Prelaboratorio 1. Cul es la diferencia entre cultivo primario y lneas celulares?

Cultivo primario Se establece a partir de un tejido u rgano, y por sta razn conservan la morfologa de donde fueron extradas. En el cultivo las clulas crecen limitadamente, casi no existe tasa reproductiva y tienden a decrecer. Debido a que mantienen gran parecido con las clulas que las originaron, tienen mejor funcionalidad en ambientes ms naturales. Lnea celular Es originario de una clula proveniente de un cultivo primario Se mantiene por un periodo de tiempo limitado en el cultivo, pero sus clulas pueden reproducirse. En una lnea celular continua sus clulas son mantenidas por tiempo ilimitado, es decir son inmortales.

2. Las dos principales ventajas cuando se utilizan los cultivos celulares son: el control del medio fisicoqumico, a saber, pH, temperatura, presin osmtica, tensin de oxgeno (O2) y gas carbnico (CO2) de las clulas cultivadas y, las condiciones fisiolgicas que deben ser constantes. El control del medio fisicoqumico y de las condiciones fisiolgicas permiten el cultivo de clulas especficas. Los cultivos de clulas permiten someter a las mismas a una baja y definida concentracin de reactivos asegurando un acceso directo en ellas, lo que ahorra en un 90% lo requerido para la inyeccin del reactivo in vivo, su excrecin y su posterior distribucin a los tejidos en estudio. Aunque los estudios in vivo resulten ms econmicos que los in vitro son descartados porque el uso de la experimentacin en animales resulta cuestionado en aspectos legales, morales y ticos (Freshney, 1995). 3. La mayor parte de las clulas que se mantienen en cultivo proceden de disgregacin tisular o de tumores formados por clulas adheridas y mantienen esa caracterstica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse. Los cultivos en suspensin suelen coincidir con los de aquellas clulas que in vivo son circulantes, en general clulas sanguneas. El gran inters que tiene el cultivo de clulas sanguneas (linfocitos) ha extendido notablemente la caracterizacin de los cultivos en suspensin. El cultivo de clulas en suspensin tiene algunas ventajas: mayor facilidad de manipulacin y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separacin del sustrato mediante por ej. tripsinizacin, posibilidad de cultivo en mayor escala pues slo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases pero no de la superficie del recipiente, etc... y algunas desventajas: son cultivos homogneos en los que se pierden las interacciones. 4. a. Suero fetal bovino. El suero fetal bovino (SFB), es un producto de gran importancia en el campo de la biotecnologa. Se trata de un subproducto extrado de la sangre de los fetos de vacas en gestacin. El SBF, es un componente propio de los cultivos celulares, aunque tambin se presentan otros tipos de suero. Es comnmente utilizado en investigaciones de toxicologa, cncer, produccin de vacunas, clulas madre, y produccin de protenas como el Interfern, los anticuerpos monoclonales y el factor de coagulacin VIII. Es de amplio uso en los cultivos in vitro y en la produccin de clulas animales. A pesar de que no se conocen muy bien sus componentes y las interacciones entre estos, se pueden nombrar los principales componentes, cuya funcin se rescata en los cultivos: Protenas necesarias para la adherencia de las clulas a la matriz de soporte. Enzimas y Hormonas. Factores especficos de promocin del desarrollo celular. Factores de inhibicin del desarrollo celular. 4.d.Glutamina(aminocido): La glutamina (abreviada Gln o Q) es uno de los 20 aminocidos ms comunes empleados en la codificacin del cdigo gentico; es una cadena lateral de una amida del cido glutmico, formada mediante el reemplazo del hidroxilo del cido glutmico con un grupo funcional amina. Su funcin es sintetizar protenas, aumentar el nitrgeno de la sangre, aumentar el ATP (Adenosina Trifosfato) y mejora el sistema inmune. Es necesario suplementar el medio basal con los aminocidos esenciales. Asimismo se suplementa con otros aminocidos, pues los requerimientos pueden variar de una clula a otra. Un suplemento comn es el de glutamina, a 2 mM final, aunque hay algunas lneas celulares pueden usar el glutamato.

Hormonas no proteicas. Lpidos esenciales para el desarrollo, diferenciacin y multiplicacin celular. Minerales. Metabolitos y nutrientes. Substancias con capacidad de tampn (buffer). Inhibidores de proteasas. Ligantes. Inactivantes de materiales txicos. Crio preservacin. La conservacin de clulas vivas, mediante la congelacin, la tcnica se usa principalmente para almacenar vulos espermatozoides y sangre de seres humanos para usarlos posteriormente. Las clulas que se quieren conservar, se sumergen primero en un lquido, habitualmente glicerol. Este penetra y rodea las clulas de forma que las protege contra le efecto destructor normal de la congelacin. Se reduce la temperatura a medida que la concentracin del lquido protector aumenta, hasta que se alcanza la temperatura final de 180 c A esas temperaturas, cualquier actividad biolgica, incluidas las reacciones bioqumicas que produciran la muerte de una clula, quedan efectivamente detenidas De las tcnicas de crio preservacin existentes, cul de ellas es la ms aconsejable ?. Existen mtodos de congelacin LENTA y RAPIDA. Para aplicar los mtodos lentos se requiere un congelador programable mediante un programa informtico, capaz de realizar un descenso lento, gradual y muy controlado de la temperatura, hasta alcanzar la deseada de acuerdo al protocolo de ejecucin (-30 centgrados - 80 centgrados comnmente). Los crioprotectores ms utilizados en estos casos son el dimetilsulfxido (DMSO), propanendiol (PROH) y el glicerol. Los mtodos rpidos incluyen la vitrificacin y la congelacin ultrarrpida: * la tcnica de vitrificacin consiste bsicamente en la utilizacin de una solucin altamente viscosa que, al ser enfriada, aumenta su viscosidad hasta alcanzar la consistencia de un vidrio; posee la gran ventaja de que no se producen daos celulares causados por la formacin de cristales de hielo extracelulares. De todas las maneras, no hay que olvidar que las altas concentraciones de crioprotectores utilizados en la vitrificacin son txicas para los embriones y por tanto se desaconseja su utilizacin en congelacin de embriones humanos. * los mtodos que utilizan bajas concentraciones de crioprotectores son los denominados ultrarpidos y normalmente las pajuelas conteiner de los embriones a crio preservar, son sumergidas directamente en Nitrgeno lquido partiendo de 0 grados centgrados en una primera fase en la que se vaporizan con Nitrgeno lquido ( sus vapores) antes de la inmersin. Cultivo Para linfocitos humanos se requiere un periodo de incubacin de 72 horas. Colcemid Es un inhibidor mittico, anlogo sinttico de la colchicina y sumamente activo. Se aade tras el cultivo celular para inhibir la formacin de uso acromtico, divisin del centrmero, inhibir la mitosis y detener el ciclo celular detenido en metafase por degradacin de los microtbulos esenciales para el correcto proceso mittico. Fitohemaglutinina (PHA) (mitgeno) La Fitohemaglutinina (conocida como PHA por la abreviacin de Phytohaemagglutinin) es una lectina que corresponde al grupo de protenas que reconocen carbohidratos y se caracterizan por su habilidad para combinarse con receptores de membrana de carbohidratos y formadas estructuralmente por un dominio tipo lectina y otro globular (reconoce a carbohidratos). Es reconocida por su capacidad para aglutinar eritrocitos y leucocitos y estimular inespecficamente la proliferacin de clulas T siendo esta caracterstica mitognica lo que le da su principal aplicacin. Su funcin es participar como factor de crecimiento en el medio de cultivo.

5) Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con slo los aminocidos esenciales. Se necesita siempre la suplementacin con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratn y clulas HeLa. Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso ms corriente, contiene ms aminocidos y en mayor concentracin que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adicin de suero (10%). RPMI 1640. Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares leucmicas en suspensin. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados. Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulacin albmina bovina, transferrina, selenito, et... Es muy til para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. Tambin sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.

Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de lneas celulares humanas, debe ser suplementado con protenas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es til para el cultivo de clulas amniticas. 6) LA BROMODEUXIRIDINA (BrdU) se usa con el fin de detectar la proliferacin celular en los cultivos.
Recuperado de:
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