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Colunas HPLC
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01_Altdorf, Switzerland 02_Amsterdam, Netherlands 03_Ardea, Italy 04_Athens, Greece 05_Atsugi, Japan 06_Aubonne, Switzerland 07_Auckland, New Zealand 08_Bangkok, Thailand 09_Bari, Italy 10_Barra do Corda, Brazil 11_Beijing, China 12_Beirut, Lebanon 13_Belgrad, Serbia 14_Bogot, Colombia 15_Boston, USA 16_Bratislava, Slovakia 17_Brisbane, Australia 18_Brussels, Belgium 19_Bucharest, Romania 20_Budapest, Hungary 21_Buenos Aires, Argentina 22_Bunschoten, Netherlands 23_Cairo, Egypt 24_Calais, France 25_Cambridge, Canada 26_Caracas, Venezuela 27_Carlos Spegazzini, Argentina 28_Casablanca, Morocco 29_Chilly-Mazarin, France 30_Chilworth, United Kingdom 31_Coinsins, Switzerland 32_Copenhagen, Denmark 33_Corsier-sur-Vevey, Switzerland 34_Dammam, Saudi Arabia 35_Darmstadt, Germany 36_The Hague, Netherlands 37_Dietikon, Switzerland 38_Dijon, France 39_Dubai, United Arab Emirates 40_Dublin, Ireland
41_Durham, USA 42_Espoo, Finland 43_Mexico City, Mexico 44_Etobicoke, Canada 45_Feltham, United Kingdom 46_Fontenay-sous-Bois, France 47_Fourways, South Africa 48_Frankfurt a. M., Germany 49_Frederiksberg, Denmark 50_Geneva, Switzerland 51_Gernsheim, Germany 52_Gibbstown, USA 53_Goa, India 54_Grafing, Germany 55_Guangzhou, China 56_Guatemala City, Guatemala 57_Hanoi, Vietnam 58_Hauppage, USA 59_Hawthorne, USA 60_Hellerup, Denmark 61_Herzlia-Pituach, Israel 62_Ho-Chi-Minh City, Vietnam 63_Hohenbrunn, Germany 64_Hong Kong, China 65_Hull, United Kingdom 66_Istanbul, Turkey 67_Ivrea, Italy 68_Jakarta, Indonesia 69_Jeddah, Saudi Arabia 70_Karatschi, Pakistan 71_Kaunas, Latvia 72_Kawagoe City, Japan 73_Kilsyth, Australia 74_Kuwait City, Kuwait 75_Lufelfingen, Switzerland 76_Lehrte, Germany 77_Les Berges du Lac, Tunisia 78_Lima, Peru 79_Lisbon, Portugal 80_Ljubljana, Slovenia
81_London, United Kingdom 82_Lorenskog, Norway 83_Lyon, France 84_Madison, USA 85_Madrid, Spain 86_Mailand, Italy 87_Makati-Stadt, Philippines 88_Manlleu, Spain 89_Martillac, France 90_Mainz, Germany 91_Meyzieu, France 92_Milwaukee, USA 93_Mississauga, Canada 94_Modderfontein, South Africa 95_Mollet del Valls, Spain 96_Monaco, Monaco 97_Montevideo, Uruguay 98_Moscow, Russia 99_Mumbai, India 100_Napa, USA 101_Ness-Ziona, Israel 102_Netanya, Israel 103_Newport, United Kingdom 104_Norwood, USA 105_Nottingham, United Kingdom 106_Oakville, Canada 107_Onahama, Japan 108_Osaka, Japan 109_Oslo, Norway 110_Overijse, Belgium 111_Palmerston North, New Zealand 112_Panama City, Panama 113_Paris, France 114_Poole, United Kingdom 115_Potters Bar, United Kingdom 116_Prague, Czech Republic 117_Pyongtaek-Shi, South Korea 118_Quetta, Pakistan 119_Quito, Ecuador 120_Reinbek, Germany
121_Ricany-Jazlovice, Czech Republic 122_Riga, Latvia 123_Rio de Janeiro, Brazil 124_Riad, Saudi Arabia 125_Rockland, USA 126_Rome, Italy 127_San Diego, USA 128_Santiago de Chile, Chile 129_So Luis, Brazil 130_So Paulo, Brazil 131_Savannah, USA 132_Schaffhausen, Switzerland 133_Schwalbach, Germany 134_Semoy, France 135_Seoul, South Korea 136_Shah Alam, Malaysia 137_Shanghai, China 138_Singapore, Singapore 139_Sofia, Bulgaria 140_Spittal, Austria 141_Stockholm, Sweden 142_Sydney, Australia 143_Taipeh, Taiwan 144_Taloja, India 145_Tallin, Estonia 146_Taoyuan, Taiwan 147_Tokyo, Japan 148_Tunbridge Wells, United Kingdom 149_Unterschleissheim, Germany 150_Vantaa, Finland 151_Vienna, Austria 152_Wilna, Lithuania 153_Wadeville, South Africa 154_Warsaw, Poland 155_West Drayton, United Kingdom 156_Zagreb, Croatia 157_Zug, Switzerland
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UNIVERSO MERCK
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EQUIPE DE CROMATOGRAFIA Assistncia Tcnica Equipe de Vendas Paulo Fellippe Daniel Teixeira Paulo Fellippe Alexandre Rosolia Douglas Vicco Guilherme Carrara
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CONTEDO DO TREINAMENTO
Introduo a HPLC e princpios bsicos Seleo de colunas e fase mvel Slica Convencional Slica Ultra-Pura Blocos monolticos
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A FUNO DA COLUNA
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A ADSORO QUMICA
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AZ
AM
FASE NORMAL
mecanismo: Reteno por interao da fase estacionria polar com a parte polar da molcula da amostra. Fase estacionria: SiO2, Al2O3, -NH2, -CN, -Diol, -NO2 Fase Mvel: heptano, hexano, ciclohexano, dioxano, metanol mtodo: Separao de componentes no polares para mdio polares (Hidrocarbonetos e cidos carboxlicos) O O O O Si O H O O O Si O H Si O H O CH 2
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AM
AZ
FASE REVERSA
mecanismo: Reteno por interao da fase estacionria no polar (cadeia de hidrocarbonetos) com a fase no polar da molcula da amostra. Fase estacionria: n-octadecil (RP-18), n-octil (RP-8), etil (RP-2), Fenil, -NH2, CN, -Diol, Polimeros hidrofobicos Fase mvel: metanol ou acetonitrila / gua ou tampo, THF ou dioxano.
O O O O Si O O O O Si O Si O CH Si CH H CH Si CH 3 3 3 3
H2O
CH3OH
H2O
CH
OH
CH3OH
H2O
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POLAR
APOLAR
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POLAR
APOLAR
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CARACTERIZAO
Fase Normal Polaridade da f.e. polaridade da fase mvel ordem de eluio da amostra alta baixa-mdia menos polar primeiro Fase Reversa baixa mdia-alta mais polar primeiro
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Superspher
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TIPOS DE RECHEIO
Fase Reversa:
modificao: RP-8, RP-select B, RP-18, -CN, -Diol, -NH2 Estrutura: LiChrosorb, LiChrospher, Superspher, Purospher, Purospher STAR, Chromolith.
Fase Normal:
modificao: Si, -Diol, -CN, -NH2 Estrutura: LiChrosorb, LiChrospher, Superspher, Purospher STAR , Chromolith.
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ESTRUTURA DO RECHEIO
LiChrosorb
irregular
esfrico
Chromolith
monoltico
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DIMENSES FSICAS
Hibar
LiChroCART
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Comprimento (mm)
Pr-coluna manuCART
Dimetro (mm)
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HOLDER MANU-CART O acoplador manuCART 4 utilizado em colunas com 2 mm, 3 mm, 4 mm e 4.6 mm de dimetro interno. Os cartuchos podem ter 250 mm, 150 mm, 125 mm e 75 mm de comprimento. utilizado para prcolunas de 4-4 e 10-2.
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MONTANDO UM MANU-CART
Montando sem a pr-coluna: 1. Coloque a rosca no cartucho 2. Fixe as duas partes da trava voltadas para dentro e as envolva com a rosca 3. Rosqueie o conector de tubulao Montando com pr-coluna: 1. Coloque a rosca no cartucho 2. Fixe as partes da trava voltadas para fora 3. Coloque a pr-coluna neste espao vazio formado 4. Rosqueie o conector de tubulao
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A FASE MVEL
A fase mvel interage fsico-quimicamente com as substncias presentes na amostra e com o enchimento da coluna, assim influenciando de forma decisiva na separao. Recomendaes: gua usada deve ter alto grau de pureza, grau HPLC tipo LiChrosolv (vendida pela Merck em embalagens de 1 L), ou gua ultra-purificada por equipamentos (EasyPure RT VWR). A leitura de resistividade indica somente o teor de ons. Para medir o teor de orgnicos na gua podemos utilizar a tcnica de TOC (carbono orgnico total) e elimin-los com o uso de equipamentos de purificao com luz UV (oxida orgnicos a CO2 e H2O). No utilizar reagentes de grau tcnico, p/sntese, resduos de pesticidas, p/anlise, ou UV em anlises com gradiente. Solventes grau HPLC. A maioria dos problemas de anlise e com o equipamento tem origem na fase mvel. Porm... Coluna e Equipamento so sempre culpados!
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FILTRAO DA FASE
gua destilada inadequada. gua deve ser grau HPLC. Livre de bactrias, utilizando uma filtrao de 0,2 m (brevundimonas diminuta). Resistividade de pelo menos 18 megohm/cm. Teor de orgnicos < que 20 ppb Para evitar o entupimento do filtro de 2m basta a membrana de 0,45m.
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MEMBRANAS DE FILTRAO
Membranas de steres de celulose usadas na microbiologia servem somente para filtrao de gua. Membranas de PTFE e celulose regenerada so compatveis com a maioria dos solventes orgnicos e com gua.
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Relao de Transparncia Quando a fase mvel no muito transparente, diminui a sensibilidade (pois o detector precisa subtrair o sinal para zerar a absorbncia) e aumenta o rudo. Offset: Indica o quanto o detector teve que compensar a absorbncia da fase mvel para poder zerar a linha de base; enfim indica a qualidade da fase mvel (transparncia).
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GASES DISSOLVIDOS
Fases mveis saturadas com ar podem resultar em bolhas ou problemas na bomba, noise, drift, assim como outros problemas relacionados ao detector.
120 100 80 60 40 20 0
Aquecimento Hlio Vcuo Ultrassom
OBS: Aquecimento o modo mais eficiente de remoo de gases dissolvidos, mas inconveniente. Purga com He eficiente por apenas alguns minutos. Vcuo menos eficiente, mas pelo menor custo usado por muitos.
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10
LiChrosorb
10
LiChrospher Superspher
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LiChrosorb RP-8 LiChrosorb RP-select B LiChrosorb RP-18 LiChrospher RP-8 LiChrospher RP-8e LiChrospher RP-select B LiChrospher RP-18 LiChrospher RP-18e Superspher RP-8 Superspher RP-8e Superspher RP-select B Superspher RP-18 Superspher RP-18e
9,5 11,4 16,2 12,5 13,0 11,5 21,0 21,6 12,5 13,0 11,5 21,0 21,6
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TAMPO? TRIETILAMINA?
2 3
Vitaminas
Pesticidas
Aromticos 3
3 1 4 5 4 2
5 6 7
14 min
2 5
14 min
14 min
Eluent:
Methanol / 0.01M phosphate buffer pH 3.0 (2:98, v/v) + 2 ml/l triethylamine Flow rate: 2 ml/min Detection: UV 270 nm Sample: 1. Ascorbic acid; 2. Nicotinic acid; 3. Pyridoxol hydrochloride; 4. Niacin; 5. Thiamin hydrochloride
Acetonitrile / Water (70:30) 2 ml/min UV 220 nm 1. 4,4-DDOH 2. -Endosulphan 3. 4,4-DDM 4. Heptachlor 5. p,p-DDT 6. o,p-DDT 7. Aldrin
Acetonitrile / Water (75:25) 1 ml/min UV 254 nm 1. Benzene 2. Naphthline 3. Fluoren 4. Anthracen 5. Benzanthracen
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DEFINIES
Compostos Inicos: Molcula orgnica que contm um ou mais grupos funcionais capazes de comportar-se como cido ou base na faixa de pH correspondente. cidos ou Bases Fortes: so compostos que ionizam-se completamente na faixa de pH correspondente.
HA B + H+
A- + H+ BH+
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FUNO DE PKA E PH 99 % B
Plotagem em forma de S. Quando um cido (HA) ou base (B) ioniza, torna-se muito menos hidrofbico (mais hidroflico). Como resultado, sua reteno em fase reversa reduz de 10 a 20 vezes.
Ponto central: pH = pKa, metade dos compostos ionizados. pKa 1.5: toda mudana em reteno com origem no pH ocorre nesta faixa. pH < 2.5 ou pH > 5.5: composto est completamente ionizado ou completamente molecular, e a reteno no altera muito nesta faixa.
99 % BH+
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DISSOCIAO DE CIDO
Assim, recomenda-se que o pH esteja pelo menos +/- 1 unidade fora do pKa.
Quanto mais afastados estes valores, menores sero os efeitos de pequenas mudanas de composio de fase mvel na reteno.
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OH Si OH O Si O Si O Si O OH OH OH CH3 CH2
CH2
CH2 CH2
Si CH3
Modificao monofuncional
O H Si
C3 H O Si C18H37 C3 H
O H
CH3
Endcapping
H Si O O O O Si Si O C3 H Si C18H37 C3 H
Endcapped
O H
CH3 CH3
Si CH3 C3 H
ODS-1
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TESTE ENGELHARDT
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Thiourea Aniline Phenol 2,3 Dihydroxynaphthalene 4 - Ethylaniline Diethylphthalate N, N Dimethylaniline Toluene Ethylbenzene
t0
basic acidic chelating basic neutral basic neutral neutral Chromatographic Conditions:
Column: LiChrospher RP18e 4 mm x 250 mm Mobile Phase: Methanol/Water 58/42 (v/v) Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: 40 C Detection: UV 254nm
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3,4,5
1 4
2 1 2 6 7 9
30 min 30 min
3 8 4 3 2 1
30 min
Eluent:
Methanol / 0.05 M phosphate buffer pH 4.8 (50/50, v/v) Flow rate: 1ml/min Detection: UV 254 nm Sample: 1. Anilin 6. N,N-Dimethylaniline 2. Phenol 7. Toluol 3. o-Toloidine 8. Benzoeic acid 4. m-Toloidine methylester 5. p-Toloidine 9. Ethylbenzene
Eluent:
Methanol / 0.7 mM acetic acidr (2/100, v/v) Flow rate: 1 ml/min Detection: UV 260 nm Sample: 1. Iso nicotinic acid 2. Nicotinic acid 3. Iso nicotinic acid amide 4. Nicotinic acid amide
Acetonitrile / Water (75/25, v/v) 1 ml/min UV 254 nm 1. Benzene 2. Naphthalin 3. Fluorene 4. Anthracen 5. Benzanthracen
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1
2 1 4 5 6
30 min
2 3
3
2
4
30 min
1
30 min
Eluent:
Acetonitrile / 0.05 M phosphate buffer pH 4.8 (20/80, g/g) Flow rate: 1ml/min Detection: UV 220 nm Sample: 1. Barbituric acid 2. Codeine phosphate 3. Atropinium sulfate 4. Papaverine 5. Noscapinium chloride 6. Diphenhydramine
Eluent:
Acetonitrile / 0.02 M KH2PO4 pH 4.7 (25/75, v/v) Flow rate: 2 ml/min Detection: UV 220 nm Sample: 1. Atenolol 2. Metaprolol 3. Bisoprolol 4. Propranolol
Eluent:
Acetonitrile / phosphate buffer pH 2.3 (31.2/86, g/g) Flow rate: 1 ml/min Detection: UV 220 nm Sample: 1. Diphenhydramine 2. MPPH 3. Diazepam
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Mtodo Otimizado
Tipo B
M= Na, K, Fe
SiO2(Na, K, Fe)
SiO2
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DIFERENAS
Teor de metais em g/L Sdio LiChrosorb LiChrospher 340-400 150-250 1 Clcio 1300 6-10 1 Magnsio 160-220 4-6 1 Ferro 20-25 20-40 3 Alumnio 15-20 75-140 1
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Na + - O
H H
Si
Si
livre
O H
Fe
OH Si O Si OH O O O OH Si O Si O OH
2+
-O Si O Si
Si O H
geminal
H
O O O OH Si O Si
Me
O Si
rix at
Si O H Si O H
vicinal
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AGENTES QUELANTES
OH OH
OH
OH
OH
Purpurin
Quinizarin
2.
Chromatographic conditions: Mobile phase: buffer Flow rate: Detection: Temperature: Sample: Methanol / 20 mM Phosphate pH 3,0; 75:25 (v/v) 1.0 ml/min UV 254 nm 30 C 1.) Purpurin 2.) Quinizarin
10
RP-18 convencional
2.
10
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CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 Si CH2 CH2 CH2 CH2 C6H13
CH3
O Si
OH CH3 OH Si O O Si OH O
Modificao bifuncional
ODS-2
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INFLUNCIA DA DESATIVAO
RP-18 convencional
1
.
CH3
20
40
Purospher
1 2
RP-18 e
Piridina (1)
2-Metilpiridina (2)
Chromatographic Conditions:
Mobile phase: Flow rate: Detection: Temperature: 40
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20
PROCAINAMIDAS
Aplicao
3
Purospher RP-18e
Column: LiChroCART 125-4 Purospher RP-18 e, 5 m Mobile phase: Methanol / 0.02 M Phosphate buffer pH 7.6 40:60 (v/v)
0 1 2
7,5 3
15
Temperature: Sample:
7,5
15
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TESTE ENGELHARDT
3 6 1 7 2 5
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Thiourea Aniline Phenol 2,3 Dihydroxynaphthalene 4 - Ethylaniline Diethylphthalate N, N Dimethylaniline Toluene Ethylbenzene
8
t0
basic acidic chelating basic neutral basic neutral neutral Chromatographic Conditions:
Column: Purospher RP18e 4 mm x 125 mm Mobile Phase: Methanol/Water 55/45 (v/v)
9
12
24 min
UV 254nm
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Page 55
ODS-3
Page 57
As colunas a base de slica normal resistem a um pH entre 2-7,5. Abaixo do limite de pH, ocorre hidrlise dos silanis desativados. Acima do limite de pH, temos a solubilidade da slica.
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Teste de Tanaka
A: k (Pentyl benzene) 9.59 B: (Pentyl-/ Butyl benzene) F 0,0 1.51 C: (Triphenylene/ o-Terphenyl) 1.63 Capacidade de D: (Caffeine/ Phenol) troca inica (E,F) 0.44 E: (Benzylamine/ Phenol; pH7.6) 0.23 0,0 E F: (Benzylamine/ Phenol; pH2.7) 0.02
Hidrofobicidade (B)
1,6
0,3
3,0 0,6
1,4 0,8
1,5
0,4
1,2 1,0
1,8 2,4 C
0,6
0,2
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Competitor-Z
A 10 F
F
Competitor-S
A 10
F
Competitor-P
A 10
6,0
0,0
0,3
1,6
3,0 0,6
1,4 0,8
1,5
0,4
0,0
1,2 1,0
1,8 2,4 C
E
0,6
0,2
Competitor-L A
10 F B
F
Competitor-N
A 10
Competitor-I A
10 F
B
Competitor-D
A 10 B F
C E
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Page 61
2 1
0,0
5.0
10.0
0,0
15.0
30,0
Methanol / Water 95:5 (v/v) 1.0 ml/min UV 280 nm 40C - Tocopherol (1), - Tocopherol (2), - Tocopherol (3), - Tocopherol Acetate (4)
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BLOCO MONOLTICO
Page 65
BLOCO MONOLTICO
1.51463.0001 Chromolith Flash RP-18e (25 x 4.6 mm) 1.51450.0001 Chromolith SpeedROD RP-18e (50 x 4.6 mm) 1.02129.0001 Chromolith Performance RP-18e (100 x 4.6 mm)
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Mesoporos: 13 nm
Macroporos: 2m
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BLOCO MONOLTICO
BLOCO MONOLTICO
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BLOCO MONOLTICO
Tipo de slica: Tamanho da partcula: Tamanho do mesoporo: rea Superficial: Volume de poro: Modificao: % de Carbono: Cobertura Superficial: Estabilidade de pH: Porosidade Total: Alta pureza bloco monoltico 130 (13 nm) 300 m2/g 1 ml/g RP-18 endcapped 18 % 3.6 mmol/m2 2 7.5 >81%
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Tamanho do macroporo: 2 m
BLOCO MONOLTICO
Chromolith X colunas de material particulado 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8
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5m 5m 5m
Chromolith Performance
BLOCO MONOLTICO
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BLOCO MONOLTICO
2 1 3 4 5
1 mL/min - 17 bar
Mobile Phase Flow rate Detection Sample Acetonitrile/ 0.1% TFA in water (20(80; v/v) 1-9 ml/min 222 nm 1. Atenolol 2. Pindolol 3. Metoprolol 4. Celiprolol 5. Bisoprolol
5 mL/min - 85 bar
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BLOCO MONOLTICO
2 1 3 4 5 1 3 2 4
1 mL/min - 17 bar
0.0
1.5
12
9 mL/min - 153 bar
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BLOCO MONOLTICO
Tocol
0 0.1
Alpha.tocopherol
Alpha.tocopherol
0.2
Tocol
0.1
0.2
0.3 min
0.3 min
BLOCO MONOLTICO 1. Presso muito menor = anlises mais rpidas 2. Comprimento da coluna no limitado pela presso
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BLOCO MONOLTICO
6
2 1
5 8 7 4
0,0
2,0
4,0 min
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BLOCO MONOLTICO
6 Column 2 colunas Chromolith Performance RP-18e 100-4.6mm Mobile A: Acetonitrile phase B: Water Gradient Time/min %A %B 0,0 20 80 7,0 90 10 Flow rate 3 mL/min Detection UV 220 nm Temp. ambient Inj.Volume 10 L Sample 1. Prednisolone 2. Cortisone 3. Nortestosterone 4. Estradiol 5. Testosterone 6. Corticosterone 7. Estrone 8. Progesterone
2 1
3 5 7 4 8
0,0
3,5
7,0 min
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BLOCO MONOLTICO 1. Presso muito menor = anlises mais rpidas 2. Comprimento da coluna no limitado pela presso = melhor resoluo de picos
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ACESSRIOS
BLOCO MONOLTICO
Column Chromolith Performance 1x Chromolith Performance 2x Chromolith Performance 3x Chromolith Performance 4x Chromolith Performance 5x Particulate 5 m Competitor X Particulate 5 m Competitor Z Particulate 5 m Competitor L Particulate 3.5 m Competitor X Particulate 3.5 m Competitor Z Particulate 3.5 m Competitor L Length (mm) 100 200 300 400 500 250 250 250 150 150 150 Back pressure (bar) 30 60 90 120 150 320 210 220 330 260 400 Plate Number N (Anthracene) 10.000 19.000 27.000 35.000 41.000 16.000 17.500 18.500 11.500 14.000 19.000
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[dimetro: 4.6 mm, fase mvel: acetonitrila/gua (60/40; v/v), fluxo: 3 mL/min, temperatura: 25 injeo: 10 L de antraceno (10 g/mL)]. C,
BLOCO MONOLTICO
BLOCO MONOLTICO
6 5 7
14 x Chromolith Performance
3 4
30
60 min
BLOCO MONOLTICO 1. Presso muito menor = anlises muito mais rpidas 2. Tamanho da coluna no limitado pela presso = melhor resoluo 3. Bloco monoltico de slica muito resistente
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BLOCO MONOLTICO 1. Presso muito menor = anlises muito mais rpidas 2. Tamanho da coluna no limitado pela presso = melhor resoluo 3. Bloco monoltico de slica muito resistente = maior vida til
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PR-COLUNAS
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TEMPERATURA MXIMA
4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 No. of injections
[temparature: 45 mobile phase: acetonitrile/water (60/40; v/v); flow rate: 2 mL/min, injection volume: 10 L] C;
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Progesterone Anthracene
BLOCO MONOLTICO
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BLOCO MONOLTICO
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BLOCO MONOLTICO
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(...) No fim, tudo d certo... Se ainda no deu certo, porque no chegou ao fim.
Trecho retirado de O Encontro Marcado (Fernando Sabino).