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Apostila de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof Cristiane Alves da Fonseca

METABOLISMO DO DNA
Replicao Reparo Recombinao

*Processo pelo qual cpias fidedgnas das molcs do DNA so sintetizadas (replicao), junto de processos que afetam a estrutura da informao (reparo e recombinao). Nucleases: enzimas que degradam o DNA. Exonucleases: degradam o DNA a partir de uma extremidade ou seja, removem nucleotdeos a partir da extrem. 5 ou 3.

Endonucleases: agem no interior dos cidos nuclicos, reduzindo-os a fragmentos cada vez menores. *endonucleases de restrio: clivam apenas seqncias especficas. REPLICAO DO DNA

*Regras bsicas p/ o processo de replicao aplicveis a procariotos e eucariotos: 1. Semiconservativa uma fita funciona como molde 2. Incio da replicao seq. Especficas (origens) E. coli: oriC (rica em GATC) 3. Mov. da forquilha de replicao Unidirecional X Bidirecional (geralmente) 4. Direo da replicao sentido 53. 5. Semidescontinuidade da replicao Contnua em uma fita (53) Descontnua na outra (deveria ocorrer 35- forma fragmentos de Okazaki) O DNA sofre replicao semi-conservativa -Trs teorias tentaram explicar a replicao do DNA: Teoria conservativa: Cada fita do DNA sofre duplicao e as fitas formadas sofrem pareamento resultando num novo DNA dupla fita, sem a participao das fitas "parentais" (fita nova com fita nova formam uma dupla hlice e fita velha com fita velha formam a outra dupla fita). Teoria dispersiva;

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Teoria semi-conservativa: Cada fita do DNA duplicada formando uma fita hbrida, isto , a fita velha pareia com a fita nova formando um novo DNA.

Experimento: Clulas de E.coli crescidas por vrias geraes, num meio onde a nica fonte de nitrognio era cloreto de amnio (NH4Cl) com a substituio do nitrognio normal (14N ) por nitrognio "pesado" (15N ).

Desta forma, todos os componentes nitrogenados das clulas que cresceram neste meio, incluindo as bases do DNA, estariam enriquecidos por nitrognio "pesado". A densidade dos componentes das clulas crescidas em 15N maior do que a dos componentes das clulas crescidas em meio "normal" (14N) , no caso o DNA das clulas "parentais". A anlise do experimento foi feita por ultra-centrifugao utilizando uma soluo concentrada de cloreto de csio. Porque Cloreto de Csio? O cloreto de csio usado porque sua soluo aquosa tem uma gravidade especfica prxima a do DNA . Quando esta soluo centrifugada por um longo perodo de tempo e em alta velocidade, atinge-se um equilbrio com a formao de um gradiente de densidade contnuo, com a poro mais concentrada no fundo do tubo e a poro menos concentrada no topo. Os resultados mostraram que as clulas crescidas em presena de 14N apresentavam DNA situado no topo do gradiente. A 1 gerao de bactrias crescidas em 15N mostrou DNA na fase intermediria do gradiente, indicando a formao de um hbrido de DNA (14N e 15N), e uma segunda gerao, na zona mais densa, indicando, a formao do DNA 15N.

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*Com estas observaes concluiu-se que a replicao do DNA semiconservativa.

O DNA circular replicado bidirecionalmente


-O material gentico de bactrias (procarioto) organizado sob a forma de uma molcula de DNA circular. -John Cairns evidenciou por autoradiografias a presena de "olhos" ou "bolhas de replicao" nos cromossomos circulares de bactrias crescidas em meio de cultura contendo [3H] - timidina.

A anlise indica que o DNA dupla hlice se replica por um processo progressivo de separao das duas fitas parentais, acompanhada pela sntese de uma nova cadeia complementar a este DNA (fita filha).

A extremidade onde est a "bolha" de replicao chamada de forquilha de replicao. Uma "bolha" de replicao pode ter uma ou duas forquilhas. Se tiver apenas uma forquilha significa que a replicao unidirecional e se tiver duas forquilhas a replicao bidirecional. Com base nos estudos autoradiogrficos, demonstrou-se que a replicao do DNA bidirecional (uma "bolha" de replicao com duas forquilhas que se movimentam em sentidos opostos).

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Em procariotos e bacterifagos, o DNA tem apenas uma "bolha" de replicao, enquanto que em eucariotos existem vrias "bolhas" de replicao que esto distribudas ao longo do DNA.

A sntese de uma molcula de DNA pode ser dividida em 3 etapas: 1. Iniciao 2. Alongamento 3. Terminao DNA Polimerases DNA Pol enzima que sintetiza a nova fita de DNA. Adiciona nucleot. na extrem. 3OH de uma regio pareada do DNA possibilitando o crescimento da cadeia no sentido 53 DNA Pol I Esta enzima a mais abundante na clula e tem trs atividades diferentes: atividade polimersica: insere nucleotdeos ao grupo OH-3 livre da cadeia do DNA parental, atividade exonuclesica de 3 para 5: retira os nucleotdeos de DNA que possam estar errados. importante para os mecanismos de reparo do DNA. atividade exonuclesica de 5para 3: retira os nucleotdeos que fazem parte dos "primers" de RNA. 3 domnios de ativ. P/ o processo de replicao e reparo do DNA. *Regio carboxiterminal ativ. de polimerizao e exonuclease 35 (fragm. Klenow) *Regio amino-terminalativ. Exonuclease 53 (fragm. Pequeno) Ativ. Exonuclease 35: reconhecer e clivar um pareamento errneo na extrem. 3OH da fita nova (correo do erro) Ativ. Exonuclease 53: remove blocos de nucleot. (10 nucleot.)

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**Se no DNA ocorrer: Nick (quebra da ligao fosfodister) ou gap (falta de alguns nucleotdeos) pode acontecer: 1. Ativ. Exonuclesica 53 remove blocos de nucleot. da regio alterada. 2. Ativ. Polimersica sintetiza as regies removidas originando fita nova.

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DNA Pol II Participa do Reparo do DNA. DNA Pol IIIprincipal enz. p/ o processo de replicao. Apresenta maior processividade

Clulas eucariticas: 4 DNA Pol.- sintetiza o primer (primase) - ativ. Exonuclease 35, processividade - reparo do DNA - reparo do DNA DNA Pol mitocondrialreplicao do DNA mitocondrial processividade e ativ. Exonuclease 35 INICIAO Origem de replicao: oriC (245pb, conservado em bactrias) *Arranjo geral: 2 sries de repeties curtas3 rep. De 13pb 4 rep. De 9pb 8 enzimas e prot. Participam na fase de iniciao abrem a hlice do DNA na origem e estabelecem um complexo pr-iniciao.

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Para aliviar esta presso do "supercoil" um grupo de enzimas, denominadas de topoisomerases, quebram momentaneamente o DNA, fazendo com que este sofra algumas rotaes e em seguida este mesmo grupo de enzimas refazem a ligao "quebrada". Em procariotos estas topoisomerases so conhecidas como DNA girase. Este processo de desenrolamento do DNA extremamente importante em procariotos. Antibiticos do tipo ovobiocina e cido oxolnico inibem a ligao da DNA girase ao DNA. O emprego destes inibidores levam a formao de mutantes.

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