EXTENSIONES O FROTIS SANGUNEO

Una extensin o frotis sanguneo consiste en recubrir parcialmente un porta con una gota de sangre, de tal manera que las clulas de sta se dispongan formando una sola capa de ellas. Esto puede hacerse manual o automticamente. Lo ltimo se realiza mediante un aparato (spinner) que centrifuga rpidamente el porta con la sangre depositada en su centro. Con este aparato se obtienen unos frotis que presentan una distribucin celular muy homognea.

1. PARTES DE UNA EXTENSIN.

1.1. CABEZA.

Es la zona inicial de la extensin.

Es la regin ms gruesa.

En ella se encuentra una mayor proporcin de linfocitos, y los hemates forman aglomerados (pilas de monedas).

1.2. CUERPO.

Es la zona media del frotis.

Su espesor es el apropiado.

En ella existe una adecuada proporcin entre los distintos tipos de leucocitos.

Contiene la "zona ideal" de observacin, que corresponde a la porcin que limita con la cola.

1.3. COLA.

Es la zona final de la extensin.

Suele tener un aspecto redondeado.

Es la regin ms fina.

En ella se encuentra una mayor proporcin de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos), y adems. los hemates estn deformados y presentan una tonalidad uniforme.

En su porcin terminal suelen ser ms abundantes las plaquetas, sobre todo si son grandes.

1.4. BORDES.

Contienen una mayor proporcin de leucocitos grandes.

Si estn deshilachados, en ellos las clulas son difciles de reconocer por estar deformadas o destruidas 2.CARACTERSTICAS DE UNA BUENA EXTENSIN.

La cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta.

La cola debe estar cercana al otro extremo del porta, pero sin llegar a l.

El borde de la cola tiene que estar finamente deshilachado. Ese fino deshilachamiento recibe el nombre de "barbas".

Toda la extensin ha de ser fina y homognea.

Los bordes laterales de la extensin deben estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente.

Una extensin normal ha de tener una longitud de las partes del portaobjetos.

El uso de teidores automticos exige la realizacin de extensiones ms cortas que las consideradas normalmente como correctas (con una longitud de la mitad del portaobjetos).

3. DEFECTOS DE UNA EXTENSIN.

Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud y excesivo grosor. Esto se debe a un inadecuado tamao de la gota de sangre o/y a un error en la velocidad o/y a un fallo en el ngulo de extensin de la misma.

Presencia de escalones o estras. Esto est ocasionado por una falta de uniformidad en el deslizamiento de la gota.

Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre. Esto se produce por la presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta.

Extremo final excesivamente dentado.

4. UTILIDAD DE LAS EXTENSIONES.

El estudio de las extensiones sanguneas es esencial para el anlisis morfolgico de las clulas hemticas y para la realizacin del recuento diferencial linfocitario (RDL). Adems, es imprescindible

para la distincin de una autntica trombopenia de una pseudotrombopenia producida por agregados plaquetarios.

La investigacin de las extensiones tambin es til para la comprobacin de las alarmas que proporcionan los autoanalizadores hematolgicos

5. REALIZACIN DE UNA EXTENSIN SANGUNEA.

Las extensiones sanguneas se llevan a cabo deslizando un porta sobre otro en el que se ha depositado previamente una gota de sangre. Con esto se obtiene una fina capa de clulas sanguneas que puede ser adecuadamente observada con el microscopio.

Material necesario

Una lanceta de aplicacin manual o automtica (por ejemplo, la del sistema Glucolet de los laboratorios Ames).

Algodn.

Un capilar no heparinizado, si la muestra es sangre venosa anticoagulada, o heparinizado, si la muestra es sangre capilar.

2 portas limpios y libres de grasa. Uno de ellos puede ser normal y el otro ha de ser, preferentemente. esmirilado y biselado (el porta extensor). Para mantener limpios los portas, se deben seguir las siguientes indicaciones:

Lavar los portas con agua y jabn lquido. Aclararlos con abundante agua caliente. Sumergir los portas, durante una hora en una solucin de etanol- ter etlico o, simplemente etanol. Volver a aclarar los portas y dejar secar. Por ltimo recordar que siempre debemos tocar los portas por los bordes, de esta forma evitamos manchar las superficies de los mismos con suciedad o grasa procedente de los dedos.

Guantes desechables.

Un rotulador de vidrio.

Reactivos

Un desinfectante: alcohol etlico (etanol) de 70, o mejor an, solucin alcohlica de povidona yodada.

Solucin de etanol-eter etlico en una proporcin de 50:50.

Muestra

Sangre capilar no anticoagulada o sangre venosa adecuadamente anticoagulada. La forma correcta de extraer sangre capilar es la siguiente:

Elegir el tercer o cuarto dedo de una de las manos. Desinfectar el pulpejo del dedo selecciondo con un algodn embebido en un desinfectante apropiado. Dejar que el desinfectante se evapore.

Con una lanceta, pinchar firme y rpidamente una cara lateral de este pulpejo. Tras lo anterior con un algodn seco retiramos la primera gota emitida. Presionamos el extremo del dedo, a nivel del lado opuesto al de la puncin, hasta obtener la cantidad de sangre deseada. Por ltimo, tapamos el pulpejo con una tirita.

La sangre venosa tiene que haber sido extrada hace menos de 3 horas, ya que pasado este tiempo, se producen unos cambios apreciables en las clulas, que se manifiestan, al ser teidas stas, como alteraciones en su morfologa.

Una vez extrada, la sangre venosa ha de ser anticoagulada con EDTA. Para realizar frotis sanguneos no debe utilizarse sangre anticoagulada con heparina, ya que sta agrega las clulas y produce un fondo azul en las extensiones de sangre teidas con el colorante de Wright.

Hay que tener en cuenta que la sangre capilar contiene ms hemates y leucocitos y menos plaquetas que la sangre venosa.

Tcnica

Con los dedos ndice y pulgar de una mano, sujetar un extremo del porta normal (porta soporte), a nivel de sus bordes, y situarlo sobre una mesa. Tambin puede apoyarse, simplemente, el porta soporte sobre el extremo del dedo corazn de la mano que lo sujeta. De esta forma, el porta soporte forma un ngulo con la mesa.

Con un capilar cargado mediante capilaridad de sangre problema, depositar una pequea gota de sta (de unos 5 microlitros) en la cara superior de ese porta, a no menos de 2 cm del extremo opuesto al que agarra la mano.

Colocar un extremo del porta esmerilado (porta difusor o extensor) un poco por delante de la gota de sangre y formando un ngulo de 45 con el porta soporte. Es conveniente utilizar siempre el mismo porta extensor, para adaptarlo a esta funcin.

Desplazar suavemente hacia atrs el porta extensor, hasta que alcance la gota de sangre.

Dejar que la gota se extienda, por capilaridad, a lo largo del extremo del porta extensor que toca el porta soporte.

Antes de que la sangre alcance los bordes de ese extremo, deslizar el porta extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, y a una velocidad media. Este deslizamiento debe acabar, aproximadamente, a 1 cm del extremo final del porta soporte, con un movimiento de ascensin del porta extensor.

Secar rpidamente la extensin, agitndola al aire, para que sus clulas no se distorsionen.

Escribir el nombre del enfermo, en el porta que soporta la extensin.

Lectura de resultados

A la hora de leer los resultados, se han de tener en cuenta las caractersticas propias de una buena extensin y los defectos que puede tener una extensin incorrecta.

LDC- Hematologa U.D. 3

- 8 -TINCIONES HEMATOLGICAS La realizacin de extensiones y tinciones es prctica habitual en el laboratorio. Pese a no realizarse a todas las muestras, al no ser considerado procedimiento de rutina, es necesario en aquellos casos en los que se detecte mediante anlisis previos alguna alteracin. La correcta realizacin, as como una buena interpretacin de lo observado, permite en muchos casos el diagnstico de hematopatas. 1. INTRODUCCIN. Las tinciones hematolgicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin de las estructuras que componen las clulas sanguneas. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las clulas sean visual izadas microscpicamente con mayor facilidad. 2. TIPOS DE TINCIONES. Las tinciones hematolgicas pueden clasificarse segn distintos criterios:

Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que se pretende colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales. Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el diagnstico hematolgico, se dividen en tinciones tradicionales y especiales.

2.1. TINCIONES VITALES Y NO VITALES. Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas. Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol. 2.2. TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES. Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que con frecuencia derivan de la anilina (tinciones tradicionales o clsicas). Estos colorantes se renen en 4 grupos:

Colorantes cidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina. Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno. Colorantes neutros: son sales de un cido y de una base coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno. Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias que tienen un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante. Uno de ellos es el Sudn III empleado para teir las grasas.

Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas. Una coloracin es panptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrmica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematolgicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que l prepar. Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante cido (eosina) y de colorantes bsicos (tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilacin oxidatiya (colorantes tipo azur). Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que ms frecuentemente se emplean en el diagnstico hematolgico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinacin con la de May-Grnwald). Tambin hay tinciones panpticas rpidas que producen una coloracin fcil y rpida de las estructuras celulares. Las tinciones especiales slo se usan en circunstancias especficas. Son de dos clases:

Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las clulas y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiacin visible, de un color caracterstico. Los fluorocromos ms utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro. Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, ms o menos abundante, o la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos.

Sirven para reconocer clulas leucocitarias (normales o anmalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas clulas leucocitarias inmaduras a la lnea granuloctica o a la monoctica. 3. DENOMINACIN DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS. Atendiendo a sus apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de las siguientes formas:

Estructuras acidfllas u oxifilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza cida.

Si el colorante cido que captan es la eosina, se dice que son eosinfilas. Con las tinciones tradicionales adquieren un color rosado.

Estructuras basfllas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina.

Con las tinciones tradicionales adquieren un color azulado. Si se tien de lila o prpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurfllas.

4. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES REALIZADAS A FROTIS SANGUNEOS. Si la tincin de una extensin sangunea es demasiado rosa, probablemente esto se deba a:

Un pH bajo del colorante. Un tiempo de coloracin insuficiente. Un lavado excesivamente prolongado. Si la tincin es demasiado azul, posiblemente, esto est causado por: un grosor excesivo de la extensin, o un pH alto del colorante. Una coloracin excesivamente prolongada. Un lavado insuficiente.

Si tras la tincin aparecen artefactos o/y precipitados en la extensin, probablemente esto se deba a:

Un empleo de portaobjetos sucios. Una falta de filtracin del colorante. Una coloracin excesivamente prolongada. Un secado del colorante durante la tincin. Un lavado insuficiente.

Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teidores automticos de las extensiones sanguneas. Actualmente, no suelen emplearse en la prctica clnica. 5. TINCIN GIEMSA. Las tinciones hematolgicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de oxidacin (azur A, azur B y azur C) como colorantes bsicos, combinndolos con la eosina como colorante cido. De este modo, obtenemos una tincin diferencial, es decir, una tincin que es capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares segn se tian stas con el colorante cido, con el bsico o con la mezcla de ambos. Segn la proporcin de azul de metileno y de eosina que compongan el colorante tendremos distintos mtodos de tincin. Entre ellos, los ms conocidos son el mtodo de Giemsa, el de Wright, el de Leishman y el pan ptico de Pappenheim. Metdica Es un extracto de las tcnicas de tincin hematolgicas de la casa Panreac. Fundamento Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa. Material necesario

Microscopio ptico.

Portas bien limpios. Cristalizador. Puentes de tincin. Pipetas Pasteur con chupete. Frascos lavadores. Tubos de ensayo.

Reactivos

Muestra

Colorante en solucin segn Giemsa de Panreac. Solucin tampn pH 7,2 de Panreac. Metanol. Aceite de inmersin.

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. El anticoagulante de eleccin es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sdico y el oxalato potsico pueden dar preparaciones defectuosas. Tcnica

Preparamos un frotis sanguneo segn la tcnica descrita con anterioridad. Colocamos el frotis sobre el puente de tincin, en el cristalizador y en posicin horizontal. Cubrimos el frotis con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis. Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno segn Giemsa con 2 ml de solucin tampn pH 7,2. Es importante realizar esta dilucin en el momento de la tincin, ya que el colorante precipita y no es vlido para otro da. Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frotis con la dilucin de colorante, dejndolo actuar durante 25 minutos. Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampn pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posicin vertical.

Lectura de resultados Una vez seca la tincin, echamos una gota de aceite de inmersin y examinamos al microscopio ptico con el objetivo de 100 x. Los eritrocitos se tien de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta. Los neutrfilos presentan el ncleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulacin de un color violeta rojizo.

6. TINCIN DE WRIGHT. Metdica Extracto de las tcnicas de tincin hematolgica de la casa Panreac. Fundamento El colorante utilizado es una solucin de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10 al 25%) junto con otros derivados del alcohol metlico. Dada la presencia de metanol en la composicin del colorante, no es necesario un paso previo de fijacin antes de la coloracin. Slo si se van a guardar las extensiones sin teir de un da para otro precederemos a su fijacin para evitar el deterioro del frotis. Material necesario

Microscopio ptico. Cristalizador. Puentes de tincin. Pipetas Pasteur con chupete. Frasco lavador. Guantes. Tubos de ensayo.

Reactivos

Muestra

Solucin de eosina-azul de metileno segn Wright. Solucin tampn pH 7,2. Aceite de inmersin.

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes ms adecuados son la heparina y el EDTA. Tcnica

Realizar un frotis sanguneo muy fino. Dejar secar al aire. Sobre la extensin colocada horizontalmente en el puente de tincin verter 1 ml de eosina-azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solucin tampn pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posicin vertical. Inmediatamente antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solucin tampn pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con esta dilucin la

extensin. Teimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua del grifo. Volvemos a lavar con solucin tampn pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posicin vertical. Lectura de resultados Depositamos una gota de aceite de inmersin y observamos con el objetivo de 100 x. Las clulas se observan coloreadas de la misma manera que con la tincin de Giemsa. 7. TINCIN PANPTICO RPIDO. Metdica Extracto de la tcnica Panptico rpido de la casa QCA. Fundamento Este mtodo de tincin diferencial es un sistema que ana la policroma y la calidad que proporcionan los mtodos clsicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecucin (15 segundos solamente). Frente a las tcnicas de tincin descritas anteriormente, donde el colorante se extenda sobre el frotis, sta presenta la peculiaridad de ser un mtodo de inmersin, donde el frotis se sumerge en la solucin colorante durante un tiempo determinado. Material necesario

Cubetas de Wertheim o similares. Cestillo para portas. Frasco lavador.

Reactivos

Muestra

Solucin n 1: Solucin alcohlica de triarilmetano. Solucin n 2: Solucin tamponada de xanteno. Solucin n 3: Solucin tamponada de tiazina. Agua destilada.

Frotis sanguneo preparado recientemente y que se ha dejado secar al aire. Tcnica En tres cubetas de Wertheim o similares se disponen los colorantes solucin n 1, n 2 y n 3.

Colocamos los frotis en el cestillo para portas y lo sumergimos en la cubeta con la solucin n 1 durante 1 segundo. Repetimos la inmersin cuatro veces (en total 5 segundos). Dejamos escurrir. Sumergimos a continuacin otras cinco veces, cada una de un segundo de duracin, en la cubeta con la solucin n 2. Dejamos escurrir.

Finalmente, sumergimos otras cinco veces de un segundo cada una en la cubeta con la solucin n 3. Lavamos con agua destilada y dejamos secar.

Lectura de resultados Depositamos una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100 x. Las coloraciones obtenidas en las clulas sanguneas son similares a las de la tincin de Wright y Giemsa. Sin embargo, podemos variar la intensidad de la tincin modificando el nmero de inmersiones en los colorantes n 2 y n 3, segn se desee destacar las tonalidades rosas o las azules. Notas sobre el mtodo

Las cubetas con las soluciones colorantes, especialmente la del n 1, debern guardarse siempre bien tapadas, con el fin de evitar una evaporacin excesiva que podra inducir a desviaciones de color respecto a las tinciones habituales. Antes de agotar el contenido de una cubeta, debemos ir adicionando una nueva cantidad de solucin colorante para mantener, da a da, un nivel apropiado del mismo. De vez en cuando se debe renovar todo el contenido de la cubeta. En aquellos laboratorios con pequeo nmero de frmulas hemticas, las cubetas de Wertheim pueden ser sustituidas ventajosamente por pequeos frascos de cristal con tapn a rosca.

LDC- Hematologia U.D. 4 - 11 -

El uso de teidores automticos exige la realizacin de extensiones ms cortas que las consideradas normalmente como correctas (con una longitud de la mitad del portaobjetos).

3. DEFECTOS DE UNA EXTENSIN.

Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud y excesivo grosor. Esto se debe a un inadecuado tamao de la gota de sangre o/y a un error en la velocidad o/y a un fallo en el ngulo de extensin de la misma. Presencia de escalones o estras. Esto est ocasionado por una falta de uniformidad en el deslizamiento de la gota. Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre. Esto se produce por la presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta. Extremo final excesivamente dentado.