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COMPARACIN DE LA PRODUCCIN DE GALACTOOLIGOSACRIDOS (GOS) A PARTIR DE LACTOSUERO EN POLVO Y LACTOSA USANDO Aspergillus orizae Y ENZIMA GALACTOSIDASA LIBRE COMPARISON

OF GALACTOOLIGOSACCHARIDES (GOS) PRODUCTION FROM CHEESE WHEY POWDER AND LACTOSE BY Aspergillus oryzae FREE CELLS AND FREE GALACTOSIDASE Avella N.*, Solano C.*, Castro G.** *Estudiantes Programa de Ingeniera de Alimentos Universidad de La Salle, Bogot, Colombia, Carrera 4 # 10 70. **IQ MSc Docente Programa de Ingeniera de Alimentos Universidad de La Salle, Bogot, Colombia, gacastro@unisalle.edu.co. RESUMEN El objetivo del trabajo fue evaluar la produccin de galactooligosacridos (GOS) a escala de laboratorio por medio fermentativo aplicando Aspergillus oryzae var. effussus y por reaccin enzimtica usando -galactosidasa comercial, utilizando como sustrato, lactosa y lactosuero en polvo con una concentracin inicial de 11% de lactosa en los dos casos. La concentracin 7 inicial del hongo en el medio fue de 2.9*10 esporas por mililitro, la duracin de la fermentacin fue de 24 horas, para la -galactosidasa la reaccin dur 12 horas. La produccin de GOS con la enzima fue de 43.91% con lactosa y 44.45% con suero, para el hongo la produccin ascendi a 41.36% con lactosa y 43.27% con suero, estos resultados no presentan diferencias significativas de acuerdo al anlisis estadstico. Las mayores producciones se alcanzaron a la hora 16 para la fermentacin con el hongo y a la hora 10 para el proceso enzimtico. Palabras clave: Galactooligosacaridos, -galactosidasa, Aspergillus oryzae, lactosuero, lactosa.

SUMMARY The objective was to evaluate the production of galactooligosaccharides (GOS) on laboratory scale by Aspergillus oryzae var. Effussus free cells and free -galactosidase enzyme, the substrates were lactose and cheese whey poder, with an initial lactose concentration of 11% in 7 both cases. The initial concentration of fungus in the medium was 2.9 * 10 spores per ml and the fermentation time was 24 hours, for the enzymatic reaction the time was 12 hours. GOS production of the enzyme was 43.91% and 44.45% for lactose and cheese whey respectively, for the fungus 41.36% and 43.27% for lactose and cheese whey respectively, these results were not significantly different according the statistical analysis. The best yields were achieved at sixteen hour for fungus and at ten hour for enzyme. Keywords: Galactooligosaccharides, -galactosidase, Aspergillus oryzae, cheese whey, lactose. mediante reacciones transgalactosilacin (Figueroa, usando la enzima -galactosidasa. de 2004),

INTRODUCCION Los prebiticos son definidos como ingredientes alimenticios no digeribles que benefician la salud del hospedero estimulando selectivamente el crecimiento y/o actividad de un nmero limitado de bacterias intestinales que son beneficiosas (Huerta, 2005). Los galactooligosacridos (GOS) se encuentran dentro de este grupo de sustancias, en donde estos azcares se hallan de forma natural en la leche de mamferos y en algunos productos procesados en los que se pueden obtener

La -Galactosidasa, tambin conocida como lactasa, es una hidrolasa que ataca el grupo O-glucosilo de lactosa, su fuente son hongos como el Aspergillus niger y Aspergillus oryzae que a menudo se utilizan para la hidrlisis de la lactosa en el suero. La lactosa es el principal sustrato para la sntesis, este disacrido est presente en el suero de la leche en un alto porcentaje, adems de que se puede adquirir con su concentracin total en polvo luego de ser sometido a ciertos procesos

qumico (Figueroa, 2005). Se conoce que los GOS son producidos de la lactosa hace ms de 50 aos y sin embargo el inters comercial de los mismos solo se da con el descubrimiento de la bifidogenia en donde este tipo de productos es clasificado como ingrediente alimenticio prebitico de gran impacto industrial (Dey-chy, 1998). En la actualidad y ya desde hace algunos aos se ha notado el inters por los consumidores en tener mejores hbitos alimenticios, incluyendo en su dieta alimentos enriquecidos y funcionales que mejoren la digestin y que tengan efectos positivos sobre la flora bacteriana, adems de aumentar el crecimiento de bacterias intestinales beneficiosas. Los microorganismos llamados probiticos mejoran estas funciones, pero necesitan a su vez fuentes nutritivas suficientes, estas sustancias son proporcionadas por los prebiticos, de forma tal que en conjunto son capaces de mejorar la salud en los seres humanos. El objeto de este estudio, es producir prebiticos, galactooligosacridos GOS, a escala de laboratorio utilizando la enzima -galactosidasa comercial (libre) y el microorganismo A. oryzae, a partir de lo cual se determinan las condiciones del proceso de fermentacin en cuanto a tiempo, sustrato MATERIALES Y METODOS Manejo del microorganismo y produccion de esporas La cepa de A. oryzae var. effussus usada durante el desarrollo de esta investigacin, fue proporcionada por Departamento de agricultura de Estados Unidos (USDA servicio de investigacin agrcola) y se encontraba liofilizada por lo que fue necesario llevar a cabo la activacin de dicha cepa. Para la activacin, en un ambiente estril (Cmara de bioseguridad) se llev a cabo la siembra de la cepa A. oryzae en cajas de petri con agar papa dextrosa (PDA) y agar sabouraud (medios precursores del crecimiento de hongos) por puncin para ulteriormente incubar a 30 C durante 7 das para activacin y crecimiento de la cepa. Metodologia de conteo de esporas La cuantificacin o conteo de esporas se desarrolla por medio de la camara de Neubauer (SANCHEZ, 2009).

Caractersticas del medio para la reaccin enzimtica con -galactosidasa comercial libre. Corresponden a un total del 89 % de tampn fosfato y 11 % p/v de lactosa en polvo o lactosuero en polvo y un mililitro de enzima -galactosidasa (SANCHEZ, 2009). Caractersticas del medio para fermentacin con A. Oryzae. Corresponden a un total del 89 % de una solucin constituida por (K2HPO4 0.84%, MgSO47H2O 0.102%, KCl 0.088%, FeSO47H2O 0.007%, NaNO34H2O 0.085%, extracto de levadura 2.0%, CaCO3 0.136%)) y 11% p/v de lactosa en polvo y suero en polvo y un mililitro de la solucin 7 de esporas a una concentracin de 2.9*10 esporas por mililitro (SANCHEZ, 2009). Caractersticas de la muestra para la reaccin enzimtica. Se ajusta pH a 6.5 incuba a 55 C por 12 horas, tomando muestras por triplicado cada dos horas, las cuales son sometidas a inactivacin de la enzima por accin de temperatura a 100 C por 5 minutos, posteriormente se lleva a cabo centrifugacin de las muestras a 1000 rpm durante 10 minutos y se almacena a congelacin a -18 C. Caractersticas de la muestra para la fermentacin. Se ajusta el pH a 5.5 e incubando a 30 C y 200 rpm durante 24 horas en agitador orbital GENESIS , tomando muestras por triplicado cada cuatro horas, las cuales son sometidas a inactivacin de la enzima por accin de temperatura a 100 C por 5 minutos. Posteriormente se lleva a cabo centrifugacin de las muestras a 1000 rpm durante 10 minutos y se almacena a congelacin a -18 C. Cuantificacion de GOS (DNS) Se hace por medio del mtodo DNS para cuantificar azucares reductores presentes en las muestras, luego se aplica la siguiente ecuacin:

Debido a que los galactooligosacridos GOS son los azcares no reductores de acuerdo a la ecuacin anterior se puede decir que:

Anlisis estadstico Todas las pruebas se hicieron por triplicado, se desarroll un anlisis estadstico descriptivo tanto para el comportamiento de produccin de GOS en la fermentacin de los dos sustratos lactosa y lactosuero en polvo con A. oryzae como para las reacciones enzimticas de los mismos sustratos pero con la enzima galactosidasa, debido a que con este tipo de anlisis no se pueden afirmar diferencias significativas. Posteriormente se desarrolla un modelo a dos filas de clasificacin con interaccin entre el grupo y el tiempo con anidamiento de individuos entre grupos, mediante los programas R y SAS. RESULTADOS Y DISCUSION La grfica 1 muestra como desciende el porcentaje de azcares reductores, debido al consumo para la produccin de GOS, los cuales a ascienden a 4.83 y 4.89%, para lactosa y lactosuero respectivamente. A partir de la hora 8 con lactosa y 10 con lactosuero, la produccin de GOS adicional es tan escasa que permite establecer estos como tiempos adecuados para el proceso en ambos casos.

var. Effussus, como agente fermentativo, el tiempo en este caso fue el doble, 24 h, debido a lo sugerido en la literatura. Se podra establecer la hora 16 como el tiempo requerido para el proceso, debido a que a partir de esta no se genera producto adicional. Se logr una concentracin de GOS de 4.55 4.76% con lactosa y lactosuero respectivamente.

12 10 8 6 4 2 0 0 2 % A. R. Lactosa % A. R. LSuero 4 6

% GOS Lactosa % GOS LSuero

Grfica 2. Produccin de GOS (%) y consumo de azcares (%) para el proceso con Aspergillus oryzae libre. Los tiempos de 0 a 6 corresponden a las horas 0, 4, 8,12,16,20,y,24 del proceso.

12 10 8 6 4 2 0 0 2 % A. R. Lactosa % A. R. LSuero 4 6

% GOS Lactosa % GOS LSuero

Grfica 1. Produccin de GOS (%) y consumo de azcares (%) para el proceso con enzima Galactosidasa libre. Los tiempos de 0 a 6 corresponden a las horas 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 del proceso.

En la grfica 2 de aprecia un comportamiento similar al anterior, pero en este caso se evalu el Aspergillus. oryzae

Los porcentajes de GOS estn reportados con referencia al total de la masa reaccionante, para compararlos con los obtenidos en otros trabajos, se deben convertir a porcentaje pero referente esta vez al total de azcares iniciales en el proceso, que corresponden a 43.91% (Lactosa) 44.45% (Lactosuero) usando la enzima y 41.36% (Lactosa) y 43.27% (Lactosuero), con el hongo, estos resultados no presentan diferencias significativas, lo cual se confirm por la aplicacin del modelo estadstico mencionado. Al comparar con los resultados de los trabajos de PeaMontenegro y Neri, con 37.01 y 26% de produccin de GOS, respectivamente, permite afirmar que vale la pena seguir mejorando el proceso. La enzima permite llegar a un resultado muy similar que el logrado con el hongo, pero en la mitad de tiempo, lo cual hace energticamente ms viable esta opcin.

CONCLUSIONES Los resultados de este trabajo arrojan que no es necesario el desarrollo industrial y tecnolgico que implica la extraccin de lactosa para la produccin de GOS ya que no se presentan diferencias significativas si el proceso es desarrollado a partir de lactosuero en polvo; la muestras que contienen lactosa y suero con galactosidasa produjeron un 4.82% y 4.89% respectivamente, adems la velocidad de produccin con el suero es mayor que la lactosa observando el comportamiento entre las horas 4 y 8, que son mayores que la lactosa variando de 0.07% a 3.32%, mientras que en la lactosa la produccin en este tiempo es del 2.3%. En el tratamiento de lactosa en polvo y lactosuero en polvo con el microorganismo A. oryzae el punto mximo alcanzado esta alrededor de la hora 20 con un 4.8% y en cuanto al uso de la enzima -galactosidasa y el microorganismo A. oryzae la mejor produccin de prebiticos galactooligosacridos GOS se da con la enzima a la hora 10 con un 4.87% contra un 4.54% producido por el hongo. De acuerdo al anlisis estadstico aplicado con un nivel de significancia de 5% para el tratamiento de lactosa en polvo y lactosuero en polvo en presencia del microorganismo A. oryzae y enzima galactosidasa se concluye que no existen diferencias estadsticamente significativas entre los sustratos, tambin se observa que en el tratamiento de lactosa y lactosuero en polvo con enzima -galactosidasa el punto mximo de produccin de prebiticos ocurre en la hora 12 en donde la lactosa alcanza una produccin de 4.40% y el suero un 5.62%. Debido a que no se presentan diferencias significativas entre los tratamientos usados se puede aplicar cualquiera de estos para la produccin de galactooligosacridos, sin embargo basndose en razones de costos y tiempo de proceso, se recomienda usar el

medio que est compuesto por lactosuero en polvo como sustrato, usando enzima galactosidasa, con un tiempo total de 10 horas de reaccin.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Dey-chyi, S. (1998). Production of galactooligosaccharides by b-galactosidase immobilized on glutaraldehyde-treated chitosan beads. Biotechnology Techniques 4. 273276. Figueroa, I. (2004) Estudio de agentes selectivos en el crecimiento de bacterias probioticas. 3. Huerta, l. Sntesis Enzimtica de galactooligosacridos a partir de residuos de la industria lctea: Desafos tecnolgicos y oportunidades. Desarrollos tecnolgicos 14. 2. Martnez, M. (2001) Una tcnica de cuantificacin de azucares reductores. TESE. Neri D., Balco V., Dourado F., Oliveira J., Carvalho L., Teixeira J. (2009), Galactooligosaccharides production by bgalactosidase immobilized onto magnetic polysiloxanepolyaniline particles, Reactive & Functional Polymers 69 246251. Pea-Montenegro, T.D., Snchez, O.F.(2010),Produccin de galactooligosacridos empleando clulas libres de Aspergillus oryzae UA1 Universidad de los Andes. Departamento de Ingeniera Qumica, Departamento de Ciencias Biolgicas, Bogot DC, Colombia. Snchez, O. Sucrose Biotransformation to Fructooligosaccharides by Aspergillus sp. N74 Free Cells. Universidad de los Andes. Departamento de Ingeniera Qumica, Departamento de Ciencias Biolgicas, Colombia. 2009.

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