UE Biochimie structurale Semestre 4

Les acides nucliques: mthodes danalyse

Documents cours 1 Les objectifs: -Connaitre la structure dun acide nuclique -Comprendre les mthodes de purification et dextraction des acides nucliques -dosage et lectrophorse : savoir quantifier et vrifier la qualit des ac nucleiques -dcrire lactivit d enzymes qui permettent dtudier les acides nucliques ( couper-coller-copier-marquer )

I-Rappels sur les acides nucliques (structure chimique)

-Les acides nucliques (ADN/ARN )sont des polymres linaires de nuclotides relis par des liaisons phosphodiesters

-NUCLEOTIDE =

BASE

PENTOSE

GROUPE(s) PHOSPHATE(s)

Pyrimidine

Purine

I-Rappels sur les acides nucliques (structure chimique)

Pyrimidine

Purine

I-Rappels sur les acides nucliques (structure chimique)

-Les acides nucliques (ADN/ARN )sont des polymres linaires de nuclotides relis par des liaisons phosphodiesters

-NUCLEOTIDE =

BASE

PENTOSE

GROUPE(s) PHOSPHATE(s)

NUCLEOSIDE

Ribose ARN

2 dsoxyribose ADN

Liaison N-osidique

I-Rappels sur les acides nucliques

-Les acides nucliques (ADN/ARN )sont des polymres linaires de nuclotides relis par des liaisons phosphodiesters

-NUCLEOTIDE =

BASE

PENTOSE

GROUPE(s) PHOSPHATE(s)

NUCLEOSIDE

Nucloside monophosphate

Liaison phosphomonoester

Nucloside triphosphate

I-Rappels sur les acides nucliques

orientation de la chaine

dsoxyribose

5-3

Trinuclotide dADN : critures conventionnelles dpTpApG

dA-dC-dT-dG 5 T-A-G 3 T
p p

A
p

I-Rappels sur les acides nucliques

Hlice droite dADN : molculaire double brin: -Antiparallle -Complmentarit des bases [A]=[T] et [C]=[G]

Forme B de la double hlice dADN

Principales tapes de purification des acides nucliques

I-extraction et purification des acides nucliques

Il existe diffrents protocoles exprimentaux pour extraire les acides nucliques qui suivent approximativement le mme schma gnral:

-Lyse des cellules

-Elimination des protines et lipides

-Elimination dun acide nuclique donn

(un extrait dacides nucliques contient un mlange ARN, ADN gnomique et ADN plasmidique pour les bactries)

Principales tapes de purification des acides nucliques

-Lyse des cellules :
Pour liminer lARN: digestion par une RNase( Dnase free )

I-extraction et purification des acides nucliques

-Dgradation protines: -hydrolyse enzymatique: -prcipitation des protines avec des agent s chaotropiques -Extraction des acides nucliques (Elimination protines et lipides) -extraction phnol /chloroforme (non miscible hydrophobe):

pH 8

Dbris lipidiques

A pH acide pH5

ADN
Dbris lipidiques

Principales tapes de purification des acides nucliques

I-extraction et purification des acides nucliques

-Extraction des acides nucliques et concentration des acides nucliques -extraction par chromatographie dadsorption sur colonne de silice

Fixation ADN en prsence de NaCL

Elution faible force ionique

lavage

SiO2

-Concentration des acides nucliques

-prcipitation thanol en prsence de cations:
haute force ionique NaCl 3M. Na+ neutralisent les groupements PO4- de lac nuclique qui devient moins soluble. -Ajout de 2 volumes dthanol , lacide nuclique est rcupr aprs centrifugation sous forme solide -un lavage lthanol 70% permet dliminer les sels

I-extraction et purification des acides nucliques: purification de plasmide

Principales tapes de purification des acides nucliques: miniprparation plasmidique Technique:LYSE ALCALINE
2 sortes dADN : LADN gnomique issu du ou des chromosomes des cellules (taille : + 106 pb ) LADN plasmidique ( molcule dADN circulaire double brin extra chromosomique rplication autonome) (petite taille environ 103 pb )

Lyse des cellules + -dtergent SDS (dodcyl sulfate de sodium) -soude pH 13 +Rnase Dnase free Neutralisation rapide de la solution

ADN dnatur: sparation des deux brins dADN ARN digr

Rappariement des duplex dADN. LADN gnomique trs long ne peut se rapparier correctement. Il devient insoluble. LADN plasmidique se renature et reste en solution.

Sparation des espces dADN et des protines par centrifugation

Concentration des ADN plasmidiques par prcipitation thanol

Dosage des acides nucliques par spectrophotomtrie absorption UV Principe de spectrophotomtrie

(Cf TP bases de biochimie )

II-Dosage des acides nucliques: spectrophotomtrie

I0

A= log (1/T)=log

I0 I

Dosage des acides nucliques par absorption UV

II-Dosage des acides nucliques : spectrohotomtrie

Les nuclotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due aux bases azotes A,C,G,T, U
-Estimation de la concentration en acides nucliques - Estimation de la puret de lchantillon

Abs

Spectre dabsorbance

Loi de Beer Lambert

Abs 260 nm= l

Absorbance ou densit optique

260 nm

C
Concentration M

Trajet optique cm

Coeff dextinction molaire M-1cm-1

-chantillon dADN pur :

Abs 260/Abs 280 compris entre 1,8 et 2

si le rapport est < 1,7 prsence de protines Si le rapport est > 2 prsence dARN

Dosage de solutions pures dacides nucliques par absorption UV

II-Dosage des acides nucliques: spectrophomtrie

Pour dterminer approximativement des concentrations en acides nucliques de solutions pures , on peut assumer que:

Dans les conditions standards de mesure (cuve 1 cm, temprature ambiante)

pour une solution pure dADN db :

pour une solution pure dADN sb :

1 Abs 260 = 50 g/mL

1 Abs 260 = 37 g/mL (hyperchromicit 50 g/ml dADN ont une absorbance de 1,25 )

pour une solution pure d ARN:

1 Abs 260 = 40 g/mL

Ce dosage est facile dutilisation et sensible (2-3 g/ml) mais ne peut pas tre utilis pour des concentrations infrieures 0,25 g/mL (Abs 260=0.005)

Electrophorse sur gel Cas particulier de lADN et du BET:

Les acides nucliques sont des macromolcules polyanioniques chargs ngativement pH 8. Sous un champ lectrique, ils vont migrer vers lanode (ple +).

III-Electrophorse sur gel des acides nucliques

Le gel est constitu de polymres formant un maillage dagarose ou polyacrylamide, baignant dans un tampon conducteur.

La vitesse de migration des acides nucliques dpend: -leur masse molculaire donc de leur taille (bases ou pb) -du maillage du gel support de llectrophorse (concentration en agarose ou acrylamide)

Cas particulier de lADN et du BET: Electrophorse sur gel Llectrophorse permet aussi de sparer des molcules dacides nucliques suivant leur structure: par exple diffrentes formes dun plasmide (molcule dADN circulaire double brin extrachromosomique rplication autonome).

III-Electrophorse sur gel des acides nucliques

Mobilit lctrophortique diffrente

dpt

+
-forme relche
-forme linaire -forme surenroule

III

II

Forme I circulaire covalemment ferme Forme II circulaire relache (un brin coup) Forme III linaire (deux brins casss) Aprs une prparation plasmidique on rcupre les formes I et III. Aprs digestion par des enzymes de restriction la forme III

Des outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques Nuclases

-Les ADN et ARN sont les substrats des nuclases qui hydrolysent la liaison phosphodiester. Elles agissent in vivo et in vitro. -Elles sont classes suivant : leur mode dattaque

IV-Outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques

Des outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques Les enzymes de restriction
-Endonuclases qui hydrolysent les liaisons phosphodiesters lintrieur dun ADN double brin des sites spcifiques palindromiques (4 8 pb).

IV-Outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques

criture simplifie GTT/AAC

G/AATTC

--ACGTTAACCGAATTCCTCGGTTTAACTGAATTCCGTATCCC---TGCAATTGGCTTAAGGAGCCAAATTGACTTAAGGCATAGGG-Digestion par EcoRI --ACGTTAACCG oH --TGCAATTGGCTTAA p

pAATTCCTCGGTTTAACTG OH HOGGAGCCAAATTGACTTAAp pAATTCCGTATCCCC-OHGGCATAGGG--

Des outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques Ligases

IV-Outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques

Ces enzymes catalysent la formation dune liaison phosphodiester entre un 5 phosphate et un 3OH adjacent. Elles permettent une liaison covalente entre deux molcules dADN (ligature-ligation). Elles ncessite nt le nuclotide ATP .

ADN ligase + 2 ATP

2 AMP + PPi

Des outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques Kinases-polymrases

-On peut marquer les acides nucliques en ajoutant ou substituant des groupes marqueurs: -isotopes radioactifs (32P, 33P, 35S), des fluorophores -Marquage aux extrmits: -extrmit 3OH: grce la terminal transfrase -extrmit 5P: grce la T4 kinase en remplaant le groupement 5P par un isotope radioactif pCGATC----------GCATTTOH OHGCTAG-----------CGTAAAp
Dphosphorylation

IV-Outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques

Phosphatase alcaline

CGATC----------GCATTTOH OHGCTAG-----------CGTAAA
T4 polynuclotide kinase + Adnosine -P-P-P32 (ATP P32) phosphorylation ADP

pCGATC----------GCATTTOH OHGCTAG-----------CGTAAAp

Des outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques Kinases-polymrases

-On peut marquer les acides nucliques en ajoutant ou substituant des groupes marqueurs: -isotopes radioactifs (32P, 33P, 35S), des fluorophores -Marquage aux extrmits: -extrmit 3OH: grce la terminal transfrase -extrmit 5P: grce la T4 kinase en remplaant le groupement 5P par un isotope radioactif -Marquage interne:

IV-Outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques

Des outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques polymrases

IV-Outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques

A C G T -Synthse d ADN: A T C G A T A T A Amorce (oligonuclotide) C A G 5 T-G-C-A-T-G-A-C-C-G-T-G-G-A-C-T-T-A-A-A 3C G 5

dNTPs

3 3

A-C-G-T-A-C-T-G-G-C-A-C-C-T-G-A-A-T-T-T-G-C-A-T-T-G-C-A

ADN polymrase
Mg2+

5 5

progression dans le sens 5-3

*
On peut marquer un ADN par synthse en ajouter un dNTP P32

Daprs Lehninger principles of biochemistry