Tesis Maca - UNICA

UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA
" METODOS ANALITICOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE LA MATERIA PRIMA Y DE LOS DIVERSOS PRODUCTOS PROCESADOS DE LA MACA (Lepidium meyenii Walp.) "
TESIS
Presentado por:
Bach. Gutirrez Parvina, Jos Elas Bach. Montao Fuentes, Katyusca

Para optar el Ttulo de:
QUIMICO FARMACEUTICO
ICA PERU 2002
A nuestros padres, por el abnegado apoyo incondicional
Agradecimiento
Al Dr. Artemio Chang Canales, Director del Laboratorio de Productos Naturales de Facultad de Farmacia y Bioqumica de UNICA. Por el asesoramiento permanente en el desarrollo de la tesis. Al Mrs. Julio Cesar Bracho Prez, Jefe de la Seccin de Implementacin y Desarrollo de Tcnicas Analticas de Plantas Medicinales ( ADATE UE) de Laboratorios Hersil S.A. Por el asesoramiento permanente de la ejecucin de la tesis en dicha Institucin. A las Doctoras Roxana Bustos, Ana Balta y Rosa Alanoca, Qumico Analistas de Laboratorios Hersil. Por el Apoyo en el asesoramiento y Manejo del HPLC. A los Doctores Miguel Grande y Julio Moreno, del Centro Nacional de Control de Calidad INS- Chorrillos. Por el asesoramiento de la aplicacin de los parmetros analticos.
A Laboratorios Farmacuticos Industriales Hersil S.A. Al Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Farmacia y Bioqumica UNICA.
A la Pontificia Universidad Catlica del Per, Universidad Mayor de San Marcos, Universidad Agraria la Molina, Universidad Cayetano Heredia y el Centro Internacional de Papa.
INDICE
I.
INTRODUCCIN
II. GENERALIDADES 1. Lepidium meyenii Walp. "Maca 2. Estudios sobre los Glucosinolatos e Isotiocianatos 3. Estudios sobre los Fitosteroles III. MATERIALES Y MTODOS 1. Obtencin de las Muestras 2. Preparacin de los Extractos 3. Identificacin de Constituyentes 4. Aislamiento de los Esteroles y Otros Componentes del Extracto Diclorometnico Obtenido por Ultrasonido. 5. Cuantificacin del -Sitosterol por Cromatografa Liquida de Alta Resolucin (HPLC) en Harina y Comprimidos de Maca. IV RESULTADOS Y DISCUSIONES 6. Resultado s delas Extracciones en Gradiente Obtenidos por Reflujo, Soxlet y Ultrasonido 7. Resultados de los Mtodos de Identificacin de Esteroles, Glucosinolatos e Isotiocianatos 8. Resultado del Aislamiento de los esteroles y Otros Componentes Extracto Diclorometnico Obtenido por Ultrasonido 9. Resultados de la Cuantificacin del -Sitosterol por Cromatografa Liquida de Alta Resolucin HPLC en Harina y Tabletas de Maca. V VI VII CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA del
INTRODUCCIN
En la actualidad hay un incremento en la aceptacin de la fitoterapia que se refleja en la mayor demanda de plantas medicinales y los productos elaborados a partir de ellas, lo cual incentiva realizar caracterizaciones qumicas de sus componentes y desarrollar nuevos mtodos analticos para el control de calidad de los fitofrmacos. Diversos estudios biolgicos y fitoqumicos realizados a la maca, para determinar las bases fsicas que demuestren su uso como medicina tradicional de nuestros pueblos, afirman sus bondades medicinales y que sea considerado como un alimento superior. La produccin de fitofrmacos a partir de la maca requiere de mtodos analticos para su identidad y calidad tanto en la materia prima como en sus formas farmacuticas y as homogenizar y estandarizar la maca para evitar productos de baja calidad o adulterados. Actualmente muchos de los Laboratorios Farmacuticos Nacionales que elaboran formas farmacuticas a partir de la maca no han establecido un protocolo de anlisis adecuado, tanto para la materia prima como de sus formulaciones . En el presente trabajo se desarrolla diversos mtodos analticos, partiendo de las diversas investigaciones realizadas hasta el presente sobre los componentes como los esteroles, glucosinolatos e isotiocianatos en la maca. Se realiza mtodos de extraccin en gradiente empleando reflujo, soxlet y ultrasonido, empleando muestras de maca fresca, seca y harina, de los cuales adicionalmente se realiza en los extractos obtenidos por reflujo el screening fitoqumico preliminar, de ello resulta que el mtodo de extraccin empleando la tcnica de ultra sonido y empleando diclorometano como solvente, es eficiente para obtener los componentes lipdicos . Se determina mtodos de identificacin de los extractos lipdicos , de los esteroles y los isotiocianatos, empleando estndares y la tcnica cromatogrfica de capa fina, en los cuales resulta eficiente los criterios analticos del mtodo. Se separa y los componentes en qumicos capa fina como a los esteroles del extracto La diclorometano(harina de maca) obtenido por ultrasonido, empleando cromatografa en columna cromatografa escala preparativa(CC-CCFP). determinacin del perfil cromatogrfico de los esteroles aislados empleando HPLC. Tomando cantidades de 1 a 8 g de harina de maca genuina utilizado por el Laboratorio Hersil S. A. y la forma farmacutica de tabletas y efectuando la extraccin por ultrasonido y diclorometano como solvente, se logra extraer los esteroles de forma sencilla y rpida como demandan los mtodos de extraccin empleados en los ensayos rutinario de un laboratorio, para su identificacin en cromatografa de capa fina y cuantificar el -sitosterol por HPLC. Se utiliza la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) como una tcnica especfica y selectiva, estndares y cartuchos a base de slica gel para purificar los esteroles en los extractos y cuantificar el -sitosterol presente en la maca como componente mayoritario de los esteroles.
II
GENERALIDADES
1. Lepidium meyenii Walp (maca).
1.1. Antecedentes La maca es un producto alimenticio y medicinal, cuya planta(Lepidium meyenii Walp.) fue domesticada por comunidades preinca , probablemente en San Blas Junn hace 2000 aos antes de Cristo y cultivada en las condiciones ambientales extremas de nuestra Cordillera de los Andes Centrales, entre los 4100 a 4300 m.s.n.m., cuya ubicacin mas especifica corresponde a la meseta de Bombom en Junn y Cerro de Paco(1,2,3,4). En los ltimos aos por la popularidad de este producto se ha expandido la produccin a los departamentos de Ancash, Apurimac, Ayacucho, Huanuco, Huancavelica y Puno , como resultado 1999 se cultivo aproximadamente 1200 ha de maca ; este incremento, denominado como el boom de la maca, es debido al incremento de su la demanda en Japn, Europa y EEUU. El gobierno en el mismo ao, en un esfuerzo de darle valor agregado, prohbe la exportacin de la maca como raz, por lo cual desde la fecha se empieza a exportar como comprimidos, cpsulas, y otros derivados. Este producto usado por la medicina tradicional, le atribuyen
propiedades como; afrodisaco, corrige la esterilidad femenina y masculina, regulador hormonal en la menopausia y entre otros(4,). Tambin es reportado para incrementar la energa y vitalidad(5), otras propiedades medicinales incluye, reduce la estrs, regula la secrecin hormonal, estimula el metabolismo y mejora la memoria, actividad antidepresiva y combate la anemia, leucemia y cncer; por lo que tambin es conocido con el nombre de ginseng peruano (5).
1.2. Estudios realizados en Animales y Humanos.
Muchas de las propiedades atribuidas a la maca por la medicina tradicional a sido demostrado por diversos trabajos de investigacin realizado por varios autores y empleando diferentes modelos cientficos. El trabajo realizado por Bo Lin Zheng et. al.(2000) evaluan el efecto de un extracto lipdico purificado de maca sobre el comportamiento sexual en ratas y ratones. Utilizan 02 extractos(patentado) M1y M2, en ratones se midi el nmero de introducciones completas y en ratas con disfuncin erctil el periodo de ereccin latente. Se concluye que la administracin oral del extracto lipdico
purificado mejor la funcin sexual de ratas y ratones, evidenciado por el incremento en el nmero de introducciones completas en ratones normales, incremento en el nmero de hembras positiva para esperma (2.5 veces ms que el control) y la disminucin del periodo latente de ereccin en ratas con disfuncinsexual(6) . La investigacin realizada por Cicero A.F.G. et. al. (2001), estudia el efecto de la ingesta oral aguda y crnica de la raz pulverizada de maca en el comportamiento sexual de 60 ratas macho. En la cual estas ratas dividido en tres grupos y administrado por va oral durante 15 das las siguientes dosificaciones: 15 mg/kg (1 grupo); 75 mg/kg(2 grupo); solucin salina 0.05 mL/Kg(3 control), los parmetros evaluados: primera monta(PM); primera intromisin( 1ra I); latencia posteyaculotaria(LP); eyaculacin(C), intervalo intercopulatorio(II); eficacia copulotoria(EC). Observan que tanto las dosis baja como alta reducen significativamente la primera monta(PM), primera intromisin(1ra I) y el intervalo intercopulatorio(II), la dosis 75 mg/kg disminuye la latencia posteyaculatoria(LP), luego de los 15 dias de tratamiento disminuye de forma estadsticamente significativa todos los parmetros evaluados. Como resultado del trabajo concluyen que la administracin aguda y crnica de la raz de maca mejora de forma significativa los parmetros de la actividad sexual de la rata macho(7) . Otra investigacin realizada por Cicero, A.F.G. et. al.(2002), estudian el efecto de la administracin oral de los extractos de maca en el desempeo sexual de ratas machos sexualmente no experimentadas(8) . En el estudio utilizan 100 ratas: 80 machos y 20 hembras ovarioectomizados y puestas en estado estrual con benzoato de estradiol y progesterona, extractos de maca obtenido en gradiente( trozada, secada a 60C y extrada a temperatura ambiente con hexano, cloroformo y metanol), forman 04 grupos de ratas macho a los que le administra los extractos va tubo gstrico por 05 das de la siguiente manera: 1 grupo; 52 mg extracto hexanico, 2 grupo; 870 mg de extracto metanlico, 3 grupo; 24 mg extracto cloroformico, 4 grupo (control); solucin salina. Resultado: Se hall que todas las fracciones utilizadas disminuyen de forma significativa la latencia de intromisin, el intervalo copulatorio e incrementan la frecuencia de intromisin as como la eficacia copulatoria. o o Los extractos hexanico y metanlico aumentan la frecuencia de monta. Sllo la fraccin hexanico aumento de forma significativa la latencia de monta. o De forma global, slo la fraccin hexanica mejor la mayora de los parmetros sexuales evaluados.
Experiencias con pacientes reportadas en la Townsend Letter for Doctors & Patients (USA) (1998), en el cual los mdicos utilizan la maca en la prctica de la medicina alternativa y complementaria, entre ellos cabe mencionar al Dr. Hugo
Malaspina, Mdico en la ciudad de Lima, declara: la maca aporta hormonas externas al cuerpo, estimula los ovarios y otras glndulas para producir hormonas necesarias, seala que trata 200 pacientes mujeres con estas perimenopausia, postmenopausia, y con histerectoma total o parcial, mujeres con implante de seno, manifiesta que hay mejora en los sntomas de pacientes(9) . La parte farmacolgica del trabajo realizado por Jeri Crdenas (1995) en Ayacucho, sobre la fertilidad en mujeres, en el cual empleando un producto semielaborado a partir de la maca, suministrada por un periodo de 06 meses al ao a mujeres de infertilidad no gentica, logra la fecundacin(10) .
El efecto del la maca en el ser humano realizado Gonzles F. ,G y Col.(2001) realizado en la Universidad Peruana Cayetano Heredia, determin la accin de tabletas de Lepidium meyenii Walp. En el anlisis seminal(pautas de la OMS) 09 varones adultos normales cuyas edades oscilan de 24 a 44 aos que se les administr tabletas de maca de 1300 a 3000 mg por da durante 04 meses. Se miden las hormonas LH, FSH, prolactina, testosterona y estradiol, entes y despues del tratamiento. Se encontr aumento: del volumen seminal, cantidad de esperma por eyaculacin, esperma mvil y de la motilidad espermtica. No hubo modificaciones de hormonas sricas(11) . El trabajo realizado por Apumayta V. U. y Col(1998), sobre la actividad estrognica de la maca en 05 mujeres postmenospusicas, a las cuales les dan de ingerir cpsulas de 300 mg de extracto de maca. Concluye que la hormona FH disminuye de 117.19 mUI/ml a 32.03 mUI/ml, medidos antes y despus del tratamiento (normal 8-40mUI/ml)
(12)
Estudio realizado sobre la evaluacin nutricional de la maca en animales, es la siguiente: El trabajo realizado por Canales M. y Col(2000), evala la capacidad nutricional de esta raz en un modelo cientfico aplicado a dos generaciones de ratones( padres y cras). En al cual cada una de estas generaciones divididos en 03 grupos son alimentados de la siguiente manera: 1 grupo; 30% de maca cruda en alimento balanceado comercial(ABC), 2 grupo; 30% de maca cocida en ABC, 3 grupo; solo ABC(control). Los resultados muestran lo siguiente: curvas de crecimiento similares y adecuadas en los 03 grupos, no se encuentra sobrepeso ni desnutricin, el grupo de la maca cocida tuvo mejores curvas decrecimiento que el grupo control; la cual fue mas evidente en la segunda generacin(cras), el grupo de la maca cruda tuvo un crecimiento inferior al grupo control, y los valores de protenas totales y albminas sricas fue superior en el grupo de la maca cocida respecto a los dems grupos(13) .
1.3. Constituyentes Qumicos de la Maca. Segn los metabolitos presentes es dividido en componentes bromatolgicos y fitoqumicos , esta ltima como responsable de sus propiedades mdicas . denominados como ecotipos(20,16) . 1.3.1. De los componentes Bromatolgicos. La maca posee un alto valor nutricional en comparacin a otros cereales y tubrculos(14), comprobado experimentalmente por curvas de crecimiento(13), por lo que es considerado como alimento superior, los aminocidos de la protena es de primersima calidad. Estos coadyuva las propiedades medicinales de esta raz. Diversas investigaciones realizadas por Garr en (1972) y Dini A., et al. (1994), concluyen que la raz seca de la maca contienen: 59% de carbohidratos, 10.2% de protena, 8.5% de fibra, 8.5% de humedad, 2.2% de lpidos y 4.9% de cenizas ; minerales (mg/100g) como: Fe 16.6% , Mn 0.8% , Cu 5.9% , Zn 3.8% , Na 18.7% , K 2050% y Ca 220%, vitaminas(mg/100g) como: Tiamina B1(0.2), Riboflavina B2(0.35) y vitamina C(2.50) agua(17) . La protena de la maca posee un excelente perfil de aminocidos esenciales (mg/g protena): cido asprtico (91.7); cido glutmico (156.5); Treonina (33.1); arginina (99.4); tirosina (30.6); fenilalanina (55.3); valina (79.3); metionina (28); isoleucina (47.4); leucina (91); lisina (54.5) y el lpido(2%), muestra una buena composicin de cidos grasos esenciales: mirstico (1.4%), palmtico (23.8%), linolico (32.6%), olico (11.1%), esterico (6.7%) y araqudico (1.6%) identificado como glucosa y fructosa(16) .
(14). (14,15)
la
diferencia de los componentes es insignificativa en los diferentes colores de races
. La maca fresca contiene 80% de
El
contenido de azcares reductores en la maca seca es alto (6.4 8.0%),
1.3.2. De los Componentes Fitoqumicos.
GLUCOSINOLATOS E ISOTIOCIANATOS
Los lato.
glucosinolatos
(17,18)
mayoritarios
terminados
en
la
maca
son
bencilglucosinolato,
p-metoxibencilglucosinolato,
(18,17)
p-hidroxibencilglucosino-
La maca fresca contiene 1% (peso/peso) de estos componentes El isotiocianato determinados en
expresados como bencil-glucosinolato.
la maca seca por cromatografa gaseosa es el bencil isotiocianato. (6)
Tabla 01: Composicin de glucosinolatos en tres muestras de maca expresado como umol/g (porcentaje de cada glucosinolato).
Muestra Maca fresca Maca seca Maca harina 1 2 3 4 5
(17)
total
*%BGS
0.57 (2.2) 0.09 (1.8) 0.05 (1.2)
1.61 (6.3) 0.27 (5.8) 0.49 (12.1)
0.3 (0.2)
0.15 (0.7)
16.94 (66.4) 3.20 (71.0) 2.70 (66.7)
0.05 (0.1)
6.38 0.2 25.66 1.147 (25.0) (0.1) 0.89 (20.0) 0.88 (21.7) 4.45 4.06
0.199
0.181
1: 5-metilsulfinilpentil glucosinolato, 2: p-hidroxibencil glucosinolato, 3: m-hidroxibencil glucosinolato, 4: penta-4-enilglucosinolato, 5: bencil glucosinolato, 6: indolil-3-metil-glucosinolato, 7: p-metoxibencilglucosinolato, 8: 4-metoxi-indolil-3-metil glucosinolato. *%BGS : Porcentaje de glucosinolatos totales en paso de muestra expresado como bencilglucosinolato(PM 447).
ESTEROLES
Los esteroles determinados por cromatografa gaseosa en los extractos lipdicos se indican en la tabla N 02
Tabla 2. Esteroles presentes en la maca.(14) Esterol SITOSTEROL CAMPESTEROL ERGOSTEROL BRASSICASTEROL ERGOSTADIENOL Porcentaje en forma de acetato 45.50 27.30 13.60 9.10 4.50
Fuente: Dini A. Universidad de Npoles - Italia, 1990.
Se ha identificado componentes nuevos en los extractos lipdicos en los ltimos estudios realizados.La maca contiene el derivado benzilado de 1,2dihidro-N-hidroxipiridina, denominado macaridina, junto con las amidas benziladas (denominadas macamidas) N-benzil-5-oo-6E, 8Eoctadecadienamida y N-bencilhexa-decanamida, tiene tambien el acido keto acclico 5-oxo-6E-octadeca-dienoico.(19) La presencia de flavonoles en maca ha sido determinado por HPLC fase reversa. La maca tiene un bajo contenido de flavonoles expresado como catequina en comparacin con el t verde (2.5 mg/g vs 145 mg/g).(21) Se informa la deteccin de 04 alcaloides denominndolos macana 1,2,3 y 4 determinados por cromatografa de papel, las cuales hasta la actualidad no se han caracterizado.(22)
2. Estudios sobre los Glucosinolatos e Isotiocianatos

2.1. Importacia de los Glucosinolatos e Isotiocianatos Los glucosinolates son metabolitos secundarios presentes generalmente en las especies de la familia Brassicaceae, la cual abarca las hortalizas como la Col, Coliflor, Brcoli, Coles de Brusela, Nabo, Rbano, Berro, etc..(24) Estos compuestos son los precursores de los isotiocianatos, las cules son las que le confiere las propiedades biolgicas(52) y farmacolgicas(51,49) a las drogas derivadas de estas plantas medicinales y proporcionan a los vegetales frescos como la maca, el rabanito y mostaza, olores fuertes, sabor acre y picante.(24) Actualmente estos metabolitos esta atrayendo su atencin por sus cualidades quimioprotectores del cncer atribuida recientemente, en el cual el bencilisotiocianato presente en la maca como su respectivo glucosinolato a sido reportado como un potente anticancergeno de las glndulas mamarias y del estomago.(40) Jonhs (1981) menciona que las propiedades estimulantes de la fertilidad de la maca esta relacionado con la presencia de isotiocianatos aromticos biolgicamente activos, derivados por la hidrlisis de sus glucosinoaltos, especialmente del bencilglucosinolato y p-metoxibencilglucosinolato(ver cuadro 01).(17) 2.2. Hidrlisis por mirosinasa de las plantas y microflora digestiva Generalmente los glucosinolatos se agrupan en tres clases basadas en sus precursores de biosntesis(aminocidos); glucosinolates alifticos, aromticos y del indol heterocclico, dependiendo si se originan de los aminocidos alifticos (metionina, alanine, valine, leucine, isoleucine), de los aminocidos aromticos (tirosina, fenilalanina) o del triptfano respectivamente.(24,31,38) Se localizan en los tejidos de todos los rganos de la planta y la myrosinasa; una -tioglucosido glucohidrolasa (EC 3,2,3,1) se localiza en clulas dispersadas de myrosin, ambos siempre presente en la especie.(38,35.34) Los glucosinolatos son relativamente estables, pero el dao sobre el tejido por contusin, cortado, o maltratado en la recoleccin, transporte de las plantas frescas entra en contacto con la myrosinasa, la cual cataliza la hidrlisis en sus aglicones inestables, esta ultima por un rearreglo de Lossen forma los compuestos biolgicos activos, tpicamente isotiocianatos, y junto con ellos la hidrlisis origina D-glucosa y HSO4- (ver figura 01 B).(26,27,32) La descomposicin de los intermediarios aglicones hacia los isotiocianatos no es enzimtico, sin embargo, sobre condiciones particulares, favorecido por la presencia de iones Fe2+ y medios de pH fuertemente cidos y/o en algunas especies como producto de las hidrlisis, se han determinado la formacin de componentes menores, como los tiocianatos y nitrilos. mirosinasa son enzimas
(28,33,37)
La
no especficos con respecto al cadena (R) del aglicn, por

(30)
tanto puede hidrolizar una gama de glucosinoaltos de las distintas especies y su actividad es incrementada por la presencia del cido ascrbico. Los glucosinolatos son componentes mayoritarios a comparacin de sus respectivos isotiocianatos en las drogas o alimentos cocidos, tales como los hortalizas, en la cual la enzima se desnaturaliza por el calor.(55,45,52) Estos son convertidos a isotiocianatos en el tubo digestivo despus de su ingestin, por la flora microbiana comensal de nuestro sistema digestivo, la cual poseen enzimas como la mirosinasa o izoenzimas que catalizan la hidrlisis de los glucosinolatos hacia sus isotiocianatos, la cuales luego son absorbidos por el lumen intestinal. (36.25)
2.3. Qumica de los Glucosinolatos e Isotiocianatos Los glucosinolatos son sales orgnicas sulfatadas relativamente estables, presentes en las plantas en la forma potsica, son molculas altamente cargadas, en la cual el grupo sulfato con un pKa _ 9 es ionizado en casi todas las circunstancias.(45,56)Todos tienen una estructura en comn que consiste en un residuo -D-tioglucosido unido a una parte del sulfonatado aldoxima y a una cadena lateral R (perteneciente al aglicn) variable derivados de los aminocidos, la isomera geomtrica en su estructura en el enlace C=N es (Z),ver figura 01.(23) Los isotiocianatos son compuestos relativamente no polares, generalmente solubles en solventes orgnicos como el CH2Cl2 , estas molculas son reactivas por ser electrfilos, y pueden reaccionar con grupos nucleoflicos como aminos, hidroxilos, tioles, de las protenas u otros metabolitos.(560,53) Estas sustancias puras son de consistencia aceitosa y poseen alta tensin de vapor por el cual son generalmente voltiles; el alil y fenilisotiocianatos son altamente voltiles, la cuales por dejarlos en libertad en el ambiente son fuertemente picante y lacrimgena.(44) ver protocolo del bencil glucosinolasto anexo N . Los isotiocianatos formados de glucosinoaltos indlicos son generalmente inestables y se descomponen espontneamente para formar generalmente compuestos citotxicos y los isotiocianatos de los glucosinolatos alifticos que poseen grupos nucleoflicos en la cadena (R) reaccionan intramolecularmente, como el -hidroxialquenilisotiocianato (progoitrin y epigoitrin) se ciclan inmediatamente a oxazolidinas-2-tiones, este es un agente antitiroideo en los mamferos, la cual ha mostrado inhibir la iodacin enzimtico de tirosina hacia tiroxina.(29) Estos dos clases de glucosinolatos presentes en algunas especies no lo trataremos mas all por no ser de nuestro inters.
2.4. Metodologa de anlisis Glucosinolatos estn presentes en la muestra vegetal fresca en niveles mucho ms altos en comparacin de los secos, para evitar su desdoblamiento en las muestras frescas durante extraccin, inicialmente se inactiva la enzima gobernadora de su hidrlisis, bajo corriente de nitrgeno o desnaturalizar por calor a 100C por 3 min.(44) La extraccin generalmente se realiza con solventes polares, como al MeOH al 70% acuoso. La tcnicas rpida y econmica utilizada para su rpida determinacin e identificacin cualitativa de cada uno los componentes individuales es la Cromatografa de Capa Fina en la cual es necesario utilizar estndares.(56,58) La
determinacin tambin se realiza bajo la forma de isotiocianatos, en al cual se aprovecha la presencia de la enzima propia de la muestra fresca, y en la seca se emplea mirosinasa externa purificada(39) , las cuales convierten cuantitativamente los glucosinoaltos hacia sus isotiocianatos, esta ltima se extrae con solventes apolares como el CH2Cl2 del extracto acuoso(medio de la hidrlisis), luego por su volatilidad generalmente se deriva a tiourea, la cuales son determinados en Cromatografa de Capa Fina. La Determinacin de los isotiocianatos por hidrlisis enzimtico provee una ruta superior para la identificacin de los glucosinoaltos y la resolucin en la cromatografa de capa fina depende principalmente de la diferencia en la cadena lateral (R) .(17) En el secado natural de la maca, hay una importante hidrlisis de glucosinolatos, degradacin gobernada por la temperatura ambiental y la mirosiansa respectivamente, y el secado en el horno a temperatura por encima de 60C desnaturaliza la enzima por lo tanto el producto contendr mayor concentracin de glucosinolatos en comparacin con la secada naturalmente.(18) A la temperatura ambiente, cuando se almacena por periodos de tiempos largos estos pueden hidrolizarse fcilmente hacia sus aglicones(31), esto justifica la diferencia de estos componentes en al maca, en la cual el producto fresco posee 1% y la seca menos de 0.3% en peso, expresado como bencilglucosinolatos, y adicionalmente el procesamiento de la maca seca en sus derivados como la harina, reduce a un mas estos glucosinolatos, ver cuadro 01.(18) 2.5. Actividades biolgicas de los Glucosinolatos e Isotiocianatos Las plantas medicinales con glucosinolatos han sido utilizadas como alimento o propsitos medicinales por diversas culturas a atreves de los siglos, como la maca, uno de los componentes, los glucosinolatos aromticos, las cuales pueden justificar parte de las activadas biolgicas, traducido en su deseable atributo medicinal y nutricional.(18) Thimoty(1981), demostr la actividad antibitica in vitro del bencilisotiocianato y p-metoxibencil-isotiocianato presentes en la maca, los cuales 10 - 100 ug mostr actividad significativa para especimenes de Candida albicans, Echerichia coli y Staphylococcus albus.(17) Actualmente estas especies son usados como fuentes de compuestos quimio-protectores, por tener un valor farmacolgico potencial detallado para el cncer.(49) Por lo dicho, los glucosinoaltos aromticos de la maca fresca(1% en peso) la cual es 100 veces mayor de los niveles encontradas de las
inflorescencias comestibles de las
Brassica olearacea (col, coliflor y brcoli), es un
buen candidato para esta terapia.(17,42) Estudios epidemiolgicos recientes han demostrado que la ingestin en la dieta de cantidades considerables de vegetales con glucosinolatos, como coles, coles de bruselas, brcoli, coliflor, rbano, colinabo, nabo y berro; proporcionan una proteccin natural frente a los agentes cancergenos, al disminuir el riesgo de desarrollar cnceres en el pncreas, hgado, colorectal y prstata.(40,44,43,47,48) La actividad esta relacionada con los isotiocianatos, la cual se forma despus de su ingestin con la participacin de la flora microbiana comensal, la cual posee enzimas como la mirosinasa.(36) Ciertos isotiociantos especialmente los aromaticos ha mostrado ser un potente inhibidor de tomorogenesis en varios modelos de animales de laboratorio (glndula mamaria, pulmn, esfago) y efecto citoesttico , selectivo y citotxico en clulas cancerganas humanas como la leucemia, las cuales han sido demostrado en Vitro.(40,41,47,48,49) Los mecanismos por el cual los isotiociantos actan como inhibidor del cncer en humanos, estn encaminado por neutralizar un amplio nmero de carcingenos y/o supresin de la proliferacin de clulas neoplsicas activos; expresado como : (1) Accin inhibitoria sobre al Fase I, la cual representa las enzimas responsables para la bioactivacin de carcingenos, como CYP2E1 isoenzima de la citocromoP450; (2) actividad inductora de la fase II, la cual representa el mas importante sistema de enzimas desintoxificadoras en el organismo humano, como la quinona reductasa, glutatin S-transferasa, UDP-glucorunosil-transferasa, (NAD(P)Hquinona reductasa, las cuales son importantes enzimas hepticas para la proteccin de carcingenos.
(51,52,48,46)
3. Estudios sobre los Fitosteroles

3.1. Fitosteroles
Los fitosteroles son metabolitos secundarios ampliamente distribuidos en las plantas superiores y estn compuestos generalmente de -sitosterol, campesterol, brassicasterol, estigmasterol y el ergosterol, presentndose en forma libre (aglicones), formando esteres o como parte de un glicsido (saponinas). Estos compuestos derivan biogenticamente del escualeno, todos contienen el ncleo ciclopentanoperhidrofenantreno, presentan un grupo -OH en el carbono C3, poseen una cadena lateral de 8 a 10 carbonos y un doble enlace en el carbono C5 , por lo cual, se pueden representar con la estructura bsica del colestanol, a la cual los grupos metilo y etilo se unen al carbono C24, ver figura 02. El -sitosterol es un anlogo del colesterol diferenciado por el grupo etilo adicional en su cadena lateral.(85,83,92,91,90,64,58)
3.2. Importancia de los Fitosteroles
La investigaciones ha demostrado que muchas de los plantas medicinales populares poseen concentracin altas de fitosterols, como la Uncaria tomentosa y guianensis, Palmetato de sierra, Pygeun africanun, Gingko biloba, Panax ginseng, Ginseng siberiano, etc., en los cuales, estos compuestos confieren parte de las propiedades biolgicas y farmacolgicas de estas drogas y puede justificar algunas de las propiedades teraputicas en la maca.(60,79) Estos compuestos han demostrado ejercer efectos bioqumicos nicos y significativos en animales y seres humanos, encontrandose en el suero y el tejido fino de seres humanos sanos en 800-1000 veces menos del nivel de concentracin del colesterol.(76) El -sitosterol es el fitosterol principal, la cual han sido estudiado intensamente en animales de laboratorio y han demostrado poseer caractersticas antiinflamatorias, antipirticas, antineoplsicas, y de inmune-moduladores.(69,71,80) Estudios in vitro, animales, y en seres humanos, han demostrado propiedades promisorias en la proliferacin y normalizacin de la funcin de la clula-T, activacin y sensibilizacin del sistema inmune, y normalizar el cociente de DHEA:cortisol.(71) Restablecer el equilibrio al sistema inmune esta relacionado con la terapia en procesos de la enfermedades tales como infecciones virales crnicas, supresin inmune, estrs inducido, tuberculosis, alergias, cncer, artritis reumatoide y otras condiciones autoinmunes.(54)
3.3. Actividades biolgicas de los fitosteroles
El nivel de los fitosteroles en el plasma (-sitosterol se extienden de 0,3 a 1,02 mg/100ml) y los tejidos finos del hombre es muy baja, por su pobre absorcin en el intestino y la rpida excrecin, son rpidamente metabolizados por el hgado en el carbono C21 y excretado va cido biliar junto con otros esteroles propios del organismo metabolizados en el C24. La absorcin controlada por el organismo es relativamente bajo (el 5% o menos del producto diario), una dieta optima de los fitosteroles como esteroles libres y conjugado son de 200 a 300 mg al da, en el plasma y las heces de pacientes en las dietas desprovistas llegan a ser rpidamente libres, por lo tanto, los fitosteroles son micronutrientes esenciales no sintetizados necesarios en el cuerpo humano, los cuales deben ser administrados en la dieta diariamente para el funcionamiento ptimo del sistema inmune.(65,68,76,72)
Se presume a los fitosteroles ayudar la conversin del cido linolico hacia los cidos grasos poliinsaturados, este proceso es esencial para la conversin de los cidos grasos del Omega 6 en prostaglandinas y leucotrienos , las cuales son precursores de hormonas y sustancias involucradas con el soporte del sistema inmune.(76) Por otro lado la mayor parte de animales y humanos estudiados muestra que los fitosteroles reduce el nivel de colesterol del plasma sanguneo por inhibicin de su absorcin intestinal.(75,77,54,70) Estos compuestos son factores de gran alcance en la lucha inmunolgica contra enfermedades humanas y de animales, los estudios de mltiples investigaciones han demostrado proporcionar los efectos fisiolgicos protectores y teraputicos importantes para ayudar a mantener un sistema inmune en equilibrio. Los mecanismos por la cual estos compuestos actan son; activando y sensibilizado el sistema inmune, por el cual ayuda al cuerpo a identificar correctamente sus clulas en los desordenes auto inmune, como en el artritis reumadoidea, sndrome de lupus erimatoso y soriasis, en los cual el sistema inmune esta activado y no sensibilizado, al destruir estos indistintamente las clulas del cuerpo.(76) Las concentraciones a que actan metabolitos en los ensayos in vitro son de picogramos a femtogramos.(79) Lo efectos biolgicos son los siguientes: o
Modulacin Inmune:
Los estudios in vitro, animales, y humanos han
demostrado que una mezcla de -sitosterol y su glucsido en relacin de 100:1, es capaz de realzar en varios aspectos la respuesta inmune: selectivamente incrementa la actividad de las clulas T-Helper-1 (TH1), manteniendo la actividad normar de las clulas TH2, dando lugar a una subida significativa del interleucin-2 (Il-2) y el interfern gamma (IFN-g) que realzan actividad natural directa de la clula acecinas (NK). Al mantener o regular las clulas TH2 conduce a equilibrar los niveles de las interleucinas (Il-4, Il-6, Il-10) implicados en la diferenciacin y la inflamacin de la actividad del linfocito-B.(79,81,71) Esta combinacin tambin dio lugar al mantenimiento del cortisol y de la elevacin de los niveles de DEA.(79,81,68) o
Artritis Reumatoide: La artritis reumatoide
es una enfermedad inflamatoria
caracterizada por el sistema inmune no regulado. los B-linfocitos llegan a ser hiperactivo y secretan los anticuerpos que destruyen los tejidos finos sinoviales de las articulaciones. Una combinacin de -sitosterol y su glucsido demuestra incrementar los niveles de las clulas TH1, regulando la produccin del anticuerpo en los linfocitos-B, tambin disminuy la secrecin de citocinas relacionados con la inflamatorios por los macrfagos, de tal modo disminuyendo la inflamacin.(71,79,76) o
Cncer: Una carencia de la secrecin de Il-2 y de IFN-g por las clulas de TH1
conduce a las clulas de NK no ser capaces de reconocer las estructuras en la superficie de las clulas del tumor. Estos compuestos incrementan la secrecin de Il-2 y de IFN-g, realzando actividad de la clula de NK y disminuyendo la inflamacin.(74,81,73)
Hipertrofia Benigna
Prosttica (BPH): Estudios clnicos fueron conducidos en
350 hombres diagnosticados con la hipertrofia prosttica benigna, con duraron de seis meses y las dosificaciones del -sitosterol de 60-130 g diariamente. Aunque el mecanismo exacto sigue siendo confuso, la administracin dio lugar a un caudal urinario mejorado en los estudios, tambin mostr mejora en sntomas subjetivos de los pacientes con BPH.(81,69)
3.4. Metodologa de Anlisis
Los fitosteroles
libres son slidos cristalinos incoloros, solubles en
solventes
orgnicos, relativamente apolares como el diclorometano. Por la presencia en comn del grupo cromforo tales como -OH y enlaces dobles C=C aislados, sus espectros ultravioleta UV en metanol (200-360 nm) nicamente muestran un mximo de absorcin alrededor de 202 nm debido a transiciones del enlace doble.(62,63,64) El mtodo utilizado para la extraccin de esteroles libres y esterificados del tejido vegetal seco y molido, se realiza con un volumen suficiente de solventes apolares como el cloroformo o benceno, generalmente realizadas a temperaturas menores de 40C. (Bligh y Dyer). Para la purificacin y separacin de esteroles a partir de extractos lipdicos, se emplean con buenos resultados la Cromatografa en Columna (CC) y la Cromatografa en Capa Fina (CCF) de slica gel. Los mtodos clsicos de anlisis requiere de un proceso de saponificacin y luego extrados con solventes orgnicos para ser analizados por Cromatografa Gaseosa; la cual establece mtodo no rpido para su determinacin al realizar previa derivatizaciones de estos componentes. Actualmente se ha desarrollado con fines analticos la Micro Extraccin en Fase Slida (MEFS), la cual purifica el analito de inters de las pequeas cantidades de muestras. La Cromatografa Liquida de Alta Resolucin(HPLC) es una tcnica rpida, selectiva y especifica, en la cual se reportado la cuantificacin del -sitosterol.(57,58,59,61,66,67,78,83)
II Materiales y Mtodos
1. 0btencin de las Muestras

10 Kg de maca seca y 05 Kg de maca fresca(MF) fueron adquiridas en la provincia de Carhuamayo del departamento de Junn y llevado para su certificacin de identidad al Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (ver anexo N 01). La muestra seca fue molido hasta harina en la molinera Inkanature S.R.L. Vitarte-Lima, la cual fue utilizada en las extracciones denominado como maca seca(MS) para y en el aislamiento del -sitosterol en Cromatografa de Columna. 02 Kg harina de maca(MH) proveniente de departamento de Cerro de Pasco, fue adquirida por Dr. Artemio Chang. Comprimidos y harina genuina de maca, utilizado para la determinacin de sitosterol en HPLC, fueron proporcionados por Laboratorios Industriales Farmacuticos Hersil S. A.
2. Preparacin de los Extractos

Los solventes: ter de petrleo, CH2CL2, ActOEt y EtOH fueron obtenidos por destilacin en columna fraccionada y el Metanol fue grado analtico. 2.1 Extraccin por Reflujo o
Extraccin en Gradiente(1): 50 g de cada una de las muestras se

extrajeron con solventes de polaridad creciente: ter de petrleo, CH2CL2, EtOH y H2O, siguiendo el esquema N0 1.
Muestras:
a) b) c) Maca fresca Maca seca molida Harina de maca
o Procedimiento : Se pesa cuidadosamente 50 g de muestra y se coloca

un Erlenmeyer de 300 ml y se agrega ter de petrleo hasta cubrir la muestra, agitar y llevar con el solvente hasta 02 cm por encima de la superficie de la muestra; macerar por 48 horas y reflujar durante 04 horas, filtrar primero con tela tupida y luego con papel de filtro de flujo rpido. El marco se seca y se repite el mismo procedimiento con CH2Cl2 y EtOH, con la diferencia en este ltima solvente se deja macerar por 07 das y luego reflujar por 08 horas. El marco, luego de esta ltima extraccin, se mezcla con H2O, decanta y luego llevar hasta 02 cm por encima de la muestra y reflujar por 04 horas. Los extracto obtenidos con los diferentes solventes se dejan en la estufa a 40 45 C.
En el caso de la muestra fresca, se pesaron, cortaron en tajadas e inmediatamente se licuaron con el primer solvente y se verti al Erlenmeyer del sistema reflujo para el sometimiento al calor, luego se continuo la extraccin por gradiente segn el procedimiento antes mencionado.
Esquema N 01 : Extraccin por Reflujo
2.2
Extraccin por Soxlet o
Extraccin en Gradiente(1) : 25, 50 y 100 g de cada una de las 03

muestras se extrajeron con solventes de polaridad creciente: ter de petrleo, EtOH y H2O, siguiendo el esquema N0 2.
Muestras:
a) Maca fresca b) Maca seca molida c) Harina de maca
Procedimiento : Se colocan la muestra en cartucho de papel de filtro y

se introducen cuidadosamente en la cmara del soxlet, luego agregar ter de petrleo hasta humedecer el cartucho y abastecer el reservorio; luego realizar las corridas hasta agotamiento, descargar el extracto del reservorio. Los cartuchos se secan y se repite el mismo procedimiento con EtOH y H2O. Los extracto obtenidos con los diferentes solventes se filtran y se dejan en la estufa a 40 45 C. En el caso de la muestra fresca pesada es cortado y licuado finamente con el primer solvente antes de continuar la extraccin. Esquema N 02: extraccin por soxlet
2.3
Extraccin por Ultrasonido o
Extraccin en Gradiente : 01 Kg harina de maca obtenido por la

molienda de la maca seca, se extrajeron con solventes de polaridad creciente : CH2CL2, AcOEt y MeOH 70% acuoso, siguiendo el esquema 03.
Equipos: Ultrasonido BRANSON 8510, Rotavapor BChi tipo B-461.
Procedimiento : En una botella mbar con tapa hermtica de 04 L

colocar 01 Kg de la muestra, agregar CH2Cl2 hasta cubrir la muestra (400 ml), agitar, aadir 1000 mL del solvente y luego sumergir en el bao de ultrasonido y someter radiacin ultrasnica por 16 horas con temperatura de bao menor de 35 C, luego se filtrar en vaci empleando embudo bchner y papel filtro Watman N 40. El extracto se rotavapora en vaci y 35 C hasta sequedad. Realizar este procedimiento por triplicado. El marco, luego de la extraccin anterior se repite el mismo procedimiento (triplicado) con AcOEt y MeOH 70%. En estos dos ltimos extractos se rotavaporan a 40 50 C y si es necesario, se terminan secar con corriente de nitrgeno. Esquema N 03 Extraccin por ultrasonido de la muestra seca
2.4
Obtencin del extracto de Isotiocianatos (E - ITC) La obtencin fue realizada siguiendo el mtodo de Betelli(), con algunas modificaciones, en la cual los glucosinolatos son hidrolizados por la mirosinasa propia (interna) de las muestras frescas. Procedimiento: En un Erlenmeyer 100 mL se aade 20 g de maca fresca finamente triturada (realizado previamente en un mortero), se aade 20 ml de agua desionizada, para su hidrlisis fue llevado a 37 C por 30 min.. Luego fue filtrado con papel Wattman N 40, extrado por 02 veces con 10 mL de CH2Cl2 en una pera de decantacin, la fase diclorometnica fue recolectado en una botella mbar de 40 mL y guardado hermticamente hasta su anlisis.
3. Identificacin de Constituyentes
3.1 Screening Fitoquimico Preliminar o
Muestra : Los 12 extractos obtenidos en gradiente por reflujo, fueron

divididos en 02 partes de 50% en peso, en los cuales se realizaron Screening Fitoquimico Preliminar y la Cromatografa de Capa Fina para Isotiocianatos y Esteroles.
Procedimiento : Se tom una porcin del 50% de peso de cada una de

las muestra y sigui segn el modelo de la marcha general fitoqumica de Rondina y Coussio
(2,3),
con algunas modificaciones para obtener las N 04, sobre las cuales se realiza las
fracciones, segn el esquema compuestos.
reacciones especificas para determinar la posible presencia de algunos
Esquema 04: Obtencin de las Fracciones
3.2 Cromatografa en Capa Fina de los Extractos o Materiales e Instrumentos: - Cromatoplacas de vidrio: slica gel 60 F254 0.25 mm. Merck o Vacio y aire comprimido Balanza analtica Mettler Toledo AB 204 Solventes grado analtico Jeringa graduada de 10 y 20 uL Benzil isotiocianato 98.8 % ( Aldrich), ver anexo N 02
Estandar: -
o
-
B- Sitosterol 49 % (Aldrich), ver anexo N 03 Anisaldehido- H2SO4 (38) Vainillina - H2SO4 (sol. A y B) (38) Lieberman Bouchard(38) AgNO3 amoniacal Yodo
Reveladores:
Muestras: Los extractos obtenidos fueron regenerados y luego diluidos en su respectivo solvente de extraccin de la siguiente forma: 1. Extractos por Reflujo: Se tom la segunda porcin restante de 50 % en peso y fueron diluidos a razn 1 :20 (g/ml) de extracto y solvente . 2. Extractos por Soxlet: Se tom los extractos correspondientes a las muestras de 50 g de maca y fueron diluidos a razn de 1 :20 (g/ml) de extracto y solvente. 3. Extractos por Sonicacin : Se tom los 03 extractos obtenidos y fueron diluidos a razn 1:5 (g/ml) de extracto y solvente, luego de ello es tomado 01 mL y enrasado en una fiola de 10 mL, de aqu se separ 02 mL para el anlisis. Las soluciones madres formadas, fueron rotavaporados para regenerar el extracto seco y conservados Columna. De estas soluciones madres se tomaron 02 mL y almacenados en recipientes mbar de 05 mL hasta su anlisis de identificacin de los Isotiocianatos y Esteroles. hasta su utilizacin en la cromatografa de
3.2.1. Isotiocianatos La determinacin de los isotiociantos en las muestras es una ruta superior para identificacin de los glucosinolatos en CCF. Estndar ( 5. 03mg/mL): En una fiola de 10 mL se aade 50.3 mg de benzilisotiocianato y se enrasa con diclorometano. Procedimiento : Las placas fueron activadas a 120
0
C por 30
minutos, la cmara fue saturadas con la fase mvil por media hora . Se sembraron las muestras y el estndar y luego se eluyeron con los siguientes sistemas : 1. Hexano : diclorometano ( 4:1 ) 2. Hexano : diclorometano ( 4:2 ) 3. Hexano : acetato de etilo ( 4:1 ) 4. Hexano
Los cromatogramas fueron esprayados con nitrato de plata amoniacal, segn empleado por Shiroya(87) (0,2 g de nitrato de plata y 5 mL de amoniaco concentrado, diluido con metanol a 100 mL), luego calentados en estufa a 110
0
C por 10 minutos hasta aparicin de
manchas marrn oscuro y esprayados con HNO3 0.5 N para neutralizar el exceso de revelador.(88) Tambin fueron revelados con vapor de Iodo.(89)
3.2.2. Esteroles o Estndar ( 5.2 mg/mL): En una fiola de 10 mL se aade 5.2 mg de -Sitosterol 49% y se enrasa con diclorometano. o Procedimiento : Las placas fueron activadas a 120
0
C por 30
minutos, la cmara fue saturadas con la fase mvil por media hora. Se sembraron las muestras y el estndar y se eluyeron con los siguientes sistemas : 1.CH2Cl2 - MeOH (9:1) 2.CH2Cl2 - AcOEt (8:1) 3.CH2Cl2 - AcOEt (9:1) 4.Hexano - AcOEt (4:1) 5.Hexano - CH2Cl2 (3:2) Los cromatogramas fueron esprayados con 10 ml de reveladores como: Vainillina- H2SO4 (sol. A- sol. B), Anisaldehido-H2SO4, Lieberman-Bouchart, luego calentados en estufa a 110 minutos hasta aparicin de manchas violeta morada.
0
C por 10
4. Aislamiento de los Esteroles y Otros Componentes del Extracto Diclorometnico Obtenido por Ultrasonido
El extracto diclorometnico obtenido de la harina de maca por ultrasonido fue sometido a fraccionamiento por Cromatografa de Columna(CC) con sistemas de solventes de polaridad creciente, deducidos segn los sistemas de solvente utilizado para la identificacin de esteroles en CCF y bibliografas diversas Materiales e Instrumentos: - Columna cromatogrfica 2.4 cm de dimetro por 50 cm de largo - Gel de slice para CC dimetro 0.05 - 0,20 mm Carlo erba - Vacio y aire comprimido - Balanza analtica Mettler Toledo AB 204 - Rotavapor Buchi tipo B-465 - Cromatoplacas de vidrio: slica gel 60 F254 0.25 mm Merck - Cromatoplacas Preparativas de vidrio: slica gel 60 F254 01 mm Merck - Jeringa graduada de 10 y 20 uL o Solventes: Hexano, CH2Cl2, AcOEt y MeOH.
(90-93)
. Luego las fracciones
fueron unidas segn los resultados desarrollados en CCF, rotavaporados y pesados. o
4.1. Fraccionamiento en Cromatografa de Columna. 8 g del extracto fue fraccionado con 80 g de slica gel para Cromatografa de Columna (CC). Segn la recomendacin de Hostettmann(94) : relacin de 1 g de muestra por 10 g de soporte. o Procedimiento: El extracto es disuelto totalmente con una alcuota del solvente de extraccin y luego embebido en 10 g de slica gel para CC mezclado y rotavaporado hasta polvo fino y homogneo. Luego este preparado es aplicado sobre el sistema de empaque de la columna prepara. La elucin se realiza con solvente de polaridad creciente segn tabla N 01 aplicando 2.5 bar de presin y se recolecta fracciones de 40 - 60 ml a un flujo de 1-2 ml/ min.
Tabla 01. Fracciones eludas en cromatografa de columna del extracto diclorometnico obtenido por ultrasonido. Sistema de solvente Volumen (mL) Fracciones 1-4 5-7 8-11 12-13 14-16 17-18 19-21
Hexano 100% CH2Cl2 en Hexano 50% CH2Cl2 100% AcOEt en CH2Cl2 0% AcOEt en CH2Cl2 10% AcOEt en CH2Cl2 20% AcOEt en CH2Cl2 30%
160 120 160 100 120 100 120
AcOEt en CH2Cl2 40% AcOEt en CH2Cl2 50% AcOEt en CH2Cl2 60% AcOEt en CH2Cl2 70% AcOEt en CH2Cl2 80% AcOEt en CH2Cl2 90% AcOEt 100% MeOH en AcOEt 10% MeOH en AcOEt 20% MeOH en AcOEt 30% MeOH en AcOEt 40% MeOH 100%
100 200 200 200 200 200 600 300 300 300 300 100
22-23 24-27 28-30 31-34 35-37 38-41 42-51 52-56 57-61 62-67 68-72 73-74
4.2. Cromatografa en Capa Fina de las Fracciones las fracciones recolectadas fueron agrupadas con base al anlisis de la CCF por visualizacin con reveladores de H2SO4 al 50%, anisaldehido-H2SO4 y luz Ultravioleta (UV), se rotavaporaron y como resultando de ello se obtuvieron 07 fracciones, ver tabla N 2.
Tabla 2. Datos de los pesos de las Fracciones obtenidas por Cromatografa de Capa Fina CCF. Muestra Fraccin 1 2 08 g Extracto 3 4 5 6 7 Peso ( mg ) Caractersticas Cristales amarillentos
F8-13
1088.00 456.80 1120.45 1052.00 446.5 320.90

2488.20
F14-15
F16-18 F19-29 F30-39 F43-49 F51-73
Pigmentos oscuros, aroma a maca
4.3. Purificacin de los Componentes por Cromatografa en Capa Fina a escala Preparativa
Las Fracciones resultante con los esteroles mas concentrado y otras fracciones
de
componentes
desconocidos
fueron
sometidos
purificacin
por
Cromatografa de Capa Fina a escala Preparativa (CCFP). Ver Tabla n3.

Tabla 3. Datos de los pesos de los esteroles y otros componentes purificados en Cromatografa de Capa Fina a escala Preparativa CCFP. Fraccin
5. Cuantificacin
del -Sitosterol Resolucin
por Cromatografa en Harina y
Liquida
de
Alta
(HPLC)
Comprimidos de Maca.
Equipo y Materiales : o Cromatgrafo HPLC LACHROM equipado con : Bomba Cuaternaria A: L-7100, Mdulo de Interfase D-7000 (gradiente), Horno de Columna L-7300, Automuestreador L 7200, Detector L-7450 con Arreglo de Fotodiodo y un Software System Manager D-2000 . o o o o o o Columna Lichrocant RP-8 250 x 4 mm Filtro de membrana Millipore 0.22 um Solventes grado HPLC Corriente de Aire Centrfuga Ultrasonido BRANSON 8510
5.1. Condiciones Cromatogrficas

Las condiciones Cromatogrficas utilizada para la determinacin del mtodo analtico son:
- Columna - Fase Movil - Modo de Corrida
: RP-8 250 x 4 mm : Acetonitrilo : MeOH (99:1) : Gradiente
- Programa de Corrida del Gradiente :

Tiempo(min) % Agua % MeOH % Acetonitrilo % Fase
0.0 10.0 15.0 16.0 20.0
0.0 1.0 10.0 0.0 0.0
0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

: 205 nm : 200-300 nm : 1,0 mL/min : 10 uL : 50 C : 20 min : 654.4 psi
0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
100.0 99.0 90.0 100.0 100.0
- Detector
- Rango de longitud de onda - Flujo - Volumen de inyeccin - Temperatura - Tiempo de corrida - Presin
Estas condiciones se mantienen constantes durante todo el proceso de estudio y fueron determinadas como resultado de mltiples ensayos con el estndar de -sitosterol 49%, esta posee otros esteroles como el campesterol, las cuales se logra la separacin de estos componentes.
5.2. Determinacin de la Linealidad y Sensibilidad

Se emplearon dos estndares; -sitosterol al 95 % y al 49%, ver certificados de anlisis en anexos, con las cuales se realizaron tres curvas de calibracin. Todos clculos de estudio correspondiente a las desviaciones estndares del tiempo de retencin y las reas por cada punto, as como el coeficiente de correlacin de la curva son determinados por el software del HPLC. 5.2.1. Curva de calibracin con estndar al 95 %
Se realiza dos curvas, con las cuales se determinan la linealidad y lmite de identificacin y el coeficiente de correlacin de cada curva entre los lmites establecidos. Curva de 0.5-30 ug/ml de -sitosterol Se form una solucin madre de 0.26 mg/mL, pesando 2.6 mg de estndar, colocado en una fiola 10 mL y enrasando con CH2Cl2 , luego de esta solucin madre se realiza una serie de diluciones (todos enrasados con CH2Cl2) para formar 07 puntos de la curva, segn la tabla N 4. Por cada punto se pasa una vez y el limite de identificacin se determina a su mxima sensibilidad del equipo.
Tabla 4. Datos de concentraciones de los puntos en la 1ra Curva de Calibracin Puntos (ug/mL) 1 2 3 4 St 0.5 St 01 St 2.5 St 05 Concentracin 0.494 0.988 2.470 4.940 ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL Puntos (ug/mL) 5 6 7 St 7.5 St 10 St 30 Concentracin 7.410 ug/mL 9.880 ug/mL 29.640 ug/mL -
Curva de 2-232 ug/ml de -sitosterol
Se form una solucin madre de 0.244 mg/mL, pesando 6.1 mg de estndar, colocado en una fiola 25 mL y enrasando con Fase Mvil (Acetonitrilo-MeOH 99:1), luego de esta solucin madre se realiza una serie de diluciones ( todos enrasados con F. M.) para formar 05 puntos de la curva, segn tabla N 05. Se realiza dos mediciones con diferencia de tiempo de 10 horas, antes y despus de las corridas de las muestras, y por cada punto se pasa dos veces en las dos mediciones. Luego se mide la desviacin estndar de rea por punto, el coeficiente de correlacin entre los puntos establecidos.
Tabla 5. Datos de concentraciones de los puntos en la 2da Curva de Calibracin Puntos St 1 St 2 St 3 Concentracin 2.318 ug/mL 27.816 ug/mL 69.540 ug/mL Puntos St 4 St 5 Concentracin 92.720 ug/mL 231.800 ug/mL -
5.2.2. Curva de calibracin con estndar 49% Se form tres soluciones de concentraciones en creciente, pesando 6.5, 7.6 y 10 miligramos en fiolas de 25 mL y enrasando con Fase Mvil, luego llevados al bao del ultrasonido y sometidos a radiacin ultrasnica por 10 minutos, filtrados a travs de membranas Millipore 0.45 um. Se pasa por dos veces cada punto, se mide la desviacin estndar de rea y el coeficiente de correlacin.
Tabla 6. Datos de concentraciones de la 3ra Curva de Calibracin con el estndar 49% Puntos St 1 St 2 St 3 Concentracin 131.56 ug/mL 153.82 ug/mL 200.24 ug/mL
Se realiza con la finalidad de comparar los resultados con el primer estndar, monitorear la resolucin de los esteroles en la muestra y mostrar su validez como estndar en la cuantificacin del -sitosterol en las muestras.
5.3. Determinacin del Mtodo de Preparacin de la Muestra Harina de Maca

Se determina una extraccin diclorometnica por sometimiento a radiacin ultrasnica, para la cual se estudian tres diferentes pesos: 02, 05, 08 g de harina de maca. Por cada cantidad estudiada se extrae dos veces y para 08 g se realiza un adicional de una extraccin por tres veces.
5.3.1. Purificacin por Extraccin en Fase Slida. Todas las extracciones realizadas son purificados para esteroles por extraccin de Fase Slida emplendose cartuchos de Slica gel para CC 0.05 - 0,20 mm de dimetro Carlo erba.
Los cartuchos son adecuados en Jeringas con mbolo de 20 mL de capacidad, en las cuales son colocados una pequea torunda de algodn en la parte inferior de salida y sobre ella 04 g de Slice. Antes de usar los cartuchos, la slice es acondicionado con 20 mL de diclorometano. Las muestras diclorometnicas objeto de estudio obtenido por extraccin ultrasnica, son trasferidos cuantitativamente en alcuotas de 10 mL al interior del cartucho directamente sobre el absorbente, luego es eluido por la columna con la presin ejecutada sobre el mbolo y colectados en fiolas, de volumen determinado segn el estudio. Dos alcuotas de 10 mL de diclorometano fresco son adicionalmente aadidos al cartucho para su lavado, eluidos completamente y juntados con la muestra en dicha fiola.
5.3.2. Extraccin Diclorometnica de las Muestras Extraccin: La cantidad de muestra en estudio(harina de maca) es depositado en un Erlenmeyer con tapa esmerilada de 125 mL, se aade el solvente extractor(dicloromatano), se lleva a bao de ultrasonido y se somete a radiacin ultrasnica por 50 min. Controlando el calentamiento del bao por debajo de 40 C . Luego se vierte el extracto en tubos de centrfuga de 50 mL y se lleva a centrifugar por 15 min., se vierte el sobrenadante en un Erlenmeyer. Luego se repite todo el procedimiento de extraccin una vez mas con el marco empleando la misma cantidad de dicloromatano fresco. Se juntan los dos extractos y se purifica en fase slida segn el procedimiento descrito en 5.3.1. Se enrasa en una fiola (volumen segn el caso de estudio) con diclorometano o fase mvil. luego se filtra con membrana Millipore de 0.2 um de dimetro, alcuotas de 02 mL es colocado en viales de HPLC para su posterior inyeccin del equipo.
Muestra : 2 g de Harina de Maca La cantidad en estudio es extrada por dos veces y representado por tres muestras. Por cada extraccin se utiliza 15 mL de diclorometano fresco, y se enrasa en fiola de 100 mL con diclorometano como volumen final, luego analizado por HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas. Las corridas en el equipo son realizadas junto a las corridas de las diluciones del estndar(puntos) correspondiente a la 1ra curva de calibracin y cuantificado bajo esta por el software. Luego se determina La desviacin estndar de las reas y del mtodo de extraccin y se expresa el resultado como mg de -sitosterol por 100 g de muestra seca.
Tabla 7. Datos del estudio con dos gramos de Muestra Muestra Peso(mg) N de extracciones Enrase (mL)*
M-1 M-2 M-3
2.00139 2.00418 2.00654
02 veces 02 veces 02 veces
100 100 100

*Solvente diclorometano
Muestra : 5 g de Harina de Maca La cantidad en estudio es extrada por dos veces y representado por una muestra. Por cada extraccin se utiliza 30 mL de dicliorometano fresco. Luego de purificacin en fase slida el extracto diclorometnico total es llevado a corriente de aire para su total volatilizacin del solvente y es regenerado con Fase Mvil a 10 mL como volumen final, luego analizado por HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas. Las corridas en el equipo son realizadas junto a las corridas de las diluciones de los estndares(puntos) correspondiente a la 2da curva de calibracin (estndar al 95%) y 3ra curva de calibracin(estndar 49%). Luego cuantificado por ambas curvas por el software. Los dos resultados
obtenidos con los estndares son procesados independientemente para su comparacin. Luego se determina La desviacin estndar del sistema y del mtodo de extraccin. Se realiza los respectivos clculos y se expresa como mg de sitosterol por 100 g de muestra seca. Muestra : 8 g de Harina de Maca Esta representado por tres muestras y las cantidades en estudio es extrada por dos veces para una muestra y tres veces para la dos ultimas muestras. Por cada extraccin se utiliza 40 mL de diclorometano fresco. Luego de su purificacin en fase slida, el extracto diclorometnico total es llevado a corriente de aire para su total volatilizacin del solvente y es regenerado con Fase Mvil a 10 mL como volumen final. Luego analizado por HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas. Las corridas en el equipo son realizadas junto a las corridas de las diluciones de los estndares(puntos) correspondiente a la 2da curva de calibracin (estndar al 95%) y 3ra curva de calibracin(estndar 49%). Luego cuantificado por ambas curvas por el software. Los dos resultados obtenidos con los estndares son procesados independientemente para su comparacin. Luego se determina La desviacin estndar del sistema y del mtodo de extraccin. Se realiza los respectivos clculos y se expresa como mg de sitosterol por 100 g de muestra seca.
Tabla 8. Datos del estudio con cinco y ocho gramos de Muestra
Muestra N de extracciones N de Muestras Peso ( g) Enrase (mL) *
05 g Harina Maca 08 g Harina Maca
01 01 02
5.0086 g 8.0555 g 8.0434 g 8.0768 g
10 10 10 10
* Fase Mvil
Clculos :
Las cuantificacin del -sitosterol en estudio de cada peso son calculados bajo sus reas y extrapolados hacia migramos de analito por el software del equipo empleando las curvas de calibracin, como se indica en cada caso. Los resultados expresados como el numero de miligramos del analito por 100 gramos de muestra seca, se procede de la siguiente manera:
- Amp - Ast - Wstd - pot st - Wmp - Vst - VMp
: rea de la muestra : rea del estndar : Peso del estndar en mg : Potencia del estndar : Peso de la muestra en g : Volumen de enrase del estndar : Volumen de enrase de la muestra
5.4. Determinacin del Mtodo de Preparacin de la Muestra Tabletas de Maca

Se determina una extraccin diclorometnica por sometimiento a radiacin ultrasnica. La cantidad de estudio corresponde a 8 gramos, representado por dos muestras y la extraccin se realiza por dos veces. Extraccin:
Se muele 20 tabletas hasta obtener un polvo fino (USP XXV). Pesar 8 g de muestra en un matraz de 125 mL, empleando 40 mL de diclorometano y sometiendo a radiacin ultrasnica se extrae por dos veces siguiendo el procedimiento para las muestras de harina. Luego se realiza la purificacin en fase slida siguiendo el procedimiento determinado(2.3.1). Llevar a sequedad con corriente de aire. Disolver el residuo con 10 mL de fase mvil, sonicar por 5 min. Y filtrar a travs de membrana Millipore 0,45 um. Luego analizado por HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas. Las corridas en el equipo son realizadas junto a las corridas de las diluciones de los estndares(puntos) correspondiente a la 2da curva de calibracin (estndar al 95%) y 3ra curva de calibracin(estndar 49%). Luego cuantificado por ambas curvas por el software. Los dos resultados obtenidos con los estndares son procesados independientemente para su comparacin. Se determina La desviacin estndar del sistema y del mtodo de
extraccin. Se realiza los respectivos clculos y se expresa como mg de sitosterol por tableta de maca.
Tabla 9. Datos del estudio de ocho gramos de Tabletas de Maca 08 g de Muestra Peso promedio Tabletas(20) 0.84903 g dos Extracciones N de Muestra 01 02 Peso ( g) 8.0017 8.0241 Dilucin(mL) * 10 10
* Fase Mvil
Clculos : Las cuantificacin del -sitosterol es calculado bajo sus reas
de pico y extrapolados por el software del equipo.
5.5. Cromatografa en HPLC de los esteroles aislados por Columna
Cromatografa y Capa Fina Preparativa.

Los esteroles aislados por Cromatografa en columna y purificados en Capa Fina a escala Preparativa fueron corridos en el HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas, identificndose los componentes y sus respectivas ares de picos.
Se realiza dos curvas, con las cuales se determinan la linealidad y lmite de identificacin y el coeficiente de correlacin de cada curva entre los lmites establecidos. Curva de 0.5-30 ug/ml de -sitosterol Se form una solucin madre de 0.26 mg/mL, pesando 2.6 mg de estndar, colocado en una fiola 10 mL y enrasando con CH2Cl2 , luego de esta solucin madre se realiza una serie de diluciones (todos enrasados con CH2Cl2) para formar 07 puntos de la curva, segn la tabla N 4. Por cada punto se pasa una vez y el limite de identificacin se determina a su mxima sensibilidad del equipo.
Tabla 4. Datos de concentraciones de los puntos en la 1ra Curva de Calibracin Puntos (ug/mL) 1 2 3 4 St 0.5 St 01 St 2.5 St 05 Concentracin 0.494 0.988 2.470 4.940 ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL Puntos (ug/mL) 5 6 7 St 7.5 St 10 St 30 Concentracin 7.410 ug/mL 9.880 ug/mL 29.640 ug/mL -
Curva de 2-232 ug/ml de -sitosterol
Se form una solucin madre de 0.244 mg/mL, pesando 6.1 mg de estndar, colocado en una fiola 25 mL y enrasando con Fase Mvil (Acetonitrilo-MeOH 99:1), luego de esta solucin madre se realiza una serie de diluciones ( todos enrasados con F. M.) para formar 05 puntos de la curva, segn tabla N 05. Se realiza dos mediciones con diferencia de tiempo de 10 horas, antes y despus de las corridas de las muestras, y por cada punto se pasa dos veces en las dos mediciones. Luego se mide la desviacin estndar de rea por punto, el coeficiente de correlacin entre los puntos establecidos.
Tabla 5. Datos de concentraciones de los puntos en la 2da Curva de Calibracin Puntos St 1 St 2 St 3 Concentracin 2.318 ug/mL 27.816 ug/mL 69.540 ug/mL Puntos St 4 St 5 Concentracin 92.720 ug/mL 231.800 ug/mL -
5.2.2. Curva de calibracin con estndar 49% Se form tres soluciones de concentraciones en creciente, pesando 6.5, 7.6 y 10 miligramos en fiolas de 25 mL y enrasando con Fase Mvil, luego llevados al bao del ultrasonido y sometidos a radiacin ultrasnica por 10 minutos, filtrados a travs de membranas Millipore 0.45 um. Se pasa por dos veces cada punto, se mide la desviacin estndar de rea y el coeficiente de correlacin.
Tabla 6. Datos de concentraciones de la 3ra Curva de Calibracin con el estndar 49% Puntos St 1 St 2 St 3 Concentracin 131.56 ug/mL 153.82 ug/mL 200.24 ug/mL
Se realiza con la finalidad de comparar los resultados con el primer estndar, monitorear la resolucin de los esteroles en la muestra y mostrar su validez como estndar en la cuantificacin del -sitosterol en las muestras.
5.3. Determinacin del Mtodo de Preparacin de la Muestra Harina de Maca

Se determina una extraccin diclorometnica por sometimiento a radiacin ultrasnica, para la cual se estudian tres diferentes pesos: 02, 05, 08 g de harina de maca. Por cada cantidad estudiada se extrae dos veces y para 08 g se realiza un adicional de una extraccin por tres veces.
5.3.1. Purificacin por Extraccin en Fase Slida. Todas las extracciones realizadas son purificados para esteroles por extraccin de Fase Slida emplendose cartuchos de Slica gel para CC 0.05 - 0,20 mm de dimetro Carlo erba.
Los cartuchos son adecuados en Jeringas con mbolo de 20 mL de capacidad, en las cuales son colocados una pequea torunda de algodn en la parte inferior de salida y sobre ella 04 g de Slice. Antes de usar los cartuchos, la slice es acondicionado con 20 mL de diclorometano. Las muestras diclorometnicas objeto de estudio obtenido por extraccin ultrasnica, son trasferidos cuantitativamente en alcuotas de 10 mL al interior del cartucho directamente sobre el absorbente, luego es eluido por la columna con la presin ejecutada sobre el mbolo y colectados en fiolas, de volumen determinado segn el estudio. Dos alcuotas de 10 mL de diclorometano fresco son adicionalmente aadidos al cartucho para su lavado, eluidos completamente y juntados con la muestra en dicha fiola.
5.3.2. Extraccin Diclorometnica de las Muestras Extraccin: La cantidad de muestra en estudio(harina de maca) es depositado en un Erlenmeyer con tapa esmerilada de 125 mL, se aade el solvente extractor(dicloromatano), se lleva a bao de ultrasonido y se somete a radiacin ultrasnica por 50 min. Controlando el calentamiento del bao por debajo de 40 C . Luego se vierte el extracto en tubos de centrfuga de 50 mL y se lleva a centrifugar por 15 min., se vierte el sobrenadante en un Erlenmeyer. Luego se repite todo el procedimiento de extraccin una vez mas con el marco empleando la misma cantidad de dicloromatano fresco. Se juntan los dos extractos y se purifica en fase slida segn el procedimiento descrito en 5.3.1. Se enrasa en una fiola (volumen segn el caso de estudio) con diclorometano o fase mvil. luego se filtra con membrana Millipore de 0.2 um de dimetro, alcuotas de 02 mL es colocado en viales de HPLC para su posterior inyeccin del equipo.
Muestra : 2 g de Harina de Maca La cantidad en estudio es extrada por dos veces y representado por tres muestras. Por cada extraccin se utiliza 15 mL de diclorometano fresco, y se enrasa en fiola de 100 mL con diclorometano como volumen final, luego analizado por HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas. Las corridas en el equipo son realizadas junto a las corridas de las diluciones del estndar(puntos) correspondiente a la 1ra curva de calibracin y cuantificado bajo esta por el software. Luego se determina La desviacin estndar de las reas y del mtodo de extraccin y se expresa el resultado como mg de -sitosterol por 100 g de muestra seca.
Tabla 7. Datos del estudio con dos gramos de Muestra Muestra Peso(mg) N de extracciones Enrase (mL)*
M-1 M-2 M-3
2.00139 2.00418 2.00654
100 100 100

*Solvente diclorometano
Muestra : 5 g de Harina de Maca La cantidad en estudio es extrada por dos veces y representado por una muestra. Por cada extraccin se utiliza 30 mL de dicliorometano fresco. Luego de purificacin en fase slida el extracto diclorometnico total es llevado a corriente de aire para su total volatilizacin del solvente y es regenerado con Fase Mvil a 10 mL como volumen final, luego analizado por HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas. Las corridas en el equipo son realizadas junto a las corridas de las diluciones de los estndares(puntos) correspondiente a la 2da curva de calibracin (estndar al 95%) y 3ra curva de calibracin(estndar 49%). Luego cuantificado por ambas curvas por el software. Los dos resultados
obtenidos con los estndares son procesados independientemente para su comparacin. Luego se determina La desviacin estndar del sistema y del mtodo de extraccin. Se realiza los respectivos clculos y se expresa como mg de sitosterol por 100 g de muestra seca. Muestra : 8 g de Harina de Maca Esta representado por tres muestras y las cantidades en estudio es extrada por dos veces para una muestra y tres veces para la dos ultimas muestras. Por cada extraccin se utiliza 40 mL de diclorometano fresco. Luego de su purificacin en fase slida, el extracto diclorometnico total es llevado a corriente de aire para su total volatilizacin del solvente y es regenerado con Fase Mvil a 10 mL como volumen final. Luego analizado por HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas. Las corridas en el equipo son realizadas junto a las corridas de las diluciones de los estndares(puntos) correspondiente a la 2da curva de calibracin (estndar al 95%) y 3ra curva de calibracin(estndar 49%). Luego cuantificado por ambas curvas por el software. Los dos resultados obtenidos con los estndares son procesados independientemente para su comparacin. Luego se determina La desviacin estndar del sistema y del mtodo de extraccin. Se realiza los respectivos clculos y se expresa como mg de sitosterol por 100 g de muestra seca.
Tabla 8. Datos del estudio con cinco y ocho gramos de Muestra
Muestra N de extracciones N de Muestras Peso ( g) Enrase (mL) *
01 01 02
5.0086 g 8.0555 g 8.0434 g 8.0768 g
10 10 10 10
* Fase Mvil
Clculos :
Las cuantificacin del -sitosterol en estudio de cada peso son calculados bajo sus reas y extrapolados hacia migramos de analito por el software del equipo empleando las curvas de calibracin, como se indica en cada caso. Los resultados expresados como el numero de miligramos del analito por 100 gramos de muestra seca, se procede de la siguiente manera:
5.4. Determinacin del Mtodo de Preparacin de la Muestra Tabletas de Maca

Se determina una extraccin diclorometnica por sometimiento a radiacin ultrasnica. La cantidad de estudio corresponde a 8 gramos, representado por dos muestras y la extraccin se realiza por dos veces. Extraccin:
Se muele 20 tabletas hasta obtener un polvo fino (USP XXV). Pesar 8 g de muestra en un matraz de 125 mL, empleando 40 mL de diclorometano y sometiendo a radiacin ultrasnica se extrae por dos veces siguiendo el procedimiento para las muestras de harina. Luego se realiza la purificacin en fase slida siguiendo el procedimiento determinado(2.3.1). Llevar a sequedad con corriente de aire. Disolver el residuo con 10 mL de fase mvil, sonicar por 5 min. Y filtrar a travs de membrana Millipore 0,45 um. Luego analizado por HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas. Las corridas en el equipo son realizadas junto a las corridas de las diluciones de los estndares(puntos) correspondiente a la 2da curva de calibracin (estndar al 95%) y 3ra curva de calibracin(estndar 49%). Luego cuantificado por ambas curvas por el software. Los dos resultados obtenidos con los estndares son procesados independientemente para su comparacin. Se determina La desviacin estndar del sistema y del mtodo de
extraccin. Se realiza los respectivos clculos y se expresa como mg de sitosterol por tableta de maca.
Tabla 9. Datos del estudio de ocho gramos de Tabletas de Maca 08 g de Muestra Peso promedio Tabletas(20) 0.84903 g dos Extracciones N de Muestra 01 02 Peso ( g) 8.0017 8.0241 Dilucin(mL) * 10 10
* Fase Mvil
Clculos : Las cuantificacin del -sitosterol es calculado bajo sus reas
de pico y extrapolados por el software del equipo.
5.5. Cromatografa en HPLC de los esteroles aislados por Columna
Cromatografa y Capa Fina Preparativa.

Los esteroles aislados por Cromatografa en columna y purificados en Capa Fina a escala Preparativa fueron corridos en el HPLC con las condiciones cromatogrficas establecidas, identificndose los componentes y sus respectivas ares de picos.
III Resultado y Discusin

6. Resultados de las Extracciones en Gradiente Obtenidos por Reflujo, Soxlet y Ultrasonido
Los resultado expresados en rendimiento de las tres muestras estudiadas soxlet y ultrasonido se expresan en las tablas N 1, N 2 y N3.
Tabla 1. Rendimiento de la Extraccin en Gradiente Obtenidos por Reflujo Solvente extractor Peso en gramos (Porcentaje de cada Extracto) 50 g Maca fresca 50 g Maca seca 50 g Harina de Maca
al
someterse extraccin por gradiente de polaridad y empleando mtodos de reflujo,
ter de petrleo Diclorometano Etanol Agua

Peso total de los extractos
0.2627 (0.53%) 0.0753 (0.15%) 1.1170 (2.23%) 4.1813 (8.36%)

5.6363 (11.27%)
0.2250 (0.45%) 0.4808 (0.96%) 9.5657 (19.13%) 15.8395 (31.68%)

26.1110 (52.22%)
2.4070 (4.81%) 0.6840 (1.37%) 8.0605 (16.12%) 9.5120 (19.02%)

20.6635 (41.33%)
Tabla 2. Rendimiento de la Extraccin en Gradiente Obtenidos por Soxlet Peso en gramos (Porcentaje de cada Extracto) Solvente extractor Maca fresca Maca seca Harina de maca
25 g *M. 50 g *M. 100 g *M. 25 g *M. 50 g *M. 100 g *M. 25 g *M. 50 g* M. 100 g *M.
ter de petrleo Etanol Agua
0.1108 (0.44%)
0.1794 (0.36%)
0.3379 (0.34) 9.6551 (9.66) 0.9313 (0.93)
0.2919 (1.17%)
0.4673 (0.93%)
1.1033 (1.10%)
1.4241 (5.70%)
2.7749 (5.55%)
5.5734 (5.57%)
2.9963 4.3132 (11.99%) (18.63%) 0.3976 (1.59%) 0.7624 (1.52%)
9.1439 17.3462 38.5056 6.6906 14.4695 32.1507 (36.58%) (34.69%) (38.51%) (26.76%) (28.94%) (32.15%) 4.9430 7.8166 17.2908 7.1051 11.9608 17.5073 (19.77%) (15.63%) (17.29%) (28.42%) (23.92%) (17.51%)
Peso total de 3.505 5.255 10.924 14.379 25.630 56.900 15.220 29.205 54.829 los extractos (14.02%) (10.51%) (10.92) (57.52%) (51.26%) (56.90%) (60.88%) (58.41%) (54.83%) *M. = cantidad de muestra
Tabla 3. Rendimiento de la Extraccin en Gradiente Obtenidos por ultrasonido en Harina de Maca Muestra 01 Kg Harina de Maca
Solvente Extractor Extraccin por tres veces (g)
Diclorometano
Acetato de etilo
Metanol al 70%
1 2 3
11.14 6.38 4.26

21.78 g (2.18%)
2.11 1.76 1.95

5.82 g (0.58%)
52.97 34.24 28.72

115.93 g (11.59%)
Peso total del extracto
7. Resultados de los Mtodos de Identificacin de Esteroles, Glucosinolatos e Isotiocianatos
7.1. Screening Fitoqumico El resultado del estudio del screening fitoqumico en todos los extractos obtenidos por reflujo se encuentra tabulado en la tabla N 04. La presencia fuertemente marcado de esteroles en las diferentes fracciones muestra que se encuentran libres y conjugados como saponinas. El estudio tambin muestra reacciones positivas para alcaloides.
7.2. Cromatografa en Capa Fina de Isotiocianatos Los glucosinoaltos de la maca fresca se hidrolizan a isotiocianatos por accin de la mirosinasa interna. La identificacin de isotiocianatos por CCF es una ruta superior para la determinacin de glucosinolatos en al maca fresca.
Fracc. Metabolito secundario
Extracto Extracto Extracto Extracto ter de Petrleo Diclorometnico Etanlico Acuoso Rx. De Identificacin Observ. Maca Maca Maca Maca Maca Maca Maca Maca Maca Maca Maca Maca Fresca Seca Harina Fresca Seca Harina Fresca Seca Harina Fresca Seca Harina
A
Taninos Sol. gelatina Lieberman-Bouchard Borntrager Lieberman-Bouchard Dragendorff Mayer Wagner Hager Triterpenos y/o Esteroides Alcaloides ? Lieberman-Bouchard Dragendorff Mayer Wagner Hager Flavonoides Shinoda Triterpenos y/o Esteroides Nafto y/o Antraquinonas Triterpenos y/o Esteroides Alcaloides ?
Cl3Fe
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + -
Verde
Verde
Verde
Shinoda
Prueba espuma
+ + +
Laucoantocianidinas y/o Catequinas Rosenheim
E
Flavonoides
Laucoantocianidinas y/o Catequinas Rosenheim
Saponinas
Tabla 4 . Resultado del Screening fitoqumico preliminar para la identificacin de metabolitos en los extractos ter de petrleo, dicloromatano, etanlico y acuoso de las tres muestras obtenidos por reflujo en gradiente de polaridad.
Los 04 sistemas de fase mvil estudiado, empleando revelados de AgNO3 y Iodo se muestra en los cromatogramas N 1 a N 7 para isotiocianatos, las cuales muestra la presencia de Bencilisotiocianato (1) y segn los reportes de Timothy Johns(17) y Genyi Li(18), sobre las proporciones en la maca de estos componentes y el comportamiento de migracin sobre los cromatogramas bencilisotiocianto(3). La ausencia de Isotiocianatos en los extractos obtenidos por reflujo y soxlet y segn su polaridad se puede aseverar la identificacin de p-metoxibencilisotiocinato(2) y p-hidroxi-
ultrasonido pertenecientes a las muestras de maca seca y harina, como lo muestra los cromatogramas, podra explicar por la volatilizacin de estos compuestos durante el secado y por otro lado la desnaturalizacin, justificado por sus propiedades reactivas (ver marco terico2.3.). La ausencia de Isotiocianatos en los extractos obtenidos por reflujo y soxlet y ultrasonido pertenecientes a las muestras de maca fresca, como lo muestra los resultados de los cromatogramas (Rf diferentes a los estndares), podra explicarse por la desnaturalizacin de estos compuestos al someterse al calor de extraccin y de la estufa en el secado. Los glucosinolatos fuertemente marcados en la maca fresca se hidroliza hacia sus respectivos isotiocianatos durante el secado y a travs del tiempo, mostrado por decrecimiento de sus precursores, por lo que se dara un prejuicio de su presencia marcada de estos componentes en las muestras secas(ver tabla 01 del maraco terico). Otra posible razn por la baja cantidad de estos isotiocianatos producidos de sus relacionados glucosinolatos es su reactividad con protenas y aminocidos al romperse las clulas durante el secado.(31)
El mtodo de identificacin desarrollado posee una sensibilidad de 5 ug de Bencilisotiocinato, es especfica para Isotiocianatos al no poseer interferencias de otros metabolitos, esto mostrado por los perfiles cromatogrficos citados.
7.3. Cromatografa en Capa Fina de Esteroles Los cromatogramas N 01 al N5 para esteroles, muestra la identificacin de estos analitos al ser desarrollados con el estndar de -sitosterol al 49% (posee campesterol y dihidrobrasicasterol), a partir de los extractos dicloromatnico y acetato de etilo obtenidos por ultrasonido de las muestra seca, por otro lado se aprecia los perfiles cromatogrficos como criterio de identidad de los extractos. De los 05 sistemas de fase mvil empleados los mas adecuados para ser empleados son: CH2Cl2 - AcOEt (8:1), CH2Cl2 - AcOEt (9:1) y Hexano - AcOEt (4:1). Los reveladores empleados resultan ser iguales en su funcin. El cromatograma N06 para esteroles, muestra la posible aplicacin en la determinacin semicuantitativa de los esteroles en los extractos lipidicos.
El cromatograma N07 para esteroles, muestra los perfiles cromatogrficos de los extracto obtenidos por reflujo y soxlet, en ello se identifica los esteroles con el estndar en cada uno de los extracto estudiados. Se aprecia la eficacia de la extraccin por soxlet de componentes lipdicos en comparacin de las extracciones realizadas por reflujo. El extracto obtenido a partir de las muestras frescas muestras por ambos mtodos de extraccin muestra la presencia fuerte de esteroles y otros componentes representado por una mancha morada en la parte superior del cromatograma (Rf antes del frente), la cual se puede presumir de esteroles esterificados por su carcter de sustancia apolar y los resultados del screenig fitoqumico.
8. Resultados del
Aislamiento de los Esteroles y otros Componentes
del Extracto Diclorometnico obtenido por Ultrasonido

Las 74 fracciones obtenidas como producto de la elusin de 08 gramos de extracto diclorometnico obtenido por radiacin ultrasnica, se muestra en el multicromatograma N01. unidas segn semejanza de sus perfiles.
8.1. Cromatografa en Capa Fina de las Fracciones El multicromatograma N02 muetra los perfiles de las 06 fracciones obtenidas como producto de la unin de su semejanza. De las fracciones resultantes; F8-13 muestra componentes apolares posiblemente esteres de cidos grasos y esteroles esterificados. F14-15 muestra los esteroles de la cual se procede a purificarlos por CCF a escala Preparativa. F16-18 se aprecia los esteroles y componente mostrado de color amarillo por el revelador. F19-29 muestra compuestos mltiples que no logra resolverse por los diferentes sistemas ensayados. F39-39 y F43-49 muestra cada uno componente diferente muy resueltos. 8.2. Purificacin de los Componentes por Cromatografa en Capa Fina a escala Preparativa De la fraccin F14-15, como producto de su purificacin por dos veces en CCF a escala Preparativa se obtiene esteroles de caracterstica blanco escamoso (peso), el cual se muestra el perfil cromatogrfico obtenido por HPLC. Las fracciones F39-39 y F43-49 fueron purificados por dos veces en CCF a escala Preparativa obtenindose en ambos casos sustancias de carcter semislido blanquecino y untuosos.
Multicromatograma N 01 : Cromatografa en Capa Fina de las 73 Fracciones Eluidas en la Columna Cromatogrfica Revelados con Anisaldehido-H2SO4.
Cromatogramas N 02 : Cromatografa en Capa Fina de las 06 Fracciones Unidas en la Columna Cromatogrfica Revelados con Anisaldehido-H2SO4
9. Resultado de la Cuantificacin del -Sitosterol Liquida de Alta Resolucin (HPLC) en Harina y Maca
por Cromatografa Comprimidos de
9.1. Condiciones Cromatogrficas Las condiciones cromatogrficas en gradiente resuelve el -Sitosterol de los dems componentes de la matriz, adems prepara la columna para la prxima inyeccin. El analito eluye aproximadamente entre 6.89-6.91 min. Los perfiles cromatogrficos en las muestras describe la rpida elusin de los componentes mas polares.
9.2. Linealidad y Sensibilidad La determinacin por HPLC del -Sitosterol resulta ser un mtodo lineal entre 01 y 231.800 ug segn los parmetros y cantidades estudiadas. Los coeficientes de correlacin de las tres curvas estudiadas son 0.9988, 0.9921y
0.9907.
Posee un limite de identificacin de 1 ug/mL.
9.2.1. Curva de Calibracin con estndar al 95% Los resultados de la dos curvas de calibracin realizada con el Sitosterol de potencia 95% se muestra a continuacin
Resultados de la 1ra Curva de 2-232 ug/ml de -sitosterol
Figura 01. Curva de Calibracin y resultados de 0.5-30 ug/ml de -sitosterol
Tabla 1. Datos de la 1ra Curva de Calibracin en HPLC del -sitosterol 95%

Puntos Concentracin N (ug/mL) rea de Pico Puntos Concentracin (ug/mL N rea de Pico
St St St St
0.5 1 2.5 5
0.494 0.988 2.470 4.940

r2 TR
1 1 1 1
No detectado 2489 5161 10441
St 7.5 St 10 St 30
7.410 9.880 29.640
1 1 1
15567
21972 60774
0.9988 6.88 min (0.0 %RSD) r = Coeficiente de Correlacin TR = Tiempo de Retencin N = numero de inyecciones
Resultados de 2da Curva de 2-232 ug/ml de -sitosterol
Figura 02. Curva de Calibracin y Resultados de 2-232 ug/ml de -sitosterol
Tabla 02. Datos de la 2ra Curva de Calibracin en HPLC del -sitosterol 95%. Determinado antes y despus de la 10 Horas.
Puntos Concentracin (ug/mL) Primera Medicin N Promedio rea % RSD N Segunda Medicin Promedio rea % RSD
St 1 St 2 St 3 St 4 St 5
002.318 027.816 069.540 092.720 231.800

r2 TR
2 2 2 2 2
4572.0 46675.0 120056.5 159417.5 390998.0
8.011 4.917 2.161 0.168 0.910
1 2 2 2 2
30014 67074 126920 182021 414588
10.884 1.133 3.542 1.325
0.9921 6.92 min (0.15 % RSD) r = Coeficiente de correlacin TR = Tiempo de retencin N = Numero de inyecciones
Figura 03. Multicromatograma de la 2da Curva de 2-232 ug/ml de -sitosterol
9.2.2. Curva de Calibracin con estndar 49% El resultado de la curva de calibracin realizado con el -sitosterol se detalla a continuacin.
Figura 04. Curva de Calibracin con estndar 49%
Tabla 03. Datos de la Curva de Calibracin en HPLC de las Soluciones Estndares III de -sitosterol
Puntos Concentracin(mg/mL) Medicin N Promedio rea Pico % RSD
St 1 St 2 St 3
r2 TR
0.13156 0.15382 0.20024
2 2 2
231780 268570 358170
1.452 2.069 2.681
0.9907 6.91 min (0.18 % RSD) r = Coeficiente de correlacin TR = Tiempo de retencin N = Numero de mediciones
Figura 05: Perfil Cromatogrfico por HPLC del Estndar -Sitosterol 40%.
9.3. Resultados del Mtodo de Preparacin de la Muestra Harina de
Maca
9.3.1. Purificacin en Fase Slida Los cartuchos acondicionados para la purificacin de los extractos obtenidos como producto de la extraccin diclorometnica, resulta ser eficiente al separar los componentes mas polares y los pigmentos oscuros por ser retenidos por la slice del cartucho. La muestra eluida con diclorometano del cartucho es eficiente expresado por la reproducibilidad en la extraccin de los esteroles, como los muestra todos los cromatogramas. 9.3.2. Extraccin Diclorometnica de la Muestra La extraccin de los esteroles libres presentes en la muestras empleando el diclorometano como solvente extractor y sometiendo a radiacin ultrasnica es reproducible, el cual es mostrado en los resultados de las tres diferentes muestras estudiadas. 9.3.3. Resultados de los estudios empleando de 2, 5 y 8gramos de Harina de Maca Las tablas del 04 al 06, muestran los resultados de las tres muestras estudiadas. El cromatrograma de La figura 06 muestra el analito de inters resuelto, su espectro ultravioleta UV, as como el resultado del arreglo de diodos.
Tabla 4. Resultado de la Determinacin de -sitosterol en Muestras de dos gramos de Harina de Maca NOMBRE Muestra-1 Muestra-2 Muestra-3
RESULTADO DSR TR
N 03 03 02
Promedio (gm/g) 0.179937 0.173511 0.171157
Promedio rea 7458.66 7192 7094.5
DSR rea 8.051% 2.305% 7.505%
17.49 gm/100g harina 2.599% 6.89 min (0.220% DSR) N = Numero de Mediciones TR = Tiempo de Retencin
Los resultados de los clculos con los dos estndares no muestran diferencia, lo cual demuestra su utilizacin como patrn o curva de calibracin en la cuantificacin del analito en las muestras
Tabla 5. Resultado de la Determinacin de -sitosterol en Muestras de cinco y ocho gramos de Harina de Maca utilizando estndar 95 %.
Nombre
02 extracciones (una muestra) 03 0.179887 158877.7 0.315%
N Promedio (gm/g) Promedio rea Pico DSR rea

RESULTADO
03 extracciones 02 extracciones (una muestra) Muestra 01 Muestra 02 02 03 03 0.128780 0.176926 0.154139 182931 0.942% 250943.7 1.695% 219532 1.082%
17.99 gm/100g 12.88 gm/100g
16.55 gm/100g 9.734% DSR
TR
6.91 min (0.087 % RSD) N = Numero de Mediciones TR = Tiempo de Retencin
Tabla 6. Resultado de la Determinacin de -sitosterol en Muestras de cinco y ocho gramos de Harina de Maca utilizando estndar 49 %.
Nombre
N Promedio (gm/g) Promedio rea Pico DSR rea

RESULTADO
05 g Harina Maca 02 extracciones (una muestra) 03 0.179326 158226.66 0.506%
08 g Harina Maca 03 extracciones 02 extracciones (una muestra) Muestra 01 Muestra 02 02 03 03 0.128469 182310 0.939% 0.176753 250453.33 0.656% 0.154015 219140 1.248%
17.93 mg/100g 12.85 mg/100g
16.54 mg/100g 9.722% DSR

N = Numero de Mediciones TR = Tiempo de Retencin
TR
6.91 min (0.087 % RSD)
Los resultados de los clculos de los cuadros 4, 5 y 6, expresa el analito como miligramos de -sitosterol por 100 gramos de harina de Maca. Muestra diferencia significativa entre las tres cantidades estudiadas, lo cual se expresa de al siguiente manera: en las cantidades mayores(08g) el mtodo de extraccin se hace menos preciso por la necesidad de realizar tres repetidas extracciones indica. Por otro lado la cantidad de analito presente, en cantidades menores de muestra(02g) es muy pequea por lo que el sistema croamatogrfico se hace menos preciso un su cuantificacin, mostrasdo por la RSD de rea de pico en las muestras 03 muestras de 02 gramos (ver tabal 04). El adicional secado con en corriente de aire y regenerado con fase mvil, despus de realizar extraccin y purificacin segn los mtodos descritos, muestra mejor resolucin y facilita la inyeccin de mayor cantidad de muestra al equipo. Esto es demostrado en el estandar 49%(ver figura 05) el cual muestra su perfil la mejor resolucin del los campesterol y dihidrobrasicasterol las cuales son isomeros.
Figura 06: Perfil Cromatogrfico del -sitosterol en HPLC en la Harina Maca
9.4. Resultados del Mtodo de Preparacin de la Muestra Tabletas
de Maca
Los resultados del estudio, donde se expresa la Desviacin Estndar Relativa (RSD%) tanto del mtodo de extraccin como del sistema deHPLC, Y del analito como miligramos de -sitosterol por tableta de Maca se concluye losiguiente: El proceso de extraccin y de purificacin en Fase Slida de muestras de Harina de Maca, repetido en las tabletas de maca muestra resulta ser aplicable segn los resultados calculados en la tabla 07. La desviacin estndar(5.7%) de las 02 muestras de 08 gramos estudiado, result estar dentro, pero al borde del criterio de aceptacin(RSD 6%) para productos naturales, esto se explicar, a mayor cantidad de muestra el mtodo de extraccin se hace menos preciso. Por otro lado, El sistema cromatogrfico muestra ser precisos para esta cantidad de analito presente en la muestra extrada, segn lo expresado las desviaciones estndares de las reas de pico en cada muestra, al resultar menor del criterio de aceptacin (menor de 2%). Por lo tanto se recomienda utilizar cantidades de 05 gramos en la extraccin y a la vez inyectar 15 uL de muestra al HPLC. El cromatrograma de la figura 06 muestra el analito de inters resuelto, su espectro ultravioleta UV, as como el resultado del arreglo de diodos. Los resultados no muestra diferencia con los dos estndares
estudiados, lo cual demuestra su empleo como patrn o en la curva de calibracin, para la cuantificacin del analito en las muestras.
Tabla 7. Resultado de la Determinacin de -sitosterol en Muestras de 8 gramos de Maca Tabletas utilizando estndar 95 % y 49%.
Nombre
08 gramos de Maca Tabletas(Extrado 03 veces) estndar 95 % estndar 49% Muestra 1 Muestra 2 Muestra 1 Muestra 2 03 03 03 03 0.115685 0.106710 0.115294 0.106300 192257 0.435% 177837.3 1.015% 191426.7 0.450% 176986.7 1.040%
N Promedio(mg/g) Promedio rea Pico DSR rea RESULTADO
0.111198 mg/TAB. 5.707
0.110797 mg/TAB. 5.740%

N = Numero de Mediciones TR = Tiempo de Retencin
DSR TR
6.91 min (0.087 % RSD)
La Figura 08 muestra los perfiles cromatogrficos obtenidos por HPLC de las muestras; harina y tableta, as como el estndar. El -sitosterol se encuentra resulto de las impurezas de la matriz del extracto, los cuales generalmente son mas polares en comparacin del analito. La pureza de pico se demuestra por el espectro Ultravioleta UV y el resultado del arreglo de diodos.
Figura N 07: Perfil Cromatogrfico de HPLC de Muestra Maca tabletas
Figura N 08: Perfiles Cromatogrficos de HPLC del Estndar -Sitosterol 49% y las Muestras de Harina y Tableta de Maca
9.5. Resultado de la Cromatografa en HPLC de los esteroles aislados
por Columna Cromatografca y Capa Fina Preparativa.
Los esteroles aislados por Cromatografa en columna y purificados en Capa Fina a escala Preparativa, contiene dos esteroles; el -sitosterol (73.38% rea) y campesterol(27.01% rea) con tiempos de retencin de 6.91 y 6.37 minutos respectivamente, conclusin llegada por los tiempos de retencin del estndar de -sitosterol 49%, la cual posee campesterol y dihidrobrassicaterol, los cuales se identifican por sus reas de pico de los cromatogramas y la composicin porcentual sealado en su protocolo de anlisis. El cromatograma 09, se muestra la pureza de pico de los dos esteroles segn el arreglo de diodos.
Figura N 09 : Perfil Cromatografico en HPLC de los dos Esteroles Aislados y purificados por CC y CCFP. Segn sus tamaos de reas -sitosterol(mayor) y campesterol(menor).
CONCLUSIONES
1.
El Mtodo de anlisis Desarrollado para La Identificacin de los Isotiocianatos en la Maca Fresca por Cromatografa de Capa fina resulta ser eficiente, especfica, reproducible y econmica.
2.
La identificacin de los Glucosinoaltos en forma de sus desdoblados Isotiocianatos en la maca fresca, resulta ser una ruta superior para el anlisis de estos metabolitos; al ser rpida y econmica a diferencia de los mtodos clsicos que derivatizan a tioureas o el uso de estndares de Glucosiunolatos que no son econmicos.
3.
El Mtodo de anlisis Desarrollado para La Identificacin de los Esteroles en la Maca por Cromatografa de Capa fina resulta ser eficiente, especfica, reproducible y econmica.
4. 5.
La presencia de esteroles en las diferentes muestras es marcada. El mtodo de extraccin diclorometnica y sometimiento al ultrasonido de las muestras de maca resulta ser eficiente y reproducible en la cuantificacin del -sitosterol.
6.
La purificacin de los esteroles en Fase Slida, segn lo acondicionado con el cartucho de slice, resulta ser eficiente para extraer los esteroles de las impurezas de la matriz.
7.
La Cromatografa Liquida de alta Eficacia HPLC
rene los requisitos
analticos de linealidad, sensibilidad y exactitud, por lo cual sus resultados producidos para el Anlisis del -sitosterol son confiables. 8. En el anlisis del -sitosterol en diferentes productos de maca, se obtuvieron las siguientes cantidades: o o 0.11 mg por tableta. 17.99 mg por 100 g de harina de maca.
RECOMENDACIONES
1. Realizar un estudio comparativo del contenido de esteroles en diferentes muestras provenientes de las diferentes altitudes y latitudes del Per. 2. Realizar estudios orientados a la identificacin de los componentes
nitrogenados que dan positivos en reacciones de alcaloides en la maca. 3. Continuar con la identificacin de los metabolitos secundarios y los estudios biolgicos para determinar los principios activos de la maca
BIBLIOGRAFA
1 2 3
5 6 7 8
9 10 11
12 13 14
15 16 17 18 19
LEN, T., 1964. The maca(Lepidium meyenii Walp.) a little known food plant from Peru. Economic Botany 18, 122-127. REA, J. (1992). Races andinas: Maca, pages 163-166 in Hernndez Bermejo and J. E. Len. Eds.. cultivos marginados, otra perspectiva de 1492. FAO. Rome. Italy. BO LIN ZHENG ET. AL.(2000) Effect of a lipidic extract from Lepidium meyenii on sexual behavior in mice and rats. Shenyang Medical College, Shenyang Liaoning College of Traditional Chinese Medicine, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing. Urology 55(4). CICERO, A. F. G. ET AL(2001).Lepidium meyenii Walp. improves sexual behavior in male rats independently from its action on spontaneous locomotor activity. Journal of Ethnopharmacology.75,225-229. CICERO, A. F. G. ET AL(2002).Hexanic Maca extract improves rat sexual performance more effectively than methanolic and chloroformic Maca extracts. Andrology 34. 177-179. WALKER, M. (1998).Effects of peruvian maca on hormonal functions in Towsend letter for doctors and patients (USA). ISSN 1059.N 184.18-23. GONZALES F. , G. y Col.(2001). Lepidium meyenii maca increased semen parameters in adult men. Asian Journal of Andrology. 75.225-229. CANALES, M. y Col. (2000).Evaluacin nutricional de Lepidium meyenii Wap. maca en ratones albinos y su descendencia. UPCH. Lima-Per. Archivos Latinoamericanos de Nutricin. Vol. 50 N02.126-133. DINI A., et al.. (1994) Chemical composition of Lepidium meyenii, in Food Chemistry 49, London, UK. TORRES V. R. y Col.(1986). Estudios de los componentes de la maca(Lepidium meyenii Walp.).Anales Cientficos-Universidad Nacional Agraria la Molina. 26(1-2):249-259. TIMOTHY A. JOHNS (1980). Ethnobotany and Phytochemistry of Tropaleolum tuberosum and Lepidium meyenii from Andes South America. Ph. D. Thesis. Department of Botany, University of British Columbia. GENYI LI, ET AL.(2001). Glucosinolate Contents in Maca (Lepidium peruvianum Chacn) Seeds, Sprouts, Mature Plants and Several Derived Commercial Products. Economic Botany 55(2). 255-262. MUHAMMAD ILIAS ET AL.(2002). Constituents of Lepidium meyenii maca. Phytochemistry 59. M. GREGORIA YLLESCA (1994) . Estudio Qumico y Fitoqumico comparativo de 3 ecotipos de Lepidium meyenii Walp Maca procedente de Carhuamayo (Junn). Tesis de Farmacia y Bioqumica, UNMSM, Lima-Per. SANDOVALA MANUEL (2001). Antioxidant activity of the Cruciferous vegetable Maca (Lepidium meyenii). Food chemistry MARSH, R. E. and WASER, J.(1970).Refinement of the crystal structure of sinigrin.Acta Crystallographica Section B 26,1030-1037. FAHEY, JET W.,(2001), The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyante among plants. Phytochenistry 56, 5-51. CONOWAY, C. CLIFFORD,(2000). Disposition of Glucosinoaltes and sulforaphane in humans after ingestion of steamed and fresh Broccoli. Nutrition and Cancer,38(2), 168-178. KJAE R, A., THOMSEN, H., (1963). Isothiocyanate-producing glucosides in species of Capparidaceae. Phytochemistry 2, 29-32.
20 Kirkland, D.F., et al. (1971). Detection of glucosinolates and myrosinase in plant tissue cultures. Lloydia 34, 195-198. 21 GIL, V., MACLEOD, A.J., (1980). The effects of pH on glucosinoalte degradation by a thioglucoside glucohydrolase preparation. Phytochemistry 19, 2547-2551. 22 VERMOREL, M. et al.(1988). Antinutritional effects on the rapesseds meals, Darmor and Jet Neuf, and progoitrin together with myrosinase in the growing rat. Journal of the Science of Food and Agricultur. 44,321-334. 23 SHIKYTA, M. et al.(1999). An unusual case of uncompetitive activation by ascorbic acid: purification and kinetic properties of a myrosinase from Raphanus stivus seedlings. Biochemical Journal 341,725-732. 24 WUARTON, BEN et al.(2001). Glucosinolate content and isotiocyanate evolution two measures of the biofumigation potencial of plant. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49,5244-5250. 25 GIL, VICTOR et al.(1980). Benzylglucosinolate degradatin in Lepidium sativum: effects of plant age and time of autolisis. Phytochenistry 49, 1365-1368. 26 COLE, ROSEMARY A.(1976).Isotiocyanates, nitriles and thioyianates as products of autolysis of glucosinolates in Cruciferae. Phytochenistry 15, 759-762. 27 TANG, C.S., (1973). Localization of benzyl glucosinolate and thioglucosidase in Carica papaya fruit. Phytochemistry 12, 769-773. 28 KJAER, A. et al.(1979). Isothiocyanates in myrosinase-treated seed extracts of Moringa peregrina. Phytochenistry 18, 1485-1487. 29 GETAHUN, S. M.(1999). Conversion of glucosinolates to isothiocyanates in humans after ingestion of cooked watercrees. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8(5), 447-451. 30 NATHAN, V. M., et al.(2001). Preparative HPLC method for the purification of sulforaphane and sulforaphane nitrile from Brassica oleracea. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49.1867-1872. 31 GRIFFITHS, D. WYNE, et al.(2001). Identification of glucosinolate on the leaf surface of plants from the Cruciferae and other closely related species. Phytochenistry 57, 693-700. 32 PALMIERI, S., et al.(1986). Myrosinase from Sinapis alba L.: A New Method of purification for glucosinolate analyses. Journal of Agricultural and Food Chemistry 34, 138-140. 33 SUGIE, S. A.,et al.(1992).Inhibitory effects of benzyl-thiocyanate (BTC) and bezyl-isothiocyanate(BITC) on diethylnitrosamine(DEN)-induced hepatocarcinogenesis in rats. Proceedings of the American Association for Cancer Research 33:160. 34 MORSE, M. A., et al.(1989).Effects of aromatic isothiocyanates on tumorigenicity, O6-methylguanine formation, and metabolism of the tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl-1butanone in A/J mouse lung. Cancer Res. 49, 2894-2897. 35 ZHANG, Y., and TALALAY, p. (1994). Anticarcinogenic activities of organic isothiocyanates: Chemistry and mechanisms. Cancer Res. 54, 1976-1986. 36 WATTENBERG, L. W.(1977). Inhibition of carcinogenic affects of polycyclic-hydrocarbons by benzyl isothiocyanate and related compounds. J. Natl. Cancer Inst. 58, 397-398. 37 ZHANG, Y. et al., (1996). Quantitative determination of isothiocyanates, dithiocarbamates, carbon disulfide, and related thiocarbonyl compounds by cyclocondensation with 1,2-benzenedithiol. Analytical Biochemistry 239, 160-167. 38 PRESTERA, T., et al.,(1996). Comprehensive chromatographic and spectroscopic methods for the separation and identification of intact glucosinolates. Analytical Biochemistry 239 39 TALALAY, P., et al., (1995). Chemoprotection against cancer by phase 2 enzyme induction. Toxicology Letters 82 (83), 173-179.
40 GAMET-PAYRASTRE, L., et al., ( 1998). Selective cytostatic and cytotoxic efects of gluco-sinolates hydrolysis products on human colon cancer cells in vitro. Anticancer Drugs 9, 41 GAMET-PAYRASTRE, L., et al., (2000). Sulforaphane, a naturally occurring isothio-cyanate, induces cell cycle arrest and apoptosis in HT29 human colon cancer cells. Cancer Research 60, 1426-1433. 42 HECHT, S.S., (1999). Chemoprevention of cancer by isothiocyanates, modifiers of carcinogen metabolism. Journal of Nutrition 129, 768S-774S. 43 PRESTERA, T., et al.,(1999). The electrophile counterattack response: protection against neoplasia and toxicity. Advances in Enzyme Regulation 33, 281296. 44 FAHEY, J.W., TALALAY, P.,(1999). Antioxidant functions of sulforaphane: a potent inducer of Phase 2 detoxication enzymes. Food and Chemical Toxicology 37, 973-979. 45 NASTRUZZI, C., et al., (1996). In vitro cytotoxic activity of some glucosinolate-derived products generated by myrosinase hydrolysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44, 1014-1021. 46 SYBIL P. PARKER(1991). McGraw-HILL Dictionary of Chemical Terms. Tomo I y II 47 LIEBES. L.,(2001). High-performance liquid chromatography-based determination of total isothiocyanate levels in human plasma: Application to studies whit 2-phenethyl isothiocyanate. Analytical Biochemistry 291, 279-289. 48 A. KJAER , A. SCHUSTER (1968). Glucosinolates in Lepidium bonaerense L. Phytochemistry 7: 1663-1666. 49 HARBORNE J. B. (1973). Phytochemical Methods a Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. London Chapman and Hall. 50 BOLLIGER H. K. ET AL.(1965). Thin Layer Chromatography a Laboratory Handbook. Edited by Egon Stahl. 51 CHOONG, YOUK-MENG, et al.(1999). A rapid gas chromatographic method for direct determination of free sterols in animal and vegetable fast and oils. Journal of Food and Drug Analysis 7(4), 279-290. 52 PHILLIPS. KATHERINE M., et al.(1999). Precise quantitative determination of phytosterols, stanoles, and cholesterol metabolites in human serum by capillary gas-liquid chromatography. Journal of Chromatography B 732, 17-29. 53 RODRIGUEZ R. J. Et al.(1982). Application of High-Performance Liquid Chromatographic separation of free sterols to the screening of yeast sterol mutants. Analytical Biochemistry 119, 200-2004. 54 SINSABAUGH R. L. Et al. (1997). A -sitosterol assay for fine-root mass in soils. Soil Biol. Biochem. 29, 1, 39-44. 55 SUX, S. H., et al. (1988). Comparison of the chromatographic properties of sterols, select additional steroids and triterpenoids: Gravity-flow column liquid chromatography, thin-layer chromatography, gas liquid chromatography, and high performance liquid chromatography. Journal Chromatography 452 56 NAIR, P., et al. (1984). Diet, nutrition intake, and metabolism in populations at high and low risk for colon cancer. Dietary cholesterol, beta-sitosterol, and stigmasterol. Am. J. Clin. Nutr. 40:927-930. 57 SUPELCO (1999). Productos cromatogrficos para anlisis y purificacin. Catalogo. 58 WATES (2001-2002). Chromatography columns and Supplies Catalog. 59 MATTSON, F. et al. (1982). Optimizing the effect of plant sterols on cholesterol absorption in man. Am. J. Clin. Nutr. 35:697-700. 60 KLIPPEL, K.F.(1997)beta-sitosterol (phytosterol) and the treatment of benign prostatic hyperplasia; British Journal of Urology 90 (3), 427-32. 61 GYLING H. ET AL.(1999)Cholesterol reduction by different plant stanol mixtures and with variable fat intake; Metabolism48:5, 575-80. 62 ALBRECHT(1996)Beta-sitosterol and beta-sitosterol glucoside stimulate human peripheral blood lymphocyte proliferation. International Journal of Immunopharmacology, 18 (12)
63 COHEN, B.I. et al.(1974). The effects of dietary bile acids and B-sitosterol upon formation of coprostanol and 7-dehydroxylation of bile acids in rats. Lipids 9:1027-29. 64 MEILLES, M.J. et al. (1977). Phytosterols and cholesterol in malignant and benign breast tumors. Cancer Research 27:3034. 65 RAICHT, R.F. et al. (1980). Protective effect of plant sterols against chemically induced colon tumors in rats. Cancer Research 40:403-5. 66 HEINEMANN, T., et al. (1993). Comparison of intestinal absorption of cholesterol with different plant sterols in man. Eur. J. Clin. Invest. 23: 827-831. 67 PEGEL KARL H.(1997) The importance of sitosterol and sitosterolin in human and animal nutrition. South African Journal of Science Vol. 93. 68 TILVIS R.S. AND MIETTINEN T.A.(1986).Serum plant sterols and their relation to cholesterol absorption.Am.J.clin.Nutr.43,92-97. 69 DYER R.G., et al.(1995). Simultaneous measurement of phytosterols (campesterol and -sitosterol) and 7-ketocholesterol in human lipoproteins by capillary column gas chromatography.J.Chrom.B.663 70 BOUIC P.J.D., et al.,(1996). Beta-sitosterol and beta-sitosterol glucoside stimulate human peripheral blood lymphocyte proliferation: Implications for their use as immunomodulatory vitamin combination. Int. J. Immunopharmac.18,693-700. 71 GUPTA M.B. et al.(1980).Anti-inflammatory and antipyretic activities of -sitosterol. Plant Medica 339,157-163. 72 CARBIN, B.E. et al.(1990). Treatment of benign prostatic hyperplasia with phytosterols. B. J. Urol ,66 639-641. 73 HOLTZ, VON et al. (1998). Beta-Sitosterol activates the sphingomyelin cycle and induces apoptosis in LNCaP human prostate cancer cells. Nutr. Cancer 32(1):8-12. 74 WAGNER H. ET AL.(1984).Plant Drug Analysis a Thin Layer Chromatography Atlas. 75 Rondina, R. y Coussio, J. ( 1960 ). Revista de Investigacin Agropecuarias, INTA , Buenos Aires, Argenti,na, 6, 353 76 Domngues X. A. (1973) . Mtodos de Investigacin Fitoqumica. Editorial Limusa, Mxico. 77 BERTELLI, DAVIDE et al., (1998) Separation by Solid Phase Extraction and Quantification by Phase HPLC of Sulforaphane in Broccoli. Food Chemistry, vol. 63, N03, 417 - 421. 78 SHIROYA, TSUGIO, (1963) Metabolism of Raffinose in Cotton Seeds. Phytochemistry 2 79 Rolf Gmelin, Kjaer, (1969) Glucosinolates in the Caricaceae. Phytochemistry 9, 591-593. 80 Kore, Gayland, (1993) Purification of the Methylsulfinyl alkyl Glucosinolato hydrolysis products : 1isothiocyanato-3 (methylsulfinyl)propane, 1-Isothiocyanato-3-(methyl-sulfinyl)butane, 4-(methylsulfinyl)butanenitrile, and 5-(methyl-sulfinyl)pentane-nitrile from broccoli Lesquerella fendleri. Journal of Agricultural and food chemistry 41, 89-95. 81 BAISTED, D. J.(1969) Sterols of Euphorbia peplus: The fate of 28-isofucosterol in Phytosterol Biosynthesis. Phytochemistry 8 , 1697-1703. 82 DOS SANTOS, PIERRE A.(1999) Esterides e cumarina em calos de Mikania glomerata Sprengel. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences 35(2). 83 MASAOUD MOHAMED (1995) Sterols and Triterpenoids from Dracaena Cinnabari. Phitochemistry 38(3), 795-796. 84 DO NASCIMIENTO, ANDREA M.(2001) Kaurene Diterpenes and Other Constituents from Mikania Stipulacea(M. Vahl) Willd. J. Braz. Che m. Soc. 12(4), 552-555. 85 HOSTEEEMANN K. et al. (1998) Preparative Chromatography Techniques: Application in Natural Product Isolation. Springer-Verag Berlin Heidelberg.

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UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

Bach. Gutirrez Parvina, Jos Elas Bach. Montao Fuentes, Katyusca

A nuestros padres, por el abnegado apoyo incondicional

1. Lepidium meyenii Walp (maca).

1.2. Estudios realizados en Animales y Humanos.

diferencia de los componentes es insignificativa en los diferentes colores de races

. La maca fresca contiene 80% de

contenido de azcares reductores en la maca seca es alto (6.4 8.0%),

1.3.2. De los Componentes Fitoqumicos.

La maca fresca contiene 1% (peso/peso) de estos componentes El isotiocianato determinados en

expresados como bencil-glucosinolato.

la maca seca por cromatografa gaseosa es el bencil isotiocianato. (6)

0.57 (2.2) 0.09 (1.8) 0.05 (1.2)

1.61 (6.3) 0.27 (5.8) 0.49 (12.1)

16.94 (66.4) 3.20 (71.0) 2.70 (66.7)

2. Estudios sobre los Glucosinolatos e Isotiocianatos

no especficos con respecto al cadena (R) del aglicn, por

inflorescencias comestibles de las

Brassica olearacea (col, coliflor y brcoli), es un

3. Estudios sobre los Fitosteroles

3.3. Actividades biolgicas de los fitosteroles

Los estudios in vitro, animales, y humanos han

es una enfermedad inflamatoria

Prosttica (BPH): Estudios clnicos fueron conducidos en

3.4. Metodologa de Anlisis

libres son slidos cristalinos incoloros, solubles en

1. 0btencin de las Muestras

2. Preparacin de los Extractos

Extraccin en Gradiente(1): 50 g de cada una de las muestras se

o Procedimiento : Se pesa cuidadosamente 50 g de muestra y se coloca

Esquema N 01 : Extraccin por Reflujo

Extraccin por Soxlet o

Extraccin en Gradiente(1) : 25, 50 y 100 g de cada una de las 03

Procedimiento : Se colocan la muestra en cartucho de papel de filtro y

Extraccin por Ultrasonido o

Extraccin en Gradiente : 01 Kg harina de maca obtenido por la

Equipos: Ultrasonido BRANSON 8510, Rotavapor BChi tipo B-461.

Procedimiento : En una botella mbar con tapa hermtica de 04 L

Muestra : Los 12 extractos obtenidos en gradiente por reflujo, fueron

Procedimiento : Se tom una porcin del 50% de peso de cada una de

fracciones, segn el esquema compuestos.

reacciones especificas para determinar la posible presencia de algunos

Esquema 04: Obtencin de las Fracciones

C por 10 minutos hasta aparicin de

. Luego las fracciones

fueron unidas segn los resultados desarrollados en CCF, rotavaporados y pesados. o

160 120 160 100 120 100 120

1088.00 456.80 1120.45 1052.00 446.5 320.90

Pigmentos oscuros, aroma a maca

Cromatografa de Capa Fina a escala Preparativa (CCFP). Ver Tabla n3.

del -Sitosterol Resolucin

por Cromatografa en Harina y

5.1. Condiciones Cromatogrficas

- Columna - Fase Movil - Modo de Corrida

: RP-8 250 x 4 mm : Acetonitrilo : MeOH (99:1) : Gradiente

- Programa de Corrida del Gradiente :

0.0 10.0 15.0 16.0 20.0

0.0 1.0 10.0 0.0 0.0

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

100.0 99.0 90.0 100.0 100.0

5.2. Determinacin de la Linealidad y Sensibilidad

Curva de 2-232 ug/ml de -sitosterol