Bioqumica

Aula 1 01/03
Enzimologia

A enzimologia a cincia que estuda as enzimas e todos os demais fatores relacionados sua ao. As enzimas so molculas ou protenas (formada por aminocidos) que atuam como catalisadores de reaes especficas e que atuam em condies amenas de temperatura num ambiente reacional favorvel (pH, temperatura, concentrao das enzimas, concentrao do substrato, concentrao dos agentes inibidores, concentrao de cofatores e fora inica). O substrato aquela substncia que ter interao especfica com o stio cataltico tambm chamado de stio ativo, que o local presente na molcula de enzima, que tem a capacidade de levar a reao a cabo. As protenas, neste caso as enzimas, so molculas com alto peso molecular, ou seja, so

macromolculas com o peso molecular que pode variar de 15000 Daltons at vrios milhes de Daltons. Como a maior parte das reaes que ocorrem no interior das clulas catalisada por enzimas, elas so assim conhecidas por biocatalisadores. Comparadas com outras reaes catalisadas por catalisadores no proticos ou inorgnicos e efetuadas na temperatura ambiente, as enzimas apresentam maiores velocidades de reao. O estudo das enzimas tem passado por grandes revolues desde que Bncher, em 1897, extraiu enzimas ativas a partir de clulas vivas e, mais importante ainda: mostrou que tais substncias tambm podiam catalisar reaes fora de sistemas vivos. Em 1926, Summer isolou e purificou molculas de enzimas e se descobriu que eram molculas de protenas, uma propriedade estabelecida anteriormente.

Nomenclatura das Enzimas Com relao nomenclatura das enzimas, no h uma regra que se aplique a todas elas. Em geral, adiciona-se o sufixo ase ao substrato sobre o qual ela atua (por exemplo, a ureiase que catalisa a decomposio da uria; a amilase que atua sobre o amido) ou ao nome da reao que est sendo catalisada (por exemplo, lcool desidrogenase que catalisa a desidrogenizao do lcool) mas h vrias excees como o pepsina e a triptina que so enzimas digestivas, arenina que uma enzima utilizada no preparo de queijos (ver tabela 3.1 do Shler). Classificao das Enzimas H seis classes principais de reaes que as enzimas catalisam que formam a base do sistema de classificao do Ensyme Comission ou EC de cdigos e nomes oficiais das enzimas. Vide tabela 3.1 Pgina 59 do Shler.

A classificao : a) b) c) d) e) f) OXIREDUTASES: so reaes de oxidao/reduo; TRANSFERASES: transformao de grupos funcionais; HIDROLASES: provocam reao de hidrlise; LIASES: reao de adio nas duplas ligaes; ISOMERASES: reaes de isomerizao; LIGASES: formao de ligaes com quebra do ATP.

Uma outra caracterstica das enzimas que geralmente elas necessitam de cofatores para se tornarem ativas. Os cofatores so substncias no proticas que se combinam com a molcula inativa (apoenzimas) para formar o complexo cataliticamente ativo (holoenzimas ou enzimas). H duas variedades distintas de cofatores: a) b) ONS METLICOS: clcio 2+, magnsio, zinco, etc; MOLCULAS ORGNICAS COMPLEXAS: ou coenzimas.

Em geral, os cofatores esto ligados por foras fracas em stios especficos presentes na molcula de enzima (ver tabela 3.2 Shler).

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A Ao das enzimas As enzimas diminuem a energia de ativao da reao catalisada ao se ligarem ao substrato formando o complexo enzima-substrato sem afetar a constante de equilbrio. Os aspectos moleculares da substrato interao entre enzima e substrato ainda no esto completamente esclarecidos. Normalmente a interao entre enzima e substrato se d por foras fracas como as de van der Waals e pontes de hidrognio na tre formao do complexo enzima-substrato. substrato.

O substrato se liga em pontos especficos da enzima chamados de stios ativos. O stio ativo apresenta uma configurao tridimensional de tal modo que h uma perfeita (ou especfica) com a o molcula de substrato. Ento, podemos dizer que h um encaixe da molcula de substrato dentro do stio cataltico da enzima. Tal modelo conhecido como chave fechadura, sendo a enzim a fechadura e o chave-fechadura, enzima substrato a chave.

As enzimas podem manter o substrato em certas posies e ngulos de tal modo a melhorar as taxas da reao (ou velocidade). Isto conhecido como efeito de orientao. Em algumas enzimas informao do complexo enzima-substrato provoca uma pequena mudana na forma tridimensional da enzima que tambm contribui positivamente na atividade cataltica. Exemplos: lisozima (lgrimas com funo bactericida) e carboxipeptidase. Assim, a catlise enzimtica depende no somente da estrutura primria da enzima (sequncia de aminocidos), mas tambm das estruturas secundrias, tercirias ou quaternrias. Logo, fatores que afetam essas estruturas: o pH, temperatura, concentrao de sais (fora inica), presena de solventes alteram a atividade cataltica da enzima pois promovem alteraes no stio cataltico (stio ativo). Normalmente, as enzimas atuam em condies amenas de temperatura e podem sofrer desnaturao nas temperaturas mais elevadas e at mesmo nas temperaturas de congelamento. Por desnaturao, entende-se pela perda das caractersticas originais da molcula ativa. A velocidade de uma reao catalisada por uma enzima sofre um aumento com o aumento da temperatura at um certo ponto e depois a velocidade diminui devido principalmente a desnaturao da molcula com a perda progressiva dos stios ativos, ou seja, h uma temperatura na qual a atividade enzimtica mxima ou tima para aquelas condies. A figura abaixo ilustra esquematicamente o efeito da temperatura sobre a atividade enzimtica.

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Ao das Enzimas: Efeito do pH O efeito da temperatura pode ser encontrado no item 3.3.5.2. No Shler. As enzimas como todas as protenas so formadas por uma sequncia de aminocidos que caracterizam a estrutura primria. Tais aminocidos podem apresentar grupos inicos que podem estar carregados positivamente ou negativamente dependendo do pH em que a molcula de enzima encontra-se dissolvida. Assim, o pH afeta os grupos presentes no stio ativo e alteram a atividade enzimtica pois haver uma alterao na configurao tridimensional do stio ativo, o que ir interferir na atividade enzimtica. Logo, as enzimas so ativas apenas em faixas estreitas de pH e haver um pH timo no qual a atividade mxima nas condies determinadas.

Figura 1 - efeito do pH sobre a atividade enzimtica: comportamento tpico

Ver seo 5.6.1 Biotecnologia Industrial Volume 1; Ver seo 3.3.5 Shler. Existe uma distribuio de carga eltrica na molcula. Temperatura e pH alteram a estrutura da molcula. Cabe lembrar que o pH do meio tambm pode alterar as caractersticas do s substrato se este possuir grupos ionizveis. Outros Fatores que Afetam a Ao das Enzimas Vimos duas importantes variveis que afetam a atividade enzimtica, porm, alm da temperatura e do pH, outras variveis devem ser observadas, pois podem provocar alteraes na estrutura da molcula alteraes de enzima e consequentemente alterar a interao enzima substrato. Esses outros fatores so: enzima-substrato. a) b) c) d) Foras fluidas como hidrodinmicas, presso hidrosttica e tenses interfaciais. Presena de agentes qumicos. Radiaes (ultravioleta, ionizantes, infravermelhos, ultrasnica). Presena de inibidores.

Cintica Enzimtica A cintica das reaes enzimticas afetada por diversos fatores como pH, temperatura, presena de substncias qumicas (agentes qumicos), etc. Em termos cinticos, as enzimas so classificadas em: etc. a) Enzimas clssicas: quando a velocidade da reao apresenta uma relao assinttica com a

concentrao de substrato, ou seja, obedecem o modelo cintico proposto por Michaelis Michaelis-Menten.

= b)

Enzimas regulatrias: so as demais enzimas que no obedecem a cintica clssica de Michaelis-

Menten. As enzimas regulatrias possuem dois tipos diferentes de stios: um stio cataltico (ou stio ativo) onde o substrato se liga e um stio regulatrio (no cataltico) onde se liga um regulador. Quando o regulador se liga na molcula, provoca uma alterao no stio cataltico o que altera as suas propriedades cinticas. Neste caso, o comportamento da velocidade versus a concentrao do substrato sigmoidal (S).

Aula 04 10/03
Cintica Enzimtica: Modelo Matemtico Um modelo matemtico da cintica das reaes enzimticas com um nico substrato foi primeiro desenvolvido por V. C. R. Henri em 1902, e depois por L. Michaelis e M. L. Menten em 1913. A cintica catalisada por uma enzima e um substrato com um comportamento clssico conhecida como cintica de Michaelis-Menten. O desenvolvimento do modelo se baseia no fato de que a soluo de enzima tem um nmero determinado de stios ativos (finito) nos quais o substrato poder se ligar. Nas altas concentraes de substrato todos os stios ativos estaro ocupados e dizemos que a enzima est saturada. O modelo clssico descreve uma cintica de saturao que pode ser obtida a partir de um esquema reacional simples que envolve a etapa reversvel para a formao do complexo enzima-substrato (E.S) e a etapa dissociativa do complexo E.S. +
/

Assume-se que a formao do complexo E.S rpida e que a formao do produto irreversvel. A taxa de formao do produto P pode ser dada por: = = 3 .

A variao na concentrao do complexo E.S pode ser escrita como:

= 1 0 =

2 . + .

Como a enzima no consumida na reao (catalisador), temos:

Michaelis e Menten, considerando um equilbrio rpido entre enzima e substrato, definiram: 2 = 1 . =

Como:

= . = =

0 0 + .

Logo:

Km a constante de dissociao do complexo E.S. Como: = 3 = Foi definido que: 0 + = 3 0 = v= velocidade da reao S=concentrao do substrato Vm=velocidade mxima da reao Km=constante de Michaelis-Menten A ltima equao descrita conhecida como modelo clssico ou modelo de Michaelis-Menten e ilustra a influncia da concentrao do substrato sobre a velocidade da reao. Graficamente, o modelo de Michaelis-Menten pode ser representado: + = . +

Logo:

Logo:

Figura 2 - Representao grfica do modelo clssico (M.M) que mostra o efeito da [S] na velocidade da reao enzimtica

Anlise do Modelo Podemos fazer esta anlise considerando dois casos: a) Altas concentraes de substrato. Neste caso, pode-se observar:

Ou seja, a reao enzimtica se comporta como se fosse de ordem zero; b) Concentraes muito baixas de substrato. Neste caso, a reao se processa como se fosse de

primeira ordem. Ou seja:

Observao 01: a concentrao de enzima afeta a velocidade da reao e aumentando-se a concentrao da enzima, aumenta-se proporcionalmente a velocidade mxima da reao. Observao 02: Km, conhecida como constante de Michaelis-Menten, um indicativo da afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, quanto menor o Km, menor a afinidade (maiores taxas). Observao 03: Km corresponde a concentrao de substrato na qual a velocidade de reao metade da velocidade mxima.

Determinao dos Parmetros Cinticos Vmax (Vm) e Km O modelo obtido um modelo geral com dois parmetros cinticos importantes que so a velocidade mxima da reao (Vm) e a contante de Michaelis-Menten (Km). Cada enzima e seu substrato possui valores distintos de Vm e Km. Para que esse modelo tenha utilidade prtica e que possa ser aplicado numa reao particular, torna-se necessrio o conhecimento dos mesmos para se resolver a equao de projeto do reator. Para se obter estes parmetros, devemos ter dados experimentais, por exemplo a partir de um pequeno reator batelada, no qual se adiciona uma quantidade conhecida de substrato [S0] e de enzima [E0]. A partir do tempo inicial, se acompanha a concentrao do produto ou a concentrao do substrato com o transcorrer do tempo, assim, obtm-se a curva P versus t, ou S versus t.

Determina-se as velocidades em t=0 por: = = pares de V e S que so pontos do grfico v versus S. Esses pares de V e S convenientemente arranjados e ajustados ao modelo nos permitir a determinao dos parmetros | =0 | =0

Este valor para as velocidades corresponde ao valor de E0 e S0. Desta forma, possvel gerar vrios

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Determinao de Vm e Km Mtodo 1 mtodo de Lineweaver-Burk (duplo recproco) Neste mtodo toma-se o recproco de ambos os membros da eq. De Michaelis-Menten de tal modo que : 1/v versus 1/s apresenta uma relao linear do tipo y=ax+b com coeficiente angular a=Km/Vm e coeficiente linear b=1/Vm ou seja:

1 Km 1 1 = + v Vm S Vm

(01)

Logo com os pares 1/v e 1/s fazemos uma regresso linear e da tira se o coeficiente linear e calcula tira-se calcula-se Vm e ento determina-se Km pois o coeficiente angular obtido na regresso linear tambm conhecido.

Figura 3. Grfico do modelo de Linewaver-Burk

Esse mtodo 1 deixa as variveis dependente (v) e independente (S) bem separadas. Os melhores valores dos dados experimentais nas concentraes mais altas de substrato ou prximos a Vm ficam ento aglomerados prximos origem enquanto que os dados com medies menos precisas ficaro dispersos s mais longe da origem e tero um grande peso no clculo do coeficiente angular. Sendo assim, neste mtodo Km tem baixa preciso, j Vm tem boa estimativa neste mtodo. Devido a este fato, outros mtodos foram desenvolvidos para se determinar Vm e Km. Mtodo 2 Mtodo de Eadie-Hoftee Hoftee Este mtodo torna linear a relao entre v x v/s partindo da eq. De Michaelis Michaelis-menten, sendo Km o coeficiente angular e Vm o coeficiente linear. (02)

v = Vm Km

v S

Figura 4. Grfico do mtodo de Eadie-Hofstee

Neste mtodo, ambas as coordenadas contem a varivel v que est sujeita a grandes erros experimentais. Mtodo 3 Mtodo de Hanes-Woolf Woolf Relaciona (S/v x v):

S 1 Km = S + v Vm Vm
Graficamente:

(03)

Figura 5. Grfico do modelo de Hanes-Woolf

Cada um desses mtodos possuem pontos fracos seja no clculo de Vm ou de Km. Mtodo 4 Mtodo Grfico ou direto de determinao de Vm e Km Existe tambm o chamado mtodo grfico ou direto. Neste caso diretamente num grfico : os pares v e S so colocados

Figura 6. Grfico do mtodo grfico

Exemplo (7.7 Fogler) Determine os parmetros de Michaelis-Menten Vm e Km para a reao de decomposio da ureia pela urase. Sabendo que os dados cinticos so conhecidos e mostrados na tabela abaixo: S (kmol/m) V (kmol/m.s) 0,2 0,02 0,01 0,005 0,002

1,08

0,55

0,38

0,2

0,09

Usar os 3 mtodos e comparar. 1) Y=0,75+2,07.10-2X

1/Vm=0,78

Vm=1,33 km=2,76.10-2

Km/Vm=2,07.10-2

2)y=1,2216+2,44.10-2X Km=2,44E-2 Vm=1,2216

3)1,9846E-2+0,826X=y

Vm= 1,2106 Km=1,40E-2

Aula 06 17/03
Cintica Enzimtica (continuao) Obs: (cap. 5 do Fogler mtodo numrico-pg216-derivada no ponto inicial) Reaes enzimticas na presena de inibidores Quando certas substncias esto presentes numa reao enzimtica e provocam uma diminuio nas taxas da reao ns dizemos que tais substncias inibem a reao enzimtica. Essas substncias so chamadas inibidores e geralmente sua presena deve ser evitada no meio reacional. Temos inibidores que se ligam irreversivelmente molcula de enzima e anulam a atividade enzimtica, ou seja, a enzima perde sua funo cataltica. Dentre esses inibidores temos os ons de metais pesados tais como chumbo, mercrio, cdmio, etc. Cabe lembrar que esses ons podem ser removidos com o uso de agentes quelantes tais como o EDTA e Citrato. Outros tipos de inibidores so ditos reversveis, pois se dissociam mais facilmente aps se ligarem a enzima. Dentre esses inibidores ns temos:

1 Inibidores Competitivos 2 Inibidores No competitivos Obs: Tabela 3.7 (Bailey Ollis pg. 122) Classificao de inibidores Alm desses inibidores temos outros que se ligam ou ao substrato ou ao complexo ES e que tambm iro interferir negativamente sobre a atividade enzimtica. Definio - Atividade Enzimtica: Unidades de atividade enzimtica designa a quantidade de enzima que fornece certa quantidade de atividade cataltica sob determinadas condies padronizadas (pH, Temperatura, Concentrao de substrato e fora inica) para aquela enzima em particular. Por exemplo uma unidade de atividade de glicoamilase definida como a quantidade de enzima a qual produz um micromol de glicose por minuto numa soluo de amido a 4% , pH 4,5 e 60 C. 1) Cintica enzimtica na presena de inibidores competitivos

Um inibidor competitivo compete com o substrato para se ligar ao stio cataltico da enzima. Geralmente so substncias que possuem semelhana com o substrato. Um mecanismo proposto para cintica competitiva : E+SESE+P (01)

E+IEI

(02)

A partir desse mecanismo pode-se chegar na seguinte expresso que descreve a reao enzimtica quando um inibidor competitivo est presente no meio reacional.

v=

V mS I +S K m 1 + Ki

(03)

I Ap K m = K m 1 + Ki

(04)

v=

Vm S Ap Km + S

(05)

Graficamente:

Figura 1. Curva com e sem inibidor Michaelis Menten(Sem inibidor I=0(azul);Com inibidor I>0(vermelha))

Nota-se que o inibidor competitivo no altera a velocidade mxima da reao quando comparada aquela sem inibidor competitivo (I=0).

Figura 2. Grfico Lineweaver-Burk com e sem inibidor Um exemplo prtico de inibio competitiva pode ser observado no caso do antibitico sulfanilamida. A sulfanilamida tem estrutura molecular similar ao cido p-aminobenzico que utilizado pela clula para produzir um composto vital chamado cido flico. A sulfanilamida bloqueia esta rota bioqumica da bactria e acaba por mata-la. Obs: Os efeitos negativos do inibidor competitivo sobre a cintica enzimtica podem ser atenuados promovendo-se a reao em altas concentraes de substrato visto que nas altas concentraes de substrato as taxas se aproximam da velocidade mxima que no alterada na presena do inibidor competitivo. 2) Cintica enzimtica na presena de inibidor no competitivo

Os inibidores no competitivos podem se ligar ou a enzima ou ao complexo ES o que prejudicar a formao do produto, neste caso o mecanismo proposto : E+SESE+P (06)

E+IEIEIS

(07)

ES+IEIS

(08)

v=

ap Vm S Vm ap onde, Vm = I Km + S 1 + Ki

(09)

Neste caso Km no afetada porem a uma diminuio em Vm e consequentemente na velocidade da reao. Graficamente:

Figura 3. Curvas com inibidores no competitivos (a)Michaelis-Menten (b) Lineweaver-Burk

Observando o modelo, nota-se que, o inibidor no competitivo diminui a velocidade mxima da reao e assim a sua presena no meio reacional sempre dar menores taxas para reao, quando comparada com a reao sem o inibidor no competitivo. Inibio pelo substrato Muitas reaes enzimticas so inibidas quando a concentrao de substrato elevada, ou seja, a partir de uma concentrao crtica de um substrato, um aumento na concentrao do substrato provoca uma diminuio nas taxas, neste caso o mecanismo proposto :

E+SESE+P

(10)

ES+SES2

(11)

v=

Vm S
ap Km + S +

(12)

S K si

Graficamente:

A inibio dominante nas altas concentraes de substrato e pode-se mostrar que Scritico que a concentrao de substrato a partir da qual a velocidade comea a diminuir.

Aula 07 22/03
(3.34 Shuler inibio pelo substrato) Determinao de Kmap, Ksi e vm Neste modelo, para se determinar tais parmetros, devemos fazer algumas consideraes: 1Faz-se a reao com baixas concentraes de substrato. Nessa situao S2/Ksi1 e o efeito =

inibitrio do substrato praticamente no observado, e a equao da taxa pode ser escrita como: 1+

Logo, podemos usar um dos mtodos de linearizao (L.B, H.W. e E.H) e assim se obtm Kmap e vm 2Para se obter o Ksi, obtm-se dados cinticos com elevadas concentraes de substrato onde a = inibio predominante. Neste caso Kmap/S21 1+

Assim, linearizando a equao a cima por um dos mtodos vistos, e com os pares v e S (S>critico), obtm-se Ksi e vm. Exemplo 1: a hidrlise da uria pela urase sofre com um tipo de inibio. Os seguintes dados foram obtidos para esta reao de hidrlise:

S=0,2M 1.v-1 0,22 0,33

12 I 0 0,00 0,51 27 0,76 0,00 0,00

44 0,88 61 1,10 8 1,15 93 0,00 0,00 0,00

S=0,0 2M 1.v-1 0,68 1,02 1,5 1,83 2,04 2,72 3,46

I 0 0,0 013 0,0 022 0,0 032 0,0 037 0,0 044 0,0 057

abc-

Determine a constante de MM: Qual tipo de inibidor esta presente? Qual a constante de inibio? S(g.L1)

Ex: foram obtidos os seguintes dados cinticos para uma reao enzimtica: V(E0=0,015 g.L ) 1,14 0,87 0,7 0,59 0,50 0,44 0,39 0,35
-1

V(E0=0,00875 g.L-1)

20 10 6,7 5 4,0 3,3 2,9 2,5

Aula 08 24/03
Grfico de LB com inibio de substrato ****** fazer

Projeto de reatores enzimticos

Como vimos, o modelo mais utilizado para representar a velocidade de uma reao enzimtica o modelo clssico (ou modelo de MM) ou outros modelos que se baseiam no modelo clssico e que descrevem situaes particulares, como por exemplo fenmenos de inibio. Assim,basta aplicar a equao da velocidade na equao de projeto do reator e assim resolvendo a equao de projeto juntamente com a equao da velocidade, ns podemos determinar por exemplo o tempo para que a reao atinja uma dada converso ou o volume do reator necessrio para produzir uma certa quantidade de produto.

1-

Reatores batelada ou descontnuos = na equao acima, e as condies iniciais S(t=0)=S0 e S(t)=S, integrando

[ENTRA] - [SAI] + [REAGE] = [ACMULO]

Vamos considerar obtemos:

. ln

Logo, a equao acima nos permite calcular implicitamente o tmepo necessrio para que S0 diminua at um valor de S qualquer. Pode-se escrever em termos de converso:

. ln 2Reatores contnuos agitados (CSTR) Q=vazo volumtrica(Qe=Q=cte) Se=[S] na alimentao Pe=[P] na alimentao (Pe=0) V=volume reacional (cte)

1 1

[ENTRA] - [SAI] + [REAGE] = [ACMULO] . . Definindo D=Q/V=tava de diluio temos: = No estado estacionrio: = = 1 + . . = = .

Considerando a equao da taxa de MM obtemos:

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Reatores enzimticos (continuao)

-Reatores batelada . ln -Reatores CSTR

1 1 = .

= + .

-Reatores PBR (com enzimas imobilizadas) . Onde x=converso Se= [S] na alimentao = porosidade do leito = / = . ln 1 + .

Q a vazo volumtrica

 = tempo de residncia *Referncia: Gacesa e Hubble-Tecnologia de enzimas captulo 4. Determinao dos parmetros cinticos Vm e Km utilizando os dados obtidos do reator

1-

Reatores batelada

Neste caso a Equao 1 pode ser reescrita como: 1 . ln 1 1 =

. ex
.

Esta uma Equao da reta do tipo y=b-ax, onde y dado por . ln

.

, logo . . ln

uma reta com coeficiente angular -1/km e com coleficiente linear

. Assim, com uma regresso linear,

calculamos o km e conhecendo km e o coef, linear determinamos o Vm. -Reatores CSTR A Equao 2 pode ser reescrita como . = 1

Novamente temos uma equao da reta (S/X) vs. (X/1-X), logo, faz-se vrios experimentos com diferentes vazes que na alimentao e coleta-se os dados no regime estacionrio para uma dada vazo, reorganiza-se os dados na forma linear acima e faz-se a regresso linear e determina-se Km e Vm. Exerccio 1- 7.8 do Fogler) Considere a reao de decomposio da uria pelo ureiase vista anteriormente. Considere essa reao efetuada em um reator batelada sobre as mesmas condies para uma dada concentrao de enzima utilizada para obter os dados vistos no exemplo. Pergunta-se: a) Determine o tempo necessrio para atingir uma converso de 90 % quando a concentrao inicial da uria for Cao=0,02 mol/L. b) Determine o tempo necessrio para atingir esta mesma converso no caso de a concentrao da enzima ser o dobro da utilizada anteriormente.

Exerccio 2) Fazer o exerccio 7-11 do Fogler. Cintica da desativao enzimtica Como vimos, as enzimas so molculas proticas de configurao complexa que atuam como catalisadores que so sensveis as condies fsico-quimicas ambientais, ou seja, podem sofrer desnaturao. No decorrer das reaes enzimticas a desativao ou desnaturao da enzima ocorre com uma dada velocidade (taxa) que dependera da estrutura da molcula e das condies do processo. Logo,

a quantidade de enzima ativa responsvel pela transformao do substrato em produto pode diminuir consideravelmente durante a reao. Assim, torna-se importante conhecer a cintica da desativao enzimtica. Um modelo proposto de desativao enzimtica o da desativao irreversvel de primeira ordem com relao enzima ativa (Ea), ou seja:

Onde kd a constante de desativao. Como uma desativao de primeira ordem, temos: = | =

.

. =

Com

Logo: (2)

A Equao 2 mostra que a concentrao da enzima ativa diminui exponencialmente com o tempo. Logo este fenmeno de desativao pode ser levado em conta nos modelos cinticos. Na obteno de MM, vimos que logo quando a concentrao de enzima ativa diminui, devido desnaturao irreversvel de se esperar que a velocidade mxima tambm diminua. = (3)
/

A estabilidade das enzimas pode ser dada pelo tempo de meia vida =

, ou seja, o tempo necessrio

para que a atividade enzimtica seja reduzida para a metade, ou seja, o tempo de meia vida dado por:
/

(4)

Exerccio 3) Utilizando um reator batelada, obter uma equao considerando a desativao enzimtica de primeira ordem.

Aula 10 31/03
Modelo cintico para enzimas regulatrias SE APLICA A DADOS QUE SE COMPORTEM DE FORMA SIGMOIDAL = = (1)

n= coeficiente de cooperatividade n>1 cooperatividade positiva n<1 Cooperatividade negativa Representao grfica do modelo (1)

Determinao de n: temos Logo: =

Assim: ln Obtm-se o grfico linearizado de ln = versus , obtendo por regresso os parmetros n e Km.

IMOBILIZACAO DE ENZIMAS (REF SHULER 3.4)

Vimos at o momento a reao enzimtica com as enzimas livre, isto , tais molculas tinham a liberdade de se movimentar por todo o volume reacional o que traz algumas desvantagens como por exemplo a instabilidade, rpida perda da atividade cataltica e tambm a reutilizao j que separ-las do meio aps a reao teria altos custos, logo tambm teremos a contaminao do produto com as enzimas. A imobilizao de enzimas refere-se a restrio da mobilidade da molcula num dado espao. A imobilizao de enzimas traz inmeras vantagens tais como a sua reutilizao e eliminao dos processos de recuperao e purificao da enzima. Tambm, a imobilizao pode fornecer um ambiente melhor para a atividade enzimtica o que pode conferir uma maior estabilidade e faixas mais amplas de pH e temperatura de ao. Como, as enzimas so caras a reutilizao do catalisador ser vital em muitos processos. Com a imobilizao a pureza do produto melhorada e tambm diminui os problemas com tratamentos de efluentes, ainda as enzimas imobilizadas podero sofrer menores interferncias de inibidores ou ativadores. A enzima livre normalmente imobilizada em um suporte inerte, como por exemplo vidro poroso, slica, entre outros que veremos a seguir. O suporte pode ser tambm ser chamado de matriz e onde as enzimas ficaram grudadas. Alem de inerte, ou seja, no podem sofrer decomposio fsica, qumica ou bioqumica nas condies do processo, tambm devera ser obviamente um suporte insolvel.

O principal interesse em imobilizar uma enzima obter um bio catalisador com atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo( no apenas a reao em si mas o bombeamento em si entre outros) em comparao com sua forma livre. As enzimas tambm podem ser imobilizadas entre membranas semipermeveis, neste caso haver um processo a aquele que ocorre para as enzimas intra celulares. Mtodos de imobilizao Os principais mtodos de imobilizao so ilustrados na figura abaixo, onde temos os dois principais que so o aprisionamento das molculas ou a imobilizao em superfcies, seja por adsoro das enzimas ou a imobilizao por ligao covalente das molculas. Figura(3.16 Shuler, pg 79) Mtodo de Aprisionamento de Enzimas O aprisionamento de enzimas consiste no enclausuramento de molculas de enzima em um pequeno volume. Neste caso nos temos o aprisionamento em gis ou polmeros e tambm as molculas podero ficar aprisionadas entre membranas incluindo a micro encapsulao. A imobilizao por aprisionamento pode ser efetuada utilizando materiais polimricos como por exemplo o alginato de clcio (clcio o sdio) o Agar, k-carragena, gis de poli-acril-amida e colgeno. Neste caso mistura-se uma soluo com enzimas livres e polmero antes que a reao de polimerizao seja efetuada, garantindo que as molculas de enzimas fiquem aprisionadas na rede polimrica aps a reao de polimerizao. Tambm para o aprisionamento podem ser utilizadas membranas como as de nylon, celulose, polisulfonas e poliacrilatos. importante que os poros da membrana sejam capazes de reter as molculas de enzima que possuem alto peso molecular, mas que permitam a passagem de compostos com baixo peso molecular como do seu substrato e produto. O aprisionamento entre membranas embora possua algumas vantagens da imobilizao j mencionadas tambm apresenta algumas limitaes como por exemplo limitaes difusionais e surgimento de um micro ambiente desfavorvel e tambm muitas das molculas aprisionadas podem escapar para o ambiente externo contaminando o produto. Para o caso das limitaes difusionais (fenmenos intrnsecos da transferncia de massa) deve-se trabalhar o dimetro da partcula ou o dimetro do poro.

Aula 11 05/04
Imobilizao Superficial
As molculas de enzima podem ser imobilizadas sobre a superfcie de materiais que so chamados de suportes ou matrizes. Temos dois tipos principais de imobilizao superficial.

a) Imobilizao por adsoro b) Imobilizao por ligaes covalentes

Imobilizao por Adsoro

A adsoro refere-se ligao de molculas de enzimas sobre a superfcie de um suporte por foras fracas, por exemplo, as de Wan der Waals. O stio ativo da enzima neste caso, da molcula

adsorvida, normalmente no afetado e a molcula retm a atividade aps a adsoro. Uma desvantagem da imobilizao por adsoro o fenmeno da dessoro das molculas, principalmente na presena de foras hidrodinmicas elevadas ou por alteraes no microambiente. Quando o fenmeno da dessoro das molculas torna-se um problema, resolve-se promovendo um conjunto de ligaes cruzadas (crosslinking) das molculas adsorvidas, o que pode estabiliza-las e aprisiona-las sobre a superfcie do suporte. O cross-linking das molculas pode ser efetuado utilizando-se glutaraldedo. Entretanto, o so do glutaraldedo poder desnaturar algumas molculas. Dentre os suportes ou matrizes utilizados para adsorver as enzimas temos materiais inorgnicos como: alumnio, slica, vidro poroso (CPG), cermicas, terra diatomcea, argilas, entre outros. Tambm existem matrizes orgnicas formadas por celulose, por exemplo, CMC (carboximetilcelulose) e DEAE celulose (dietilaminoetil), amido, carvo ativado e resinas de troca inica comerciais (que foram otimizadas) como a amberlite, Sephadex e Dowex. As superfcies destes materiais normalmente precisam passar por um pr tratamento (ativao) que pode ser qumico ou fsico para que a mobilizao por absoro seja efetuada.

Imobilizao por Ligao Covalente

quando se promove a reteno das molculas sobre a superfcie de um suporte por ligaes covalentes. Isto efetuado quando certos grupos funcionais tais como grupos amino, carboxlicos, hidroxilas e sulfidrilas interagem covalentemente com o suporte. Obviamente, tais grupos no podem ser do stio ativo. Para se evitar a perda do stio ativo da enzima na imobilizao covalente promove-se o bloqueio do stio ativo utilizando, por exemplo, um inibidor competitivo, que garante proteo ao stio ativo. O inibidor descartvel aps a inibio covalente. Os grupos funcionais do material suporte so normalmente ativados utilizando-se reagentes qumicos como por exemplo, brometo de cianognio (ativa grupos hidroxilas), (...). Os grupos ligantes presentes na molcula de enzima so normalmente os grupos ou resduos laterais dos aminocidos (...) os grupos amino e carboxlico presentes em ambas as extremidades da cadeia polipeptdica.

Aula 12 07/04
(CONT.) imobilizao enzimas
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tabela 3.3 do shuler: isso no cai na prova, despenca! (piadinha idiota do Lucenae Cerevisae) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Estudar: Suportes para imobilizao de enzimas? Como feita a imobilizao por adsoro? Cap. 6 Tecnologia de ls enzimas Gacesa e Hubble --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Alm do glutaraldedo podemos efetuar as ligaes cruzadas entre as molculas de enzima (cross-link) utilizando a bis-diazobenzidina e o cido 2,2-dissufnico. Quando as molculas em soluo so submetidas a esses agentes formar-se- um agregado de molculas insolvel. Para se fazer o crosslinking de molculas de enzima adsorvidas, o suporte (adsorvente) dever ser impregnado com soluo da enzima de tal modo a preencher todos os poros, em seguida dever ser submetido aos agentes crosslinking (normalmente glutaraldedo). Mas uma vez quando se faz as ligaes cruzadas entre enzimas haver uma perda significativa da atividade bem como severas limitaes difusionais (molcula tem dificuldade de passar pela rede e reagir). Caractersticas desejveis para o suporte ou matriz visando imobilizao

O tipo de material suporte mais indicado para uma dada imobilizao vai depender da enzima e da aplicao particular. Os dois principais critrios usados na seleo de um material suporte so: 1. A capacidade ligante do suporte, ou seja, o nmero de grupos funcionais, a densidade de carga, a

porosidade e hidrofobicidade do suporte. 2. A estabilidade e reteno da atividade enzimtica, o qual depender dos grupos funcionais do

suporte e das condies microambientais. Se a imobilizao provocar alteraes conformacionais na enzima ou se grupos reativos envolvidos na imobilizao estiverem no stio ativo com certeza haver perda de atividade. Cabe lembrar que normalmente as molculas imobilizadas ganham maior estabilidade ou at mesmo aumento de atividade. Tambm durante a imobilizao a molcula de enzima poder ter seu stio ativo orientado de tal forma que impedir o acesso do substrato (efeito estril). A figura abaixo ilustra algumas consequncias da imobilizao das enzimas

Figura 7. Imobilizao de enzimas

Normalmente enzimas cujo substrato seja de alta massa molecular ter sua atividade reduzida aps a imobilizao o que ocorre em menor extenso para as enzimas cujo substrato possui baixa massa molecular. Isto ocorre principalmente devido a impedimentos estricos. Por exemplo, substrato de alto peso molecular como a casena e o amido, cujo peso molecular comparvel ao das enzimas podem no ser capazes de atingir o stio ativo da molcula da enzima imobilizada. A imobilizao normalmente afeta a estabilidade trmica das enzimas, em geral a estabilidade trmica melhora j que haver a presena de barreiras difusionais trmicas e menor agitao e deformao das molculas que se encontram imobilizadas.

Tambm a estabilidade com relao ao pH normalmente aumenta aps a imobilizao.

Resumindo: Quando a enzima imobilizada haver mudanas na atividade comparadas com a enzima livre. Isto pode ser devido a diversos fatores como, por exemplo, mudanas conformacionais da molcula aps a imobilizao e tambm a imobilizao poder dificultar o acesso do substrato ao stio ativo da enzima. Tambm poderemos ter efeitos de partio que nada mais que as diferenas de concentrao (de enzima, substrato, cofatores, etc) entre o seio do meio reacional e a pelcula ou filme estagnado que se encontra ao redor da partcula. E assim, essas diferenas implicaro em diferentes atividades. Tambm, a imobilizao promover o surgimento de efeitos difusionais de Transferncia de massa, que pode ser de 2 tipos: os internos referentes aos poros do suporte e os externos referentes a presena da pelcula estagnada ao redor da partcula. Assim, se a velocidade da reao for maior que a velocidade de difuso do substrato na pelcula, a concentrao do substrato na superfcie ser menor que na soluo. A espessura desta pelcula poder depender das condies de fluxo hidrodinmico ao redor da partcula. A resistncia interna T.M. tambm aparece para as enzimas imobilizadas em partculas porosas. Novamente a velocidade da reao poder fazer com que a concentrao do substrato diminua j que a difuso poder ser mais lenta. A velocidade observada depender da difusividade do substrato, da porosidade da partcula, da concentrao de substrato no seio do lquido e da cintica enzimtica.

Aula 13 12/04
Aplicaes da catlise enzimtica (= uso das enzimas)
As enzimas utilizadas pelas indstrias qumicas e farmacuticas provem em sua grande maioria de processos fermentativos onde se cultiva um determinado micro-organismo num processo fermentativo que conduz a enzima de interesse. Tambm algumas enzimas podem ser obtidas de tecidos de plantas e/ou animais. Dentre as de utilizao industrial as proteases so as mais utilizadas pela indstria representando cerca de 60% do mercado de enzimas. As proteases podem ser utilizadas pelas indstrias de alimentos, panificao, fabrico de queijos em amaciantes de carne e tambm nas indstrias de detergentes, pois sua adio melhora a eficincia na remoo de manchas proteicas. As lpases tambm so importantes pois hidrolisam lipdios produzindo cidos graxos e glicerina e so utilizadas tambm na industria de detergentes, de processamento de leos vegetais, em laticnios, e na produo de biodiesel. As amilases so utilizadas na hidrlise do amido sendo as mais importantes a -amilase, a -amilase e a glico-amilases. So utilizadas na formao de detergentes, na indstria txtil para desengomao de tecidos, na produo de aucares pela sacarificao de amidos. Outras enzimas importantes so as pectinases utilizadas nas indstrias de suco de frutas e indstrias de vinhos, pois melhoram o rendimento, reduzem a viscosidade e a turbidez. As celulases (na verdade um complexo enzimtico) so usadas na hidrlise da celulose e so utilizadas por algumas indstrias de processamento de cereais, produo de lcool a partir de resduos lignocelulsicos como palhas e cascas de cereais cuja tecnologia est em desenvolvimento.

Dentre o uso mdico, as enzimas podem ser utilizadas em diagnsticos como, por exemplo, o uso da glicose oxidase na determinao no nvel de glicose do sangue na urina. Tambm podem ser utilizadas em terapias, como por exemplo a tripsina, uma enzima digestiva que pode ser utilizada pro pessoas que tiveram o estmago removido(por cncer). Tambm a lisozima que utilizada como bactericida, pois hidrolisa a parede celular de bactrias gram-positivas. Outra importante aplicao da catalise enzimtica no campo mdico e que tem salvo milhares de vidas no mundo o uso da estreptoquinase em conjunto com o TPA (Tissue Plasminogen Activatar) utilizada na dissoluo de cogulos presentes nas artrias de recm infartados. Outra importante aplicao industrial das enzimas a converso do fumarato para aspartato utilizando a aspartase. O aspartato utilizado para produzir o aspartame um adoante (edulcorante) de baixa caloria. Tambm, outra aplicao a converso da glicose para frutose pela enzima glicose isomerase. A frutose cerca de 1,5 vezes mais doce que a glicose, sendo bastante utilizada na industria de refrigerantes e sucos. Enfim, as enzimas tem inmeras aplicaes incluindo o desenvolvimento de bio-sensores capazes de monitorar substncias esprecificas em um meio complexo. TABELA 3.5 shuler enzimas de importncia industrial. Cap. 7 do Gacesa Xerox Consideraes sobre a utilizao das enzimas

O critrio de viabilidade econmica de um processo est estritamente relacionado com as normas legais tanto para as operaes que fazem parte do processo, como para a pureza do produto final. Muitas das restries legais se referem a assuntos de segurana que afetam os equipamentos usados no processo bem como o direcionamento do produto final. No caso de materiais biolgicos e bioprodutos a diversas reas que apresentam risco potencial com efeitos nocivos: 1. 2. 3. 4. Microbiolgica Toxidade qumica Toxidade relacionada com a atividade enzimtica Reaes alrgicas;

Os problemas oriundos da atividade microbiolgica dependero do micro-organismo selecionado como agente produtor e devero refletir-se nas medidas de segurana incorporadas no processo de produo. Os produtos destinados ao consumo humano necessitam cumprir todos os critrios de pureza que assegurem nenhum risco de contaminao qumica ou microbiolgica. A toxidade qumica geralmente advm de substncias produzidas no metabolismo secundrio dos micro-organismos, como por exemplo, as mico toxinas e as aflo toxinas, a produo de metanol na fermentao alcolica, etc. A toxidade relacionada com a atividade enzimtica pode ser vista, por exemplo, no caso das enzimas proteolticas utilizadas na produo de detergentes. A inalao do p pelos operadores pode provocar

leses nos brnquios pulmonares com graves consequncias. Logo, deve-se tomar todo cuidado na manipulao destas substncias especialmente as que se encontram na forma de p, que podem ser inalados, ou de lquidos concentrados que podem causar leses tipo custicas na pele e mucosas. Logo o contato deve ser evitado. Tambm o contato com material biolgico estranhos pode causar uma resposta imunolgica que pode se agravar ao longo do tempo provocando uma resposta alrgica que poder ser grave e em alguns casos fatal dependendo do organismo.

Aula 14 14/04 Processos fermentativos

Figura 8. Processo Fermentativo genrico

Um processo fermentativo envolve um conjunto de operaes e tcnicas envolvidas na transformao de um dado substrato num produto de interesse econmico e estas transformaes sero efetuadas por um micro-organismo especialmente selecionado para aquela transformao em particular a nvel industrial. Denominamos fermentao estas transformaes efetuadas sob determinadas condies controladas de pH, temperatura, de nutrientes, de aerao, etc. Isso se processa dentro de um bio-reator tambm conhecido como fermentador ou dorna de fermentao. A nvel industrial esses fermentadores apresentam de dezenas a milhares de litros.

O sucesso de um dado processo fermentativo depende muito da correta definio de quatro pontos bsicos: 1. 2. 3. 4. A escolha do micro-organismo; A formulao do meio de cultura; A forma de conduo do processo fermentativo (contnuo, batelada, etc); As etapas de recuperao do produto.

Na verdade esses 4 pilares de um processo fermentativo interagem enormemente sendo necessrio defini-los de forma conjunta levando em considerao os aspectos bioqumicos e econmicos o que pode ser complexo. Os micro-organismos devem reunir um conjunto de caractersticas de forma a serem indicados para uma aplicao industrial. Tais caractersticas desejveis veremos adiante. O meio de cultura e a matria prima utilizada para obt-lo tambm deve possuir caractersticas para ser utilizado numa aplicao industrial como, por exemplo, ser de fcil obteno e exigir o mnimo de tratamentos prvios e obviamente conter o substrato que ser transformado no produto. Com relao s formas de conduo do processo fermentativo estas podem ser dimensionadas para operao contnua ou descontnua (batelada), cada uma com suas caractersticas prprias de controles fsico-qumicos. Cabe lembrar que cada uma delas apresenta vantagens e desvantagens que veremos mais adiante. Com relao a recuperao do produto vai depender das caractersticas deste produto, a elaborao de estratgias com a seleo de um conjunto de operaes unitrias a serem utilizadas numa sequencia at a obteno do produto final na forma desejada, que dever obedecer normas legais dependendo de sua aplicao, por exemplo, consumo humano ou animal. Alm disso, no se pode esquecer dos tratamentos dos efluentes produzidos de tal modo que a produo tenha maior impacto possvel. Todas as etapas que se seguem aps a fermentao so denominadas de tratamentos downstream, e so da mais alta importncia para o rendimento final do produto. Em geral deve-se estabelecer o menor nmero de operaes downstream para maximizar o rendimento do produto. Alm dos aspectos econmicos envolvidos.

Substratos e matrias primas para o processo de fermentao industrial

A maioria dos substratos utilizados nas fermentaes industriais direta ou indiretamente originado de produtos agrcolas, em geral, os processos de fermentao tem a vantagem de serem versteis com relao a matria prima, adaptando-se como seja conveniente de acordo com a disponibilidade e custo da matria prima. Em geral, a matria prima para uso industrial deve possuir maior nmero das seguintes caractersticas desejveis:

1. prvio; 2.

Ser o mais barato possvel, ou seja, ser de fcil obteno e exigir pouco o nenhum tratamento

A matria prima deve conter o substrato e atender as necessidades nutricionais do micro-

organismo, para que este se desenvolva e produza o produto desejado; 3. Deve auxiliar no controle do processo, ou seja, no causar dificuldades como variaes drsticas

no pH ou produo de espuma excessiva; 4. No provocar problemas na recuperao do produto, por exemplo, possuir alta viscosidade o que

aumenta custos com energia para filtrao; 5. A matria prima deve ser de fcil estocagem e permitir algum tempo de armazenamento a fim de

estarem sempre disponveis ; 6. 7. Deve ter composio razoavelmente fixa; No causar dificuldades no tratamento final dos efluentes.

Tipos de matrias primas

1.

Matrias primas amilceas: o substrato principal o amido que um polissacardeo formado por

molculas de glicose unidas atravs de ligaes glicosdicas -1,4. O amido est presente em cereais como trigo, milho, cevada e arroz, e tambm em batatas, mandiocas, e outros tubrculos. Todas as metrias primas amilceas podem ser utilizadas na obteno de lcool etlico de qualidade destinado as indstrias de perfumes e cosmticos, de licores, cervejas, saqus, etc. 2. Matrias primas celulsicas: Neste caso o substrato principal a celulose, e tambm um polissacardeo formado por molculas de glicose unidas por ligao -1,4. As matrias primas celulsicas so obtidas dos resduos agrcolas como cascas de cereais e suas palhas, bagaos de frutas, sabugo de milho, serragens, e outros resduos das indstrias madeireiras e de mveis. Tambm so chamadas matrias primas lignocelolsicas. Tais matrias primas apresentam baixo teor de nitrognio e sais minerais, podem ser utilizadas na produo de protena unicelular (SCP Single cell protein) e tambm na produo de etanol celulsico que tem ganhado importncia nos ltimos anos, visto que os resduos lignocelulsicos so os mais abundantes no mundo (matria prima barata). 3. Matria prima proteica: Neste caso o substrato principal so as protenas solveis. Por exemplo, o

sub produto da industrializao do milho, conhecido como milhocina ou gua de milho, contm protenas solveis e sais minerais que podem ser utilizados na produo de antibiticos por fermentao , tambm o soro do leite uma matria prima proteica que alm das protenas solveis contem a lactose que um dissacardeo composto por glicose mais galactose, que pode ser tambm um substrato dessa matria prima. 4. Matrias primas diversas: Alm das anteriores, outras podem ter importncia, como por exemplo os

hidrocarbonetos, tanto alifticos como aromticos, que podem ser utilizados na produo de compostos orgnicos oxigenados como gorduras, steres, cido saliclico, lcool, e protena unicelular, tambm as

algas e plantas marinhas, que so ricas em glicdios e protenas podem ser utilizadas na produo de acetona; tambm os esteris encontrados em vegetais superiores, podem ser utilizados na produo de hormnios, etc.

Tratamentos da matria prima

1. O amido deve ser sacarificado previamente, caso os micro-organismos a serem utilizados no

produzam enzimas, do tipo amilases. A sacarificao do amido consiste na sua hidrlise, liberando aucares como glicose e maltose. A sacarificao pode ser efetuada por mtodos qumicos (hidrlise cida ou bsica) ou por via bioqumica (utilizao de enzimas, as amilases). A hidrlise enzimtica a preferida pois feita de forma branda e conduz a uma sacarificao limpa do amido evitando problemas de

corroso comuns na hidrlise cida e tambm produz um mosto ruim (mosto o caldo que ser fermentado). As enzimas amilases existem naturalmente em alguns gros maltados e tambm so produzidas por alguns fungos e bactrias. A amilases de origem vegetal so uma combinao de e amilase, um exemplo a fabricao da cerveja na qual a cevada germinada (o malte) contem amilases em grandes propores que sacarificam o amido do gro liberando aucares utilizados pela levedura na produo da bebida alcolica. Dentre os micro-organismos que produzem amilases podem citar o Aspergilus Nger. Para que o amido seja sacarificado pela enzima necessrio estar disperso numa soluo (amido solvel), consegue-se isso fazendo o cozimento do amido. 2. Celulose: Os resduos lignocelulsicos quando hidrolisados fornecem aproximadamente 70% de

monossacardeos como glicose, frutose, xilose. E aproximadamente 30% de lignina. A lignina atua como uma barreira para o acesso da enzima a cadeia de celulose, logo, tais resduos precisam de tratamentos prvios para remoo da maior parte da lignina, dentre estes temos: o alcalino quando se utiliza NaOH a cerca de 4% em temperatura elevada ou soluo de perxido de hidrognio(H2O2) conhecido como tratamento oxidativo. Tambm existe o mtodo de exploso por vapor, quando o matria submetido a vapor e altas temperaturas e uma reduo rpida na presso promove uma exploso na cadeia lignocelulsica, todos estes mtodos objetivam expor a cadeia de celulose, tornando-a suscetvel ao ataque enzimtico.

Aula 15 19/04 Micro-organismos de interesse industrial

Fontes de micro-organismos de interesse
Os micro-organismos para uso industrial podem ser obtidos das seguintes formas principalmente: 1. Isolamento a partir de recursos naturais: os micro-organismos esto presentes no solo, na gua,

nas plantas, em resduos em decomposio, etc. Porm a obteno de micro-organismos a partir destes recursos exigir muito trabalho experimental e custos altos devido a enorme flora microbiana a ser

pesquisada. No entanto o trabalho de pesquisa tem enorme importncia na obteno de novas linhagens de interesse industrial, ou seja, espcies bastante eficientes na transformao do substrato no produto de interesse. O isolamento de novas linhagens deve ter inicio com certas premissas e objetivos bem definidos, visto que h uma disponibilidade muito grande de espcies at que haja convergncia para o processo ou produto que se deseja produzir. 2. Compra em colees de culturas: muitas espcies podem ser adquiridas em colees de cultura,

como por exemplo, o Centro de Culturas Tropicais (CCT). Neste caso preciso saber qual espcie de micro-organismo de interesse e ento faz-se a compra. Normalmente os micro-organismos so disponibilizados na forma de p liofilizado contido em pequenas ampolas e no laboratrio da indstria promove-se a preparao do inoculo em volumes crescentes at se atingir um volume suficiente para inocular o bio-reator. 3. Obteno de mutantes naturais: Devido a sua alta taxa de crescimento podero surgir espcies

mutantes dentro da populao original. Tais mutaes espontneas podero conduzir a espcies interessantes para uso industrial, por exemplo, maior eficincia na transformao de substrato em produto. Tais mutaes naturais so aleatrias e imprevisveis, o que pode no ser interessante aguardar as linhagens. 4. Obteno de mutantes induzidos: Como vimos anteriormente pode ser dispendioso aguardar o

surgimento de linhagens mutantes, para isso, lana-se mo de tcnicas prprias capazes de induzir a mutao numa dada populao, por exemplo, pode-se submeter uma dada populao de microorganismos de interesse ao de agentes mutagnicos, como raios ultravioletas, ou substncias qumicas (como a nitrosoguanidina). Todo esse processo de seleo de mutantes caro, mas todo esforo pode ser recompensado como, por exemplo, o que houve com a indstria de antibiticos, quando linhagens de Penicillium chrysogenum que produz a penicilina, cujo processo sofreu significativas melhoras desde a descoberta. 5. Obteno de micro-organismos recombinantes: Neste caso a engenharia gentica e seus avanos

possibilitam a criao de espcies capazes de produzir substncias que originalmente no eram capazes, para isso, genes especficos de espcies diferentes so combinados na cadeia gentica do microorganismo, que ento se desenvolve com as novas caractersticas genticas, por exemplo, o microorganismo receptor uma espcie bem conhecida fisiologicamente como a levedura Sacaromices cerevisiae e a bactria Escherichia coli.

Caractersticas desejveis de micro-organismos de interesse industrial

Os micro-organismos tambm devem reunir um conjunto de caractersticas, para que seja utilizado em um processo larga escala. Dentre as caractersticas desejadas, temos:

1. Apresentar elevada eficincia na converso do substrato em produto: a matria prima pode pesar
significativamente no custo final do produto, logo, o micro-organismo a ser utilizado dever ser capaz de converter o substrato no produto de forma eficiente.

2. Permitir o acmulo do produto no meio: ao transformar o substrato no produto o micro-organismo

deve ter a capacidade de tolerar as mais elevadas concentraes de tal forma a reduzir os custos nas operaes de recuperao, separao e purificao do produto, ou seja, o micro-organismo dever sofrer o menos possvel com os fenmenos de inibio pelo produto.

3. No produzir substncias incompatveis com o produto: durante o seu crescimento, os microorganismos produzem diversas outras substncias alm do desejado e tais substncias no podero interferir negativamente com o produto de interesse, por exemplo, a produo da glico-amilase por aspergillus. A glico-amilase a enzima que hidrolisa o amido, produzindo glicose muito utilizada na industria de alimentos. Ocorre que alguns micro-organismos produtores de glico-amilase tambm produzem a trans-glocosidase, uma enzima que promove a polimerizao da glicose, e que no pode mais se hidrolisada pela glico-amilase.

4. Apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico: neste caso, no basta apenas o microorganismo ser bom produtor da substncia desejada, caso ele no tenha constncia desejada, que dever se manter durante todas as etapas do processo, ou seja, o micro-organismo dever ter comportamento previsvel em todas as etapas do processo fermentativo.

5. No ser patognico: por razes bvias os micro-organismos no podero ser causadores de

doenas exceto nos casos especficos, como vacinas, etc. Neste caso todos os cuidados de manipulao e isolamento da produo devero ser observados com critrios rgidos.

6. No exigir condies de processo muito complexas: a operao de bio-reatores e os controles de

processo desempenham um papel fundamental, logo, os micro-organismos devero suportar condies de operao de tais reatores reais, e todos problemas envolvidos com a transferncia de massa (de nutrientes, de oxignio, etc.), e de transferncia de calor.

7. No exigir meios de culturas caros: Neste caso, a matria prima dever sofrer o mnimo de prtratamentos, seja de tratamentos fsicos ou qumicos, como adio de suplementos e nutrientes.

8. Permitir uma rpida liberao do produto para o meio, obviamente estamos lidando com a cintica
da produo e quanto mais rpida, melhor visto que as operaes subsequentes dependem da liberao do caldo fermentado.