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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CINCIAS DA SADE DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

Roteiro de Aulas Prticas de Microbiologia e Imunologia

NDICE
I - ESTERILIZAO E DESINFECO ------------------------------------------------------ 3 II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS ------------------------------------------- 9 III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ---------------------------------------------------16 IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS-------------19 V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO --------------22 VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS -----------27 VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS ----------------33 VIII REAES ANTGENO ANTICORPO --------------------------------------------------37 IX REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS-----------------------------------------------------41

Esterilizao e Desinfeco

I - ESTERILIZAO E DESINFECO
Esterilizao o processo de destruio por meio de agentes fsicos ou qumicos de todas as formas de vida microbiana (vrus, bactrias, fungos e esporos) presentes num material. A esterilizao pode ser realizada por agentes fsicos e qumicos. ESTERILIZAO POR MTODOS FSICOS

1. Calor mido 1.1. Autoclavao - um processo de esterilizao pelo vapor sob presso em cmaras conhecidas como autoclaves onde vapor de gua mantido em temperatura acima de 100oC, pelo emprego de presso maior que a atmosfrica, a uma temperatura de 121oC. O tempo de exposio depende do material a ser esterilizado. Este processo utilizado para esterilizar vidraria, instrumentos cirrgicos, meios de cultivo e outros. 1.2. Tindalizao ou esterilizao fracionada o Processo de esterilizao na temperatura de 100 C durante 30 minutos, repetindo-se o aquecimento 2 a 3 dias consecutivos. Este processo usado na bacteriologia para a esterilizao de certos meios de cultura que se alteram em temperaturas elevada, como meios contendo acares, leite etc. 2. Calor Seco 2.1. Forno de Pasteur - Neste processo so empregados fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser regulada e mantida pelo tempo necessrio para que haja esterilizao. realizada em temperatura de 170-180oC, em estufas eltricas por 1 a 2 horas. O material a ser esterilizado deve ser distribudo de modo uniforme para facilitar a distribuio do calor que emana das paredes laterais e da base da estufa. Este processo indicado para esterilizar vidraria, instrumentos cirrgicos passveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais impermeveis como ceras, pomadas, p e leos. 2.2. Incinerao - um processo usado para materiais descartveis e carcaa de animais utilizados em experimentos. 2.3. Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico de Bunsen utilizado em rotina de laboratrio para esterilizao de alas de platina e bordas da boca de tubos e bales.

Esterilizao e Desinfeco

3.

Filtrao - um processo usado para esterilizao de gases e lquidos tais como soros, solues de enzimas e vitaminas, acares, que no podem ser submetidos ao calor. A filtrao consiste em passar o material a ser esterilizado por filtros de poros muito pequenos que no permitem a passagem de bactrias e fungos. 3.1. Tipos de filtros: Disco de amianto - Filtro de SEITZ Membrana de ester de celulose- Millipore Filtros de partculas de ar de alta eficincia (HEPA) removem quase todos os microrganismos maiores que 0,3m de dimetro. So utilizados para reduzir o nmero de micrbios transmitidos pelo ar.

4. Radiaes 4.1. Radiao ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na esterilizao do ar e de ambientes. Na indstria de alimentos so aplicados para esterilizao de superfcies de pes, xaropes, sacos plsticos, garrafas de gua mineral, carnes mantidas sob refrigerao. Porm, seu uso limitado, devido a seu baixo poder de penetrao, pois trata-se de radiao no ionizante. 4.2- Raios gama e raios X (radiaes ionizantes)tm alto poder de penetrao. Raios gama tem sido empregado na esterilizao de certas vacinas e sanitizao de alimentos embalados. MTODOS QUMICOS

Glutaraldedo 2% - As solues de glutaraldedo so indicadas para esterilizao ou desinfeco de instrumentos mdicos cirrgicos sensveis ao calor, equipamentos de anestesia gasosa, fibroscpios, partes pticas de endoscpios etc. Exposio em torno de 18 horas. Formaldedo (Soluo Alcolica 8%) A frmula alcolica apresenta 8% de Formaldedo. Sua atividade germicida atribuda inativao de protenas e cidos nuclicos microbianos. Exposio em torno de 18 horas. As solues aquosas Formaldedo (soluo aquosa 10%) alm de no liberar vapores irritantes no possuem os inconvenientes das solues alcolicas sobre lentes de equipamentos pticos e artigos de poliestireno e borracha em exposies prolongadas. Exposio em torno de 18 horas. MTODOS FSICO-QUMICOS Estes mtodos associam o produto qumico com o uso de equipamentos, garantindo assim a efetividade ao processo e a segurana dos profissionais de sade, sendo utilizado para materiais termosensveis.

Esterilizao e Desinfeco

1 Esterilizao por xido de etileno: A esterilizao realizada baixa temperatura em torno de 54C durante 8 a 12 horas. Para materiais de implantes e prteses se recomenda uma aerao ambiental em torno de 7 dias. Esterilizao por vapor de formaldedo baixa temperatura: A esterilizao por vapor de formaldedo realizada em autoclaves, em concentraes baixas em torno de 2% sob forma de vapor, em temperaturas que variam entre 73C e 82C durante 90 e 180 minutos. Precaues - As precaues recomendadas para estas solues consistem em utilizar luvas ou pinas para o manuseio de artigos nelas imersas e, nos casos das solues alcolicas, mant-las em cubas de esterilizao fechadas em ambientes ventilados. DESINFECO E ASSEPSIA * Desinfeco - A Desinfeco consiste na destruio ou reduo dos microrganismos na forma vegetativa, presentes num material inanimado ou superfcies inertes, mediante a aplicao de agentes fsicos ou qumicos. A desinfeco no implica a eliminao de todos microrganismos viveis, porm elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfcies ou local tratado. * Assepsia - o termo usado para designar o processo de desinfeco de tecidos vivos. Os anti-spticos so preparaes contendo substncias microbiocidas ou microbiostticas podendo ser usadas na pele, mucosas e ferimentos. Exemplos: solues alcolicas, solues iodadas, solues de permanganato de potssio, formulaes base de sais de prata, iodforos, etc. Obervaes: No so recomendados a utilizao de iodofros no recmnascido, pois pode ocorrer absoro transcutnea de iodo com supresso da funo tireoideana. Para a finalidade de antissepsia, no so permitidas as formulaes contendo mercuriais orgnicos, acetona, quaternrios de amnio, hipoclorito a 0,5%, ter e clorofrmio. A desinfeco pode ser realizada por agentes fsicos e qumicos. AGENTES FSICOS: 1.0. Pasteurizao - um processo empregado na indstria de alimentos que elimina microrganismos patognicos (bacilos tficos, paratficos e desintricos, brucelas, estreptococos, bacilo da tuberculose) de produtos como o leite pasteurizado, vinho, cerveja, submetendo-os a temperatura de 63oC por 30 minutos ou 75oC por 15 segundos.

Esterilizao e Desinfeco

Os tempos e as temperaturas de pasteurizao dependem do mtodo e do produto a ser tratado. A pasteurizao no um processo de esterilizao, uma vez que esporos e bactrias no patognicas podem permanecer viveis. 1.1. gua Fervente - Artigos de pequeno porte, depois de lavados com detergente adequado, podem ser desinfetados por imerso em gua a 100oC durante 10 minutos. AGENTES QUMICOS: Principais compostos utilizados em desinfeco e assepsia: lcoois - solues a 70% e 80% Fenis e Derivados - Fenol, Cresis, Ac. saliclico e c. Benzico. Halognios Iodo, Iodforos (Polivinil PiralidonaIodo/PVP-I, cloro, Hipoclorito de Sdio ou clcio). Metais Pesados - Mercrio (Mercrio Cromo, Mertiolato), Prata (Nitrato de prata), Cobre (Sulfato de Cobre). Violeta de Corantes - Verde brilhante e malaquita. Genciana, Azul de Metileno. Detergentes Sintticos -Aninicos: laurilsulfato de sdio -Catinicos: cloreto de cetilpiridnio. Oxidantes - gua oxigenada, permanganato de potssio. cidos, lcalis - c. Sulfrico, c. clordico, soda (NaOH).

NOTAS: As seguintes precaues devero ser tomadas para evitar a sobrevivncia de microrganismos contaminantes, falhas de esterilizao ou a recontaminao dos artigos esterilizados, independentes do processo de esterilizao. 1. A escolha do processo de esterilizao

Processo de esterilizao mais eficaz o vapor saturado sob presso, seguindo-se o calor seco e os esterilizantes qumicos.A escolha depende da natureza do artigo a ser esterilizado. 2. Limpeza prvia A presena de matria orgnica (leo, gordura, sangue, pus e outras secrees) protege os microrganismos contaminantes do contato indispensvel com o agente esterilizante. Por outro lado, quanto menor for o nmero de microrganismos presentes, maior ser a possibilidade de esterilizao. Assim, necessrio lavar cuidadosamente todos os artigos em solues desencrostantes (hiploclorito de sdio, detergentes sintticos etc), e enxagu-los abundantemente com gua corrente e no ltimo enxague com gua destilada ou deionizada antes de submet-los a qualquer processo de esterilizao.

Esterilizao e Desinfeco

3.

Invlucros

pacotes

Os invlucros devem permitir o contato dos artigos com o agente esterilizante, bem como mant-los livres de microrganismos durante a estocagem. A permeabilidade ao vapor e ao xido de etileno, a impermeabilidade a partculas, a ruptura e a flexibilidade so as caractersticas mais importantes para a seleo de um invlucro. Estocagem Aps a esterilizao, essencial que os pacotes estejam ntegros secos e frios, a fim de conservarem a esterilidade dos artigos neles contidos. Se o pacote, ao ser removido da cmara ainda estiver quente, o vapor contido no papel condensa na temperatura ambiente, criando uma presso negativa que aspira o ar (contaminado) do ambiente atravs do invlucro. Este atua como se fosse um filtro, deixandose penetrar pelo ar e retendo clulas, partculas bacterianas ou no. Se este invlucro no estiver ntegro, os artigos no pacote sofrero recontaminao. A umidade alm de diminuir a resistncia de invlucros de papel, facilita rupturas e interfere no mecanismo de filtrao do ar. Para evitar a contaminao posterior, recomenda-se o uso de cestos metlicos. Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menos possvel, sempre com delicadeza e estocados em ambientes limpos e secos (30 a 60% de umidade) e temperatura em torno de 25oC, reesterilizados quinzenalmente quando no utilizados. Medidas Preventivas

4.

5.

Uso de luvas, Avental e, se necessrio, mscara. Materiais contaminados por agentes patgenos devem ser esterilizados antes de serem descartados. Aps o manuseio de materiais contaminados por agentes microbianos, lavar cuidadosamente as mos com sabo ou solues detergentes antisspticas, como solues aquosas de Polivinil Pirrolidona-Iodo (PVP-I) a 10%, cloro-hexidina a 4% ou hexaclorofeno a 3% adicionado de 0,3% de clorofenol. Aula Prtica - Anlise do efeito da ao de anti-spticos relacionada ao crescimento bacteriano. Objetivo: Observar o efeito de anti-spticos sobre crescimento bacteriano na superfcie da pele das mos. Materiais: Swab estril Placa com meio de cultura gar nutriente. o

Esterilizao e Desinfeco

Anti-spticos: Sabo lquido e Soluo lcool-iodado e lcool 70% Tcnica: 1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos, sobre a superfcie do meio de cultura. Fechar a placa. 2. Lavar as mos com gua corrente e sabo lquido, deixar a gua escorrer espontaneamente em seguida colocar a ponta dos dedos sobre a superfcie do meio de cultura. Fechar a placa rapidamente. 3. Friccionar a ponta dos dedos com soluo de lcool iodado 2%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos sobre o meio de cultura, como item 2. 4. Friccionar a ponta dos dedos com soluo de lcool 70%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos sobre o meio de cultura, como item 2. 5. Incubar a 37C por 24 horas. OBS: Esta prtica dever ser realizada com apenas um aluno de cada grupo. Para observao da eficcia dos anti-spticos, utilizar dedos diferentes. Resultado: Ao dos Agentes lcool Iodado lcool 70% Sabo Sem anti-spticos Crescimento Bacteriano

Tcnicas de Colorao de Bactrias

II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS

As tcnicas de colorao iniciadas por Paul Erlich e Robert Koch (1843-1910) permitiram ao microbilogo distinguir as clulas bacterianas quanto a sua morfologia, tamanho e arranjo celular e diferenci-las de acordo com as suas caractersticas tintoriais. Os corantes so divididos em dois grupos: os cidos e os bsicos. Os corantes bsicos so sais com base corada que se unem eficazmente a substratos cidos, tendo uma grande afinidade para corar material nuclear (azul de metileno, cristal violeta, fucsina bsica, safranina). As bactrias comportam-se como material nuclear e desse modo, quase todos os corantes utilizados em bacteriologia so corantes bsicos. Os corantes cidos tendem a corar mais eficientemente os substratos bsicos, como o citoplasma.

MORFOLOGIA
As clulas bacterianas so caracterizadas morfologicamente pelo tamanho, forma e arranjo. Tamanho - as bactrias so microscpicas medindo desde 0,3 por 0,8m at 10 por 25m. As espcies de maior interesse mdico medem entre 0,5 a 1m por 2 a 5m. Forma - as bactrias podem ser classificadas quanto a forma em trs grupos bsicos: Cocos - clulas esfricas. Bacilos - clulas cilndricas, em forma de bastonetes. Espirilos - clulas espiriladas. Algumas delas se comportam como bacilos curvos, em forma de vrgula, que podem ser denominados vbrios. Ex: Vibrio cholerae. Arranjos - Grupamentos bacterianos. Dependendo do plano e do nmero de divises atravs das quais as bactrias continuam unidas, podem aparecer os seguintes arranjos: 1.Cocos Pares: diplococos (ex.: gonococos) Cadeias: (ex.: estreptococos) Ttrades ou cbicos (Sarcina) Cocos em cachos (ex.: estafilococos) 2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como clulas isoladas, porm ocasionalmente, pode-se observar: bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeia (estreptobacilos). Aps a diviso de algumas bactrias, podem ocorrer movimentos caractersticos, por exemplo:, um movimento em chicotada pode levar as bactrias a posies paralelas.

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Divises repetidas e seguidas desses movimentos determinam posies semelhantes a letras chinesas caractersticas do bacilo diftrico.

PREPARAO DE ESFREGAO BACTERIANO PARA COLORAO

1-Preparao a partir de meio lquido Usando ala de platina estril, colocar duas a trs alquotas de cultura bacteriana preparada em meio lquido sobre a superfcie de uma lmina de microscopia. Espalhar sobre a lmina, fazendo movimentos circulares de dentro para fora e deixar o esfregao secar a temperatura ambiente. Em seguida, realizar a fixao passando duas a trs vezes a lmina na chama do bico de Bunsen. 2-Preparao a partir de meio slido Colocar uma pequena gota de gua destilada numa lmina. Com ala de platina colocar sobre a lmina uma pequena poro do crescimento bacteriano. Espalhar sobre a lmina e prosseguir a preparao como no item anterior. 3-Preparao a partir de material biolgico Usando um swab estril (zaragatoa), friccionar a superfcie da mucosa ou leso oral por exemplo e fazer um esfregao circular na superfcie de uma lmina. Deixar secar temperatura ambiente. Recolocar o swab dentro do tubo de ensaio e executar a fixao, como no item anterior.

COLORAO SIMPLES
Tcnica de colorao caracterizada pelo uso de apenas um corante, permitindo a observao da forma, tamanho e grupamento da clula bacteriana. Esta tcnica de colorao bastante utilizada para a deteco de cocos que causam meningite (Neisseria meningitidis), em amostra de lquido cefalorraquidiano (LCR). MTODO 1)Preparar o esfregao bacteriano em lminas; 2)Cobrir toda a lmina com soluo de azul de metileno, aguar dar 5 minutos e desprezar o corante na pia; 3)Lavar a lmina rapidamente em gua corrente, secar com papel de filtro ou temperatura ambiente (sem esfregar) e observar em objetiva de imerso. RESULTADO Visualizar, descrever a bactrias existente na lmina. morfologia e arranjo das

Tcnicas de Colorao de Bactrias

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COLORAO DE GRAM (Colorao diferencial)

Este mtodo de colorao foi empiricamente desenvolvido pelo bacteriologista dinamarqus, Christian Gram, em 1884, e permite distino entre diferentes bactrias que podem mostrar uma morfologia similar, porm com propriedades tintoriais diferentes. A colorao de Gram classifica as bactrias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas. TCNICA DE COLORAO DE GRAM 1)cobrir toda a lmina com soluo de cristal violeta, aguardar um minuto e desprezar o corante na pia; 2)cobrir a lmina com lugol, aguardar um minuto, desprezar o lugol na pia; 3)inclinar a lmina e gotejar lcool-acetona at que no haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos), lavar a lmina rapidamente em gua corrente. 4)cobrir a lmina com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos. Lavar, secar e observar em objetiva de imerso. NOTAS 1)O Cristal violeta s se liga a parede celular bacteriana aps a adio da soluo de lugol (mordente) 2)O etanol poder ser usado como agente descorante fraco. 3)O material dos corantes empregados na tcnica, principalmente sedimento do cristal violeta, poder aparecer como artefato. 4)O descoramento para mais ou menos resultante da incorreta diferenciao pelo lcool-acetona. 5)A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental na colorao de Gram. Em culturas envelhecidas, clulas Gram Positivas freqentemente se tornam Gram Negativas. Enzimas lticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos parede da clula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (lcoolacetona). Conseqentemente, o complexo iodo cristal violeta poder ser retirado da clula, nessa fase de colorao. RESULTADO Visualizar, desenhar a morfologia e classificar as bactrias nas lminas de acordo com o seu comportamento diante dos corantes de Gram: Bactrias Gram positivas coradas em roxo Bactrias Gram negativas coradas em rosa INTERPRETAO A colorao de Gram classifica as bactrias em Gram positivas ou Gram negativas. O mecanismo da colorao de Gram, se refere composio da parede celular, sendo que as Gram positivas possuem espessa camada de peptidoglicano e cido teicico, e as Gram negativas, uma fina camada de

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peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o tratamento com o lcool (ou lcool-acetona) extrai os lipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactrias Gram negativas. Assim, o complexo cristal violeta iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactrias Gram negativas so descoradas. A parede celular das bactrias Gram positivas, em virtude de sua composio diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado. COLORAO DIFERENCIAL PELO MTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882) A colorao de Ziehl-Neelsen o mtodo para a pesquisa de bacilos lcool cido resistentes (BAAR) incluindo-se o bacilo da tuberculose, o bacilo de Hansen e micobactrias atpicas. Este mtodo de colorao se baseia na propriedade das micobactrias de se corarem inicialmente pela carbolfucsina (a fucsina dissolvida numa soluo de fenollcool-gua) e resistirem a uma descolorao por lcoolcido. Atravs desta colorao, podemos visualizar um grupo restrito de bactrias que possuem sua parede celular constituda de lipdeos em grande concentrao, devido a presena de cras e cidos graxos de cadeia longa(cidos miclicos), que conferem clula a caracterstica de lcoolcido resistncia. COLETA DO MATERIAL 1- Coletar a amostra, antes da antibioticoterapia. 2- Obter, de preferncia o primeiro escarro da manha antes da ingesto de alimentos. 3- Orientar o paciente para escovar os dentes com gua (no utilizar pasta dental) e enxaguar a boca varias vezes, inclusive com gargarejos. 4- Respirar fundo, umas oito ou dez vezes, e tossir profundamente, recolhendo o material no frasco de coleta estril. 5- Quando o material produzido for escasso, coletar amostra aps nebulizao. 6- Enviar ao laboratrio o mais breve possvel. O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivares so imprprias para anlise bacteriolgica, pois no so representativas do processo infeccioso. PREPARAO DO ESFREGAO Colocar as amostras em lminas (novas e desengorduradas) com aplicador de madeira. Escolher a partcula mais densa ou uma mistura da amostra, quando s existirem pequenas

Tcnicas de Colorao de Bactrias

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partculas purulentas ou mucosas. E com aplicador estirar a amostra em 1/3 da lmina, deixar secar temperatura ambiente e fixar como no procedimento anterior. Tcnica: 1)Cobrir toda a lmina com fucsina fenicada. 2)Com auxlio de uma chama, aquecer a lmina, pela sua parte inferior at emitir vapores. Repetir duas vezes esperando o corante esfriar. Aguardar 5 minutos, no deixando o corante nem ferver nem secar. 3)Lavar a lmina com gua corrente, suavemente. 4)Inclinar a lmina descorar com soluo lcool cido clordrico, at no sair mais corante. 5)Lavar a lmina com gua corrente. 6)Cobrir o esfregao com soluo de azul de metileno de Loeffler durante 30 segundos. 7)Lavar a lmina em gua corrente. 8)Deixar secar e observar ao microscpio, com a objetiva de imerso. Notas: 1.Na colorao de Ziehl, o aquecimento no deve ser feito muito intenso, a ponto de ferver o corante, mas apenas at ligeira emisso de vapores. 2.A colorao de fundo feita para corar bactrias e outras estruturas que foram diferenciadas, para o efeito contrastante ou distino entre as bactrias e clulas presentes no material. RESULTADO: Visualizar, esquematizar e classificar as bactrias existentes nas lminas. A classificao dever ser quanto resistncia ou no das bactrias ao descoramento em lcool cido. Bactrias lcool cido resistente (BAAR) permanecem coradas de vermelho pela fucsina. Bactrias no lcool cido resistente (BNAAR) no retm a fucsina, aparecem coradas pelo azul de metileno.

TCNICAS DE PREPARAO DOS CORANTES DE GRAM Preparao do Cristal Cristal violeta cido fnico lcool absoluto gua destilada de Violeta: 1g 2g 10ml 100ml

Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar o lcool. Juntar aos poucos o cido fnico, misturando sempre, de modo a obter uma mistura bem homognea. Juntar a gua

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pouco a pouco, misturando bem. repouso, em papel de filtro. Preparao do Lugol: Iodo Iodeto de potssio gua destilada

Filtrar aps 24 horas de

1g 2g 300ml

Triturar o iodo com o iodeto de potssio em gral de vidro. Juntar a gua e misturar bem. Preparar em quantidade que seja usada antes de 30 dias. Preparao de lcool acetona: lcool 800ml Acetona 200ml Unir os dois componentes e misturar bem. Preparao da Fucsina para Colorao de Gram: Fucsina 2,5g lcool etlico 100ml gua destilada 90ml A soluo estoque (fucsina e lcool etlico) deve ser preparada unindo-se os dois componentes e misturando bem. Para usar 10ml da soluo em 90ml de gua destilada, isto , diluir a 10% em gua destilada. Armazenamento de corantes: Os corantes devem ser estocados em frascos de vidro mbar em local onde as condies ambientais sejam favorveis, com temperatura entre 20 e 25C (T.A.) e sem teor de umidade. TCNICAS DE PREPARAO DOS Preparao de Fucsina Fucsina bsica lcool a 95% Fenol fundido gua destilada CORANTES DE ZIEHL-NEELSEN fenicada: 1g 10ml 5g 100ml

Dissolver num gral o corante no lcool. Adicionar aos poucos o cido fnico, misturando sempre, de modo a obter uma mistura bem homognea. Juntar a gua pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar aps 24 horas de repouso. cido clordrico lcool 95% cido clordrico (dens. 1,19) 100ml 1ml

Tcnicas de Colorao de Bactrias

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10,3g 30ml 1ml 100ml

Azul de Loeffler A)Azul de metileno lcool a 95% B)Soluo de hidrato de sdio a 0,01% gua destilada Misturar A) e B).

Diluir 10 vezes em gua destilada.

Meios de Cultivo Bacteriano _______________________________________________________________________

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III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO

Meios de cultivo so compostos de gua e de nutrientes essenciais ao crescimento de microrganismos. Basicamente, um meio de cultivo deve conter alm de extrato de carne para o fornecimento de protenas, carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sdio. A constituio de um meio de cultivo adequado bastante variada e depende das exigncias nutricionais do microrganismo. Os meios de cultivo so utilizados para o isolamento e identificao de microrganismos, testes para controle de esterilizao ambiental, anlise de alimentos e de gua, etc. Os meios de cultivo podem ser preparados no laboratrio de microbiologia de duas formas: (1) a partir de seus ingredientes bsicos, (2) dos desidratados disponveis comercialmente, ou podem ser comprados prontos para uso em tubos de ensaio ou placas de Petri. Didaticamente, os meios de cultivo podem ser classificados quanto consistncia e quanto funo. a) Quanto consistncia: o meio pode ser lquido, semi-slido e slido. Meio lquido: aquele em que os nutrientes esto dissolvidos em aquosa. So os caldos (broth). Meio semi-slido: Esse meio possui na sua composio alm dos nutrientes, gar (polissacardeo extrado de algas marinhas) a 0,5%. Meio slido: um meio que possui na sua composio nutrientes e um teor de 1,5% de gar. Apresentado em placas ou tubos inclinados ou no. b) Quanto funo: O meio de cultivo pode ser enriquecedor, seletivo, diferenciador e de manuteno. Meio enriquecedor ou enriquecido: aquele que permite o crescimento de microrganismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento. Ex.: BHI, gar sangue, gar chocolate. Meio seletivo: aquele que contm substncias que inibem o crescimento de certos microrganismos, sem impedir o crescimento de outros. Ex.: gar SS (Salmonella, Shigella) Meio diferenciador ou indicador: empregado para detectar colnias bacterianas com propriedades distintas. As bactrias acidognicas so conhecidas pela ao da cor do indicador cido-base adicionado ao meio. As bactrias que hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelas zonas claras produzidas nos meios contendo suspenses de amido. Bactrias hemolticas so visualizadas pelas alteraes produzidas no gar sangue. Os produtores de gs sulfdrico

Meios de Cultivo Bacteriano _______________________________________________________________________

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formam uma zona escura de sulfito ferro no meio contendo excesso de ferro. Ex.: gar EMB, gar sangue. Meio de manuteno: um meio utilizado para estocagem e deve ser de baixo teor nutritivo para evitar a rpida morte celular, devido a eliminao de substncias txicas resultantes do metabolismo dos microrganismos. Ex.: gar Nutriente. Preparao: Um fator que influencia na preparao do meio de cultivo a temperatura. Ao preparar um meio de cultivo no podemos manter temperatura ambiente uma soluo no estril por mais de uma hora, devido a possibilidade de evaporao da gua e de crescimento microbiano. Alguns componentes so utilizados pelos microrganismos e os demais, pelo efeito da evaporao, se concentram. Aps preparados os meios devem ser esterilizados pelo processo de esterilizao adequada. Tcnica Preparao de meio lquido: Meio de B.H.I. (Brain-HeartInfusion). Componentes do meio: Infuso de corao ................... 250g Infuso de crebro ................... 200g Peptona ............................... 10g Dextrose................................ 2g Cloreto de Sdio ....................... 5g Fosfato de Sdio ..................... 2,5g gua destilada ...................... 100ml Execuo a)Adicionar 100ml de gua destilada aos ingredientes previamente pesados; b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsen ou forno de microondas; c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10ml por tubo. Colocar tampo de algodo em cada tubo; d)Autoclavar (121C por 15 a 20 minutos). Preparao de meio slido: Meio gar nutriente (gar Base) ou gar Gelose. Componentes do meio: Extrato de Carne ....................... 3g Peptona ................................ 5g gar ................................. 15g gua destilada ..................... 1000ml

Conservao dos meios de cultivo

Meios de Cultivo Bacteriano _______________________________________________________________________

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Aps preparados, os meios devem ficar temperatura ambiente at o esfriamento total. Quando a quantidade de meio preparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deve ser armazenado em geladeira dentro de sacos plsticos para evitar desidratao. Quando a quantidade de meio for grande e no de uso imediato, deve ser distribudo em frascos com rolha, selados com tampas de alumnio e logo aps autoclavados. A maioria dos meios de cultura na forma desidratada pode ser conservada temperatura ambiente durante anos e outros que contenham substncias termolbeis em sua composio so guardados em geladeiras. Para usar frascos de meio lquido, abrimos o selo de alumnio, retiramos a rolha de borracha com cuidados asspticos e, em ambiente estril, transferimos o meio para tubos estreis (atravs de pipetas). Para usar frascos de meio slido, fundimos o gar imergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou forno de microondas a temperatura de 100oC. Aps a fuso do gar abrimos o selo de alumnio, retiramos a rolha de borracha e transferimos o meio para tubos (atravs de pipetas estreis) ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperatura ambiente.

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Positivas _______________________________________________________________________

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IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS

Em se tratando de material clnico para ser submetido a exame bacteriolgico este deve ser colhido antes da administrao de antimicrobianos, porque se a bactria for sensvel quele antibitico, dificilmente ela crescer nos meios de cultura. A bactria poder estar morta no momento da colheita ou ento ter o seu crescimento inibido pelo antimicrobiano presente no material clnico.
1- ISOLAMENTO - As bactrias podem ser cultivadas in vitro em

meios de cultura que lhes forneam todas as condies nutricionais e ambientais necessrias ao seu crescimento. As culturas so feitas pela semeadura dos materiais clnicos em meios slidos distribudos em placa de Petri, em tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos. Depois de semeados os meios devem ser incubados em temperatura e atmosfera adequadas. O perodo de incubao varia de acordo com a velocidade de crescimento da bactria. A grande maioria das bactrias pode ser cultivada em 24 a 48 horas. Excees so feitas para o cultivo de Neisseria (1416hs) e Mycobacterium (at 21 dias). Material para colheita e isolamento: Abaixador de lngua "Swab" gar sangue Procedimento: Transferir a amostra colhida com o "Swab" para um ponto da superfcie do meio distribudo em placa e semear pela tcnica de estrias. Incubar a placa a 37C por 24h e fazer a identificao bioqumica e diferenciao de atividade hemoltica e enzimtica.
2- IDENTIFICAO:

2-1 Gnero: Streptococcus As espcies de maior interesse Streptococcus pyogenes, Streptococcus Streptococcus pneumoniae. clnico so: agalactiae,

Atividade hemoltica Os estreptococos podem ser classificados de acordo com o atividade hemoltica no no meio de gar sangue em: a)-hemolticos: quando lisam completamente as hemcias (in vitro) liberando hemoglobina e formando uma zona clara ao redor da colnia.

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Positivas _______________________________________________________________________

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b)-hemolticos: quando causam lise incompleta das hemceas com liberao de pigmento verde (reduo da hemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor da colnia. c)-hemoltico: ausncia de atividade hemoltica. Morfologia celular: Corados pelo mtodo de Gram, aparecem como Gram positivos esfricos ou lanceolados, de tamanho varivel, isolados ou em grupos formando cadeias curtas ou longas. Diferenciao bioqumica: Estreptococos -hemolticos Utilizar o Teste de sensibilidade a Optoquina para diferenciar o Streptococcus pneumoniae (sensvel a optoquina) de estreptococos viridescentes (resistente a optoquina), e o Teste de Solubilidade em Bile. As bactrias solveis em Bile so da espcie Streptococcus pneumoniae, as bactrias insolveis em Bile so de estreptococcos viridescentes. Estreptococos -hemolticos Os estreptococos -hemolticos elaboram carboidratos grupo-especficos. Estes carboidratos so utilizados em reaes de precipitao com anti-soros especficos, que possibilitem a separao dos grupos. Grupo A representado pelo Streptoccus pyogenes. 1. O Teste de sensibilidade Bacitracina permite separar os estreptococos do grupo A (cerca de 85%) dos demais grupos. Nos resultados de identificao baseados nesta prova devese indicar estreptococos -hemolticos do grupo A pelo teste de Bacitracina. 2. Pyr Teste Baseado na hidrlise enzimtica da Lpyrrolidonyl-beta-naphtylamide. Destina-se a identificao do Streptococcus pyogenes. A hidrlise atravs da enzima Lpyrroglutamyl-aminopeptidase, presente nesta bactria verificada atravs da reao do PYR Reagente com a betanaphtylamide livre que forma uma base de SHIFF de colorao vermelha-cereja. 2-2 Gnero Staphylococcus As trs espcies de maior interesse Staphylococcus aureus, Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus. clnico so: epidermidis,

Morfologia celular So cocos Gram positivos que podem apresentar-se isolados ou em pares, em pequenas cadeias ou aglomerados em cachos. Identificao e diferenciao

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Positivas _______________________________________________________________________

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a)Atividade enzimtica Prova de coagulase: A 0,5ml de plasma de coelho, adicionar 0,1ml de cultura em caldo. Incubar em banho-maria a 37C e verificar a intervalos de 30 minutos, se h formao de cogulo. O Staphylococcus aureus produtor de coagulase. O Staphylococcus epidermidis, no produtor de coagulase, usualmente considerado no patognico mas pode estar envolvido em certas situaes clnicas: endocardite bacteriana, em cirurgia com prtese, em transplante de medula e em cateterismo venoso (Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica Ministrio da Sade). b)Sensibilidade a novobiocina Teste de novobiocina Preparar uma suspenso em caldo e semear em gar. Colocar um disco de novobiocina (5mg), incubar a 37C por 24 horas e verificar a formao de um halo de inibio de 14mm. Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente a droga) do S. epidermidis (sensvel a droga). O S. saprophyticus causa relativamente freqente de infeco do trato urinrio em pacientes jovens.

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao ___________________________________________________________________________

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V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO

Introduo: A anlise da sensibilidade das bactrias aos agentes antimiccrobianos est relacionada vrias tcnicas ou mtodos laboratoriais in vitro utilizados para determinar a sensibilidade e a resistncia de determinado microrganismo a antimicrobianos. DETERMINAO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS EM BACTRIAS A identificao de bactrias isoladas de espcimens clnicas necessita de teste complementar para determinar o perfil de sensibilidade daquela espcie frente a quimioterpicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogas disponveis no combate quela infeco, so estudadas por grupos (aminoglicosdeos, betalactmicos, fluorquinolonas, macroldeos, peptdeos e sulfas) e em concentraes padronizadas (proporcionais s concentraes atingidas no soro de pacientes em tratamento) obtidas por estudo "in vitro". Drogas que mostraram-se inibidoras para determinado isolado bacteriano so selecionadas pela seletividade txica, efeitos secundrios, facilidade de administrao (oral e parenteral), e pelos custos do tratamento. Vrias tcnicas foram desenvolvidas mas a metodologia desenvolvida por Kirby, Bauer & Turck (1966) utilizada mundialmente por apresentar resultados rpidos e seguros. Um segundo tipo de teste de sensibilidade realizado utilizando-se espcies no patognicos, para fins de pesquisa bsica, quando se deseja estudar mecanismos de ao das drogas ou modelos de resistncia antimicrobiana ou ainda para marcar uma populao. Neste caso, so determinados os grupos de drogas e a concentrao mnima inibitria (CMI) por mtodo quantitativo. Objetivos: 1) Avaliao da atividade e do espectro de ao de novos agentes antimicrobianos; 2) Nos estudos de populaes bacterianas, para estabelecer o padro de sensibilidade sob o efeito seletivo de antimicrobianos; 3) Como marcadores epidemiolgicos. Fundamento: Substncias antimicrobianas so incorporadas ao meio de cultivo (lquido ou gar), em concentraes inibitrias para aqueles organismos sensveis. A concentrao dada em g/ml ou Unidades Internacionais (UI).

Mtodos: 1.Qualitativo - Pesquisa que grupos de drogas antimicrobianas so bactericidas para determinada espcie bacteriana numa determinada concentrao. Ex.: Tcnica de Kirby Bauer(1966). 2.Quantitativo - Pesquisa que concentrao de determinada droga antimicrobiana inibitria para uma espcie bacteriana isolada. Determinao da concentrao mnima inibitria (CMI). Mtodo de difuso com disco (Tcnica Kirby Bauer): Difuso da droga, sob forma de disco ou comprimido na superfcie do meio slido. 1. Padronizao do inculo bacteriano: A partir da placa original da cultura bacteriana do microrganismo a ser testado so transferidas 4 a 5 colnias para um meio de cultura lquido (Caldo-Soja-Casena, Caldo BHI, caldo Mueller-Hinton). Em seguida, incuba-se durante 2 a 4 horas. A densidade do inculo deve ser comparada com a escala de turbidez de McFarland (cido sulfrico + cloreto de brio), equivalente a 104 bactrias por ml de meio. 2. Semeio: Realizado atravs de swab estril embebido no inculo bacteriano e passado em toda a rea da superfcie do meio gar Mueller-Hinton (crescimento confluente). Deixar secar por 2 minutos. Com auxlio de uma pina estril colocar sob a superfcie do meio inoculado os discos de antibiticos em pontos eqidistantes (30 mm). Incubar a temperatura ideal para o crescimento daquela populao bacteriana por 18-24h. Leitura: Observar halo de inibio em torno do disco de antimicrobiano. O dimetro deste halo medido em mm (halmetro) e comparado com a tabela recomendada pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Para cada agente antimicrobiano, o dimetro do halo poder ser interpretado como sensvel (S), resistente (R) ou intermedirio (I). Teste E: Mtodo de difuso mais avanado que permite estimar a concentrao mnima inibitria (CMI), a mais baixa concentrao de antibitico que impede o crescimento bacteriano. Uma tira revestida de plstico contendo um gradiente de concentrao do antibitico, e a CMI pode ser lida em uma escala impressa na tira. Utilizao de Drogas de baixa difuso: molculas grandes e polarizadas. Considerar pequenos halos como sensveis. Drogas de Considerar alta difuso: molculas pequenas halos com maiores dimetros que e apolares. os padres.

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao ___________________________________________________________________________

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Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao ___________________________________________________________________________

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Considera-se uma populao sensvel a determinada droga quando esta populao inibida por concentrao trs ou mais vezes inferior a concentrao que a substncia atinge no sangue. Amostras resistentes so inibidas por concentraes intermedirias. Ex.: Droga X atinge concentrao srica de 32g/ml. Populaes que so inibidas por 8g so consideradas sensveis e aquelas inibidas por concentraes acima de 16g consideradas resistentes. Fatores Intervenientes capazes de alterar a interpretao: Utilizao de meio muito ricos ou muito pobres em composio de "simular" falsos microrganismos resistentes ou sensveis. Utilizao de inculos muito concentrados (densos) e formao de tapetes de clulas mortas entre bactrias vivas e a droga. Para algumas infeces como difteria (C. diphteriae), meningite meningoccica no so realizados antibiogramas. Utilizam-se drogas de escolha. Devido a variabilidade de marcas de resistncia a drogas devem ser realizados sempre nas bactrias Enteropatognicas (Salmonella, Shigella, E. coli soropatognicas e para Mycobacterium tuberculosis). Observar a concentrao da droga que impregna o papel de filtro que compe o disco ou comprimido. Observar prazo de validade das drogas ensaiadas. Seleo de substncias antibiticas: Bactrias gram positivas: Penicilina, Eritromicina, Clindamicina, Gentamicina e Tetraciclinas. Para Staphylococcus no precisa testar Ampicilina e Carbenicilina (Produtores de betalactamases). A meticilina representa betalactmico (penicilina) no degradada pela betalactamase. Bactrias gram negativas (Enterobacteriaceae): Ampicilina, Cefalosporinas, Gentamicina, Tetraciclinas, Cloranfenicol, Trimetoprim + Sulfametoxisazol e Amoxacilina. Infeces urinrias: Ampicilina, Ac. Nalidxico, Nitrofurantonas, Cefalosporinas, Sulfas e Fluorquinolonas. Para infeces por Pseudomonas sp.: Carbenicilina, Gentamicina, Tobramicina, Pipraciclina e Amicacina. Para infeces por cpas de Anaerbios: Bacterides, Peptococos, Fusobactrias e Clostrdios: Clindamicina, Metronidazol, Rifampicina, Vancomicina e Tetraciclinas.

Microrganismos de referncia Mantenha culturas-estoques de S. aureus (ATCC25923) e E. coli (ATCC25922). Teste esses microrganismos de referncia, pelo mtodo que foi descrito, usando discos de antibiticos representativos daqueles a serem empregados no teste de isolados clnicos. Comparaes de resultados para os microrganismoscontrole de teste para teste oferecem uma verificao na reprodutibilidade do processo do teste e na credibilidade dos discos-teste. Limitaes do mtodo O mtodo de interpretao descrito aqui se refere a patgenos de crescimento rpido e no deve ser aplicado a microrganismos de crescimento lento, para os quais os critrios dos halos no so apropriados. E para antibiticos que se difudem lentamente em gar, ex: polimixina B.

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao ___________________________________________________________________________

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Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao ___________________________________________________________________________ Tabela 1. Limites para interpretao do antibiograma com 24 antibacterianos de uso corrente na teraputica clnica.
Antibacteriano
Amicacina Ampicilina ao testar microrganismos Gram-negativos e enterococos Ampicilina ao testar estafilococos e microrganismos sensveis penicilina G Ampicilina ao testar Haemophilus sp. Bacitracina Carbenicilina ao testar Proteus sp. E E. coli. Carbenicilina ao testar Pseudomonas aeruginosa Cefalotina ao relatar sensibilidade a todas as cefalosporinas Clindamicina ao relatar sensibilidade clindamicina e lindomicina Cloranfenicol Colistidina Eritromicina Estreptomicina Gentamicina Konanilcina Nalidxico, cido Neomicina Nitrofurantona Novoblocina Oxocilina Penicilina G. ao testar Estafilococos Penicilina G. ao testar outros microrganismos Penicilina G. Sulfazotrin (Sulfatomoxazol + Trimetoprin) Sulfonamidas Tetraciclina Tobramicina Vancomicina

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Smb.
AM AP

Conc. disco
30mcg 10mcg

Zonas de inibio (em mm) Resistente Interme Sensvel dirio

14 ou menos 11 ou menos 15-18 12-13 17 ou mais 14 ou mais

AP

10mcg

20 ou menos

21-28

29 ou mais

AP BC CR CR

10mcg 10un. 100mcg 100mcg

19 ou menos 8 ou menos 17 ou menos 13 ou menos

___ 9-12 18-22 14-16

20 ou mais 13 ou mais 23 ou mais 17 ou mais 18 ou mais

CF

30mcg

14 ou menos

15-17

CL CO CL EL ET GN KN AN NO NT NV OX PN PN PL SFT SF TT TB VC

2mcg 30mcg 10mcg 15mcg 20mcg 20mcg 30mcg 30mcg 30mcg 300mcg 30mcg 6mcg 10un. 10un. 50un. 25mcg 300mcg 30mcg 10mcg 30mcg

14 ou menos 12 8 13 11 12 13 13 12 14 17 9 ou ou ou ou ou ou ou ou ou ou ou menos menos menos menos menos menos menos menos menos menos menos

15-16 13-17 9-10 14-17 12-14 13-14 14-17 14-18 13-16 15-16 18-21 10-13 21-28 12-21 0-11 11-15 13-16 15-18 13-14 10-11

17 ou mais 18 11 18 15 15 18 19 17 17 22 14 ou ou ou ou ou ou ou ou ou ou ou mais mais mais mais mais mais mais mais mais mais mais

20 ou menos 11 ou menos 8 ou menos 10 ou menos 12 14 12 9 ou ou ou ou menos menos menos menos

29 ou mais 22 ou mais 12 ou mais 16 ou mais 17 19 15 12 ou ou ou ou mais mais mais mais

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas ___________________________________________________________________________

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VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS

As bactrias Gram-negativas incluem vrios gneros de bacilos fermentadores de carboidratos (Enterobactrias) ou no fermentadores de carboidratos (Ex.: Pseudomonas, Acinetobacter). Os bacilos mais freqentemente isolados de amostras clnicas em laboratrios de microbiologia pertencem a famlia Enterobacteriaceae e so denominados enterobactrias (Ex: Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Shigella, salmonella, Proteus, Serratia, etc.). Esses bacilos esto amplamente distribudos na natureza e so encontrados principalmente no trato intestinal do homem e de animais. O isolamento e identificao das bactrias Gramnegativas baseiam-se principalmente em reaes bioqumicas que ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismo bacteriano. 1 - ISOLAMENTO Para o isolamento dos bacilos Gram-negativos utilizados principalmente meios seletivos diferenciais.

so

a) Meios de isolamento gar salmonella Shigella (SS), gar Hektoen (HE), gar MacConkey, gar Verde Brilhante, gar Eosina Azul de Metileno (EMB), gar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e gar Bismuto Sulfito. b) Tcnica de semeio para isolamento Transferir o inculo bacteriano para um ponto da superfcie do meio de cultivo distribudo em placa e semear pela tcnica de estrias utilizando a ala de platina flambada. Incubar a placa a 37oC por 18-24h e fazer a diferenciao e identificao bioqumica. 2 - IDENTIFICAO (Provas bioqumicas) 2-1. Fermentao glicose) de carboidratos (lactose, sacarose,

Nos sistemas de provas bacteriolgicas o processo de fermentao detectado por observao visual das mudanas de cor dos indicadores de pH do meio quando os produtos cidos so formados pelas bactrias. a) Princpio Os testes de fermentao de carboidratos determinam a capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinado

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas ___________________________________________________________________________

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acar, incorporado numa concentrao de 0,5 a 1,0% em meio base de vermelho de fenol, produzindo cidos com ou sem gs. b) Meio: base de vermelho de fenol Indicador de pH: Vermelho de fenol cido (cor amarela) - pH < 6,8 Alcalino (cor rosa) - pH > 8,4 Neutro (cor laranja) - pH = 7,4 c) Tcnica Transferir, com ala de platina estril, uma colnia bacteriana isolada para o meio lquido vermelho de fenol adicionado do carboidrato a ser fermentado. Incubar a 37oC por 18-24h. d) Resultado POSITIVO: cor amarela -- presena de cido (carboidrato fermentado) NEGATIVO: cor rosa -- ausncia de cido (Carboidrato no fermentado) 2-2 gar TSI (gar Trplice-acar-ferro) a) Princpio No meio TSI distribudo em tubos de ensaio observa-se a fermentao ou no dos acares (lactose, glicose e sacarose) pelas bactrias Gram-negativas, com produo ou no de gs CO2. Tambm pode se observar a formao de H2S (gs sulfdrico ou sulfeto de hidrognio) pela sua reao com o sulfato ferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado de sulfeto ferroso que se manifesta por uma reao visvel de cor negra. b) Meio TSI Neste meio, alm do gar e das fontes de carbono e de nitrognio, tambm esto presentes o tiossulfato de sdio que uma fonte de enxofre para a produo de H2S e o indicador de pH vermelho de fenol,que j foi visto no tpico anterior. c) Tcnica Transferir a colnia bacteriana isolada para o meio TSI, utilizando-se a agulha de platina flambada. A inoculao dever ter a profundidade de 2/3 do meio em uma nica picada. Em seguida, fazem-se estrias na superfcie inclinada. Incubar a 37oC por 18-24h. d) Resultado e interpretao O resultado obtido pela visualizao da mudana de cor no pico (superfcie inclinada) e no fundo (profundidade) do tubo de ensaio contendo o gar TSI:

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas ___________________________________________________________________________

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Pico alcalino/fundo alcalino - Ausncia de fermentao dos aucares. Ex: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter. Pico alcalino/fundo cido - Fermentao apenas da glicose. Ex: Shigella. Pico alcalino/fundo cido e negro - Fermentao da glicose e produo de H2S. Ex: Salmonella, Proteus, Citrobacter. Pico cido/fundo cido - Fermentao dos trs aucares. Ex: Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e outros componentes do grupo coliforme. 2-3. Motilidade a) Princpio e meio O meio de cultivo apropriado para teste de motilidade bacteriana deve ser semi-slido (0,5% de agar) para permitir a difuso de bactrias mveis. b) Tcnica Inocular em uma nica picada a colnia bacteriana isolada no meio, utilizando-se a agulha de platina estril. Incubar a 37oC por 18-24h. c) Resultado A motilidade bacteriana detectada pelo exame macroscpico do meio para se observar uma zona de crescimento difuso (turbidez) que parte da linha de inoculao feita com a agulha de platina. 2-4. Citrato a) Princpio Determinar se um microrganismo capaz de utilizar o citrato como nica fonte de carbono para seu metabolismo e crescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrognio presente no meio tambm ser, havendo liberao da amnia com a conseqente alcalinizao do meio. b) Meio: gar Citrato de Simmons Este um meio slido no qual a nica fonte de carbono o citrato de sdio, tendo como indicador de pH o azul de bromotimol. c) Tcnica A bactria em estudo inoculada na superfcie do gar inclinado em tubo fazendo-se estrias na superfcie do meio, utilizando-se a ala de platina flambada. Incubar a 37oC por 18-24h ou at 3 dias, se necessrio. d) Resultado POSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilizao do citrato

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NEGATIVO: meio verde (neutro) - No utilizao do citrato 2-5. Teste da lisina descarboxilase a) Princpio Determinar a habilidade enzimtica de uma determinada bactria em descarboxilar o aminocido lisina, com a subsequente alcalinizao do meio devido a formao de amina alcalina (cadaverina). b) Meio LIA (gar lisina ferro) Este meio contm como indicador o prpura de bromocresol: cido: cor amarela -- pH < 5.2 Neutro a bsico: cor prpura -- pH = 6.8 c) Tcnica A bactria teste inoculada em uma nica picada no meio LIA em tubo de ensaio, utilizando-se uma agulha de platina estril. Em seguida, fazem-se estrias na superfcie oC por 24h. inclinada. Incubar a 37 d) Resultado POSITIVO: meio prpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilao da lisina e conseqente formao de aminas. NEGATIVO: meio amarelo (cido) - No ocorreu a descarboxilao da lisina. A acidificao do meio ocorre porque a bactria fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio. 2-6. Teste de Indol a) Princpio Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol a partir da molcula de triptofano. Quando ocorre a degradao deste aminocido por bactrias que possuem a enzima triptofanase ocorre a formao de: Indol, cido pirvico e amnia. Este teste til para diferenciar a E.coli (indol positiva) de outras enterobactrias. b) Meio e reativo Caldo Triptofano Reativo de Kovac ou Reativo de Ehrlich Composio: pdimetilaminobenzaldedo, HCL concentrado, lcool isoamlico (Kovac), lcool etlico absoluto (Ehrlich). c) Tcnica Inocular o caldo triptofano com a bactria em estudo e incubar a 37oC por 18-24h. Em seguida, adicionar gotas do reativo de Kovac no tubo. d) Resultado

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O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfcie do meio aps a adio do reativo indica a presena de indol e uma prova positiva. A cor vermelha aparece na camada de lcool quando o indol produzido reage com o pDimetilaminobenzaldedo presente nos reativos de Ehrlich ou de Kovac. 2-7. Teste de urease a) Princpio Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar enzimaticamente a uria pela urease com a formao de duas molculas de amnia (NH3), resultando na alcalinizao do meio. b) Meio caldo uria Este meio tem como indicador de pH o vermelho de fenol, j visto anteriormente. c) Tcnica Inocular o caldo uria com uma ala de platina carregada de cultura pura do organismo em estudo. Incubar a 37oC por 18-24h. d) Resultado POSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presena de urease NEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausncia de urease 3 MTODOS DE IDENTIFICAO AUTOMATIZADOS 3-1. Sistema API Enterobactrias 20E (bio Mrieux) Identificao de

O sistema de identificao API 20E consiste em tiras plsticas com 20 compartimentos miniaturizadas que contm os substratos desidratados (meio de identificao bioqumica) e uma cmara plstica de incubao com tampa frouxa. Cada compartimento possui um pequeno orifcio superior atravs do qual a suspenso bacteriana diluda em soluo salina ou gua destilada estril pode ser inoculada com uma pipeta. A ao bacteriana sobre o substrato produz mudana de cor que interpretada visualmente em 24 horas a 35C. O fabricante fornece folhas de trabalho para registro das interpretaes visuais das reaes coloridas, que em seguida so convertidas em nmero do bitipo de 7 dgitos, levando a identificao da espcie bacteriana. Os 20 substratos includos para identificao de enterobactrias so: ONPG, arginina diidrolase, lisina descarboxilase, ornitina descarboxilase, citrato, sulfeto de hidrognio, urease, triptofano desaminase, indol, Voges-

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Proskauer, gelatina, glicose, manitol, inositol, sorbitol, ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina, arabinose. Pelo sistema API 20E so identificadas mais de 100 espcies de bactrias Gram-negativas. Esse sistema um dos mais utilizados nos laboratrios clnicos e de pesquisa. Obs: Tambm so comercializados outros sistemas API para identificao de bactrias Gram-positivas. 3-2. Sistema VITEK O sistema VITEK (bio Mrieux) um sistema computadorizado que consiste em um mdulo gerador de vcuo, leitor-incubador, computador-impressora e um monitor de computador. Este sistema utilizado com cartes de teste VITEK para identificao bacteriana e provas de susceptibilidade a antibiticos, totalmente automatizadas. Este sistema permite a identificao de enterobactrias em 8 horas, sendo aceito como um mtodo confivel para identificao rpida de bacilos Gram negativos nos laboratrios de microbiologia clnica. Cada carto de identificao possui 30 testes bioqumicos que no necessita adio de reagentes, evitando erros. VITEK capaz de detectar mais de 300 espcies de microrganismos (bactrias Gram-negativos e Gram-positivos e leveduras).

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VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS

Os fungos so organismos eucariticos, heterotrficos, obtendo sua alimentao a partir de matria orgnica inanimada ou nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos. Estes microrganismos causam doenas humanas, em animais e vegetais. De um modo geral, os fungos incluem os bolores (ou mofos) e as leveduras. Os bolores so filamentosos e pluricelulares e as leveduras se apresentam sob forma unicelular. Conhecer os aspectos microscpicos e macroscpicos dos fungos de extrema importncia para a identificao destes organismos que so agentes etiolgicos de processos infecciosos, de reaes de hipersensibilidade imediata e tardia e produtores de micotoxinas. A coleta do material o primeiro passo para obteno de um resultado laboratorial confivel. Deve-se sempre questionar o paciente em relao ao uso de medicaes antifngicas tpicas e/ou sistmicas. Caso o paciente esteja fazendo uso da medicao, o mesmo dever ser orientado a suspend-la por um perodo de 15 dias, em caso de uso tpico e 1 ms, quando se tratar de drogas de uso sistmico. Esta suspenso deve ser realizada com autorizao mdica. de grande importncia que todos os espcimes clnicos encaminhados para diagnstico laboratorial, venham acompanhados de uma ficha, que contenha no mnimo as seguintes informaes: identificao e procedncia do paciente, tempo de evoluo da leso, localizao e aspectos clnicos da leso, possveis contatos com animais e solo, uso de drogas. 1)ASPECTOS MICROSCPICOS DOS FUNGOS 1.1- Exame microscpico direto O diagnstico microbiolgico e imunolgico das micoses pode ser feito pelo exame microscpico direto, exame histopatolgico, cultivos, testes intradrmicos, pesquisa de anticorpos sricos e de antgenos. O exame microscpico direto o mtodo mais usado no diagnstico de rotina das micoses por ser rpido e sensvel, permitindo a visualizao do fungo e em muitas ocasies, sua identificao. importante salientar que a realizao do cultivo paralelamente ao exame direto imprescindvel para um completo diagnstico laboratorial micolgico. A tcnica de preparao para o exame direto, varia de acordo com o material biolgico a ser investigado e da suspeita clnica da etiologia do processo. Preparao do exame direto com amostras clnicas densas (p.ex.: escamas epidrmicas, ungueais e plos):

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos 40 ________________________________________________________________________

a) Clarificar a amostra clnica, j sobre a lmina, com 1 gota da soluo de hidrxido de potssio (KOH) a 10-20%; b) Aquecer suavemente a lmina na chama do bico de Bunsen; o calor juntamente com o KOH vai dissolver a queratina presente na amostra, clareando o material de fundo; esperar 10 minutos, tempo necessrio para clarear o material de fundo. c) Corar o material com 1-2 gotas de lactofenol azul-algodo (ou azul de Amann); d) Cobrir com lamnula; e) Examinar ao microscpio com objetiva de 40X. Exemplos de algumas caractersticas morfolgicas dos fungos: clula brotante

Pseudo-miclio

Hifa cenoctica

Hifa septada

Hifa artrosporada Epidermophyton sp Microsporum sp Trichophyton sp

A- Macrocondeos B- Microcondeos

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Preparao da lmina a partir do cultivo de fungos: a) Colocar 1 a 2 gotas do corante lactofenol azulalgodo; b) Retirar uma pequena poro da colnia (do miclio reprodutivo ou areo, no caso dos fungos filamentosos) e colocar sobre a lmina; c) Cobrir com lamnula; d) Observar ao microscpio com objetiva de 40X. Aps o preparo da lmina podemos visualizar os aspectos microscpicos dos fungos. Observaes: As amostras de consistncia lquida e relativamente claras podem ser examinadas diretamente ao microscpio aps a mistura em uma gota de soluo salina em lmina de vidro. A utilizao do corante lactofenol azul-algodo importante porque o fenol inviabializa os microrganismos vivos e o azul-algodo cora a quitina, presente nas paredes das clulas fngicas. 1.2- Aspectos microscpicos dos fungos filamentosos ou bolores O fungo filamentoso se origina a partir de um esporo, que emite um filamento tubular microscpico, chamado hifa, que posteriormente se ramifica formando um conjunto de hifas denominado miclio, que pode ser vegetativo ou reprodutivo (areo). Algumas hifas apresentam paredes transversais ou septos e so chamadas hifas septadas, outras no possuem septos e so chamadas hifas cenocticas . Microscopicamente, os bolores so identificados principalmente pelos tipos de esporos, corpos de frutificao e hifas. Os esporos so muito importantes na classificao dos fungos, sendo as classes diferenciadas, primariamente, pelas caractersticas morfolgicas dos esporos. A anlise conjunta das caractersticas microscpicas, em geral, permite a classificao genrica do fungo. A definio da espcie, geralmente, tarefa de laboratrios de referncia. 1.3- Aspectos microscpicos das leveduras Como leveduras, os fungos apresentam-se unicelulares com forma oval ou arredondada. A reproduo assexuada das leveduras ocorre principalmente por gemulao ou brotamento. Algumas vezes, aps a gemulao, as leveduras e as clulas-filhas ficam aderidas, formando uma estrutura conhecida como pseudomiclio (p.ex., Candida). As leveduras tambm podem se reproduzir sexuadamente atravs de ascosporos ou basidiosporos. Portanto, a observao microscpica de

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estruturas assexuadas e sexuadas bastante empregada na identificao genrica das leveduras.

2) ASPECTOS MACROSCPICOS DOS FUNGOS (Observao macroscpica das colnias em meio slido). Ao contrrio do que se verifica no estudo das infeces bacterianas, em que o cultivo o principal mtodo diagnstico, nas infeces fngicas ele um complemento do exame microscpico direto. As razes que podem contribuir para isso, so o crescimento lento dos fungos e as dificuldades para cultivar alguns deles. O isolamento primrio, seguido da correta identificao dos agentes etiolgicos, uma condio indispensvel para o diagnstico laboratorial das micoses, e, para tanto, a escolha do meio de cultura adequado uma tarefa de extrema importncia. Uma ampla variedade de meios de cultura pode ser utilizada num laboratrio de micologia, atendendo a diversos fins, tais como: isolamento primrio do fungo a partir dos espcimes clnicos, a identificao taxonmica dos gneros e espcies, a estocagem e manuteno em micoteca, e, mais recentemente a execuo de testes de susceptibilidade frente a diferentes antifngicos. A seleo do meio a ser empregado deve, basicamente, levar em considerao o tipo de amostra biolgica a ser semeado e a suspeita clnica. Apesar da variedade de meios de cultivo disponveis(muitos vendidos pronto para uso, outros preparados artesanalmente), o gar Sabouraud ainda o meio mais utilizado dentro de um labotatrio de micologia. A esse meio podem ser acrescidos muitos inibidores,tais como o cloranfenicol e a cicloeximida, objetivando otimizar o isolamento em espcimes clnicas possivelmente contaminadas por bactrias e fungos anemfilos (fungos que apresentam suas estruturas de reproduo comumente vetorizadas por correntes de ar). O meio de Sabouraud o principal meio de cultura utilizado na micologia mdica. utilizado para o cultivo primrio geral dos fungos (leveduras, filamentosos e alguns dimrficos), emespecial para Dermatoftos, uma vez que as principais caractersticas macro e microscpicas desse grupamento fngico so descritas a partir do seu crescimento nesse meio. Porm importante salientar que alguns fungos filamentosos dos gneros Aspergillus, Fusarium, Scopulariopsis, ou algumas leveduras como o Cryptococcus neoformans, por exemplo, podem ter seu crescimento inibido na presena da cicloeximida. As caractersticas principais deste meio so o seu pH cido (5.8) e seu elevado teor em glicose, que o torna mais seletivo para fungos, dificultando o

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crescimento bacteriano. Entretanto, o meio no totalmente impediente para bactrias, por esta razo deve ser acrescido de antibiticos que inibem o crescimento destes microrganismos. O clorafenicol um dos antibiticos mais utilizados, pela comodidade do seu uso, pois pode ser esterelizado na autoclave e pelo seu amplo espectro de ao. A composio do gar Sabouraud foi,inicialmente proposta pelo micologista Raymond Jacques Sabouraud, em 1904, e vem apresentando diversas modificaes com o passar dos anos, com alteraes na quantidade de alguns componentes, tais como a dextrose e a adio de substncias inibidoras , como o clorofenicol e a cicloeximida. COMPOSIO DO MEIO GAR SABOURAUD: Dextrose (glicose) ---- 20g Peptona -------------- 10g gar ------------------ 20g gua ---------------- 1.000ml pH final = 5.6 Dissolver agar, peptona e dextrose em gua destilada, aquecendo em banho-maria. Autoclavar, por 15 minutos, a 121C.

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OUTROS MEIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO DOS FUNGOS: gar batata dextrose, gar malte, gar fub, gar extrato de levedura glicose, etc. 2.1- Aspectos macroscpicos dos fungos filamentosos A morfologia das colnias dos fungos filamentosos um importante dado e pode auxiliar bastante em sua identificao. Para isso so feitas observaes quanto textura, cor, topografia, consistncia, contorno da colnia, etc. TEXTURA A textura da colnia refere-se s caractersticas dos miclios areos em seu conjunto e pode ter aspecto: ALGODONOSO OU COTONOSO: miclio areo denso e alto; AVELUDADO: miclio areo baixo, lembrando veludo; PULVURULENTO: hifas planas, esfarelam-se facilmente devido densa produo de condias; CREO OU GLABROSO: superfcie lisa, pois no produzem miclio areo. COR- A colnia pode ser branca, amarelada, acinzentada, alaranjada, verde, rosa, creme, marrom, etc. A cor do verso e anverso da colnia e os anis concntricos de diferentes cores so aspectos a serem considerados na identificao. CONSISTNCIA- A colnias coricea, mole, etc. pode ser pastosa, branda,

CONTORNO- A colnia pode ser circular, oval, elptica, irregular, etc. 2.2- Aspectos macroscpicos das leveduras A maioria das leveduras cresce adequadamente a o 30 C ou temperatura ambiente em gar Sabouraud. Caractersticas como cor, consistncia, bordos, superfcie e topografia tambm so observadas em meios de cultivo slidos. Com 2 a 3 dias de incubao formamse colnias de cor branca a creme, amarelada, alaranjada ou vermelha, de textura pastosa, mucides ou secas, lisas ou enrugadas. A habilidade da levedura crescer a 37oC uma caracterstica importante; a maioria das leveduras patognicas cresce bem a 30-37oC, enquanto as saprfitas no crescem em temperaturas mais elevadas.

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ASPECTOS DAS COLNIAS FNGICAS QUANTO AO RELEVO 1. Cerebriformes 2. Rugosas 3. Apiculadas 4. Crateriformes

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ASPECTOS DE COLNIAS FNGICAS QUANTO TEXTURA

1.Algodonosas 2.Furfurceas 3.Penungentes 4.Arenosas 5.Veludosas 6.Glabrosas

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VIII REAES ANTGENO ANTICORPO
Introduo terica A exposio de eptopos (antgenos=imungenos) a um sistema de clulas e tecidos imunologicamente competentes, origina estimulao de linfcitos B e T . Os primeiros(LB), diferenciam-se aps divises mitticas, em plasmcitos que so clulas munidas de um Sistema de membranas (Golgi e RE)prprios de clulas produtores e secretoras de protenas. Estas protenas so glicoprotenas globulares com funo de se combinar quimicamente com os elementos que formam parte do eptopo que deu origem a todo este fenmeno celular e secretor. Os linfcitos T, ao serem estimulados, secretam interleucinas, que so protenas cuja funo estimular outros linfcitos T e B (interleucinas 2,4) macrfagos, NK, linfcitos citotxicos (interferon gama)por exemplo. Apenas discutiremos, por enquanto, a ao das globulinas produzidas pelos plasmcitos: Os anticorpos ou imunoglobulinas. AES IN VITRO: Reaes antgeno anticorpo Estas acontecem entre a poro Fab das molculas de anticorpo e o eptopo dos imungenos. Nesta poro Fab, que se estabelecem ligaes no covalentes fracas como :pontes de Hidrognio, ligaes eletrostticas, hidrfobas e mediante foras de Van der Waals. Conhecendo os tipos de ligaes que se estabelecem e mantm unidos o complexo antgenoanticorpo, fica fcil entender o conceito de especificidade, pois somente podero se formar estas ligaes em nmero suficiente para se manterem estveis, SE O ANTICORPO REALMENTE FR DIRIGIDO CONTRA ESSE EPTOPO. Se as ligaes se formam tambm a nvel de estrutura primria e secundria do anticorpo, formando numerosas ligaes de curto alcance, o complexo estvel. Ento, numa primeira instancia, deve haver interao qumica entre imungeno (antgeno quando falamos de reao in vitro E FAB do anticorpo. Numa Segunda etapa, grande nmero de molculas do complexo antgeno-anticorpo, tendem a formar malhas que naturalmente sedimentam como grumos grosseiros ou como sedimento fino, dependendo da condio fsica do antgeno. Se particulado (hemcias, bactrias, protozorios) se observam grumos; se solvel, se forma fino precipitado com o imunocomplexo. ALGUNS CONCEITOS IMPORTANTES: Atravs das reaes sorolgicas pode-se pesquisar anticorpos contra um determinado antgeno bacteriano, parasitrio, mictico, ou at mesmo contra componentes do

prprio indivduo como acontece nas doenas autoimunes. Nestes casos ,variaes no ttulo de anticorpos indicam evoluo ou involuo da doena ou infeco. J ,quando interessa utilizar estas reaes para detectar antgenos circulantes no soro ou plasma, basta saber se estes existem ou no, as reaes podem ser apenas qualitativas. Se quiser quantificar o antgeno, basta comparar o resultado com concentraes de padres bem quantificados. Ttulo: a maior diluio do soro que ainda reage positivamente numa reao antgeno-anticorpo. Assim, um alto ttulo indica uma grande quantidade de anticorpos(foi necessrio diluir muito os anticorpos presentes para que estes desaparecessem na unidade de volume pr-fixada. Ex.: ttulo 1/10<1/455.Este ltimo contm mais anticorpos que 1/10,pois foi necessrio diluir os soros 455 vezes, para que no ficasse mais anticorpos no tubo de ensaio. Sensibilidade da reao; Qualidade de uma determinada tcnica, que permite detectar pequenas quantidade s de antgeno ou anticorpo no material analisado. Por exemplo,as tcnicas imunoenzimticas, detectam <1g de anticorpo ou antgeno, enquanto que as reaes que utilizam radioimunoensaio, detectam anticorpos ou antgenos na ordem de picogramas. Especificidade: Qualidade de uma tcnica que permite que a reao antgeno anticorpo acontea com eptopos que so exclusivos de uma determinada doena. Quando h reao com outros eptopos, outros anticorpos tambm entram a somar na reao, e estamos frente a reaes cruzadas ou falso positivas REAO DE AGLUTINAO DIRETA Na reao de aglutinao direta utilizam-se partculas antignicas insolveis em sua forma integra ou fragmentada. Hemcias, bactrias, fungos e protozorios podem ser aglutinados diretamente por anticorpos. REAES DE PRECIPITAO Ao reagir antgenos solveis com seus respectivos anticorpos, formam se redes que tendem a precipitar. Nesta reao possvel observar que as reaes antgeno-anticorpo dependem das concentraes do antgeno e dos anticorpos presentes. Assim se formar um complexo estvel quando Antgeno e anticorpo estejam em concentraes equivalentes, de outro modo, haver dissoluo do complexo e o precipitado no se forma, embora haja Ag e Ac. As reaes de precipitao hoje em dia, so executadas em meios semi slidos como gis de agarose (gel neutro, incolor). Tanto antgeno e anticorpo podem difundir neste meio, dependendo do seu tamanho molecular, at encontrar as propores timas de antgeno anticorpo, ento precipitam formando linhas ou halos de precipitao no local. Varias

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aplicaes existem na rotina tcnicas: Imunodifuso radial Imunodifuso dupla Imunoeletroforese Contra imunoeletroforese

laboratorial

para

estas

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REAO DE FLOCULAO TCNICA DE VDRL Teste no treponmico para o diagnstico de Sfilis: VDRL A tcnica de VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory) um exemplo de de reao esta de em floculao, um causada cujo com pela objetivo suspeita a de pesquisa sfilis, anticorpos indivduo

sendo

doena

espiroqueta

Treponema pallidum sub-espcie pallidum. A tcnica de VDRL pode ser realizada atravs dos mtodos qualitativo e quantitativo. utilizada como triagem sorolgica para a pesquisa de anticorpos em um indviduo com suspeita de sfilis e tambm para acompanhamento da resposta teraputica do paciente positivo, atravs da titulao dos anticorpos. A cardiolipina o antgeno utilizado na tcnica que pesquisa anticorpos, chamados de reagina. Trata-se de um fosfolpideo ocorre que atualmente preparado a partir do corao de um com anticorpo este denominado de reagina na bovino, sendo assim denominado cardiolipina. Aparentemente, produo que sfilis, reage complexo cardiolopina-

lipoprotena. No se sabe exatamente por que a reagina produzida; todavia, no se trata de um anticorpo especfico contra o T. pallidum. Os espiroquetas possuem uma substncia lipide, e para possvel semelhante que os que ao esta complexo substncia de seja o suficientemente lipoprotena cardiolipina. Um fato de grande importncia nesse teste de triagem sorolgica para Sfilis , que nem todo sifiltico comprovado cardiolipinacontra

anticorpos

produzidos

antgeno lipide dos espiroquetas tambm possam reagir com a

atravs de provas treponmicas, produz reao positiva para essa prova de VDRL. Outro dado de grande

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importncia

laboratorial, o fato de cerca de 2% de pacientes na sfilis primria e secundria serem falsamente negativos devido a um excesso teste de de antgenos (fenmeno conhecido e como pr-zona). na Devido a esta ocorrncia a OMS, sugeriu a realizao desse triagem, qualitatiamente quantitativamente diluio de 1/8 para todos pacientes submetidos a esse meio de diagnstico laboratorial. Por outro lado, alguns pacientes apresentam resultados falsopositivos, sem possuir a doena ou terem se submetido a algum tipo 1. 2. 3. 4. 5. de exposio. Segue abaixo as principais causas de resultados falso-positivos: Infeces virais ou bacterianas e em muitos estados febris, como hipersensibilidade ou vacinao; Doenas sistmicas crnicas, com presena de anticorpos antifosfolpideos; Doenas reumatides do colgeno; Doenas infecciosas como Malria e Tuberculose; Doenas treponmicas no-sifilticas, como bouba, pinta, Borrelia (doena de Lyme) ou febre recidivante.

Material para um grupo Mtodo qualitativo VDRL, soro positivo e negativo, ponteiras, pipeta automtica de 50 l, lminas, luva descartvel, culos protetor. Procedimento: Sobre a lmina limpa marcar retngulos. Colocar 50 l de da amostra do soro positivo e do soro negativo. Colocar uma gota do antgeno (cardioplina).

 Homogenizar durante um minuto com movimentos de vaivm presena ou no de floculao na lmina. Leitura dos resultados: O resultado observado pela floculao que

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para que ocorra a reao Antgeno-Anticorpo e observar a

ocorrer,

poder ser uma floculao leve, moderada ou intensa,depender da presena do ttulo dos anticorpos no soro do indivduo.

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TESTE RPIDO DE TRIAGEM ANTICORPOS PARA HIV 1/2. QUALITATIVA PARA DETECO DE

O teste rpido HIV 1/2 - Bio-Manguinhos um teste de triagem, que usa um coquetel de antgenos para detectar anticorpos para HIV 1/2 em soro, plasma ou sangue total humano. O teste se baseia nas tecnologias de imunocromatografia e fluxo lateral. Resumo: O Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV) um retrovrus, identificado em 1983 como agente etiolgico da Sndrome de Imunodeficincia Adquirida. A AIDS caracterizada por alteraes em funo e nmero na populao de linfcitos T (T helper), que desempenha um papel chave na resposta imunolgica do hospedeiro humano, deixando os portadores deste vrus suscetveis a infeces oportunistas e certas malignidades. O HIV constitudo por uma molcula de RNA, protegida por um capsdeo e um envelope. O envelope do vrus o principal alvo da resposta imune. A presena do vrus faz com que o sistema imune dos pacientes produza anticorpos antiHIV. A deteco destes anticorpos deve ser usada como parte do diagnstico laboratorial para o HIV 1/2. Ensaios de ELISA, Imunofluorescncia, Western Blot, tcnica da Cadeia de Polimerase (PCR) entre outros, complementam o diagnstico laboratorial definitivo para AIDS. PRINCPIO DO TESTE: O Teste Rpido HIV- 1/2 Bio-Manguinhos emprega a combinao de uma protena conjugada com partculas de ouro coloidal e antgenos de HIV 1/2 ligados a uma fase slida (membrana). A amostra aplicada ao respectivo poo (S), seguida da adio de um tampo de corrida. O tampo proporciona o fluxo lateral dos componentes liberados, promovendo a ligao dos anticorpos aos antgenos. Os anticorpos presentes, em casos positivos, se ligam s protenas especficas conjugadas ao ouro coloidal. No caso de uma amostra ser positiva o complexo imuno-conjugado migra na membrana de nitrocelulose, sendo capturado pelos antgenos fixados na rea do TESTE(T), produzindo uma linha roxo/rosa. Na ausncia de anticorpos para HIV 1/2, a linha no aparece na rea do teste. Nos dois casos, a amostra continua a migrar na membrana produzindo uma linha roxo/rosa na rea de CONTROLE(C), o que caracteriza o funcionamento adequado dos reagentes.

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COLETA DA AMOSTRA:

O teste Rpido HIV 1/2, Bio-Manguinhos realizado com soro, plasma, ou sangue total humano. Soro: o soro obtido do sangue total coletado assepticamente por puno venosa em tubo sem anticoagulante. Aguardar o sangue coagular a temperatura ambiente e centrifugar a 2000rpm, durante 10 minutos. Separar o soro do cogulo para evitar hemlise. Plasma: coletar o sangue total em tubo com anticoagulante, centrifugar a 2000rpm durante 10 minutos e separar o plasma sobrenadante. Sangue total: Coletar o sangue em tubo com EDTA, heparina ou citrato de sdio. Para sangue de ponta digital, utilizar a lanceta, conforme as instrues, desprezando a primeira gota. Coletar a segunda gota com a ala coletora descartvel. Para todos os materiais, seguir as instrues do procedimento do teste, como demonstrado a seguir.

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Procedimento para interpretao dos resultados a seguir:

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IX REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. AMATO NETO, V. et al. Antibiticos na Prtica Mdica. 2. BAILEY, R. et al. Diagnstico Microbiolgico.Editora mdica Pan
Americana S.A 1973. 3a ed.

3. JAWETZ, E. et al. Microbiologia Mdica. 18. ed. Guanabara

Koogan, 1996.

4. KONEMAN E.W.; ALLEN

S.D.; JANDA W.M.; SCHRECKENBERGER P.C. & WINN JNIOR W.C.

Diagnstico Microbiolgico Texto e Atlas colorido 5aed. Medsi, 2001.

5. LACAZ, C.L. Micologia Mdica, 1995. 6. PELCZAR M.J., CHAN E.C.S; KRIEG N.R. Microbiologia: conceitos e
aplicaes. v.1, 2a ed. Makron Books, 1996.

7. ROITMAN, I. Tratado de Microbiologia. Vol. 1. 8. TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O F.; CANDEIAS J.A N.;
Microbiologia. 3a. ed. Atheneu, 2002.

9. RAVEL, Richard. LABORATRIO CLNICO: APLICAES CLNICAS DOS

DADOS LABORATORIAIS. 6 edio. Editora Guanabara Koogan, 1995.

10. SIDRIM, J.J.C & ROCHA, M.F.G. MICOLOGIA MDICA LUZ DE

AUTORES CONTEMPORNEOS. Editora Guanabara Koogan, 2004.