Dicrosmo Circular

Yraima Cordeiro
Departamentos de Frmacos Faculdade de Farmcia UFRJ

Yraima Cordeiro

DICROSMO CIRCULAR DE PROTENAS

Yraima Cordeiro Dicrosmo Circular a medida da absorbncia diferencial entre as duas rotaes de luz circularmente polarizada por uma molcula assimtrica.

Dicrosmo Circular de Protenas

Elliptical polarized light (purple) is composed of unequal contributions of right (blue) and left (red) circular polarized light. Eric Y. Hayden

CD gera luz elipticamente polarizada

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= eixo menor(b)/eixo maior (a)

ER e EL, magnitudes dos vetores eltricos da luz circularizada para a direita e para a esquerda, respectivamente; Quando ER = EL, 0 luz linearmente polarizada; luz circularmente polarizada. Quando ER ou EL = 0, 45

O efeito de CD geralmente pequeno, ento a tan pequena e pode ser aproximada de Dessa forma a elipcicidade diretamente proporcional ao CD. em radianos.

Luz linearmente x circularmente polarizada

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Circular

Linear

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Um pouco de espectroscopia aplicada a sistemas biolgicos

Determinao de Concentrao de Protenas

1) Bradford (1976) Comassie blue 2) Lowry (1951) Cu2+ Ensaios colorimtricos

3) Coeficiente de Extino Molar @ 6,0 M GdmHCl/H2O - Pace et al, 1995, Protein Science, 4, 2411

(280, gua, M-1 cm-1) = (#Trp)(5.500) + (#Tyr)(1.490) + (#Cistina)(125)

- Gill & von Hippel, 1989, Anal. Biochem., 1812, 319 - Edelhoch, 1967, Biochemistry 6, 1948.

A = .c.l

Expresso do CD
Diferena de absorbncia dos dois componentes (lcp e rcp).

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Ou medir a elipcicidade pode ser usada como medida pois a luz plano polarizada se torna elipticamente polarizada aps passar atravs de um meio opticamente ativo.

Relao entre elipcicidade molar e

L R = (AL AR)/(lC) []() = 100()/(lC)

l, centmetros C, moles.L-1
Elipcicidade molar por resduo

Dimenses: [] em deg.cm2dmol-1 (L- R) em M-1cm-1

Importante: especificar a notao utilizada!

Fasman, G.D., Circular Dichroism and the Confromational Analysis of Biomolecules (1996) Plenum Press, New York. Hecht, E., Optics 3rd Edition (1998) Addison Wesley Longman, Massachusetts.

Relao elipcicidade vs CD
= elipcicidade (rad) tan = (|El| |Er |)/ (|El|+|Er |)
= [exp(-Al/2) - exp(-Ar/2)]/[exp(-Al/2) + exp(-Ar/2)]

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Convertendo para deg, (deg) = 180 x ln 10 x A/4 = 32.98 A Elipcicidade diretamente proporcional ao CD

1 rad = 57.29578 deg

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Unidades Dicrosmo Circular

From to
(A) (mA) () (o) (mo) []

Absorbance
A mA/1000 *C*l/M
o/32.98

Milli absorbance
A*1000 mA *C*l*1000/M
o/0.03298

Molar Extinction
A*M/(C*l) A*M/(C*l*1000)
o*M/(C*l*32.98)

Degrees
A*32.98 mA*0.03298 *C*l*32.98/ M
o

Millidegrees
A*32980 mA*32.98 *C*l*32980/ M
o*1000

Molar ellipticity
A*M*3298/ (l*C) mA*M*3.298/ (l*C) *3298
o*M*100/(l*C)

mo/32980 []*C*l/ (3298*M)

mo/32.98 []*C*l/ (3.298*M)

mo*M/ (C*l*32980) []/3298

mo/1000 []*C*l/ (100*M)

mo []*C*L*10/ (M)

mo*M/(10*l*C) []

Instrumentao

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Relao entre luz linearmente x luz circularmente polarizada

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Vetor eltrico da luz linearmente polarizada soma de luz rcp e lcp de = magnitude.

Gerao de luz circularmente polarizada a partir de feixes lineares

Gerao de luz elipticamente polarizada a partir de feixes circulares

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Equipamentos atuais de CD: modulam a luz entre as 2 rotaes e medem a de absorbncia a cada . A = log (IO/IL) - log(IO/IR) = log(IR/IL)
www.protein.iastate.edu/images/cd_fig1.jpg

Instrumentao

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Jasco J-810 Fonte de luz: lampada de xennio 150w (180 a 800nm); Monocromador prismtico para disperso da luz em diferentes comprimentos de onda; Modulador fotoelstico gera luz circularmente polarizada; Permite quantificao da luz rcp e lcp; Deteco tubo fotomultiplicador.

Equipamentos atuais

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Jasco, photophysics (Chirascan)... Nitrognio: remoo de oxignio dos compartimentos da lmpada, do monocromador e da amostra; Oznio: degradao da ptica, proteo do usurio; Absoro de UV pelo oxignio.
Acessrio Peltier (0 a 100oC); Banho trmico; Stopped flow cintica rpida.

Calibrao
cido d-10-canforsulfnico

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Concentrao da amostra
A intensidade do CD proporcional a concentrao da espcie ativa; a concentrao? a absoro reduo na quantidade de luz que chega nos detectores. Voltagem do PMT - do rudo.
Absorbncia tima para medidas de CD: Abs = 0,89 Para uma cubeta com 1mm de caminho ptico, esta absorbncia alcanada com concentrao protica de 0,1 a 0,3 mg/mL.

Relao sinal/rudo em funo da absoro da amostra

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Solvente tambm absorve! Abs mxima a 1.0 amostra + solvente + cubeta Abs amostra normalmente vlida 0,3

~0,9

Johnson, 1985

Cubetas
Caminho ptico:
1,00 cm quantidade de amostra (~ 3mL) 1,0 mm 200 a 300L 0,1 mm ~ 50L (outro suporte necessrio)

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A concentrao tima protica depende do caminho ptico da cubeta utilizada

A = .c.l

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Importncia da escolha do tampo

Solvent system Cut off (nm) for 1mm path length Solvent system Cut off (nm) for 1mm path length

Water Trifluoroethanol Hexafluoroisopropanol Acetonitrile Methanol Ethanol 2-Propanol Cyclohexane Dioxane

< 185 <185 <185 185 195 196 196 <185 232

(NH4)2SO4 0.15M NaCl 0.15M NaClO4 0.15M NaNO3 0.15M Phosphate 100mM Tris 100mM Pipes 100mM Mes 100mM GdnHCl 4M Urea 4M

191 196 <185 245 <185 195 215 205 210 210

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Determinao da estrutura secundria de protenas por CD

Estrutura secundria de protenas

ngulos de toro em protenas phi P2 -57 -120 -78 psi -47o +120o +150

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Transio
Alfa-hlice: * (~191 193 nm), perpendicular ao eixo da hlice, Forte. * (~208 - 210 nm), paralela ao eixo da hlice, fraca; n * (~ 222 nm), paralela ao eixo da hlice;

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pharm1.pharmazie.uni-greifswald.de/bednarski_...

Transio folha: * (~190 - 200 nm); n * (~ 210 - 225 nm).

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http://www.chembio.uoguelph.ca/educmat/phy456/gif/sheet1.gif

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E protenas em random coil?

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Poly(Pro)II

CD de peptdeos desordenados Johnson, 1985.

Protenas desordenadas

Poliprolina (PII)

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Efeito do solvente sobre estrutura secundria de protenas e peptdeos

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Estabilidade trmica de ptns avaliada por CD

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Reversibilidade?

CD monitorar transies induzidas por temperatura e agentes desnaturantes. Presso no possvel.

1.2

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1,0

B
1.0

Fraction aggregated (f)

f (fraction denatured)

0,8

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 2 4 6 8

0,6

0,4

0,2

rPrP23-231 rPrP51-90 rPrP32-121

0,0

Guanidine hydrochloride [M]

20

30

40

50

60

70

80

Temperature (oC)

Efeito de agentes qumicos e do incremento de temperatura nas construes da rPrP rPrP23-231 rPrPD51-90 rPrPD32-121

Enovelamento protico Intermedirios do enovelamento

Yraima Cordeiro

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Deteco de intermedirios de enovelamento

230 nm

pH 7.5

pH 2

pH 5

216 nm

Far-UV CD spectra of SMA (amyloidogenic light chain variable domain) as a function of pH. Panel A: spectra at pH 7.5 (dots), pH 5 (square), and pH 2 (triangle). The solid line in panel B is a fit to eq 2 and gives apparent pKas of 6.3 and 3.7. The solid line in panel C is a fit to eq 1 and gives an apparent pKa of 3.5. Khurana et al., Biochem 2001

Monitorar interao protena-ligante Muda Estabilidade? Muda Estrutura?

Thermodynamics of Binding of a Low-Molecular-Weight CD4 Mimetic to HIV-1 gp120
20

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C Raw Ellipticity (mdeg)

10

Interao ptn:DNA

-10

-20

200 210 220 230 240 250 260

CD spectra of gp120 alone and in the presence of NBD556. The concentrations of NBD-556 were 0, 5, 10, 20, and 300 M for curves 1-5, respectively, as indicated in the figure. Concentration of gp120: 3.7 M.

190

Wavelength (nm)

Cordeiro et al., J. Biol. Chem. 2001

Schn et al., Biochem. 2006

Interao protena - ligante

15

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Elipticidade Bruta (mgrau)

10 5 0 -5

-10 200 220 240 260 280 300 320

Comprimento de Onda (nm)

PrP23-231 N2aRNA [PrP23-231 + N2aRNA] [PrP23-231] + [N2aRNA]

Gomes et al, J. Biol. Chem. 2008.

Near UV: 250 330 nm

Informao sobre aminocidos aromticos, pontes de enxofre, interao com ligantes. Intensidade das bandas de CD ~1 ordem de magnitude < far-UV; Avaliao de intermedirios da via de enovelamento; Maior quantidade de protena necessria.

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Near-UV anlise de estrutura terciria

Yraima Cordeiro Resduos aromticos

pH 2.0

296 nm

268 nm

287 nm

Near-UV CD spectra for SMA. Panel A shows plots of molar ellipticity for pH 7.5, pH 5, and pH 2. Panel B shows the pH dependence of the molar ellipticity. The lines through the data are fits to eq 1 for peaks at 296 and 287 nm, yielding apparent pKas of 3.2 and 3.4, respectively, which correspond to formation of IU. The data at 268 nm are fitted to eq 2, resulting in two apparent pKa values of pH 4.9 and 3.7. Protein concentration was 0.7 mg/mL.

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Estimar contedo de estrutura secundria de ptns a partir do espectro de CD:

Processo emprico no h soluo nica para a deconvoluo de um espectro de CD Levar em considerao seguintes fatores: A estrutura 3D obtida por difrao de raios-X de protenas de referncia mantida em soluo aquosa; As contribuies dos elementos individuais de estrutura secundria para o espectro total de CD so aditivas e o efeito da estrutura terciria no espectro (Far-UV) desprezvel; Somente cromforos peptdicos so responsveis pelo espectro de Far-UV e contribuies de outros peptdeos podem ser descartadas; Cada elemento estrutural (como -hlice ou folha-) pode ser descrito como um espectro de CD nico e o efeito de variabilidade geomtrica de elementos de estrutura secundria desprezvel.

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Princpios gerais dos mtodos disponveis

S() = espectro de CD de uma ptn. Analisado como combinao linear de k espectros base, Bk():
Onde N, nmero de estruturas secundrias e fk a frao da estrutura secundria de k

Os espectros base Bk() so calculados a partir de espectros de CD de um grupo de protenas de referncia com estrutura 3D conhecida.

Simplificando
A = A1 + A2 + ... An An = kn.l.Cn

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A = (k1.C1 + k2.C2 + ... kn.Cn)l

f, frao de estrutura secundria

A = [(k.f) + (k.f)]Cptn.l

r, coeficiente de correlao , rms deviation

xi e yi, fraes de estrutura secundria derivadas de anlise de raios-x e calculadas a partir do espectro de CD. n, nmero de protenas de referncia utilizado.

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Clculo do contedo de estrutura secundria e comparao entre diferentes mtodos

Depender: Escolha do espectro de CD de protenas de referncia, ex. a natureza e nmero de protenas escolhidas e a faixa de comprimento de onda do espectro de CD; Assinalamento da estrutura secundria de protenas de referncia a partir de estudos de difrao de raios-X; Procedimento matemtico espectro de CD. para deconvoluo do

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Estimativas

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Boas para -hlices; Correlao entre estimativas de CD e x-ray para folhas- e -turns depende de: Escolha dos polipeptdeos ou ptns de referncia; Nmero de protenas selecionadas; Assinalamento da estrutura secundria a partir dos dados de difrao. Intensidades menores de folhas- do que -hlices em espectros de CD. Predomnio do sinal em -hlice.

Atualmente
Melhor banco de dados; Estruturas resolvidas por ressonncia magntica nuclear;

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Estrutura cristalina estrutura em soluo.

CD na engenharia de protenas e peptdeos

Desenho de variantes enzimticos; Estudo de relao estrutura atividade; Mutaes stio dirigidas: efeitos na estrutura, estabilidade e atividade enzimtica; Base para desenho de enzimas modificadas com caractersticas especficas para desempenhar funes existentes ou para novas aplicaes.
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Vantagens da tcnica
tima para estudo de estrutura secundria de biopolmeros em soluo; Tcnica validada; Tcnica no destrutiva; Pequena quantidade de material necessria para efetuar as medidas; Aplicada a molculas em soluo; Medidas rpidas.
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