Fundamentos da Tcnica de PCR

Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao servio da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califrnia, recebeu o prmio Nobel da Qumica pelo desenvolvimento de um mtodo que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta tcnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a reas como o diagnstico de doenas, medicina forense entre muitas outras para alm da Investigao em Biologia. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction - reaco em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicao de DNA que ocorre in vivo . Durante o PCR so usadas elevadas temperaturas de forma a separar as molculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo ento a ligao de oligonucletidos iniciadores (primers), tambm em cadeia simples e geralmente constitudos por 15 a 30 nucletidos, obtidos por sntese qumica. Para amplificar uma determinada regio so necessrios dois iniciadores complementares das sequncias que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuao da DNA polimerase durante a sntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar (figura 1).

Para realizar PCR so necessrias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampo salino contendo a polimerase, oligonucletidos iniciadores, os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura submetida a vrios ciclos de amplificao que consistem em: Desnaturao do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96C), de modo a separar as duas cadeias Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associao, a mistura de reaco arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar) Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72C) O processo envolvendo estes trs passos, pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura 2). Em teoria, se for possvel levar a cabo 25 ciclos de amplificao seguidos, a concentrao de

DNA aumentaria 225 vezes embora, na prtica, devido a alguma ineficincia no processo de amplificao, esse aumento fique por um milho de vezes.

Como na tcnica de PCR se encontram envolvidos vrios ciclos de amplificao, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contnua e automatizada, os vrios ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizvel, as DNA polimerases utilizadas devero ser termoestveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termoflicaThermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reaco. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado aps electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparao com padres lineares de DNA.