Biologie celular i molecular Lp 4

METODE FOLOSITE N DETERMINAREA, IZOLAREA I PURIFICAREA COMPONENTELOR CELULARE MAJORE DE TIPUL PROTEINELOR Specificitatea structural i mai ales funcional a organitelor este

determinat de proteinele care intr n alctuirea lor, de aceea analizarea proteinelor joac un rol important n analiza biochimic a organitelor. Analiza structural sau funcional a unei anumite proteine presupune n primul rnd izolarea acelei proteine intr-o stare relativ pur. Purificarea proteinelor se realizeaz n general prin etape succesive de ndeprtare a structurilor contaminante. Dou proteine pot fi apropiate in ceea ce priveste o anumit proprietate (ncrcarea electric) i diferite in ceea ce privete o alta (masa molecular). Ca urmare purificarea complet a unei anumite proteine necesit de obicei folosirea succesiv a mai multor tehnici. Extragerea proteinelor din membrane Celulele conin mii de proteine diferite dintre care o parte sunt dizolvate n mediul intern, iar altele sunt ataate la diferite structuri celulare (proteine membranare sau din organite). Proteinele ataate membranelor sunt de 2 tipuri: Proteine periferice sau extrinseci care pot fi extrase cu soluii ionice slabe. Proteinele intrinseci sau integrale de regul transmembranare care au un domeniu hidrofob n grosimea stratului dublu lipidic i necesit folosirea detergenilor pentru extragerea membranelor. Detergenii sunt molecule amfipatice care distrug membranele, intercalandu-se n dublul strat lipidic i solubiliznd lipidele i proteinele. Partea hidrofob a moleculei de detergent este atras de cozile acizilor grai din lipide i domeniul hidrofob al proteinelor, n vreme ce partea hidrofil este atras de ap, formnd complexe solubile n ap cu proteinele i lipidele membranare. Unii detergeni sunt ionici avnd o grupare ncrcat, cum este dodecil-sulfatul de sodiu (SDS), alii sunt neionici cum ar fi Triton X-100.
1

Biologie celular i molecular Lp 4

Odat izolate i purificate, anumite proteine din membrane, pot fi ncorporate n vezicule fosfolipidice artificiale (lipozomi) pentru a li se studia funcia. n acest fel a fost demonstrat funcia pompei de Na+ -K a trei ioni K+ ctre interior. Cromatografia Este o metod fizico-chimic de separare a componenilor unui amestec, care se folosete de fenomenele ce au loc la interferenele a dou faze. Pe suprafeele dintre dou faze dintre care una este staionar (faza solid sau lichid) adsorbit pe un material poros i una mobil (solvent lichid sau gaz) pot avea loc fenomene de adsobie, schimb de ioni sau partiie ntre dou faze lichide nemiscibile, ca urmare a deplasrii fazei mobile de-a lungul celei staionare i a antrenrii componentelor amestecului n micare, cu viteze diferite, ocupnd astfel poziii diferite de-a lungul fazei staionare. n funcie de natura fazelor se disting urmtoarele tipuri de cromatografie: Faza mobila lichid lichid gaz gaz Faza stationar lichid solid solid lichid Denumire lichid - lichid lichid - solid gaz - solid gaz - lichid
+

, care menine concentraia

intracelular a acestor ioni prin pomparea a doi ioni de Na+ ctre exteriorul celulei i

Metodele de separare cromatografice se mpart n:

- metode bazate pe afinitatea diferit a componenilor (repartiie de faz,

adsorbie, absorbie, schimb ionic, afinitate);

- metode bazate pe mrimea diferit a componenilor (excluziune sferic).

Din punct de vedere practic cele mai utilizate metode de cromatografie sunt: cromatografia pe coloan, cromatografia pe hrtie, cromatografia n strat subire, gaz cromatografia. Majoritatea tehnicilor utilizate sunt cromatografia lichid n care

componentele amestecului se asociaz preferenial cu una din cele dou- faza mobil lichid, un solvent i faza staionar solid, o matrice poroas prin care
2

Biologie celular i molecular Lp 4

solventul se mic. Matricea poroas de regul la cromatografia n strat subire este constituit dintr-un strat de silicagel sau oxid de aluminiu n stare dispers depus pe o lam de sticl. Developarea se face pe un solvent apolar (benzen, toluen, petrol) sau un amestec de solveni. Dac substanele cromatografice sunt incolore decelarea petelor formate pe placa cromatografic se face cu ajutorul unor reactivi care dau reacii de culoare cu substanele amintite. Identificarea componenilor se face : - decuparea spoturilor i analize ulterioare prin analize chimice sau fizice - aplicarea simultan pe plac a substanelor etalon, spotul format si acela dat de componentul identic din amestec; - prin determinarea valorii Rf (raportul dintre distana parcurs de spot i de frontul solventului n acelai interval de timp) Cromatografia pe hrtie - reprezint una din cele mai simple metode de analiz. n aceast metod faza fix este reprezentat de o suprafata de hrtie special sau hrtie de filtru, iar faza mobil (eluentul) de un lichid ce se deplaseaz de-a lungul fazei fixe datorit forelor de adeziune i forelor gravitaional. de o

anumit substan cunoscut se va gsi, la aceeai distan de punctul de start ca

Schema cromatografie pe hrtie Se mparte n: cromatografie pe hrtie vertical (ascendent sau descendent) i orizontal (Pfeiffer).

Biologie celular i molecular Lp 4

Cromatografie pe hrtie vertical ascendent i descendent Identificarea compuilor izolai n timpul cromatografiei se face fie cu ajutorul spoturilor martor, fie calculnd timpul de reinere al fiecrui component separat (Rj), definit ca raportul dintre distana fata de linia de start pe care a migrat componentul respectiv (notat cu Xj) i distana pe care a migrat eluentul (notat cu Y): Cromatografia pe coloan Coloanele cromatografice sunt confecionate din sticl. Pentru o bun rezoluie se folosesc coloane lungi dar n condiiile n care se dorete separarea unei cantitati mari de substane se folosesc coloane cu un diametru mai mare.n interiorul coloanei se introduce faza staionar ce trebuie, ntr-o prim etap, echilibrat cu solventul de lucru. Amestecul ce urmeaz a fi separat se pipeteaz n partea superioara a tubului. Se conecteaz rezervorul cu solvent (faza mobil) la coloan i se ateapt pn ce are loc separarea. Datorit deplasrii fazei mobile de-a lungul celei staionare are loc antrenarea componentelor din amestec ntr-o micare descendent, n lungul coloanei astfel nct n timp vor ocupa poziii diferite. Fraciile sunt colectate n tuburi i apoi analizate.

Biologie celular i molecular Lp 4

Schema cromatografie pe coloan

Ex. APLICAII PRACTICE Proteinele interactioneaz cu substraturi specifice: enzimele cu substratul lor, receptorii cu ligandul, antigenele cu anticorpul specific. Fiecare din aceste tipuri de proteine poate fi ndeprtat din soluie la trecerea amestecului printr-o coloan n care de matricea inert este legat covalent la molecula cu care proteina interacioneaz specific (substrat, ligand, anticorp). De exemplu un preparat impur de receptor pentru insulin este trecut printr-o coloan de agaroz avnd ataat covalent insulina, receptorul se leag specific de aceasta, n anumite condiii care favorizeaz legarea. Odat ce toate proteinele contaminante au trecut prin coloan ieind la partea sa inferioar, moleculele de receptor insulinic pot fi detaate prin modificarea solventului din coloan. Astfel, prin cromatografia compoziiei i/sau ph-ului de afinitate se poate obine

purificarea complet a unei molecule intr-o singur etap. PATOLOGIA CELULAR

Biologie celular i molecular Lp 4

Cauze: -hipoxia i ischemia determinat de scderea aprovizionarii cu oxigen -trauma mecanica sau termic -substane chimice i medicamente -ageni microbieni -ageni imunologici precum reacia de hipersensibilitate, reacia anafilactic -deficiena sau surplusul de alimente Patogeneza se declaeaz cnd: -

Este afectat membrana celular i respectiv pompa de sodiu La descreterea ATP-ului celular Are loc descreterea sintezei proteinelor Schimbri ultrastructurale (distorsiuni ale cisternelor RE, umflarea mitocondriilor, pierderea microvililor, segregarea nucleolului i reducerea sintezei ARN) Enzimele hidrolitice distrug membranele lizozomale fapt ce este urmat de eliberarea enzimelor hidrolitice n celul ducnd astfel la digestia componentelor celulare

Exp. Patogeneza celulei hepatice Hepatocitoliza poate fi consecinta unor agresiuni celulare brutale de natura toxica, infecioasa sau anoxica. Hepatocitoliza duce la alterri mitocondriale cu scderea ATP-azei i reducerea fosforilrii oxidative, activarea catepsinei lizozomale cu dezintegrarea lizozomilor si autoliza hepatocitelor. Sindromul de citoliz hepatic, denumire dat de Fauvert, sau sindromul de suferin celular, poate fi explorat biochimic (evideniind modificrile enzimatice, vitaminice, tulburri minerale) i morfopatologic, prin puncie hepatic. Eviden ierea patologiei celulare prin modificarile enzimatice n hepatocitoliza Enzime cu specificitate hepatica: -

TGO (ASAT) TGP(ALAT) LDH4 (lacto- dehidrogenaz) LDH5 SDH (succin-dehidrogenaz) SODH (sorbitol-dehidrogenaz) OCT (ornitin-carbamil-transferaza) Locul acestor enzime in celula a fost stabilit histochimic, astfel:
6

Biologie celular i molecular Lp 4

In mitocondrii se gasesc transaminaze (TGO,TGP),GLDH (glutamat dehidrogenaza) cu rol in respiratia celulara In RE se gasesc conjugazele,fara valoare diagnostica In lizozomi se gasesc hidrolazele,fara valoare diagnostica In citoplasma se gasesc LDH,enzimele ciclului urogenic

Determinariile enzimatice n hepatopatii prezint unele dezavantaje: ca - nespecificitatea unor enzime - n leziunile hepatocelulare sinteza enzimelor se sisteaz cu dispariia lor din ser (distrofia hepatica acuta) - dificultatea determinarii unor enzime specifice (OCT,GLDH,SDH) - dificultatea aprecierii cantitative a leziunilor pe baza enzimelor

A. Variatii enzimatice in hepatopatii: 1. Transaminazele -cresc moderat in hepatitele toxice sau medicamentoase: aspirina, pirazinamida, opiacee, iproniazida) -cresc marcant in hepatite acute (TGO) -in hepatitele cronice agresive raportul TGO/TGP devine subunitar,comparativ cu celalalte forme si ciroze cand ramane supraunitar 1,2 n hepatite cronice i 1,5 n cirozele hepatice

Exist i cauze extrahepatice care determin creteri ale TGO i TGP, ca infarctul miocardic, pancreatite acute, emboliile, afeciunile musculare, intervenii chirurgicale i unele medicamente: opiacee, anticoagulante, antibiotice. 2. OCT(ornitin-carbamil-transferaza) Specificitate mare pentru ficat Crete n hepatita cronic i ciroze

3. Guanaza Creste in hepatita epidemica

7

Biologie celular i molecular Lp 4

4. LDH Izoenzime specific hepatice LDH4 si LDH5 Izoenzime specific pentru miocard LDH1 si LDH2 Zimograma LDH (diagrama benzilor obtinute prin electroforeza unui extract de proteine enzimatice solubile) difereniaz icterele hepatice de cele prehepatice si posthepatice

5. GLDH (glutamat dehidrogenaza)

Apare in ser numai in leziuni celulare severe: hepatite acute, icter obstructiv, inflamator sau neoplazic, com hepatic

B. Modificari minerale in hepatocitoliza

1. Sideremia: test nespecific considerat n trecut indice de citoliza

hepatica Crete n hepatite acute, de 2-3 ori in unele cazuri datorita eliberarii Fe din hepatocitele hipoxice;

2. Cupremia: Crete moderat n ciroze,dar crete marcat n icterele obstructive