UNIVERSIDAD CATLICA DE TEMUCO FACULTAD DE RECURSOS NATURALES ESCUELA DE ACUICULTURA

EFECTO DEL ALMACENAMIENTO DE OOCITOS EN SU FERTILIDAD Y SIMETRA DE LOS PRIMEROS BLASTMEROS DE SALMN COHO (Oncorhynchus kisutch)

Trabajo de titulacin

presentado como

parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Ciencias de la Acuicultura.

CSAR FUENTES GAMBOA CLAUDIA GONZLEZ WEBER CARLOS ROLDN MILLAHUAL

TEMUCOCHILE 2011

AGRADECIMIENTOS En esta etapa final quisiera agradecer a Dios porque en su gran inmensidad que me permiti culminar esta hermosa etapa. Agradezco a mi familia por la confianza entregada, amor, compaa y ayuda en todo momento para cumplir uno de mis objetivos en la vida. Quiero dedicar este trabajo a Dios por estar conmigo cada da y a mi hija por ser lo ms preciado en mi vida. A todas las personas que me han apoyado y creyeron en m. De forma muy especial a mi madre y mi padre, a mi hermano Gabriel y a todos mis familiares y seres queridos que han estado conmigo. Agradezco a Dios por demostrarme con experiencias cun importante es la familia en la Csar Fuentes Gamboa. Agradezco a Dios por demostrarme con experiencias cun importante es la familia en la vida. A mis padres, que me entregaron las bases para llevar esta vida a gusto y feliz. A mi madre por su infinito amor, el pilar de mi vida, mi todo, la que con su esfuerzo y entrega me ense que frente al ms gran dilema se puede salir adelante. A ti pap que ves todo lo que hago desde un plano celestial, desde pequea me enseaste a entregar amor y disfrutar cada momento como si fuese el ltimo. A mis hermanos de la vida por tantos momentos compartidos que espero jams culminen. A mi abuela, tos, primos y amigos que le dan alegra a mis das. A todos ustedes un abrazo y gracias por apoyarme en el trmino de etapa. Claudia Gonzlez Weber. Este trabajo est dedicado a mis padres, a quienes le agradezco de todo corazn por su amor, apoyo, cari y comprensin. En todo momento los llevo conmigo. Agradezco a mis hermanas y a mi abuela por la compaa y el apoyo que me brindan. S que cuento con ellas siempre. Agradezco a Dios por llenar mi vida de dicha y bendiciones. Por haber encontrado el amor, y junto a ello un hermoso bebe que viene en camino. Agradezco a los amigos por su confianza y lealtad. Agradezco a mis profesores por su disposicin y ayuda brindadas. Carlos Roldn Millahual

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NDICE DE CONTENIDOS Introduccin...1 Materiales y mtodos...4 Resultados.6 Discusin.11 Bibliografa..15

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NDICE DE FIGURAS Figura N1. Criterio utilizado para caracterizacin morfomtrica de los primeros cuatro blastmeros de salmn coho (Oncorhynchus kisutch), donde L indica el largo y A el ancho.5 Figura N2. Blastodiscos de salmn coho (Oncorhynchus kisutch), obtenidos de ovas almacenadas por 4h a 40,2C. No fecundado (A), simtrico con un clivaje (B), simtricos con dos clivajes (C), simtrico con tres clivajes (D) (barra horizontal 300 m, aumento de 56X)...6 Figura N3. Porcentaje de fecundacin y porcentaje de embriones

morfolgicamente simtricos (promedio desviacin estndar) de salmn coho (Oncorhynchus kitsuch), obtenidos de ovas almacenadas desde 4 a 96 horas, con 20 horas de incubacin a 40,2C ...6 Figura N 4. Blastodiscos no fecundados de salmn coho (Oncorhynchus kisutch), obtenidos de ovas almacenadas a 40,2C. Por 48 h (A), 72 h (B) y 96 (C) horas (barra horizontal 300 m, aumento de

56X)...7 Figura N5. Anormalidades en blastodiscos embrionarios de salmn coho (Oncorhynchus kisutch). Nmero impar de blastmeros (A), blastmeros no definidos (B), clulas aplanadas (C), distribucin espacial desorganizada (D), embriones asimtricos (E, F, G) (Barra horizontal 300 m, aumento de 56X)...7 Figura N6. Dispercin de las proporciones entre largos (a), anchos (b) y

entre anchos y largos (c) de los primeros blastmeros de salmn coho (Oncorhynchus kisutch). Donde valores menores a 0,9 y mayores a 1,1 son significativamente distintos de 1 (p<0,05) la lnea roja indica el lmite de simetra entre las proporciones.....10

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NDICE DE TABLAS Tabla N1. Largo y ancho de los primeros cuatro blastmeros de salmn coho (Oncorhynchus kisutch) (promedio desviacin estndar).....8 Tabla 2. Proporcin entre largos, anchos y anchos y largos de los cuatro primeros blastmeros en salmn coho (Oncorhynchus kisutch) (n=12

blastodiscos por hora de almacenamiento)9 Tabla 3. Tiempo de almacenamiento (horas) y porcentaje de fertilidad para distintas temperaturas y en diferentes especies de

salmnidos.12

RESUMEN En la presente investigacin se almacenaron In vitro oocitos de salmn coho (Oncorhynchus kisutch) por 4, 24, 48, 72 y 96 horas a 40,2C en lquido celmico. Para luego ser fecundados con mtodos estndares para salmonicultura. Se incub embriones a 40,2C por 20 horas y posteriormente se fij en solucin de Stockard (Costello et al., 1957). Luego de descorionizar los embriones, se extrajo los discos embrionarios y se tom microfotografas para caracterizarlos morfolgicamente en simtrico y asimtrico segn criterios de simetra, tamao y mrgenes de la clula. Posteriormente se caracteriz morfomtricamente los blastodiscos, determinando el largo y ancho de cada blastmero, luego se determinaron las proporciones entre ancho, largo y ancho y largo (A/A, L/L y A/L) con el programa Q Capture Pro 5.0. Para los oocitos almacenados por 4 horas se registr un 56,54,3% de discos fecundados y 8,78,8% de embriones simtricos. En ovas almacenadas por 24 h se evidenci 68,119,6% de fecundacin y 13,05,7% de embriones simtricos. Los blastodiscos registraron un dimetro promedio de

820,8341,7 m. En embriones de 4 clulas midieron en promedio 399,434,2 m de largo y 421,447,3 m de ancho. Las ovas almacenadas por 48, 72 y 96 horas, presentaron 0% de fertilidad. La caracterizacin morfomtrica entre A/A, L/L y A/L de los cuatro primeros blastmeros mostr que las proporciones entre las medidas de anchos y largos (A/L) (0,950,11 y 0,970,11 para ovas almacenadas por 4 y 24 horas respectivamente), no presentaron diferencias significativas frente al valor control 1 (p<0,05). Las proporciones entre los valores de anchos (A/A) y largos (L/L) mostraron diferencias significativas frente al valor control (p<0,05). Palabras claves: desarrollo embrionario, clivaje, blastodisco, blastmero, envejecimiento y simetra embrionaria.

VI

ABSTRACT In the present study In vitro" oocytes of coho salmon (Oncorhynchus kisutch were stored during 4, 24, 48, 72 and 96 hours at 40,2C in coelomic liquid. The oocytes were fertilized with the standard methods used for salmon. Embryos were incubated at 40,2C for 20 hours and then fixed in "Stockard" solution (Costello et al., 1957). After retiring the chorion from embryos, embryonic discs were removed and photomicrographs were taken to characterize the symmetric and asymmetric morphology according to symmetry criteria, size and margins of the cell. Subsequently, the blastodisc was characterized morphometrically by determining the length and width of each blastomere, then the proportions of width, length and relation width/ length (W/W, L/L and W/L) were established with the program "Q Capture Pro 5.0 ". Eggs stored during 4 hours showed the following results: 56,54,3% fertilized and 8,78,8% symmetrical embryos. In eggs stored during 24 h showed 68,119,6 fertilization and 13,05,7% of symmetrical embryo. The blastodisc recorded an average diameter of 820.83 41.69 m. 4-cell embryos presented an average length of 399,434,2 m and 421,447,3 m wide. The eggs stored for 48, 72 and 96 hours, showed 0% fertility. Morphometric characterization between W/W, L/L and W/L of the first four blastomeres showed that the proportions between the width and length measurements (W/L) (0,950,11 and 0.970,11 for eggs stored for 4 and 24 hours respectively), did not show significant differences compared to the value of 1 used as control 1 (p<0,05). The ratios between the values of width (W/W) and length (L/L) showed significant differences compared to the control value (p<0,05). Keywords: embryonic development, cleavage, blastodisc, blastomere, aging and embryonic symmetry.

VII

INTRODUCCIN En Chile se destaca el importante cambio regulatorio que rige la operacin de la industria acucola y que afecta fuertemente el nivel de riesgo sanitario en que se desempea. Es por esto que para prevenir futuras crisis de riesgo sanitarioambiental el Estado instaur una serie de normas por medio del Reglamento de medidas de proteccin, control y erradicacin de enfermedades de alto riesgo para las especies hidrobiolgicas. Entre los efectos en el rea de reproduccin de especies hidrobiolgicas, las normas retrasan la fecundacin de ovas por al menos 24 horas que es el tiempo que tardan los exmenes ictiopatolgicos para diagnosticar ISAv, IPNv y BKD. Este tiempo en que las ovas deben ser almacenadas in Vitro en fluido celmico, producen envejecimiento clular reflejado en una rpida disminucin de la fertilidad de los gametos o una deficiencia en la calidad de la progenie (Withler & Morley, 1968; Billard & Gillet, 1981; Tarn et al., 2000; Bonnet et al., 2003; Kjrsvik et al., 2003; Sohrabnezhad et al., 2006; Niksirat et al., 2007; Komrakova & Hotz, 2009). Sin embargo, ovas de trucha arcoiris se pueden mantener a 12C en medio artificial por 48 horas, sin prdida significativa de fertilidad (Goetz & Coffman, 2000; Bonnet et al., 2003). Los blastmeros son clulas originadas de rpidas y numerosas divisiones celulares del cigoto. En contraste con la mayora de los ciclos celulares, no hay aumento citoplasmtico en las primeras segmentaciones. En consecuencia, los blastmeros disminuyen su tamao a medida que se duplican. En los huevos telolecticos de peces, el volumen del vitelo es alto y restringe al citoplasma a una pequea rea en el polo animal. Debido a su desplazamiento perifrico, los primeros blastmeros son fcilmente visibles en los huevos de corion transparente como en halibut del Atlntico (Hippoglossus hippoglossus) (Shields et al., 1997), bacalao del Atlntico (Gadus morua) (Avery et al., 2009), merluza austral (Merluccius Australis) (Bustos & Landaeta, 2005), corocoro rayao

(Haemulon bonariense) (Cuartas et al., 2003), dorada (Seriola lalandi) (Moran et al., 2007), (Zebrasomma scopas) (Pavlov & Emel, 2008), bagre del Atlntico 1

(Anarhichas lupus L.) (Pavlov, 1992; Pavlov & Monkness, 1994) y turbot (Scophthalmus maximus L.) (Kjrsvik et al., 2003). En halibut del Atlntico (Hippoglossus hippoglossus) (Shields et al., 1997), bacalao del Atlntico (Gadus morua) (Avery et al., 2009), merluza austral (Merluccius Australis) (Bustos & Landaeta, 2005), corocoro rayao (Haemulon bonariense) (Cuartas et al., 2003), dorada (Seriola lalandi) (Moran et al., 2007), (Zebrasomma scopas) (Pavlov & Emel, 2008), trucha (Salmo trutta) (Killen et al., 1999) y trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) (Ballard, 1973) lo normal es que los primeros blastmeros sean de tamao y forma regular (simtricos). Sin embargo, los huevos de bagre del Atlntico (Anarhichas lupus L.), tienen blastmeros

desiguales durante las primeras divisiones (Pavlov, 1992). Han sido registrados blastmeros desiguales en peces, en su mayora a causa de contaminantes (Bobe & Labb, 2010). Estudios toxicolgicos han demostrado que los huevos con blastmeros desiguales, incluyendo embriones en etapa de blstula, no completan la embriognesis (Von Westernhagen, 1988). Lo que se debe a una mala disposicin de los centrmeros o un retraso en su posicionamiento en la clula, generando asimetra en el clivaje (Rappaport, 1961). Tambin se

encontraron diferencias

significativas en mortalidades de embriones con

clivajes anormales (blastmeros desiguales) en comparacin a las obtenidas de embriones normales (blastmeros iguales) (Westernhagen, 1988),

sealando que la industria acucola obtendra una buena herramienta de evaluacin de calidad de gametos en fases tempranas de desarrollo con la que podra disminuir los costos de produccin e instalaciones (Avery et al., 2009). Peces telesteos que poseen un corion transparente facilita la investigacin y seguimiento de las diferentes etapas del desarrollo embrionario sin tener que sacrificar el embrin (Kunz, 2004). Sin embargo, en salmnidos el corion del huevo es opaco y se debe sacrificar al embrin para realizar la evaluacin. Por esto, los estudios sobre el desarrollo embrionario en salmnidos son escasos (Snchez, 2010), destacando los trabajos de Shields et al., 1997; Kjrsvik et al., 2003; Pavlov & Emel, 2008; Snchez, 2010; entre otros. 2

La presente investigacin pretende evaluar el efecto del almacenamiento en frio en la calidad de ovocitos de salmn coho (Oncorhynchus kisutch) almacenados in Vitro por 4, 24, 48, 72 y 96 horas en fluido celmico a 4,00,2C. adems, de determinar fertilidad y realizar una caracterizacin morfomtrica de los

cuatro primeros blastmeros, lo cual servir como herramienta de evaluacin de calidad de gametos y embriones en especies salmondeas.

MATERIALES Y MTODOS En el experimento se utiliz oocitos de una hembra madura de dos aos de edad de salmn Coho (Oncorhynchus kisutch), cultivada en la piscicultura Beln del sur, ubicada en el km 22 camino Conguillo, sector la playa, comuna de Curacautn (382658 Latitud Sur, 714833 Latitud Oeste), Regin de la Araucana, Chile. Las ovas antes de ser fecundadas fueron separadas en cinco grupos con distintos tiempos de almacenamiento a 4, 24, 48, 72 y 96 horas. Estas se almacenaron in Vitro en lquido celmico a 4,00,2C sin luz en una cmara incubadora ZHICHENG modelo ZSD-A1160. Cada grupo lo formaban tres rplicas con veintitrs oocitos cada uno, (n=69, cada grupo). Cada rplica se fecund con 100 L de semen de mxima motilidad (nivel 5), segn la escala de Snchez-Rodrguez & Billard (1967). Luego de ser fecundadas se desarrollaron por 20 horas en la misma incubadora antes mencionada, a una temperatura de 40,2C. Posteriormente, fueron fijadas en solucin de Stockard (Costello et al., 1957) por una semana. Luego fueron mantenidos en PBS (Buffer salino) por veinticuatro horas y se les extrajo el blastodisco cortando el corion con micropinzas para luego fotografiar bajo una lupa estereoscpica marca Olympus SZX7 y cmara fotogrfica marca Q Imaging MicroPublisher 3.3. Para determinar la simetra morfolgica se fij los siguientes criterios: 1) Simetra: simetra bilateral respecto a los ejes de los cuatro blastmeros. 2) Tamao de las clulas: tamao uniforme entre los 4 blastmeros. 3) Mrgenes: diferenciacin clara de los mrgenes entre clulas y con el vitelo. Para el anlisis morfomtrico se tomaron slo blastodiscos con cuatro blastmeros, obteniendo un total de doce blastodiscos por cada hora de almacenamiento. Estos blastodiscos se midieron con el programa Q Capture Pro 5.0 en ancho (A) y largo (L) de cada blastmero, donde el ancho siempre fue medido en sentido horizontal y largo en sentido vertical, sin importar que la 4

medida del ancho fuese mayor a la del largo (figura N1). Para el anlisis de simetra se hizo una relacin de A/A, L/L y A/L entre todos lo blastmeros de cada blastodisco. Se utiliz como control el valor 1, siendo este el resultado esperado para proporciones entre blastmeros simtricos. Los resultados de la proporcin fueron analizados con el programa estadstico GraphPad Prisma versin 5.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Se utiliz una ANOVA de una va para muestras no paramtricas. Adems, se realiz en paralelo el test de comparaciones mltiples Dunnett's para evaluar las diferencias estadsticamente significativas entre proporciones de largos, anchos y anchos y largos de los blastodiscos con el grupo control. El nivel de significancia se fij en p< 0,05 (n=69).

Figura N 1. Criterio utilizado para caracterizacin morfomtrica de los primeros cuatro blastmeros de salmn coho (Oncorhynchus kisutch), donde L indica el largo y A el ancho.

RESULTADOS Los blastodiscos de salmn coho (Oncorhynchus kisutch), incubados a

4,00,2C por 20 horas tuvieron un dimetro promedio de 820,83 41,69 m (figura N2. A). Se observ blastodiscos con 2, 4, y 8 blastmeros (figura N2. B, C y D respectivamente). Se registr un 56,54,3% de discos fecundados y 8,78,8% de embriones simtricos para las ovas almacenadas por 4 horas. En ovas almacenadas por 24 h se evidenci 68,119,6% de fecundacin y 13,05,7% de embriones simtricos (figura N3). Las ovas almacenadas por 48, 72 y 96 horas presentaron 0% de fertilidad (figura N3), mostrando blastodiscos difusos y planos (figura N4. A, B, C). Adems, se observaron embriones con nmero impar de blastmeros (figura N5. A), blastmeros no definidos (figura N5. B), clulas aplanadas (figura N5. C), distribucin espacial desorganizada (figura N5. D), embriones asimtricos (figura N5. E, F, G).

Figura N 2. Blastodiscos de salmn coho (Oncorhynchus kisutch), obtenidos de ovas almacenadas por 4h a 4,00,2C. No fecundado (A), simtrico con un clivaje (B), simtricos con dos clivajes (C), simtrico con tres clivajes (D) (barra horizontal 300 m, aumento de 56X). El porcentaje de ovas almacenadas por 4 y 24 horas que presentaron embriones con 4 blastmeros fueron 18,8% y 20,3%, respectivamente. Estos blastmeros midieron en promedio 399,4 34,2 m de largo y 421,4 47,3 m de ancho (Tabla 1).

Figura N 3. Porcentaje de fecundacin y porcentaje de embriones morfolgicamente simtricos (promedio Desviacin estndar) de salmn coho (Oncorhynchus kitsuch), obtenidos de ovas almacenadas desde 4 a 96 horas, con 20 horas de incubacin a 4,00,2C.
ab

Letras iguales indican que no hay

diferencias estadsticamente significativas. (p>0,005; n=69).

Figura N 4. Blastodiscos no fecundados de salmn coho (Oncorhynchus kisutch), obtenidos de ovas almacenadas a 4,00,2C. Por 48 h (A), 72 h (B) y 96 (C) horas (barra horizontal 300 m, aumento de 56X). La proporcin entre las medidas de los largos de los cuatro blastmeros para ovas almacenadas por 4 horas fue 0,89 0,06 con un mnimo de 0,775 y mximo de 0,965. Para ovas almacenadas por 24 horas la proporcin entre las

Figura N 5. Anormalidades en blastodiscos embrionarios de salmn coho (Oncorhynchus kisutch). Nmero impar de blastmeros (A), blastmeros no definidos (B), clulas aplanadas (C), distribucin espacial desorganizada (D), embriones asimtricos (E, F, G) (Barra horizontal 300 m, aumento de 56X). Tabla N 1. Largo y ancho de los primeros cuatro blastmeros de salmn coho (Oncorhynchus kisutch) (promedio desviacin estndar). Horas de almacenamiento (n rplicas) 4 (3) 24 (3) Blastmero 1 Largo (m)
400,0 44,2 403,5 66,9

Blastmero 2 Largo (m)

386,6 59,3 412,4 50,3

Ancho (m)
444,5 116,6 436,4 93,4

Ancho (m)
394,9 100 394,4 52,0

Horas de almacenamiento (n rplicas) 4 (3) 24 (3)

Blastmero 3 Largo (m) 406,2 57,3 382,9 50,6 Ancho (m) 418,0 75,7 417,1 62,1

Blastmero 4 Largo (m) Ancho (m)

391,0 66,3 405,3 58,1 402,1 45,4 429,3 68,2 8

medidas de los largos de los cuatro blastmeros fue 0,88 0,07 con un mnimo de 0,751 y mximo de 0,955. La proporcin entre los valores de los anchos de los cuatro blastmeros para ovas almacenadas por 4 horas fue de 0,84 0,09 con un mnimo de 0,708 y mximo de 0,960. Para ovas almacenadas por 24 horas, la proporcin entre las medidas de los anchos de los cuatro blastmeros fue 0,85 0,08 con un mnimo de 0,730 y mximo de 0,958. La proporcin entre los valores de los anchos y los largos de los cuatro blastmeros para ovas almacenadas por 4 horas fue de 0,95 0,11 encontrndose un valor mnimo de 0,742 y mximo de 1,156. Para ovas almacenadas por 24 horas la proporcin entre las medidas de los anchos y los largos fue 0,97 0,11 con un mnimo de 0,771 y mximo de 1,220, (Figura N6) (Tabla N2). Se registr menor variabilidad entre las proporciones A/L de ovas almacenadas por 4 y 24 horas. Tabla N 2. Proporcin entre largos, anchos y anchos y largos de los cuatro primeros blastmeros en salmn coho (Oncorhynchus kisutch) (n=12 blastodiscos por hora de almacenamiento). Horas de almacenamiento (n rplicas) 4 (3) 24 (3) Proporcin L/L 0,890 0,06 0,880 0,07 A/A 0,837 0,09 0,845 0,08 A/L 0,947 0,11 0,966 0,11

Los valores de las proporciones entre largos mostraron un 50 porciento de embriones significativamente distintos de 1 (p<0,05), para ovas almacenadas por 4 y 24 h (Figura N6. A). Un 75 y 61 % de embriones mostraron diferencias estadsticamente significativas frente al valor control (p<0,05), para las proporciones entre los valores de los anchos de ovas almacenadas por 4 y 24 horas, respectivamente (Figura N6. B). Mientras que los valores de las proporciones entre anchos y largos mostraron un 1% de embriones significativamente distintos de 1 (p<0,05), para ovas almacenadas por 4 y 24 h (figura N6. C). 9

Figura N 6. Dispercin de las proporciones entre largos (a), anchos (b) y entre anchos y largos (c) de los primeros blastmeros de salmn coho (Oncorhynchus kisutch). Donde valores menores a 0,9 y mayores a 1,1 son significativamente distintos de 1 (p<0,05; n = 69 ), la lnea roja indica el lmite de simetra entre las proporciones.

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DISCUSIN El dimetro medio de los blastodiscos de Oncorhynchus kisutch fue de 820,83 41,69 m, similar a lo encontrado por Ballard, (1973) con aproximadamente 1000 m. en Onchorynchus mykiss y 880 m en Salvelinus fontinalis y en Salmo salar 950 m. Gorolidov, (1983). La figura N3 muestra que las ovas almacenadas por 24 horas presentan una mayor tasa de fertiidad en comparacin con las ovas almacenas por 4 horas. Tambin, se evidencia el gran deterioro que sufrieron ovas almacenadas por ms tiempo (48, 72 y 96 horas) mostrando 0% de oocitos fecundados, muy distinto a lo descrito por otros autores, donde fue posible mantener ovas viables por prolongados tiempos de almacenamiento in Vitro (Tabla N3). Jensen & Alderdice, (1984), demostraron que ovas de Oncorhynchus keta, aumentan el periodo que pueden ser almacenadas in Vitro con temperaturas relativamente bajas (Tabla N3), donde en condiciones de almacenamiento similares a las de esta investigacin, a 3 C consiguieron mantener ovas 233 horas con un 50% de fertilidad, superior a lo observado en este estudio. El corto tiempo que se pudo almacenar oocitos de Oncorhynchus kisutch con alta fertilidad, tiene relacin con al envejecimiento de los gametos previo al desove, ya que antes de desovar la hembra no se tuvo certeza del momento justo de la ovulacin. Sin embargo, esta se puede aproximar usando la grafica de Gordon et al., 1987, donde seala que oocitos de Oncorhynchus mykiss obtienen mejor porcentaje de fertilidad 4 das post ovulacin (>80 en el da 1 y 100% cercano al da 4), de este modo se puede determinar que la hembra utilizada estaba ovulada algunos das antes de ser desovada, considerando que nuestros porcentajes de fertilidad fueron relativamente bajos. Adems, se debe mencionar que oocitos almacenados por largos periodos fuera de la cavidad celmica de la hembra, generalmente muestran signos parecidos a la de oocitos sobre maduros como: mayor turgencia, aparicin de pigmentos, mayor dimetro, etc. (Kjorsvik et al., 1990; Niksirat et al., 2006), y por consiguiente la viabilidad de la ova es ms baja en cuanto aparecen estos signos (Kjorsvik et al., 1990). Los bajos 11

porcentajes y posterior cada de fertilidad sobre 48 horas de almacenamiento son debido a que la hembra llevaba ms de 4 das ovulada, por lo que haban muchos oocitos sobremaduros, que no fueron fecundados. Tabla N 3. Tiempo de almacenamiento (horas) y porcentaje de fertilidad en distintas temperaturas y en diferentes especies de salmnidos. Especie Ocorhynchus kisutch Oncorhynchus keta Oncorhynchus keta Oncorhynchus keta Oncorhynchus keta Oncorhynchus keta Oncorhynchus mykiss Oncorhynchus mykiss Salmo trutta Salmo trutta caspius Temperatura Almacenamiento Fertilidad (C) (horas) (%) 4 3 6 9 12 15 12 - 13 2-3 4 2-3 48 233,2 152,6 99,9 65,4 42,8 48 216 72 48 68,10% 50% 50% 50% 50% 50% 60% 77,50% 61 - 90 % 91% Autor Fuentes et al., 2011 Jensen & Alderdice., 1984 Jensen & Alderdice., 1984 Jensen & Alderdice., 1984 Jensen & Alderdice., 1984 Jensen & Alderdice., 1984 Goetz & Coffman, 2000 Niksirat et al., 2007 Billard et al., 1981 Niksirat et al., 2006

Al comparar la proporcin entre los largos y los anchos de los 4 primeros blastmeros para ovas almacenadas por 4 y 24 horas con el valor control 1 revela una evidente asimetra siendo, todos los valores significativamente distintos de 1 (< 0,9 y >1,1 son significativamente distintos de 1 (p<0,05) (Tabla 2). La proporcin entre el ancho y el largo de los 4 blastmeros para ovas almacenadas por 4 y 24 horas fue de 0,947 0,11 y respectivamente, donde se puede inferir la obtencin 0,966 0,11

de ocho blastmeros

simtricos en un tercer clivaje. Pavlov & Emel 2008 caracterizan la simetra del primer clivaje en Z. scopas, identificando algunos embriones asimtricos; 12

desincronizacin del clivaje, sincitio y otras aberraciones en el desarrollo atribuidas a la sobremadurez de huevos. Avery & Brown 2005 y Avery et al. 2009 mencionan una evaluacin de calidad de gametos basada en simetra de los blastmeros realizada solo hasta las 16 clulas, puesto que despus son demasiadas divisiones y es poco clara la evaluacin, mencionando patrones de anomala como; marginal, donut, triple y tarta, dndose algunos casos donde el patrn de asimetra es combinado. Proponiendo utilizar los patrones de segmentacin temprana blastmeros de 8-32 clulas como con una buena simetra de los

herramienta de control de calidad de

gametos correlacionndose con el xito de incubacin, tasa de eclosin, sobrevivencia de las larvas (Pavlov & Monkness 1994; Shields et al., 1997Kjrsvik et al., 2003; Avery & Brown 2005; Pavlov & Emel 2008; Avery et al., 2009). Generalmente las aberraciones, adoptan la forma de las interacciones espaciales irregulares (asimetra) o anomalas del clivaje: tamaos desiguales de las clulas, mrgenes de las clulas incompletas o incorrecto nmero de clulas, (Shields et al, 1997). Blastmeros anormales de peces han sido registrados en una serie de estudios, en su mayora sobre los efectos de los contaminantes en el desarrollo del vulo, en trminos generales conciernen a la sensibilidad de las ovas a las variables medioambientales (fsicos y qumicos) o estudios de "calidad de los ovas". Se establece que la calidad de gametos puede verse influenciada por la nutricin de los reproductores, ambiente, manejos y otros (Kjrsvik et al., 1990 & Kjrsvik et al., 2003). Las divisiones celulares anormales en la embriognesis temprana se cree que est relacionado con un deterioro del huevo (Kjrsvik et al, 1990, 2003; Shields et al, 1997). Tambin puede ser que el lquido celmico influye en la fertilidad de los huevos y esto vara segn los reproductores (Goetz & Coffman, 2000). Shield et al., 1997, sostienen que en la divisin celular la evaluacin de las primeras fases del desarrollo es el nico indicador fiable de la calidad de los huevos para el halibut. Sin embargo, esto no debera proporcionar una 13

evaluacin definitiva, por lo que debe ser acompaado por otros indicadores de viabilidad. Adems, la mayora de la mortalidad de huevos anormales ocurre durante el primer tercio de la embriognesis, lo que sugiere que algunos huevos pueden someterse a la correccin de la simetra celular durante divisiones posteriores (Von Westernhagen, 1988). Los resultados actuales muestran que para Oncorhynchus kisutch la simetra de los blastmeros es un indicador confiable de viabilidad como ya se sugiri antes, en especial cuando se

considera como el nico criterio. La evaluacin de simetra y su relacin con la calidad de huevos, son desarrolladas con xito en peces de aguas marinas, por esto, es necesario simetra de blastmeros 2010). Para una mejor evaluacin de la simetra de los primeros blastmeros y su relacin con la calidad de gametos, se recomienda llevar a cabo un estudio posterior donde se incluya un mayor nmero de hembras, se aumente la frecuencia de palpajes y as se podr conocer con mayor certeza el momento de la ovulacin. Adems prolongar los periodos de almacenamiento con evaluacin entre intervalos de menor tiempo (desde 12 horas, hasta 48 horas), correlacionar la simetra de los blastmeros con la sobrevivencia que se obtenga al cultivar los alevines obtenidos de gametos de las mismas hembras sometidos a las mismas condiciones de almacenamiento e incubacin. llevar a cabo investigaciones que correlacionen

con sobrevivencia embrionaria y larval (Snchez,

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