Validation sur boites pH naturel
S8 S12 : Validation sur boites pH neutre
S3 : Boites ralises avec une sauce dpourvue dhuile
S1 : Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 pH naturel
S2 : Bacillus stearothermophilus A36 pH naturel
S3 : Bacillus stearothermophilus A36 pH naturel Sans huile
S4 : Bacillus coagulans ATCC 7050 pH naturel
S5 : Clostridium sporogenes A27 pH naturel
S6 : Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 pH naturel
S7 : Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025 pH naturel
S8 : Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 pH neutre
S9 : Bacillus stearothermophilus A36 pH neutre
S10 : Bacillus coagulans ATCC 7050 pH neutre
S11 : Clostridium sporogenes A27 pH neutre
S12 : Clostridium sporogenes Pasteur 79.3 pH neutre
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 .
t
e
m
p
s

d
e

c
h
a
u
f
f
a
g
e

(
m
i
n
)
0
20
40
60
80
100
120
temps de chauffage calcul (en min)
temps de chauffage observ (en min)
Coming Up Time (26 min)
132
5.1.2.3.2. Saladire Mexicana
Pour cette seconde Saladire, les estimations de barmes nont t effectues
quau pH naturel. Les rsultats sont prsents dans le tableau V.7 et illustrs figure
V.8.
Tableau V.7 : Saladires ralises au pH naturel. Les valeurs des barmes calculs et observs sont
indiques.
Souche Barme en min
Estim Observ
B. stearothermophilus ATCC 12980 18 49,6
B. stearothermophilus A36 12 18,3
Alicyclobacillus ATCC 49025 14 13,7
Figure V.8 : Comparaison graphique des barmes des temps de strilisation calculs et observs
Lgende
S1 : Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 pH naturel
S2 : Bacillus stearothermophilus A36 pH naturel
S3 : Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025 pH naturel
S1 S2 S3
t
e
m
p
s

d
e

c
h
a
u
f
f
a
g
e

(
m
i
n
)
0
20
40
60
80
100
Temps de chauffage calcul (min)
temps de chauffage observ
Coming Up Time (26 min)
133
5.1.3. Dtermination des barmes pour les 2 Saladires
On peut classer les calculs de traitements thermiques en deux catgories :
- les calculs standards, au domaine dapplication trs large, dont le principal dfaut
est de conduire des barmes trop svres.
- les calculs personnaliss, adapts un produit et une cible bactrienne.
5.1.3.1. Les calculs standards
Ces calculs sont fonds sur un systme de rfrences standards (temprature
de rfrence T* de 121,1C, 12 rductions dcimales) visant dtruire une souche de
Clostridium botulinum idale aux caractristiques de thermorsistance standards
(courbe de survie linaire, valeur de z
T
de 10C). La dure de rduction dcimale
standard gnralement adopte pour ces calculs avoisine 0,2 min. On en dduit alors
une valeur strilisatrice minimale atteindre, assurant un niveau de scurit,
indpendamment de la contamination prsente avant strilisation :
Ces calculs prconisent donc une valeur strilisatrice minimale de 2,4 min
indpendamment de la nature du produit et de sa contamination. Il est ensuite possible
den dduire le barme en se rfrant aux suivis de temprature du produit tel que :
Ces calculs sont aujourdhui les plus utiliss, et leur efficacit a t maintes
fois vrifie. Cependant, ils conduisent gnralement des barmes draconiens. Le fait
quaucun autre facteur que la temprature ne soit aujourdhui intgr dans ces calculs
standards accentue la svrit des traitements en milieux acides ou dont la
w
est
rduite.
Comme la valeur de z
T
a conventionnellement t fixe 10C, pourquoi les
valeurs de z
pH
et z
pH
ne seraient-elles pas leur tour standardises ? Certaines tudes
portant sur leffet du pH de traitement chez Clostridium botulinum pourraient
permettre de fixer la valeur de z
pH
, souvent de lordre de 3,5 (tableau V.8)
min 4 , 2 2 , 0 12 .
1 , 121
= = = D n F
dt dt L F
f f
T
t
t
t
t
z
T T
T
. 10 .
0 0
*

= =
134
Tableau V.8 : Valeur de z
pH
estimes par Mafart et Legurinel (1998) partir de donnes exprimentales
de Xezones et Hutchings (1965) collectes sur Clostridium botulinum.
Temprature (C) Spaghetti Macaroni Riz
110 3,48 3,43 3,44
112,8 3,52 3,45 3,46
115,6 3,74 3,61 3,56
118,3 3,72 3,70 3,62
La bibliographie concernant leffet du pH de recouvrement chez Clostridium
botulinum est inexistante. Aujourdhui, les travaux disponibles ne permettent pas
dterminer la valeur de z
pH
de cette espce bactrienne.
5.1.3.2. Les calculs personnaliss
Ces calculs sont bass sur la destruction dune (ou plusieurs) cible bactrienne
dpendant du contexte de fabrication tudi. Ils sont mieux adapts, mais demandent
un certain nombre de renseignements parfois difficiles collecter.
O Choix des souches cibles
Dans lindustrie de la conserve, deux souches cibles sont gnralement prise
en compte :
- Une souche non pathogne (Bacillus stearothermophilus) trs
thermorsistante, mais ne prsentant aucun risque pour la sant publique.
Un nombre de rduction dcimale relativement faible peut alors tre
adopt, choisi par lindustriel en fonction du taux de contamination de la
matire premire.
- Une souche pathogne (Clostridium botulinum) moins thermorsistante
que la prcdente mais dont la toxine justifie un nombre lev de
rductions dcimales.
135
> Bacillus stearothermophilus
Dans ce manuscrit, seulement deux souches de Bacillus stearothermophilus
ont t tudies. Ces souches prsentent des valeurs de D* de 0,49 et 1,01 min. Or
dans la littrature, lordre de grandeur gnralement attribu est de 3 min 121,1C et
pH 7 (Feeherry et al., 1986 ; Fernandez et al., 1994 ; Lopez et al., 1996, 1997). Par
consquent, nous adoptons une valeur de D* de 3 min pour estimer le barme de la
souche non pathogne.
Pour les valeurs de z
T
, z
pH
et z
pH
, notre choix soriente vers les paramtres de
notre souche de Bacillus stearothermophilus A36, qui fait partie des souches les plus
rsistantes isoles par Saupiquet. Cette souche semble donc convenir pour un calcul
personnalis de traitement thermique.
En accord avec lentreprise, et compte tenu des taux de contaminations des
ingrdients entrant dans la composition des Saladires, cinq rductions dcimales
seront vises.
> Clostridium botulinum
Nayant pu tudier cette espce, nous nous rfrons intgralement aux sources
bibliographiques disponibles pour valuer sa valeur de D*. On donne gnralement
0,21 min (Mafart, 1996). Mais Casolari (1994) tudie un certain nombre de souches et
montre ainsi que le D* de Clostridium botulinum varie de 0,13 0,8 selon les
publications. Nous opterons pour la valeur la plus dfavorable de 0,8 pour lestimation
du barme de la souche pathogne.
Comme pour B. stearothermophilus, nous estimerons le barme des Saladires
Western et Mexicana partir des paramtres z dune souche unique. Mais notre tude
ne nous fournit aucune valeur de paramtre pour Clostridium botulinum. Parmi les
souches dont nous disposons, Clostridium sporogenes sen rapproche le plus dun
point de vue taxonomique. Par consquent, dfaut de valeurs propres Clostridium
botulinum, nous choisissons dutiliser des paramtres z de la souche de Clostridium
sporogenes A27 pour valuer le barme minimal appliquer pour rduire une
population de Clostridium botulinum de 12 rductions dcimales (x 10
-12
).
136
O Tableau de synthse des valeurs des paramtres des souches cibles
Le tableau V.9 rsume lensemble des paramtres de thermorsistance
proposs prcdemment. Il est ici important de rappeler que les paramtres choisis
sont ceux dtermins sur une souche de C. sporogenes dfaut de valeurs propre C.
botulinum. Le calcul ne sera donc ralis qu titre indicatif.
Tableau V.9: Valeurs des paramtres utiliss pour dterminer le nouveau
barme de strilisation des Saladires Western et Mexicana. Les non pathogne et
pathogne choisis sont respectivement Bacillus stearothermophilus et Clostridium
botulinum.
paramtres Non pathogne pathogne
D* 3 0,8
z
T
8,77 6,17
z
pH
4,08 1,59
z
pH
1,05 0,95
n 5 12
5.1.3.3. Paramtres propres au process
Quatre paramtres sont permettent de caractriser le cycle de lautoclave :
T
0
: temprature du produit lentre du strilisateur. Le cahier des charges
impose une temprature comprise entre 0 et 5C. La valeur de 0C (plus dfavorable)
sera prfre pour les calculs.
T
P
: temprature de palier du strilisateur fixe 116C.
T
C
: temprature du circuit deau de refroidissement du strilisateur en fin
de palier de strilisation. La temprature de 25C est adopte.
CUT : Coming Up Time. Il sagit du temps entre le dbut de la phase de
chauffage et le dbut du palier de strilisation. Ce temps est impos par le process de
strilisation (tableau V.3, p.120). Le CUT est de 26 min.
137
5.1.3.4. proposition des barmes
Pour chacune des deux Saladires, trois barmes sont proposs :
- Le barme standard B* : il sagit dun barme estim par la mthode
traditionnelle , cest--dire sans prise en compte du pH. Il nest bas que sur les
paramtres standards de Clostridium botulinum, cest--dire une dure de rduction
dcimale de 0,2 min et une valeur de z
T
de 10C. La valeur de destruction biologique
nest dfinie que par L
T
.
- Le barme personnalis B
1
, sans prise en compte du pH. Les valeurs de
D* et z
T
sont des valeurs personnalises indiques dans le tableau V.9
2
: ce barme est estim partir des valeurs des
paramtres de thermorsistance figurant dans le tableau V.9 et des suivis moyens de
temprature et de pH.
3
: ce barme est estim partir des bornes
dfavorables des intervalles de confiance des suivis de temprature et de pH
(Rappelons que la rgion de confiance du suivi de pH de la Mexicana na pas t
dtermine en raison dune trop faible quantit de donnes exprimentales).
Les estimations de ces barmes sont indiques dans le tableau V.10.
Tableau V.10 : temps en minute des quatre barmes dfinis ci-dessus pour deux Saladires.
Barme Saladire Western Saladire Mexicana
Non pathogne Pathogne Non pathogne Pathogne
B* --- 39,5 --- 39,5
B
1
97,5 110,0 97,5 110,0
B
2
34,0 34,5 19,0 19,0
B
3
44,0 44,6 27,5 27,5
En production industrielle, les Saladires sont aujourdhui soumises un
barme de 72 min. Daprs les rsultats du tableau V.10, on saperoit que ce barme
est trs svre. Dune part, le barme standard souvent qualifi de trs scuritaire, et
dautre part les barmes personnaliss B
2
et B
3
prenant en compte le pH sont
largement couvert puisquils ne dpassent pas 45 min.
138
5.1.4. Simulations par la mthode de Monte Carlo
Le calcul dun barme de strilisation ncessite lemploi de plusieurs
paramtres pralablement estims par lexprience. Il y a les paramtres relatifs aux
cintiques de temprature (paramtres du modle de Ball), ceux relatifs aux cintiques
de pH au cours de la strilisation, auxquels sajoutent les paramtres de
thermorsistance dune souche bactrienne choisie en rfrence (D*, z
T
, z
pH
et z
pH
).
Pour chaque paramtre, une valeur moyenne est estime, ainsi quun intervalle
de confiance 95%.
Or, il est bien vident que le calcul du barme, lorsquil intgre les valeurs
moyennes de chacun des paramtres dentre, ne conduit qu une valeur moyenne du
barme de strilisation recherch sans aucune indication concernant lintervalle de
confiance.
5.1.4.1. Principe de la mthode de Monte Carlo
Il sagit dune mthode de simulation numrique, cest--dire une mthode
utilisant des tirages alatoires des paramtres selon leur loi de distribution. Le
traitement informatique permet de ritrer le calcul un grand nombre de fois et
destimer la rpartition statistique de la rponse.
Dans notre cas, cette mthode permet de dterminer la rpartition du taux de
rduction dcimale obtenue pour un barme de strilisation donn, et dapprcier le
risque qui en dcoule.
Calcul du taux de rduction dcimal
Par dfinition :
Equation V.8
Par consquent :
Equation V.9
O F est la valeur strilisatrice corrige par les fonction
pH
et
pH
qui sont
respectivement les valeurs de destruction biologiques relative au pH de traitement et
au pH de recouvrement. Les paramtres n et D* sont respectivement le taux de
'
*
. '. .
pH pH
F D n F = =
*
'
. '.
D
F
n
pH pH

=
139
rduction dcimal et la dure de rduction dcimale dans les conditions standards de
temprature et de pH.
Les paramtres intervenant dans lquation V.9 sont au nombre de quinze :
- les paramtres de thermorsistance D
*
, z
T
, z
pH
et z
pH
estime sur la souche
bactrienne choisie en rfrence pour le calcul
- les paramtres du suivi de temprature issus du modle de Ball (f
h
, j
h
, f
c
, j
c
,
T
0
, T
C
, T
P
et CUT)
- les paramtres de cintique de pH au cours de la strilisation (Suivi linaire
dfini par deux paramtres a et b dans le cas de la Saladire Western)
- Le barme B pour lequel on souhaite connatre la rpartition du taux de
rduction dcimale
5.1.4.2. Estimation de la valeur des paramtres et de leur
loi de rpartition
La valeur et la rpartition de chaque paramtres sont dtermines par
lexprience. Toutefois, toutes ne sont pas estimes suivant la mme mthode. Nous
pouvons alors les classer selon quatre groupes.
- Groupe 0 : Les paramtres estims du modle de Ball (f
h
, j
h
, f
c
et j
c
)
Un seul suivi de temprature permet thoriquement destimer la valeur de chacun de
ces quatre paramtres. Cependant, plusieurs mesures doivent tre ralises pour
estimer un intervalle de confiance. Le tableau V.1. p.117, regroupe lensemble des
valeurs des paramtres estimes sur la Saladire Western.
La normalit est vrifie pour chaque chantillon de valeurs par le test de
Shapiro-Wilk. Le tableau V.11 indique les coefficients de corrlation entre
chacun des paramtres. Ces rsultats montrent que nous ne pouvons pas conclure
lindpendance des paramtres.
Tableau V.11 : Coefficient de corrlation entre chaque paramtre
f
h
j
h
corr f
c
j
h
corr 0,629
f
c
0,417 -0,032
j
c
0,279 0,015 0,115
Par consquent, le tirage alatoire des paramtres va sinspirer de lACP (Analyse en
Composantes Principales). La mthode consiste reproduire une matrice alatoire de
chaque paramtre selon une loi normale (N
,
) en conservant la mme structure de
corrlation que le jeu de donnes initial (Matriel et mthodes, p. 49 2.2.3.)
140
- Groupe O : Les paramtres du suivi de pH de recouvrement en fonction du
barme
Le pH de recouvrement volue de faon linaire en fonction du barme, de pente a et
dordonne lorigine b. On suppose que la rpartition des valeurs de pH de part et
dautre de cette droite suit une loi normale.
Figure V.9 : Evolution du pH de recouvrement en fonction du temps de strilisation
a = -0,028 (pente) ; b= 7,56 (ordonne lorigine)
Par consquent, pour un barme B donn, lesprance est dfinie par lquation de
droite :
Equation V.10
Lcart type sigma varie galement en fonction du barme et est calcul par :
Equation V.11
O S
rsid
est la racine carr de la variance rsiduelle de la rgression linaire
n est le nombre de mesures exprimentales
x est le temps de strilisation
- Groupe O : Les paramtres de thermorsistance (D*, z
T
, z
pH
et z
pH
)
Il sagit des paramtres du modle global prenant en compte les effets de la
temprature et du pH sur la thermorsistance. Le modle est ajust par minimisation de
b B a pH + = .
4.5
5
5.5
6
6.5
7
30 40 50 60 70 80 90 100
Barme + CUT (en min)
p
H

d
e

r
e
c
o
u
v
r
e
m
e
n
t
( )
( )
+ + =
k
i
i
resid x
x x
x x
n
S
1
2
2
0
1
1
141
la somme des carrs des carts. Les intervalles de confiance sont estims par la
mthode de Lobry et al. (1991). Cette mthode permet de dfinir dans lespace des
paramtres la rgion de confiance des paramtres du modle par tirage alatoire de
50000 points. Ces points, par projection sur les plans de chaque couple de paramtre,
renseigne sur la corrlation structurelle du modle (figure V.10). Les projections de
formes arrondies tmoignent de lindpendance entre les paramtres. Le tirage des
50000 points permet galement de dterminer la rpartition sur laxe dun paramtre
(figure V.11).
Figure V.10 : projection des rgions de confiance du modle global ajust sur la souche de Bacillus
stearothermophilus industrielle
Figure V.11 : densit de rpartition des paramtres z du modle global.
142
La figure V.11 permet destimer visuellement la normalit de la rpartition de la valeur
du paramtre dans son intervalle de confiance. Le test de Kolmogorov-Smirnov permet
de confirmer de faon statistique cette normalit au niveau de confiance 95%.
Les formes arrondies des projections de confiance tmoignent dune absence de
corrlation entre les paramtres (indpendance). Seule la corrlation entre D* et z
T
est
observe. Mais cette corrlation reste sans consquence, car le paramtre D* est fix
3 min.
- Groupe O : Les paramtres divers : T
0
, T
C
, T
P
, CUT
Certains paramtres sont fixs par le cahier des charges. La temprature de palier
est maintenue 116C et le CUT est impos 26 minutes.
Les paramtres T
0
et T
C
ne sont pas controls. Le cahier des charges impose une
temprature initiale T
0
comprise entre 0 et 5C, tandis que la temprature de leau de
refroidissement du pilote nest pas controle. Par consquent, nous choisissons de tirer
alatoirement les valeurs de T
0
et T
C
selon deux lois uniformes dont les bornes sont
respectivement comprises entre 0 et 5C, et 20 et 30C.
5.1.4.3. Programmation informatique du calcul
Les simulations de Monte Carlo reposent sur la rptition dun mme calcul mettant en
jeu des valeurs de paramtres tires alatoirement selon leurs lois. Plus le nombre de
rptition est important, et plus le rsultats est fiable. Nous choisissons de raliser ainsi
100 000 fois le calcul du taux de rduction dcimale afin dobtenir une rpartition
prcise.
La premire tape consiste tirer alatoirement 100 000 valeurs de chaque paramtres
selon leur distribution. Le tirage et ralis par Matlab (fonction random). On obtient
alors une matrice de p paramtres (colonnes) sur 100 000 valeurs (lignes).
La seconde tape correspond au calcul de la valeur du taux de rduction n pour chaque
ligne de la matrice selon lquation V.9. Les 100 000 valeurs de n sont alors prsentes
sous la forme dun histogramme.
143
5.1.4.4. Rsultats
La mthode de calcul prsente paragraphe 5.1.3. conduit lestimation de
deux barme personnaliss B
2
et B
3
.
Ces deux barmes ne prennent pas en compte la rpartition des paramtres, et
ne renseignent nullement sur la rpartition du taux de rduction dcimale. Les
simulations par la mthode de Monte Carlo permettent destimer cette rpartition.
Les rsultats de la simulation effectue pour ces deux barmes est prsente figure
V.12
A B
Figure V.12 : rpartition du taux de rduction dcimale pour un barme B2 de 34 min ( gauche) et un
barme B3 de 44 minutes ( gauche). Simulations effectues sur la Saladire Western, souche non
pathogne, pour 100 000 tirages.
Le barme B
2
, calcul partir des valeurs moyennes des paramtres, visait cinq
rductions dcimales. On saperoit sur le profil A de la figure V.13, que ces cinq
rductions dcimales ne sont quune moyenne En effet, lintgration de la distribution
indique que prs de la moiti de la surface (48%) se trouve des valeurs infrieures
5 rductions dcimales. Ces rsultats indiquent galement quun tel barme ne peut
tre satisfaisant, car prs de 1 % des tirages conduisent un n infrieur une rduction
dcimale.
Le barme B
3
prsente un profil plus raisonnable, car seulement 0,16 % de la surface
reste infrieure aux cinq rductions dcimales recherches.
A partir de ces donnes, une proposition dun nouveau barme peut tre effectue.
Selon la mthode de calcul du barme B
2
, le nombre de rduction dcimale demand
nest atteint que dans 50% des cas, ce qui paratre insuffisant. Nous proposons que ce
taux de rduction dcimal doit tre atteint dans 95% des cas. Le nouveau barme
144
satisfaisant cet objectif est de 39,5 min (figure V.13). Les surfaces cumules sont
prsentes dans le tableau V.12.
Figure V.13 : distribution du taux de rduction dcimale pour un
barme de 39,5 min. Simulations effectues sur la Saladire Western,
souche non pathogne, pour 100 000 tirages.
Tableau V.12 : valeur de lintgration de la distribution de la figure V.13
Infrieur Surface (%)
1 n 0,00
2 n 0,12
3 n 0,78
4 n 2,31
5 n 4,60
7 n 11,07
10 n 22,79
145
5.2. Discussion
5.2.1. Caractrisation du produit
Localisation du point critique
Des suivis de temprature et de pH diffrents niveaux de la boite permettent
aisment de localiser dune part le point froid, et dautre part la zone o le pH est le
moins acide. Ces deux points sont couramment qualifis de critiques, car ils
reprsentent les zones o les chances de survies des micro-organismes sont
statistiquement les plus fortes.
De ces deux points critiques, il nest a priori pas possible de distinguer lequel
des deux est le plus dfavorable, car cela ne dpend plus seulement des
caractristiques physico-chimiques du produit (temprature et pH), mais galement de
la thermorsistance de la souche cible que lon choisira en rfrence pour lestimation
des barmes. Par exemple, une souche dont la thermorsistance est fortement
influence par le pH (z
pH
et z
pH
faible) sera plus rsistante au niveau du point critique
propre au pH, et inversement si la souche est sensible la temprature.
Par consquent, les deux points critiques doivent tre tudis en parallle
jusqu la dtermination finale du barme au niveau de chacun. Les suivis de pH et de
temprature doivent alors tre raliss aux deux endroits.
Le cas des Saladires est particulier dans le sens o un point unique est la
fois critique vis vis de la temprature et du pH.
Suivi du pH au cours du traitement
Le suivi du pH au cours de la strilisation ne peut tre effectu en temps rel,
comme lest celui de la temprature, par un systme de sondes embarques. Les
mesures ne sont effectues quaprs un temps de refroidissement du strilisateur
pendant lequel le pH continu probablement dvoluer.
La cintique pH = f (barme) qui en rsulte ne correspond donc pas au suivi
du pH de traitement au cours de la strilisation, mais au suivi du pH de recouvrement.
Les seules mesures disponibles sur le pH de traitement sont la valeur initiale
(avant strilisation) et la valeur finale (aprs strilisation). Ne connaissant pas son
volution entre ces deux mesures, nous choisirons pour les calculs la valeur la plus
dfavorable des deux, qui dans le cas de la Saladire, est la valeur initiale.
146
Le pH de recouvrement
En fin de strilisation, le pH de la boite nest pas encore homogne.
Lquilibre global ne sera atteint quau bout de quelques semaines cause dun fort
effet tampon des protines du thon (figure V.13). Ces variations post-traitement sont
trop lentes pour tre prises en compte dans lestimation du pH de recouvrement. En
effet, les ventuels survivants aux traitements thermiques auront le temps de se
dvelopper avant que le pH ait atteint son quilibre final. Par consquent, le pH de
recouvrement utilis pour les calculs est le pH mesur en fin de strilisation.
5.2.2. Validation et optimisation des barmes
Les valeurs observes restent globalement proches des valeurs prdites. Nous
notons cependant que les carts constats sont dans la majorit des cas orients dans le
mme sens : les valeurs prdites sont sensiblement infrieures aux valeurs observes.
Interprtation des carts entre barmes prdits et barmes observs
Il est souvent admis que les principaux facteurs influenant la thermo-
rsistance microbienne, hormis la temprature, sont le pH et lactivit de leau.
Viennent ensuite une multitude de facteurs dont les effets peuvent tre plus ou moins
marqus selon lespce ou la souche de micro-organisme. Parmi ces facteurs sont
souvent cits lhuile (Ababouch et al., 1987 et 1995), la nature de lacide (Legurinel
et Mafart, 2001), lamidon (Olsen et Scott, 1946). On ne stonne donc pas de voir ces
diffrences entre les barmes prdits et observs sur des produits tels que les
Saladires Western et Mexicana.
Une rcente tude mene dans le cadre dun contrat ACTIA (non publie) met
en vidence ces effets de la matrice. La dure de rduction dcimale de Bacillus cereus
inocul dans diverses confitures savre deux fois suprieure celle prvue par les
modles dont les paramtres avaient t estims en milieu liquide. Dans le cas des
compotes, ce rapport atteint presque quatre. En revanche, les prvisions de dure de
rduction dcimales restent proches des valeurs observes pour des produits plus
acides tels que le ketchup, le coulis de tomate ou la sauce hollandaise. Les modles
font donc preuve dune bonne valeur prdictive, une constante multiplicative prs
qui semble caractristique de la famille de produits. En dautres termes, leffet de la
matrice jouerait plutt sur la valeur du D*, sans influencer les valeurs de z.
147
En toute rigueur, nous devrions alors noter :
Equation V.12
Cette valeur de doit tre un rsidu faible et alatoire si seuls les facteurs
temprature et pH interviennent sur la thermorsistance. Dans le cas dun produit
complexe tel que la Saladire, beaucoup dautres facteurs que lon peut qualifier de
secondaires de par leur influence dmontre plus faible que le pH ou la temprature,
vont galement intervenir. Le modle global peut alors tre corrig en :
Equation V.13
Pour appuyer ces remarques, des Saladires Western ont t confectionnes
avec un sauce sans huile. Nous avons ainsi montr pour la souche de Bacillus
stearothermophilus A36, que la prsence dhuile dans la sauce va augmenter la
thermorsistance des spores. Le temps observ pour atteindre la strilit est infrieur
lorsque la sauce utilise est dpourvue des 18% dhuile composant la recette normale
(tableau V.13). La valeur du barme observe se rapproche alors considrablement de
la valeur prdite.
Tableau V.13 : Barmes estims et observs sur la souche de Bacillus stearothermophilus A36, en prsence
et en absence dhuile.
Souche Barme en min
Estim Observ avec huile Observ sans huile
B. stearothermophilus A36 27,5 43,6 28,5
En dpit des effets de tous ces facteurs non contrls ou non pris en compte
crant un bruit de fond, le signal que constitue le pH merge de faon significative.
Les rapports de barmes et de valeurs strilisatrices prsents dans les tableaux V.14 et
V.15 entre les Saladires effectues au pH naturel (acide) et celles effectues un pH
neutre, mettent en vidence leffet marquant du pH. Pour les souches les plus thermo-
rsistantes (Bacillus stearothermophilus), le barme est divis par deux par le seul
effet du pH. En terme de valeur strilisatrice, le rapport atteint la valeur de six.
De plus, le fait que les rapports soient plus importants sur les valeurs
observes que sur celles estimes montre que le modle ne demande pas de rduction
=
estim observ
D D

=
2
. . . .
.
'
'* ' * *
* log log
4 43 4 42 1 43 42 1
3 2 1
nt recouvreme pH effet
pH
traitement pH effet
pH
e tempratur effet
T
z
pH pH
z
pH pH
z
T T
D D
148
draconienne des valeurs strilisatrices, mais modre par rapport celles suggres par
les rsultats exprimentaux. Autrement dit, la rduction de valeur strilisatrice calcule
est largement valide par lexprience directe.
Tableau V.14 : rapport entre les barmes pH naturel / pH neutre. Saladire Western.
souches estims observs
B. stearothermophilus ATCC 12980 0,46 < 0,43
B. coagulans 0,92 0,71
Tableau V.15 : rapport entre les valeurs strilisatrices F pH naturel / F pH neutre. Saladire Western.
souches estims observs
B. stearothermophilus ATCC 12980 0,15 < 0,14
B. coagulans 0,75 0,29
Optimisation des barmes des Saladires Western et Mexicana
Leffet considrable du pH se retrouve au niveau des quatre barmes prsents
dans le tableau V.10. Lcart entre dune part le barme B
1
ne prenant en compte que
le facteur temprature, et dautre part les barmes B
2
et B
3
intgrant le facteur pH,
confirme le rle primordial de ce dernier dans lestimation dun barme.
Le barme B
1
diffre du barme standard B* par le niveau de scurit, ce qui
explique la diffrence observe alors que tous les deux ne sont bass que sur le facteur
temprature. En effet, la valeur de D* choisie pour la souche pathogne
personnalise est de 0,8 min, nettement suprieure au 0,2 min que lon rencontre en
standard, et un z
T
trs faible. Ces barmes personnaliss se placent donc dans des
conditions particulirement dfavorables du point de vue des paramtres de thermo-
rsistance, prsentant alors un niveau de scurit lev.
En rsum, un nouveau protocole suivre pour la dtermination des barmes
en prenant en compte les facteurs temprature et pH peut tre propos (p. 140).
149
PROTOCOLE POUR LA DETERMINATION DU BAREME DUN NOUVEAU PRODUIT
A. Caractrisation du produit
A.a. Recherche des points critiques en temprature (point froid) et en pH (point
le moins acide). Une mme zone de la boite peut constituer le point critique pour les
deux facteurs (cas des Saladires).
A.b. Suivi des facteurs temprature et pH aux points critiques
A.c. Estimation des paramtres cintiques
- paramtres du modle de Ball pour le suivi de temprature (f
h
, j
h
, f
c
, j
c
)
- modlisation linaire ou polynomiale du suivi de pH
B. Souches utilises en rfrence pour la simulation
B.a. Choix des souches
Les souches sont choisies selon le contexte du produit traiter (nature des
contaminations des ingrdients). Ces souches peuvent tre choisies avec laide de la
littrature. Il peut galement sagir de souches isoles par lentreprise, remarques par
une thermorsistance ayant provoqu des accidents de strilisation.
Gnralement en conserverie, la simulation est effectue partir de deux souches
prises en rfrence. Ce choix peut varier en fonction du type daliment considr :
- Une souche non pathogne (B. stearothermophilus) sur laquelle le nombre
de rductions dcimales effectu reste faible.
- Une souche pathogne (C. botulinum) pour laquelle on recommande
conventionnellement 12 rductions dcimales.
B.b. Estimation des paramtres de thermorsistance
Les paramtres D*, z
T
, z
pH
et z
pH
sont estims par lexprience ou tirs de la
littrature.
C. Dtermination du barme
C.a. Collecte des paramtres caractristiques du process (Temprature de palier
du strilisateur, temprature initiale du produit, temprature de leau de
refroidissement, CUT)
C.b. Calcul du (des) barme(s)
Plusieurs barmes peuvent tre dtermins.
- un barme standard
- un ou plusieurs barmes personnaliss
Chacun de ces barmes est dtermin pour chaque point critique et pour
chacune des souches de rfrence. Le plus lev est bien videmment retenu.
150
Simulations et volutions du process
Les perspectives dvolution des produits de type Saladire passent par une
amlioration des qualits organoleptiques du produit, incontestablement altres par le
traitement thermique. Bien que revus la baisse (tableau V.10), les barmes de
strilisation peuvent encore tre rduits.
Les pistes travailler pour tendre vers une rduction des temps de chauffage
doivent sorienter vers les cintiques de temprature et de pH. Les cintiques de pH
dun produit tel que la Saladire Western restent lentes. Ce produit atteignant un pH
proche de 4,5 lquilibre voit ce potentiel inexploit, puisque le pH le plus lev dans
la boite aprs 72 mn est encore de 5,2.
Ces lents quilibres de pH sont favoriss par une strilisation en statique. Les
strilisations en autoclaves rotatifs, ou semi rotatifs (pendulaires), savrent intressant
dans les sens o les quilibres de pH sont incontestablement acclrs par dispersion
de la sauce acide dans toutes les zones de la boite. De plus, on observe une monte en
temprature beaucoup plus rapide.
Pour rpondre concrtement un tel problme, la microbiologie prvisionnelle
intervient comme un outil permettant de mesurer rapidement limpact de ce
changement de process, et den justifier lintrt.
Dans cette optique, des suivis de temprature et de pH ont t raliss au cours
dune strilisation de boite Saladire Western en pendulaire. Les paramtres du suivi
de temprature sont indiqus dans le tableau V.16 :
Tableau V.16 : Valeur des paramtres de Ball estims sur les suivis de temprature effectus au cours de
cycles de strilisation en pendulaire (12 rptitions ont t effectues).
f
h
j
h
corrig f
c
j
c
Moyenne 13,18 3,87 34,81 1,25
Ecart type 0,84 0,95 1,88 0,068
Indice Conf 95% 11,54 14,83 2,02 5,73 31,12 38,50 1,12 1,38
La diffusion de chaleur vers le point froid de la boite est largement favorise.
La faible valeur de f
h
, bien que compense en partie par un j
h
lev, traduit le gain
dintrt sur la cintique de temprature.
Quant au suivi de pH, lensemble des lgumes atteint rapidement le pH de la
sauce. La zone o le pH reste le plus lev devient la galette de thon, pour laquelle le
pH varie lentement en raison du fort effet tampon des protines.
151
Figure V.14 : Suivi du pH du thon au cours dune strilisation en
pendulaire. Les rgions 95% de confiance sont indiques en pointills.
A partir de lensemble de ces donnes, nous pouvons estimer les quatre
barmes dfinis prcdemment. Les paramtres de thermorsistance sont indiqus
(tableau V.9).
La valeur de pH prise en compte au cours du traitement est le pH du thon au
dbut de la strilisation (pH 6). Les barmes estims sont prsents dans le tableau
V.17.
Tableau V.17 : temps en minute des trois barmes dfinis
prcdemment pour la Saladire Western strilise en pendulaire.
Saladire Western
Non pathogne pathogne
B* --- 22,0
B
1
72,5 82,0
B
2
9,5 9,0
B
3
17,0 16,0
Plusieurs avantages peuvent tre tirs de ces modifications de process. Le
premier concerne les qualits organoleptiques du produit strilis. En strilisateur
statique, les flux de temprature au sein de la boite sont lents, crant un gradient de
5
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
40 50 60 70 80
temps de chauffage
p
H

d
u

t
h
o
n
152
temprature important entre le point froid et le bord de la boite. Ceci engendre une
diffrence de cuisson des ingrdients en fonction de leur localisation dans la boite, et
une surcuisson du pourtour de la boite, avec une incidence sur le got, laspect, la
texture, les couleurs La strilisation en autoclave semi rotatif augmente les flux de
chaleur, rduisant les diffrences de temprature et les inconvnients quelles
entranent.
Le second intrt concerne les quilibres de pH. La sauce va rapidement
acidifier lensemble du contenu de la boite. Cette homognisation supprime les points
locaux au pH lev o la thermorsistance reste forte.
Le troisime intrt porte sur le temps de strilisation. Une rduction du temps
doccupation du strilisateur diminue le cot de production global.
Enfin, le dernier intrt concerne la temprature de palier. Plus cette
temprature est leve, et plus la vitesse de destruction thermique augmente par
rapport la vitesse de destruction des molcules telles que les colorants, les vitamines
(ex : z
T
de la vitamine B1 = 25C, daprs Mafart, 1996). Linconvnient des
tempratures de palier leve est le gradient de temprature plus important au sein de
la boite, accentuant la surcuisson priphrique. Mais compte tenu de la diminution des
paramtres f
h
et j
h
lors dune strilisation en semi rotatif, une augmentation de la
temprature de palier de quelques degrs devrait tre envisage.
Limpact sur la thermorsistance de toutes ces modifications de process
peuvent, laide des modles et mthodes de calculs prsents dans ce manuscrit,
mesurer et valuer lintrt pour lentreprise.
153
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
La fin du XX
e
sicle aura boulevers le monde du traitement thermique en
gnral, notamment par les volutions de la microbiologie prvisionnelle, dsormais
rsolument multifactorielle. Depuis les dcouvertes de Nicolas Appert, puis les travaux
de Ball, en passant par lpoque Bigelow o seul le facteur temprature tait
considr lors dun traitement thermique, les modles ont volus vers le multifactoriel
dans le domaine de la croissance, mais un retard important a t pris dans le domaine
de la destruction.
Dans la premire partie de cette tude, les effets du pH du milieu de traitement
et du milieu de recouvrement ont t abords comme deux facteurs indpendants
exerant un effet sur la thermorsistance microbienne. Un nouveau modle modulaire
multifactoriel ajoutant ces deux facteurs la temprature a pu tre propos.
Caractrisant les effets de trois facteurs environnementaux sur la dure de rduction
dcimale D, il nest construit qu partir de quatre paramtres, faisant de lui un modle
parcimonieux et robuste.
Dans une seconde partie, ce modle nous a permis de dvelopper les calculs
destimations de traitements thermiques appliquer pour obtenir un taux de
destruction microbien prdfini. Les mthodes de calculs bauches par Bigelow, puis
par Ball lpoque o la microbiologie prvisionnelle en tait encore lre
monofactorielle, ont pu tre tendues au multifactoriel par la prise en compte du pH.
Ces nouvelles mthodes permettant lestimation de barmes ont t valides sur un
produit complexe de par sa composition et ses volutions de pH au cours de la
strilisation.
154
Les enjeux de la modlisation
Les habitudes alimentaires de ce dbut de sicle voluent rapidement, avec un
consommateur prfrant souvent des produits dures limites de consommation
rduites, au dtriment de la conserve. La concurrence des produits frais, mais aussi du
surgel, sur un march longtemps monopolis par lappertis se fait de plus en plus
forte.
Aujourdhui, lindustrie de la conserve ne peut plus se permettre de
matraquer ses produits par des traitements thermiques trop svres, entranant une
dgradation des qualits nutritives et organoleptiques des aliments, et ternissant du
mme coup son image. Cette industrie doit se tourner vers de nouveaux outils afin de
rester comptitive face la concurrence. Deux pistes peuvent tre envisages :
La premire est reprsente par les technologies dites douces, telles que le
champs puls, les traitements ionisants ou les hautes pressions. Venant en substitution
des traitements thermiques, ces procds liminent tout ou partie des micro-
organismes sans trop altrer le produit alimentaire vis, prservant ainsi son tat frais.
Malheureusement, les inconvnients de ces procds sont dune part un cot de
production plus lev, et dautre part une rglementation souvent plus contraignante
que les traitements thermiques. Par exemple, les traitements ionisants sont limits
des doses infrieures 10 kGy, trop faible pour liminer les formes sporules.
La seconde piste repose sur la thorie des barrires, visant combiner
plusieurs traitements modrs (ex : traitement thermique associ aux hautes pressions)
dont laction simultane est plus importante que la somme des effets individuels. Ces
thories sappliquent bien sr au process, mais galement la formulation du produit
(ex : acidification de laliment combin un traitement thermique). Lavenir de
lappertisation est probablement de jouer sur lapplication de cette thorie des
barrires, encore faut-il savoir la quantifier.
Le travail de Zwietering ralis dans le domaine de la croissance, et
lintroduction de son concept , cre le lien entre la microbiologie prvisionnelle et
cette thorie des barrires. La hauteur dune barrire peut tre caractrise par
linverse de au niveau de la croissance, ou par au niveau de la destruction. Une
analogie vidente existe donc entre ce concept et le concept prsent dans ce
manuscrit.
) (
1
) (
1
) (
1
max
w
a pH T

=
'
*
pH pH T
D
D
=
155
Un regain dintrt de lindustrie de la conserve vers la microbiologie
prvisionnelle permettrait daffiner quelque peu les barmes de strilisation, de
mesurer par simple simulation limpact dun changement de process ou dune
acidification du produit sur la thermorsistance bactrienne.
Mais la contradiction apparente entre la simplicit de la thorie (base sur la
prise en compte de quelques facteurs) et la complexit du comportement des spores
bactriennes au cours de la destruction appelle cependant la plus grande vigilance.
La multitude de facteurs intervenant sur la vitesse de destruction thermique, et
interagissant entre eux, ne peut bien videmment pas tre totalement matrise. Mais
une slection judicieuse des facteurs principaux et leur intgration dans nos modles
conduit peu peu des estimations de moins en moins fausses.
Face cette multitude de facteurs, tout modle, aussi complexe soit il, sera
toujours trop simple. A linverse, un modle trop complexe resterait inutilisable
puisque certains facteurs tels que la temprature ou le pH de sporulation resteront
incontrlables lorsquil sagit de la contamination naturelle dingrdients alimentaires.
La microbiologie prvisionnelle doit donc sans cesse rechercher lquilibre entre la
simplicit des modles et la justesse de la prvision.
Perspectives
Comme nous avons pu nous en rendre compte dans ce manuscrit, le modle ne
prdit pas exactement le barme exprimental, et dans chaque cas tudi, une
diffrence est observe entre le barme estim et le barme rel observ. Cette
diffrence regroupe lensemble des effets des facteurs non pris en compte (nature de
lacide, texture, lipides). Les travaux de modlisation sur leffet de lactivit de
leau du milieu de traitement (Gaillard et al., 1998) et sur leffet de la
w
de
recouvrement (Coroller et al., 2000) permettent dextrapoler notre modle global ces
deux facteurs. Daprs leurs rsultats, nous pouvons tendre notre concept aux valeurs
de destruction biologique partielle tel que :
o
pour le facteur a
w
de traitement
et pour le facteur a
w
de recouvrement
w
a
w
w
z
a
a
1
10

=
2
'
' '
'
10

=
w
a
opt w w
w
z
a a
a
' '
. . . .
*
w w
a a pH pH T
D
D
=
156
Ce nouveau modle demande cependant des validations sur des produits
industriels afin dtendre les calculs de barme de strilisation ces facteurs a
w
.
Cest ensuite sur de nouveaux facteurs que la microbiologie prvisionnelle
doit orienter ces efforts afin daffiner progressivement ses prvisions.
Enfin, les mthodes de Bigelow et de Ball ne seront dfinitivement et
totalement tendues au multifactoriel que lorsque les valeurs des paramtres z relatifs
aux nouveaux facteurs seront enfin standardises comme la t la valeur de z
T
10C.
Pour cela, de nombreuses tudes restent faire, notamment dans le domaine du
recouvrement.
157
NOMENCLATURE
Lettres majuscules
B : Barme de strilisation, ou temps de palier de lautoclave
CUT : Coming Up Time. Il sagit du temps mis par un autoclave pour atteindre la
temprature de palier.
D : Dure de rduction dcimale. Temps de traitement thermique ncessaire pour rduire
une population microbienne 1/10
e
de sa taille initiale. La temprature de traitement
peut tre prcise en indice (D
T
).
D* : Dure de rduction dcimale dtermine dans des conditions standards (121,1C ; pH
neutre).
F : Valeur strilisatrice standard
F : Valeur strilisatrice personnalise
SCE : Somme de Carr des Ecarts
T* : temprature de rfrence de 121,1C
T
p
: temprature de palier du strilisateur
T
0
: temprature initiale du produit striliser
T
c
: Temprature de leau de refroidissement dun strilisateur
VDB : Valeur de destruction biologique dfinie par D*/D
VS : Valeur strilisatrice (F)
158
Lettres minuscules
a
w
: activit de leau du produit
fc : paramtres du modle de Ball relatif au refroidissement du produit
f
h
: paramtres du modle de Ball relatif lchauffement du produit
jc : paramtres du modle de Ball relatif au refroidissement du produit
j
h
: paramtres du modle de Ball relatif lchauffement du produit
j
h
corr : paramtre j
h
corrige par prise en compte du CUT
n : nombre de dures de rduction dcimale, ou taux de rduction dcimale
pH* : pH du milieu de traitement de rfrence gale 7.
pH* : pH du milieu de recouvrement de rfrence gal 7.
pH
opt
: pH du milieu de traitement auquel la dure de rduction dcimale est maximale
pH
opt
: pH du milieu de recouvrement auquel la dure de rduction dcimale est maximale
z
T
: cart de temprature par rapport la temprature de rfrence entranant une variation
de la dure de rduction dcimale dun facteur 10.
z
pH
: cart de pH par rapport au pH de traitement de rfrence entranant une variation de la
dure de rduction dcimale dun facteur 10.
z
pH
: cart de pH par rapport au pH de recouvrement de rfrence entranant une
diminution de la dure de rduction dcimale dun facteur 10.
Lettres grecques
: Paramtre du modle de Mafart et al. (2001) exprimant la dure de la premire
rduction dcimale.
159
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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ANNEXES
Annexes 1
La mthode de Bigelow (1921)
Daprs Mafart (1996) Gnie industriel alimentaire
174
175
176
177
Annexes 2
La mthode de Ball (1923)
Daprs Mafart (1996) Gnie industriel alimentaire
178
179
180
RESUME
Les traitements thermiques sont utiliss dans lindustrie de la conserve pour assainir les
aliments et assurer leur stabilit microbiologique et biochimique. Cependant, les
nombreux effets secondaires comme laltration des qualits nutritives et organoleptiques,
incitent les entreprises rduire les barmes leurs minima, tout en maintenant la scurit
microbiologique. La recherche de ce barme optimum passe par ltude de la rsistance
thermique des formes bactriennes sporules.
La premire partie de ce manuscrit consiste en llaboration dun modle tabli sur les spores
de sept souches bactriennes (B. stearothermophilus, C. sporogenes, espces acidophiles).
Ce modle dcrit la thermorsistance en fonction de la temprature, mais surtout du pH de
laliment que nous ddoublons en deux facteurs distincts : le pH du milieu de traitement
thermique dont leffet direct sur la thermorsistance est bien connu, et le pH du milieu
dincubation post-traitement qui affecte la fois le taux de germes survivants susceptibles de
se dvelopper et la dure de rduction dcimale apparente.
La seconde partie est consacre lapplication du modle dans les calculs de barmes de
strilisation. Les mthodes de Bigelow et de Ball sont tendues au multifactoriel par
intgration du pH, conduisant ainsi un nouveau protocole de dtermination de barme de
strilisation. Pour appuyer cette dmonstration, un produit industriel est choisi en exemple :
ses barmes sont redtermins par cette nouvelle mthode.
Mots-cls : Microbiologie prvisionnelle, spores bactriennes, traitements thermiques, pH du
milieu de traitement, pH du milieu de stockage, barme de strilisation.
ABSTRACT
In canned food industry, heat treatments are used in order to produce healthier food and to
maintain its microbiological and biochemical stability. However, the numerous side effects,
such as deterioration of nutritious and organoleptical qualities, urge compagnies to reduce
their scales down to a minimum that maintain, nevertheless, the microbiological stability. This
Optimization research proceeds from the study of heat resistance of bacterial spores.
In the first part of this work, we established a model on spores of seven bacterial strains (B.
stearothermophilus, C. sporogenes, acidophilic species). In this model, the heat resistance
of these spores is related to the temperature, and mainly to the food pH, which is devided into
two distinct factors : The heat treatment medium pH whose direct effects on heat resistance
are well known, and the post-treatment medium pH which affects both the rate of surviving
spores likely to germinate and grow and the apparent decimal reduction time.
The second part is assigned to the application of the model in sterilization time calculation
methods. The Bigelows and Balls methods are enlarged by integration of pH, leading to a
new protocol for sterilization time calculations. To check this demonstration, an industrial
product is taken as an example and its scales are determined according to this new method.
Key words : Predictive microbiology, bacterial spores, heat treatments, Heat treatment
medium pH, storage medium pH, sterilisation scale.

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4.4.1.2. Influence de la temprature sur z

4.4.1.3. Analyse de variance

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