Sunteți pe pagina 1din 113

BIOCHIMIE MEDICAL I FARMACEUTIC APLICAII PRACTICE PARTEA II

CUPRINS I. Analiza urinii.....................................................................................4 I.1. Aspecte generale....................................................................4 I.2. Aciditatea urinar...................................................................9 I.3. Dozarea constituenilor normali urinari...............................12 I.3.1. Electroliii urinari...................................................12 I.3.2. Creatina i creatinina..............................................15 I.4. Determinarea componenilor patologici urinari...................19 I.4.1. Reacii de evideniere a glucidelor urinare.............19 I.4.2. Reacii de identificare a proteinele urinare............22 I.4.3. Depistarea puroiului...............................................24 I.4.4. Identificarea corpilor cetonici................................25 I.4.5. Identificarea acizilor biliari i pigmenilor biliari..26 I.4.6. Identificarea sngelui.............................................28 I.5. Sedimentul urinar.................................................................30 II. Analiza sngelui.................................36 II.1. Aspecte generale................................................................36 II.2. pH-ul sangvin............................................................38 II.3. Compui minerali n plasm...........................................47 II.3.1. Dozarea Na, K...........................................................47 II.3.2. Dozarea Ca................................................................50 II.3.3. Dozarea Mg...............................................................50 II.3.4. Dozarea Cl.................................................................52 II.4. Osmolaritatea plasmei........................................................56 II.5. Dozarea glucozei................................................................59 II.6. Dozarea lipidelor serice......................................................63 II.7. Dozarea colesterolului plasmatic........................................66 II.8. Dozarea ureei serice ...........................................................68 II.9. Dozarea acidului uric..........................................................70 II.10. Dozarea creatinei i creatininei.........................................72 II.11. Dozarea proteinelor totale din ser.....................................74 II.12. Dozarea hemoglobinei n snge........................................77 II.13. Dozarea bilirubunei serice................................................78 III. Analiza biochimic a hormonilor........82

IV. Analiza biochimic a sucului gastric...........................................87 IV.1. Aspecte generale...............................................................87 IV.2. Dozarea aciditii sucului gastric......................................88 IV.3. Determinarea sngelui din sucul gastric.....................89 V. Analiza biochimic a lichidului cefalorahidian...........................90 V.1. Aspecte generale........................................................90 V.2. Identificarea proteinelor.................................................93 V.3. Identificarea glucidelor .....................................94 V.4. Dozarea clorurilor..............................................................95 VI. Analiza biochimic a lichidelor patologice de puncie..............96 VII. Analiza biochimic a salivei.......................99 VII.1. Aspecte generale..............................99 VII.2. Determinarea amilazei salivare.........................102 VII.3. Dozarea ureei salivare.......................................105 VII.4. Dozarea amoniacului salivar.........................................107 VII.5. Determinarea activitii fosfatazei acide salivare..........108 VII.6. Determinarea activitii fosfatazei alcaline salivare......110 VII.7. Dozarea colorimetric a fosfatului anorganic salivar112 Bibliografie........114

I. ANALIZA BIOCHIMIC A URINII


I.1. ASPECTE GENERALE Urina este un lichid biologic de excreie cu o compoziie complex: apa, sruri minerale, substane organice, etc. n condiii fiziologice proprietile fizico-chimice i compoziia urinei variaz n funcie de cantitatea i felul alimentaiei. Examenul sumar de urin bazat pe investigaii calitative se practic n prima emisie de urin, de diminea, aceasta fiind mai concentrat. Investigaiile cantitative ale componentelor patologice detectate n examenul sumar, se practic din fraciuni de urin preluate din cantitatea colectat n 24 de ore sau din emisiuni separate de la anumite intervale din zi, pentru urmrirea debitului fracionat al componentului investigat sau pentru a detecta ritmul circadian al eliminrii acestuia. n situaii clinice speciale pot fi dozate la cerere, n urina de 24 de ore: cloruri, uree, ioni de calciu, fosfor anorganic, porfirine, hormoni. Pentru examenele practicate n urina de 24 de ore, recoltarea se face n modul urmtor: - bolnavul urineaz dimineaa; - aceast urin se arunc; - n tot timpul zilei i nopii se colecteaz urina ntr-unul sau mai multe vase de sticl. - a doua zi dimineaa se recolteaz prima emisiune de urin ntr-un vas separat; acesta servete pentru executarea examenului sumar i n special pentru o corect investigare a sedimentului organizat. Examenul sedimentului se practic numai n urinile proaspete. Examenul de laborator al urinei presupune : - examen macroscopic - examen microscopic - examen fizico-chimic - examen citologic. n cadrul analizelor de laborator efectuate pe urin se vor urmri investigaiile cerute n cadrul examenului sumar de urin (examen macroscopic, examen microscopic si cercetarea calitativ a unor compui care apar n urina n condiii patologice ). Valoarea cantitativ a anumitor componeni anorganici sau organici este descris n acest capitol n

continuare. Pentru dozarea acestora se utilizeaz urina din 24 de ore, datorit faptului c apar variaii ale unor constituieni n funcie de ritmul nicteremal. Pentru determinrile cantitative se recolteaz o proba de urin din emisiile reunite. Conservarea urinei se face n prezena unor substane care nu trebuie s modifice compoziia ei chimic (timol 10% n izopropanol utilizat n cazul determinrii electroliilor, aminoacizilor, proteinelor, creatininei, etc.): HCl 10N n cazul determinrii catecolaminelor si substanelor steroidice; formaldehida 40% pentru conservarea elementelor morfologice ale sedimentului). Pentru examenul bacteriologic nu se utilizeaz conservani, n acest caz recoltarea se face steril i n vase sterile. Identificarea glucidelor se face pe urina proaspt recoltat, la cel puin 40 de ore dup ce subiectului supus analizei nu i s-a mai administrat nici un medicament. Volumul urinii n condiii normale diureza la brbai este de 1500 ml (1200-1800 ml), iar la femei de 1200 ml (1000 1400 ml) n 24 de ore. n condiii fiziologice volumul de urin din 24 de ore depinde de: ingestia de lichide, alimentaie, temperatur, greutatea corporal, factori emoionali. Modificrile patologice ale diurezei se refer la: volumul de urin eliminat n 24 de ore: poliurie, oligurie, anurie i ritmul eliminrii: nicturie, opiurie. Poliuria (peste 1800 ml/24 ore) Poliuria se instaleaz datorit urmtoarelor mecanisme: -creterea filtratului glomerular (poliurie glomerular) -reducerea reabsoriei obligatorii proximale (poliurie tubular) -reducerea reabsoriei facultative la nivelul tubului distal si colector (poliuria distal) Creterea cantitativ a filtratului glomerular poate fi: -fiziologic: - ingestii crescute de lichide, - frig, - emoii (prin eliminri crescute de adrenalin), - administrri de diuretice ; -patologic: - n hipertiroidie - n caz de insuficien cardiac dup administrarea de

digital - dup terminarea crizelor dureroase n angina pectoral, - dup tahicardiile paroxistice, - colica renal, - crizele comiiale datorit unor dereglri neurovegetative - cauze extrarenale - se refer la bolile care n cursul evoluiei lor rein apa, eliminat apoi spontan dupa administrarea de diuretice, cum sunt: edemele, insuficiena cardiac, boli infecioase,etc. Reducerea reabsoriei proximale de ap se datoreaz prezenei n lumenul tubilor a unui exces de subtane osmotic active (glucoz, uree) sau datorit unor leziuni tubulare. n acest caz urina nu este niciodat hipoton. Reducerea reabsoriei la nivelul tubilor distal i colector este consecina scderii concentraiei serice de ADH (hormon antidiuretic). Ea poate fi datorat diminurii secreiei de ADH sau unor leziuni hipofizare (diabetul insipid) . Oliguria (volum urinar sub 500 ml/24 ore) Poate fi produs de: reducerea filtratului glomerular sau de creterea reabsoriei tubulare a apei . 1. Reducerea filtratului glomerular este cauzat de obicei de scderea presiunii intracapilare i este cunoscut ca insuficien circulatorie renal. Ea poate fi dat de: - reducerea debitului cardiac, - n insuficiena cardiac, - hemoragii mari, - hipotensiune arterial, - deshidratri gastro-intestinale, - pancreatite acute, - ulcer peptic perforat, - hemoliza intravascular. Oliguria poate fi produs i de maladii renale cum sunt: o insuficien renal prelungit, glomeruluronefrite acute. Oliguria produs de obstrucii intra- sau extrarenale este mai rar ntlnit i poate fi produs de: - obstrucii intrarenale cu blocarea tubilor cu hemoglobin,

mioglobin, urat sau calciu - obstrucii extrarenale date de calculi, neoplasm, stricturi sau hipertrofie prostatic. 2. Creterea reabsoriei tubulare a apei poate fi produs de : - leziuni tubulare care permit reabsoria neselectiv a filtratului glomerular - exces de aldosteron circulant, prin diminuarea aportului de ap Anuria (sub 200 ml/24 ore) Cauzele anuriei sunt n principiu ale oliguriei, uneori de intensitate mai mare. Aspectul urinii La emisie urina normal este limpede, transparent, dup cteva ore apare un depozit flocons compus din celule de descuamaie ale cilor urinare. n cazul urinilor alcaline aspectul poate fi tulbure chiar la emisie datorit fosfailor alcalinoteroi. De asemeni apar modificri ale aspectului n funcie de temperatura la care este pstrat (temperaturile sczute precipit acid uric i uraii) i n funcie de modul de conservare. Modificri patologice ale aspectului urinii se ntlnesc n afeciuni renale i ale cilor excretoare renale. Culoare Urina normal este de culoare galben deschis sau galben rocat datorit pigmenilor pe care i conine (urocromi, urobilina, porfirina, indoxil urinar, etc.). Miros Urina normal are un miros fad, datorit acizilor volatili sau substanelor urinoide. n mod normal mirosul poate fi accentuat n urinile concentrate sau dup administrarea unor medicamente i n funcie de alimentaie. Patologic, mirosul poate fi: amoniacal n boli infecioase sau tumorale renale i ale cilor excretoare renale; putrid n infecii cu flora anaerob; de mere acre n diabet.

Consistena Urina normal are consistena unei soluii slab saline. n condiii patologice consistena se poate modifica, de exemplu; o urin ce conine cantiti mari de albumin are o spum persistent; urina ce conine puroi este vscoas i filant.

I.2. ACIDITATEA URINII Urina prezinta o aciditate actual sau pH i aciditate total sau de titrare. Determinarea aciditii actuale sau a pH-ului urinei Principiu: pH-ul reprezint cologaritmul concentraiei H+ i se determin n cazul urinei cu indicatorul Guillaumin, cu hrtii indicatoare de pH sau pH- metre. Reactivi : Indicator Guillaumin (rou de metil 0,125g; albastru de bromtimol 0,40g; NaOH N aproximativ 20 ml; ap ad 1000 ml ). Tehnica determinrii : Din urina proaspt emis se pipeteaz ntr-o eprubet 10 ml i se adaug 10 picturi indicator Guillaumin. Se agit i se compar culoarea cu o scar de pH cu valori cuprinse ntre 3,6-9,2 uniti de pH. Scara de pH este realizat din hrtii sau soluii colorate diferit, pentru fiecare culoare corespunznd o anumit valoare a pH ului. Determinarea aciditii de titrare Principiu : Se titreaz aciditatea urinei cu NaOH 0,1N n prezena de indicator fenolftaleina, pn la culoarea roz persistent.n unele cazuri de urin foarte alcalin culoarea este de la nceput roie i n acest caz se face titrarea cu HCl 0,1N, fiind vorba de o alcalinitate a urinii. Reactivi : 1. Soluie NaOH 0,1 N 2. Soluie indicator fenolftalein 1% n alcool etilic Tehnica determinrii : Se pipeteaz ntr-un balon Erlenmeyer un volum exact de 10 ml urin, se adaug 3-4 picturi indicator fenolftalein i se titreaz din biureta cu NaOH 0,1N pn la culoare roz persistent, notnd cu N numrul de ml NaOH 0,1N utilizai. Calculul i exprimarea rezultatelor : De obicei aciditatea urinei se exprim n ml NaOH 0,1N necesari pentru neutralizarea a 1000 ml urin. Aciditatea de titrare = Nx100 = ml NaOH 0,1N/1000ml urin

Se mai obinuiete exprimarea n ml NaOH 0,1N necesari pentru neutralizarea urinei din 24 ore ( n acest caz se face raportarea valorii obinute cu 10 ml urin la volumul din 24 de ore ). Interpretarea rezultatelor : pH-ul urinei normale (din 24 ore) este cuprins ntre 5,6- 6,2, deci slab acid, datorit fosfailor primari, acidului uric, citric, acetic, lactic, formic, hipuric (care apar parial sub form de acizi liberi ). Aciditatea de titrare variaz obinuit n urina normal ntre 200450, n medie 350 ml NaOH 0,1N necesari pentru neutralizarea a 100 ml urin. Deoarece ntre pH i aciditatea de titrare nu este necesar s existe un paralelism, determinarea acestor doi parametri nu se exclud, ci se completeaz. Valoarea global a pH-ului pentru urina normal colectat n 24 de ore i corect conservat este de obicei n jur de 5,8-6,2, dar cu valori diferite de la o emisie la alta situate ntre 5,0-7,2. Se constat importante variaii fiziologice circadiene: dimineaa urina este mai acid (pH 5,05,5) i mai puin acid, neutr sau chiar uor alcalin dup mese, cnd H + sunt implicai n digestia gastric; n cazul aclorhidriei aceste variaii normale nu mai apar i pot indica un cancer gastric. Variaii importante ale aciditii urinei se constat n legatur cu natura regimului alimentar, n regim vegetarian urina este mai alcalin, pe cnd n regim carnat este mai acid. Explicaia acestor variaii const n faptul c n alimentele vegetale predomin anionii organici, care prin metabolizare se transform n CO2 i H2O i rmn n exces cationii care se elimin prin urin , n schimb carnea, oule (i unele cereale) conin compui care prin metabolizare dau acizi (fosforic de ex. din fosfolipide i sulfuric, din aminoacizii cu sulf, etc.). Este de accentuat c nu exist o corelaie ntre aciditatea alimentului consumat i aciditatea urinei, deoarece de ex. fructele care conin acid citric, tartric, malic, succinic (parial liberi) confer alimentului o reacie acid, ns n cursul metabolizrii (dup cum s-a menionat) ei se transform n H2O i CO2 (care se elimin prin expiraie) i rmne un exces de cationi (K+,Na+) care au neutralizat parial acizii din aliment i care eliminndu-se prin urina o vor alcaliniza; fructele care conin mari cantiti de acid benzoic (prune, afine) dau o urin acid deoarece forma de eliminare a acidului benzoic este tot un acid(acidul hipuric). Patologic se constat creteri ale aciditii urinei n diabetul zaharat datorit eliminrii corpilor cetonici, dintre care acidul betahidroxibutiric i acetil-acetic au caracter acid, n inaniie, n

insuficienele renale grave nsoite de scderea capacitii de amniogeneza, n calculoza renal i vezical, n perioada final a unor boli acute, n diareele grave. O urin puin acid, neutr sau chiar alcalin apare dup vrsturi abundente (de obicei acide), n perioada de resorbie a edemelor, n infeciile cilor urinare, dup medicamentele alcalinizante (de ex. bicarbonat de sodiu ), ape minerale alcaline. Testul bicarbonatului de sodiu. n practic se poate realiza o prob simpl de apreciere a acidozei prin administrarea bicarbonatului de sodiu n cantitate suficient pentru a produce o urin alcalin. La persoanele sntoase sunt suficiente 10g bicarbonat de sodiu, n timp ce diabeticul (sau n alte cazuri de acidoza ) necesit o cantitate mult mai mare, de ex. 30g.

I.3. DOZAREA CONSTIUIENILOR NORMALI AI URINII

I.3.1. ELECTROLIII URINARI (Na+,K+,Ca+2,Cl-) Dozarea electroliilor urinari comport metode variate, titrimetrice (Ca+2, Cl-) cu formare de precipitate (Ca+2), flamfotometrice (Na+,K+,Ca+2), colorimetrice (Mg+2), electrode ion specifice (Na+,K+,Ca+2,Cl-). Metodele cele mai folosite n practica de laborator clinic sunt fotometria n flacar i electrodele ion specifice. Dozarea clorurilor prin metoda Mohr Principiu Clorurile sunt precipitate n mediul neutru sau slab acid sub form de clorur de argint cu o soluie de azotat de argint de normalitate cunoscut. Ca indicator se folosete cromatul de potasiu, care n prezena unui exces de azotat de argint va da un precipitat rou de cromat de argint (n soluie fiind att clorura de argint, precipitat alb, ct i cromat de argint, precipitat rou, va apare o nuan crmizie).
NaCl+ AgNO3 = AgCl + NaNO 3 2AgNO3 + K 2CrO4 = Ag2CrO4 + 2KNO 3

pp. alb

pp.rou Reactivi : 1. Azotat de argint 0,1N 2. Cromat de potasiu 10% 3. Soluie tampon de acid acetic-acetat: acetat de Na 10% n acid acetic 3%. Tehnica determinrii : ntr-un balon Erlenmeyer se pipeteaz 10 ml urin, 2 ml soluie tampon i 1 ml indicator. Se titreaz din biuret cu soluia de azotat de argint 0,1N pn la culoare crmizie. Se noteaz numrul de ml de azotat de argint utilizai cu N. Calcul : Concentraia clorurilor n urin se exprim n grame de clorura de sodiu la litru, tiind c la 1 ml AgNO3 0,1N corespund 0,00584g NaCl. NaClg/l=Nx0,00584x100 Interpretarea rezultatelor:

n cazul unei diete obinuite cantitatea de cloruri urinare este cuprins ntre 10-15g la 24 de ore.dup cteva zile de dieta fr sare cantitatea clorurilor urinare scade la valori mici (sub 1g/24 ore ) i invers, crete peste valorile normale la un regim hiperclorurat. Valori crescute (hiperclorurie ) se ntlnesc n poliurie, crize postifecioase, scderea incipient a edemelor (chiar naintea apariiei acestora clorurile scad la 1,5-5g/24 de ore, crescnd greutatea corporal), boli febrile acute, insuficiena cardiac, ocluzie intestinal, n diferite leziuni renale. Dozarea calciului urinar Dozarea calciului din lichidele biologice se poate realiza prin mai multe metode: a. Metoda volumetric, se bazeaz pe precipitarea calciului cu oxalat de amoniu sub form de oxalat de calciu. Acesta izolat prin filtrare poate s fie descompus de acidul sulfuric, iar acidul oxalic rezultat se dozeaz permanganometric. b. Metoda fotometric n flacr, este comod, rapid i sensibil. n laboratoarele de specialitate este o metod curent ce servete i la dozarea altor cationi. c. Metoda complexonometric, prezint avantajul sensibilitii i a rapiditii, dar nu este specific, deoarece unii cationi, cum ar fi Mg+, pot s interfereze reacia. Dozarea calciului cu EDTA Calciul n prezena de EDTA i a murexidului ca indicator formeaz un complex chelat, complexonatul de calciu, colorat n violet. Iniial murexidul fixeaz calciul, culoarea soluiei devenind roz, iar la titrare cu EDTA, indicatorul este eliberat i soluia se coloreaz n violet.

CH2-COO CH2 N CH2-COO CH2 N

CH2-COO CH2
Ca
+2

N CH2-COO CH2-COO Ca
-

CH2-COO CH2-COO

CH2

N CH2-COO

Reactivi: 1. EDTA 0,01 M 2. NaOH 0,1N 3. Murexid Tehnica de lucru ntr-un pahar Erlenmeyer se introduc 10 ml urin deproteinizat, 10 ml NaOH 0,1 N i cteva cristale de murexid. Soluia colorat n roz se titreaz cu EDTA 0,01 M pn la virajul soluiei de la roz la violet. Se noteaz cu N- numrul de ml de EDTA folosii la titrare. Calcul
1 mlEDTA0,01 .......... 0,0004008 M ........ gCa N.f EDTA .......... ........ .......... x x = N.f EDTA .0.0004008 Ca/ proba g

Interpretarea rezultatelorCantitatea de calciu urinar eliminat n 24 de ore este cuprins ntre 0,07 0,3 g/24 de ore. Cantiti crescute apar n: hiperviatminoza D, hiperparatiroidism, osteoporoza dup fracturi. Cantiti sczute ale calciului urinar apar n: rahitism, hipoparatiroidism, spasmofilie etc.

Dozarea fosfatului anorganic Principiu Majoritatea metodelor utilizate pentru dozarea fosfatului anorganic se bazeaz pe formarea fosfomolibdatului de amoniu, n mediu acid, care prin reducerea cu diferii ageni formeaz un compus colorat care se poate doza fotometric. Ca ageni reductori se pot folosi: hidrochinona, acidul ascorbic, clorura stanoas. Indiferent de natura agentului reductor acesta trebuie preparat extemporaneu, deoarece se oxideaz repede la aer. Reactivi: 1. Soluie molibdat de amoniu: ntr-un balon gradat de 500ml se dizolv 25g molibdat de amoniu n aproximativ 300ml ap. Se adaug 75ml H2SO4 conc, dup rcirea amestecului se completeaz la 500ml cu

ap distilat. 2. Acid ascorbic 1% 3. Soluie standard de fosfat: 0,4394g KH2PO4 se dizolv la 1000 ml. Un ml din aceasta soluie conine 0,1mg P. Soluia se dilueaz la 1/50 astfel nct 1ml va conine 2 P. g Tehnica de lucru Se pregtesc trei eprubete dup cum urmeaz: Reactivi (ml) Urina dil 1/10 Standard P Apa distilata Molibdat de amoniu Acid ascorbic Martor 3,0 0,8 0,2 Proba 0.5 2,5 0,8 0,2 Standard

Dup 15 minute se citete extincia probei i a standardului fa de martor la 700nm. Calcul


Panorganic/ l = g Ep Es .0.04

Interpretarea rezultatelor Normal, cantitatea de fosfat eliminat n 24 ore este de 1-5g (dac se exprim ca P2O5) respectiv de 0,4-2g dac se exprim n fosfor. Hiperfosfaturii ntlnim n efort muscular, epilepsie,cancer,boli osoase, tuberculoza pulmonar, leucemii. Hipofosfaturii apar n boli febrile, nefrite, infecii acute, atrofia galben a ficatului. I.3.2. DOZAREA CREATINEI I CREATININEI Principiu Creatinina reacioneaz cu acidul picric n mediu alcalin, formnd un compus colorat n portocaliu. Intensitatea coloraiei se citeste la spectrofotometru faa de o proba martor. Dozarea creatinei se face indirect dup conversia ei prealabil la creatinin, prin fierbere n mediu acid. Diferena ntre creatinina dup nclzire i cea nainte de nclzire

reprezint creatina. Reactivi 1. Acid picric 0,04 M 2. NaOH 0.75 M 3. Soluie standard de creatinin 0,100% (stoc) 4. Soluie standard de lucru creatinin 0,001% (se dilueaz soluia stoc ; 1:100 cu ap distilat). Tehnica de lucru Urina se dilueaz 1:100 (1 ml urin + 99 ml ap), fr deproteinizare. Se pregtesc trei eprubete, n care se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Urina diluata Standard de lucru Apa distilata Acid picric NaOH Proba 3 1 1

Se agit coninutul eprubetelor i se las 20 de minute dup care se citete extincia probei i a standardului fa de martor la 520 nm. Calcul
mg /100 = ml creatinina Ep Es .Cs .D , unde Cs = 1, D = diluia urinii

Dac se exprim rezultatul n g creatinin/l urina, formula de calcul este: gcreatinina/l urina = Ep/Es Dac se msoar volumul urinii /24 h i greutatea subiectului se calculeaz eliminrea urinar a creatininei n:
mg / h creatininakgcorp/ 24

Interpretarea rezultatelor Creatina se elimin prin rinichi n mod diferit de creatinin. Ambele sunt filtrate liber n glomeruli, dar n timp ce creatinina este reabsorbit n tubii contori proximali aproape n totalitate, creatinina rmne i se elimin n ntregime prin urin. Din aceast cauz eliminarea creatininei reflect starea funcional a glomerulilor. Valorile eliminrii prin urin se raporteaz de obicei la masa corporal ( mg/kg

corp/24 ore). Deoarece viteza formrii i cea a eliminrii creatininei sunt constante, se poate aprecia dac s-a colectat sau nu toat urina, msurnd cantitatea total de creatinin eliminat n 24 de ore. Analizele de laborator pentru creatin si creatinina din urin au valoare practic n boli care afecteaz muchii i afeciuni renale cu implicarea glomerulilor. Valorile normale ale creatinei i creatininei urinare la femei i brbai sunt urmtoarele: Creatina brbai: 0 - 40 mg/24 h 0 - 0.30 mmol/24 h - femei: 0 100 mg/24 h 0 0,76 mmol/24 h Creatinina brbai: 1 2 g/24 h 8,8 17,6 mmol/24 h 21 26 mg/kg/24 h - femei: 0,6 1,5 g/24 h 5,3 13,2 mmol/24 h 16 22 mg/kg/24 h Valorile creatinei sunt destul de variabile de la un individ la altul i servesc exclusiv pentru diagnosticul de laborator al unor boli musculare. ntlnim valori crescute (n ser i urin) pentru creatin n: traumatisme musculare, necroze sau distrofii progresive ale muchilor. Valorile creatininemiei i creatinuriei sunt mult mai constante. Ele servesc pentru aprecierea funciei renale n determinarea clearance-ului glomerular. Probele clearance indic n general volumul de plasm care a fost utilizat de rinichi ntr-un minut pentru a elimina cantitatea dintr-o substan oarecare eliminat prin urin n acelai interval de timp. El se calculeaz din formula:
Clearance = U.V .F P

U concentraia substanei n urin P concentraia substanei n plasm V volumul urinii convertit n ml/min F factor de corecie introdus pentru masa diferit a rinichiului la diferii subieci. Determinarea clearance-ului creatininei este mai comod dect pentru alte substane (care trebuiesc injectate) i foarte utilizat n practica medical. Valoarea lui este de 85 125 ml/min pentru brbai si 75 115 ml/min pentru femei. Evident n cazul unor substane care

sunt filtrate glomerular i reabsorbite n tubi valorile clearance vor fi mai mici (ex. Ureea). Din contr substanele care sunt secretate n tubi pe lng cantitatea filtrat glomerular (ex. Ac.p-aminohipuric) vor da valori clearance mai mari (600 700 ml/min). n insuficiena renal ( nefrite cronice, nefroscleroza) n primul rnd este afectat clearance-ul creatininic, care scade. Doar n faze mai avansate ale bolii se observ creterea concentraiei creatininei n ser i scderea eliminrii urinare.

I.4. DETERMINAREA COMPONENILOR PATOLOGICI AI URINII Determinarea componenilor patologici ai urinii se refer la identificarea acestor componeni prin reacii calitative ce se efectueaz

pe urina provenit dintr-o singur emisie sau din urina de 24 de ore. Aceast determinare este cunoscut sub denumirea de analiza sumar a urinii. n unele cazuri se impune i un examen mai complet al urinii, realizndu-se i determinri cantitative. Rezultatele sunt exprimate la litru sau la urina pe 24 de ore. I.4.1. REACII DE EVIDENIERE A GLUCIDELOR URINARE Reaciile de evideniere a glucidelor se bazeaz pe caracterul lor reductor. Reducerea ionilor metalici Se realizeaz n mediu alcalin, la cald. Aceste teste nu sunt specifice deoarece nu permit diferenierea glucozei de alte glucide reductoare , care pot s apar n urin.Totui, exist unii compui reductori, care pot s interfere reacia, ca de exemplu: acid uric, fenol, acidul homogentisic, acidul ascorbic, penicilina, streptomicina. Determinrile calitative se fac pe urina de la o singur emisie, nedefecat, deoarece dac reacia este intens pozitiv, defecarea este inutil. a. Reactia Trommer se bazeaz pe reducerea hidroxidului de cupru la oxid cupros, avnd loc dispariia culorii albastre i apariia unui precipitat rou. Reactivi: 1. CuSO4 10% 2. NaOH 10% Tehnica de lucru ntr-o eprubet se pipeteaz 2 ml CuSO4, 2 ml NaOH i 5 ml urin.Se agit, se nclzete la fierbere i apariia unui precipitat roucrmiziu indic prezena unei oze reductoare. b. Reacia Fehling - se bazeaz pe acelai principiu ca i reacia Trommer. n acest caz, ns excesul de hidroxid de cupru neredus, care prin deshidratare la CuO negru ar deranja reacia, este legat sub form solubil de tartratul dublu de sodiu i potasiu. Reactivi: 1. Fehling I. Se dizolv 35 g de sulfat de cupru n 500 ml ap, se adaug 5 ml acid sulfuric concentrat i se completeaz cu ap la 1 litru. 2. Fehling II.150 g de tartrat de sodiu i potasiu se dizolv n cca 300 ml ap, se adaug 300 ml soluie de NaOH 30% i se completeaz

1.

cu ap la 1 litru. Tehnica de lucru ntr-o eprubet se pipeteaz 2 ml Fehling I i 2 ml Fehlig II, se aduce la fierbere, dup care se adaug 5 ml urin i se continu fierberea. Apariia unui precipitat rou-crmiziu indic prezena glucidelor reductoare. c. Reacia Benedict se bazeaz pe principiul reaciei Fehling, doar c sarea Seignette este nlocuit cu citratul de sodiu. Reacia este sensibil i se utilizeaz pentru determinri semicantitative. Reactivi: 1. Reactiv Benedict.173 g citrat de sodiu i 200 g carbonat de sodiu cristalizat se dizolv n 800 ml ap fierbinte i dup rcire se filtreaz ntr-un balon cotat de 1litru. Separat se dizolv 17,3 g de sulfat de cupru cristalizat n 100 ml ap i se adaug sub agitare soluiei precedente, dup care se completeaz volumul la 1 litru cu ap. Tehnica de lucru ntr-o eprubet se pipeteaz 2,5 ml reactiv Benedict i 4 picturi de urin, dup care se nclzete 5 minute pe baia de ap n fierbere. n funcie de cantitatea de glucoz prezent se va obine: Culoare Albastr Albastr verzuie Verde Brun-verzui Galben Rou-crmiziu Rezultat Urme + (cca 0,5g%) ++ (cca 1g%) +++ (cca 1,5%) ++++ (cca 2%)

Testul poate s fie deranjat de prezena acidului ascorbic sau a urailor i fosfailor. d. Testul rapid CLINITEST este o variant a reciei Benedict. n acest caz, ns reactivul se prezint sub form de pastile ce conin sulfat de cupru, acid citric, hidroxid de sodiu i carbonat de sodiu. Determinarea se face astfel: ntr-o eprubet se iau 5 picturi de urin, 10 picturi ap distilat i se adaug un comprimat Clinitest. Dup 15 secunde se compar culoarea obtinu cu o scar etalon.Testul permite o determinare semicantitativ a glucozei ntre limitele 0-2 g/100 ml urin.

e. Reacia Nylander. Reacia se bazeaz pe reducerea bismutului trivalent la bismut metalic.


Bi(OH)2 NO3 + NaOH Bi(OH)3 + NaNO 3 2Bi(OH)3 + 3R CHO 2Bi + 3R COOH + 3H 2O

Reactivi: 1. R. Nylander: 2 g azotat bazic de bismut, 24 g sare Seignette, 100 ml NaOH 8%. Tehnica de lucru ntr-o eprubet se pipeteaz 1 ml reactiv Nylander, 5 ml urin i se nclzete 5 minute la fierbere. Apariia unui precipitat brun-negru arat prezena glucozei. Reacia poate s fie deranjat de prezena unei cantiti mari de proteine, care dau un precipitat brun de sulfur de bismut. 2. Melituriile Melituriile se caracterizeaz prin prezena altor glucide, diferite de glucoz, n urin. Este vorba n principal de identificarea: lactozei, fructozei, galactozei, precum i a unor pentoze. La gravide n ultima perioad de sarcin se pune problema diferenierii lactozei de glucoza urinar. Uneori lactozuria este nsoit de o glucozurie uoar, care n acest caz nu este considerat cu caracter patologic. Fructozuria este o boal ereditar rar, care se datoreaz blocrii n ficat a convertirii fructozei la glucoz. Fructozuria se ntlnete n diabet i boli hepatice. Pentozuriile pot nsoi diabetul zaharat i apar dup ingerarea unor cantiti mari de fructe. Pentozuria esenial (caracterizat prin eliminarea xilulozei) este o boal congenital, rar. Galactoza este uneori excretat n urin n ultimul trimestru de sarcin. Se cunoate, ns i un defect metabolic ereditar, n care galactoza nu poate fi transformat n glucoz, deoarece lipsete enzima numit galactozo-uridin- transferaza, motiv pentru care galactoza poate fi depistat n urin. Punerea n eviden a acestor glucide n urin se poate realiza prin reaciile caracteristice identificrii glucidelor. I.4.2. REACII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR URINARE

Proteinele urinare sunt reprezentate n special de albumine i globuline i provin n general din plasm. Determinrile se fac de regul pe urina clar. Dac urina este tulbure, aceasta se filtreaz sau se centrifugheaz, iar dac se menine totui o slab tulbureal, atunci se fac probe paralele. Reacia urinei trebuie s fie slab acid la emisie, iar n caz contrar aceasta se aciduleaz cu cteva picturi de acid acetic. Dac urina prezint la emisie o reacie net alcalin, identificarea proteinelor este nesigur, deoarece n infeciile vezicale urina sufer un proces de fermentare amoniacal, care transform albuminele n alcali-albumine, fiind astfel dificil identificarea lor. Identificarea proteinelor urinare se realizeaz n principal prin reacii de precipitare. 1. Reacia cu acid sulfosalicilic ntr-o eprubet se pipeteaz 5 ml urin i 5-10 picturi de acid sulfosalicilic 20%. n funcie de cantitatea de protein prezent se va obine o tulbureal sau un precipitat. Dac tulbureala persist la nclzire, ea se datoreaz proteinelor, iar dac dispare sunt prezente albumozele. Reacia poate s fie fals pozitiv n cazul unui tratament cu antibiotice orale sau prin administrarea de substane de contrast. 2. Reacia cu acid tricloracetic ntr-o eprubet peste 5 ml de urin se adaug 1 ml acid tricloracetic 10%. Apariia unui precipitat alb floconos indic prezena proteinelor. 3. Reacia ESSBACH ntr-o eprubet se trateaz 5 ml urin cu 1 ml reactiv Essbach ( acid picric 10 g, acid citric 20 g, ap distilat la 1000 ml). Apariia unui precipitat alb-galben indic prezena proteinelor urinare. Aceast reacie poate s fie folosit i la determinarea semicantitativ a proteinelor urinare. Dozarea semicantitativ ESSBACH Principiu Se msoar ntr-o eprubet gradat (albuminometru Essbach) cantitatea de precipitat obinut prin tratarea urinii cu reactivul Essbach. Tehnica de lucru ntr-un albuminometru se introduce urina pn la semnul U, apoi

reactiv Essbach pn la semnul R. Se nchide cu un dop de cauciuc, se agit bine i se las n repaus la temperatura camerei. Dup 24 de ore se citete nlimea sedimentului, diviziunile exprimnd grame protein la 1000 ml urin. Citirea se poate efectua i dup 15 minute, dac reaciei i se adaug un vrf de spatul de talc. Determinarea se face numai pe urina acid, iar la nevoie se aciduleaz cu acid acetic. Deasemenea densitatea trebuie s fie 1,008; n caz contrar se va dilua urina, inndu-se cont de aceasta ns la exprimarea rezultatelor. Cu reactivul Essbach precipit i albumozele, mucoidele, acidul uric precum i unele substane medicamentoase ca: urotropina sau chinina. 4. Testul rapid cu ALBUSTIX Proteinele produc schimbarea culorii unor indicatori, fr legtur cu modificarea pH-ului. La pH constant schimbarea culorii este n funcie de concentraia proteinelor. Pentru determinarea proteinelor cu ajutorul acestui test se folosesc baghete de celuloz impregnate cu albastru de tetrabrom fenol ( tetrabrom fenol i tetrabrom sulfoftalein) i aduse la pH 3 cu un tampon citrat. Aceste baghete se introduc n urin, dup care se scot imediat. n prezena proteinelor culoarea se schimb de la galben la albastru , trecnd prin verde. Dac se compar cu o scar de culori se poate aprecia i cantitatea de protein. Acest test este mai specific dect probele de precipitare. Interpretarea rezultatelor Urina normal nu conine dect urme de proteine (20-40 mg%0), nedecelabile prin metodele uzuale. Cantitatea de protein excretat n cursul zilei variaz, de aceea determinarea se va face pe urina de 24 de ore. Proteinuriile patologice variaz n limite destul de largi, de 2 g /l la cantiti masive de 10 g/l. Se disting trei tipuri de albuminurii, i anume: - albuminurii tranzitorii pn la 2 g/l i dispar odat cu vindecarea strii patologice care le-a produs. Acest tip poate s apar n tulburri circulatorii (insuficiena cardiac), n edem pulmonar acut, accidente neurologice,stri febrile, unele intoxicaii, boli infecioase. - albuminurii intermitente acestea apar n condiii de efort fizic, oboseal. - albuminurii permanente - ce apar constant n glomerulonefrite. Cantitile eliminate pot varia de la valori foarte mici pn la

valori foarte mari (20 g/24 de ore) nsoite de hematurie. De asemeni pot s apar i n alte nefropatii (la gravide, n diabet, n litiaza, tuberculoza, cancer). I.4.3. DEPISTAREA PUROIULUI (PIURIA) Puroiul este constituit din leucocite care au suferit o degenerescenta granuloas. Acesta apare n urma proceselor inflamatorii de origine microbian. Identificarea puroiului se poate realiza prin proba Donne. Pentru determinare, ntr-o eprubeta se pipeteaz 5 ml urin i cteva picturi de NaOH 20%, se nchide eprubeta i rstoarn brusc, readucnd-o la poziia iniial. Apariia unor bule de aer care persist mai mult timp n soluie i se ridic ncet la suprafa denot prezena puroiului. Certitudinea piuriei este dat de examenul microscopic. Se consider, astfel pentru urina de 24 de ore, urmtoarele stri: -Stare normal - 10-15 leucocite/mmc -Stare patologic - 20-25 -Piurie discret - 100-500 -Cistit usoar - 1000-5000 -Cistit intens - 5000-40000 O urin ce conine sub 200 leucocite/mmc poate s dea reacie negativ pentru proteine, iar la valori mai mare reacia pentru proteine este pozitiv. Examenul urinii ce const n punerea n eviden a proteinelor, glucidelor i puroiului este cunoscut n practica sub denumirea de APZ (albumin-puroi-zaha).

I.4.4. IDENTIFICAREA CORPILOR CETONICI Corpii cetonici sunt reprezentai de: aceton, acidul acetilacetic i acidul hidroxi butiric. n special se excret cei doi acizi, dintre care acidul acetilacetic este instabil, transformndu-se n aceton prin pstrarea urinii la temperatura camerei. 1. Identificarea acetonei

a. Reacia Legal ntr-o eprubet peste 5 ml de urin se adaug 10 picturi de nitroprusiat de sodiu 10% i NaOH 10% pn la reacie alcalin. Apariia unei coloraii roii sau portocalii se datorete creatininei, iar dac se adaug n continuare acid acetic glacial intensificarea culorii la rouviolet, indic prezena acetonei, iar dispariia culorii, absena ei. Sensibilitatea reaciei este de 50-100mg aceton la litru. Reacia este pozitiv i cu acid acetilacetic. Deasemenea unele medicamente ca salicilaii i aspirina pot s interfere aceast reacie. Exist i teste rapide de determinare a acetonei din urin, cum ar fi de exemplu:ACETEST si KETOSTIX. b. Reacia Lieben Acetona tratat cu iod n mediu alcalin formeaz iodoform, care poate fi recunoscut prin mirosul caracteristic.
H 3C CO CH3 + 3NaOH+ 3I 2 H 3C CO CI 3 + 3NaCl+ 3H 2O H 3C CO CI 3 + NaOH CHI 3 + CH3 = COONa

ntr-o eprubet la 5 ml urin se adaug 1,5 ml NaOH 10% i 1,5 ml soluie de iod 0,1 N. Apariia unui precipitat galben i a mirosului de iodoform indic prezena acetonei. 2. Identificarea acidului acetilacetic Se realizeaz prin reacia Gerhardt, care se bazeaz pe formarea unui complex de culoare roie ntre aceto-acetat i ionii de fier. ntr-o eprubet se pipeteaz 10 ml urin defecat i apoi se adaug FeCl3 10% pictur cu pictur pn la redizolvarea precipitatului de fosfat feric format iniial. Reacia poate s fie interferat de prezena salicilailor. 3. Identificarea acidului -hidroxi butiric Efectuarea acestei probe nu este necesar, deoarece acetona i acidul acetilacetic sunt prezeni n toate cazurile n care se elimin acid -hidroxi butiric. Pentru a-l putea pune n eviden se efectueaz reacia Legal pe o prob de urin n prealabil fiart n mediu acid, cnd acetona i acetoacetatul sunt ndeprtai. Astfel ntr-un pahar se iau 10 ml urin la care se adaug 10 ml ap distilat, 5 picturi de acid acetic glacial i se fierb sub nis pn ce volumul este redus la jumtate; se transvazeaz ntr-o eprubet, se rcete, se adaug 10 picturi acid acetic concentrat i

10 picturi de nitroprusiat10%, dup care se agit. Se toarn apoi cu atenie pe marginea eprubetei 2 ml amoniac 10%. Apariia unui inel rou-violet indic prezena acidului -hidroxi butiric. Interpretarea rezultatelor Corpii cetonici sunt produi intermediari ai metabolismului lipidic i apar n urin n cazurile n care metabolismul glucidic este deficitar, cum ar fi de exemplu: n diabetul netratat, inaniie, boli hepatice, unele stri febrile, diaree i vrsturi. Patologice sunt cantitile care depesc 20-30 mg/litru i sunt decelabile prin probele uzuale. I.4.5. IDENTIFICAREA ACIZILOR BILIARI (CHOLALURIA) I PIGMENILOR BILIARI Identificarea acizilor biliari se poate efectua prin urmtoarele probe: 1. Proba Hay, aceasta const n urmrirea efectului tensioactiv al acizilor biliari prezeni n urin. n acest sens se presar floare de sulf pe suprafaa urinii aflat ntr-un vas cu diametru mare. Dac acizii biliari sunt prezeni, sulful sedimenteaz n cteva minute,iar n caz contrar plutete cteva ore. 2. Proba Pettenkoffer, acizii biliari n prezena derivailor furfuralici formeaz compui colorai n urma unei reacii de condensare n mediu de acid sulfuric. Astfel, ntr-o eprubet se pipeteaz 1 ml ap distilat, 1-2 ml urin, 5-6 picturi zaharoz 10% i se agit; se adaug apoi prelingnd pe pereii eprubetei 1-2 ml de acid sulfuric concentrat. Apariia unui inel rou-violaceu indic prezena acizilor biliari. Paralel se efectueaz o prob martor n aceleai condiii, nlocuind doar urina cu ap, cnd inelul obinut va avea o culoare brun-crmiziu. Interpretarea rezultatelor Cholaruria apare n special n icter mecanic (prin ocluzia canalului coledoc) cnd srurile acizilor biliari trec n torentul sangvin i apoi n urin. Prezena lor n urin este semnalat n hepatit, cnd celula hepatic suferind nu i mai poate fixa. Pigmenii biliari Pigmenii biliari sunt derivai pirolici care provin din metabolismul hemoglobinei, dintre care cei mai importani sunt: bilirubina,

biliverdina,urobolina, urobilinogenul. 1. Bilirubina. Dup cantitatea de bilirubin eliminat prin urin, culoarea acesteia variaz de la galben-nchis spre brun-nchis. Prin agitarea urinii se observ aparitia unei spume galbene sau verzuie. Urina folosit pentru determinarea bilirubinei se va pstra la ntuneric, deoarece aceasta este o substan fotosensibil. Din acest motiv n unele cazuri se adaug substane reductoare pentru a mpiedica reacia de oxidare. Reaciile de identificare a bilirubinei se bazeaz pe proprietatea sa de a forma azocolorani a. Reacia Gmelin. ntr-o eprubet peste 5 ml acid azotic concentrat se adaug cu atenie 5 ml urin, astfel nct cele dou lichide s nu se amestece. Apariia unui inel verde-smarald la suprafaa de separare i apoi a unor inele colorate n albastru, violet, rou sau galben, indic prezena bilirubinei. b. Reacia Trousseau. ntr-o eprubet se pun 5 ml urin dup care se adaug apoi 2 ml reactiv Lugol (6,5 g iod, 2,5 g KI, 6,4 ml ap i alcool la 1000 ml) n aa fel ca cele dou lichide s nu se amestece. Dac la suprafaa de separaie apare un inel de culoare verde, aceasta nseamn ca urina conine bilirubin. n mod normal urina nu conine bilirubin dect n urme, care nu pot fi decelabile prin reaciile de identificare. Eliminarea masiv de bilirubin prin urin caracterizeaz icterele prin obstrucia canalului coledoc. 2. Urobilinoizii urinari sunt reprezentai de derivaii hidrogenai ai bilirubinei:urobilinogenul,stercobilinogenul,urobilirubina,stercobilina. O parte din urobilinoizi se reabsoarbe i ajunge la ficat prin sistemul portal, iar cea mai mare parte este metabolizat n ficat i se excret urinar n cantitate de 1-4 mg. Reacia Ehrlich const n reacia urobilinoizilor cu p-dimetilamino-benzaldehida n mediu puternic acid cu formarea unei coloraii roii, prin formarea unui compus chinoid. Se trateaz 2 ml urin cu 2 picturi de reactiv Ehrlich (2g pdimetil-amino-benzaldehid dizolvat n 100 ml HCl 20%) i se las n repaus 1 minut. Apariia unei coloraii roie-intens indic prezena unei cantiti crescute de urobilinogen. Colorantul se poate extrage n cloroform sau alcool amilic. Porfobilinogenul d o coloraie asemntoare, dar care nu este solubil n cei doi solveni. Eliminri crescute de urobilinoizi se ntlnesc n icter hemolitic,

anemie pernicioas, n tulburri ale funciei hepatice: icter hepatocelular, leziuni ale parenchimului hepatic (hepatite, necroze hepatice acute i subacute, intoxicaii cu cloroform sau tetraclorura de carbon), afeciuni hepatice anicterice (ciroza portal) i n ictere prin obstrucie. I.4.6. EVIDENIEREA SNGELUI n urin pot s apar fie hematii, fie hemoglobina liber, decelabile fie prin teste chimice, fie teste enzimatice. Diferenierea ntre hematurie i hemoglobinurie se poate realiza numai prin examen microscopic, fiind necesar pentru diagnostic, deoarece cauzele clinice sunt diferite n cele dou cazuri. Urina ce conine snge sau hemoglobin are o culoare roie de intensitate variabil, n funcie de cantitatea de pigment prezent. Dac hemoglobina este transformat n methemoglobin, urina apare de culoare brun. Majoritatea reaciilor de identificare a hemoglobinei sau sngelui se bazeaz pe aciunea pseudoperoxidazic a hemoglobinei care permite, n prezena apei oxigenate, oxidarea unui leucoderivat, n produsul colorat. Deoarece leucocitele posed o activitate peroxidazic este necesar a se fierbe urina cteva minute dup o prealabila acidulare cu acid acetic.Totdeauna se va folosi urina proaspat pentru determinri. Reacia Castle-Meyer Reactivi: 1. Reactiv Castle-Meyer: 10 g KOH se dizolv n 50 ml ap, dup care se adaug 1 g fenolftalein i 5 g pubere de zinc. Se fierbe pn la decolorare i se filtreaz fierbinte. 2. Ap oxigenat 3%. Tehnica de lucru Se trateaz 3-4 ml urin cu 3 picturi ap oxigenat i 3 picturi reactiv Castle-Meyer. Apariia unei coloraii roii datorat virajului fenolftaleinei, reoxidat de ctre hemoglobin, n mediu alcalin, indic prezena hematiilor. Interpretarea rezultatelor Hematuria poate s apar n afeciuni ale cilor urinare sau n boli hemoragice. Hemoglobinuria apare n cursul unor procese hemolitice cnd hemoglobina format n exces nu se transform integral n pigmeni biliari i trece n filtrul glomerular. Deasemenea hemoglobinuria poate s apar n: infecii grave, crize de malarie, unele forme de sifilis, anemii

hemolitice, sub aciunea medicamentelor antimalarice sau unele enzimopatii eritrocitare.

I.5. SEDIMENTUL URINAR Examenul microscopic al sedimentului urinar are o deosebit importan clinic. Cercetarea lui arat starea histopatologic a nefronului i a cilor urinare de excreie. Lezarea acestor formaiuni anatomo - funcionale se evideniaz prin eliminarea unor elemente patologice sau prin excesul de elemente normale n urin.

I. Sedimentul urinar neorganizat Elementele neorganizate care intr n componena urinii sunt reprezentate de sruri precipitate sub form cristalin sau amorf. Cristalizarea depinde de gradul de concentrare al urinii, de pH-ul urinar: - reacia acid a urinii permite cristalizarea acidului uric, urailor, oxalatului de calciu i cistinei. - reacia alcalin favorizeaz cristalizarea fosfatului amoniaco-magnezian, fosfatului bi- i tricalcic, carbonatului de calciu i uratului de amoniu. Eliminarea abundent de cristale la bolnavi cu diet echilibrat anun o litiaz renal. 1. Sedimentul din urina acid - Uraii: depozite amorfe formate din granulaii fine, roucrmiziu (se dizolv prin adugare de NaOH sau la cald) - Acidul uric: forme variate hexagon, fus, lance, butoi, de culoare galben - Oxalatul de calciu: octaedri ptrai puternic refringeni, plicuri de scrisoare - Sulfatul de calciu: ace fine, prisme, incolore, apar n urinile foarte acide - Fosfatul de calciu: rozete cu prile ascuite n interior - Acidul hipuric: prisme rombice izolate sau grupate, apare foarte rar 2. Sedimentul din urina alcalin Fosfai amorfi (de calciu, de magneziu): grune mrunte, incolore Fosfatul amoniacomagnezian: capac de sicriu, frunze de ferig, incolor Fosfatul bi- i tricalcic: ace prismatice dispuse n cruce sau stea Carbonatul de calciu: granulaii amorfe sau mici sfere grupate

Uratul de amoniu: sfere galben-brune cu prelungiri n form de spini 3. Sedimente rare: se ntlnesc numai n cazuri patologice - Cistin: mici plci transparente, cu 6 fee, incolore - Xantina: seamn cu cristalele de acid uric -Leucina: sfere mici i strlucitoare cu dungi radiare i concentrice - Tirozina: ace foarte subiri adunate n mnunchiuri sau stea Interpretare clinic Cristalele de fosfai de calciu sau amoniaco-magneziene, precum i cristalele de oxalat de calciu se gsesc n sedimentul urinar n cazul alimentaiei vegetariene, dar i n litiaza renal, n diabetul zaharat i n gut. Cristalele de urai i acid uric sunt prezente n cazul alimenttiei carnate, dar i n caz de distrugeri tisulare mari, hemoragii digestive, leucoze, stri febrile, litiaz uric, gut. II. Sedimentul urinar organizat: este insolubil la cald, HCl, acid acetic Elementele organizate din sedimentul urinar cuprind celule epiteliale, leucocite, eritrocite, cilindrii, eventual flor microbian sau paraziti, spermatozoizi. Elemente celulare 1. Eritrocitele la microscop au aspect de disc glbui, cu dublu contur, strlucitoare. Pot apare i n urina normal, mai puin de 3-4 hematii pe un cmp (n medie). Peste acest numr se vorbete de hematurie microscopic. Cnd urina conine hematii n numr foarte mare (tot cmpul microscopic acoperit) este o hematurie macroscopic. Dup originea i cauzele lor, hematuriile pot fi: - renale (n litiaza renal, tumori renale benigne sau maligne, TBC renal, infarcte renale, necroz papilar, rinichi polichistic, glomerulonefrite acute sau cronice, etc.) - vezico-ureterale (n neoplasme de prostat, polipoza uretrovezical, infecii, tumori vezicale, litiaza vezicii urinare, corpi strini intravezicali sau ureterali, diverticuli vezicali, traumatisme vezicoureterale, etc.) - extraurinare: genitale, n leucoze, endocardite, diateze hemoragice, etc.

Pentru orientare asupra provenienei eritrocitelor, se recomand examinarea la microscop a coloritului lor: - eritrocitele decolorate caracterizeaz bolile renale (eritrocitele au trecut prin filtrul renal), - eritrocitele bine colorate aparin cilor urinare. 2. Leucocitele: globule sferice granulate, cu unul sau mai muli nuclei. Apar normal n urin sub 10 pe cmp. Cnd numrul leucocitelor depete 10 pe cmp i apar libere, grupate sau alterate, este vorba de o leucociturie patologic. Aceasta semnific o infecie urinar. 3. Celulele epiteliale: 1. renale: form poligonal, rotund, cu nucleu mare, vizibil 2. ci urinare (bazinet, uretere, vezic, uretr): au forme variabile n funcie de stratul din care fac parte: - stratul superficial: celule pavimentoase sau rotunde - stratul mijlociu: celule fusiforme sau n form de rachet - stratul profund: celule ovoide sau rotunde Nu este uor s se determine proveniena exact a celulelor epiteliale. Prezena n urin a ctorva celule epiteliale nu are nici o semnificaie patologic, pe cnd abundena lor exprim o descuamare considerabil i semnaleaz o inflamaie a tractului urinar. Dac forma celulelor este bine pstrat i caracteristic, se poate presupune cu destul probabilitate sediul procesului inflamator. Cilindri adevrai sunt formaiuni alungite, cilindrice, bine colorate, ce reproduc ca nite mulaje forma tubilor uriniferi. Ei se formeaz prin gelificarea n tubii renali distali a proteinelor, substanelor albuminoide i mucoase, nglobnd n acest mulaj elemente figurate sanguine, celule epiteliale, detritusuri celulare, bacterii, etc. Semnificaia cilindrilor difer n functie de compoziia lor, de abundena lor n urin: - Hialini: - transpareni, slab conturai, extremiti rotunjite - apar i n condiii normale, dup efort, ortostatism, mai rar n context patologic renal. - Granuloi: - bine conturai, extremiti rotunjite, granulaii sclipitoare refringente - sunt prezeni n nefritele difuze acute si cronice - Epiteliali: - celule epiteliale aglomerate, cu nuclei mari - apar n nefrite (nsoind cilindrii granuloi), mai ales n nefritele acute i n necroza tubular acut.

- Hematici: - eritrocite conglomerate din care unele au pierdut pigmentul - indic o leziune glomerular - Leucocitari: - leucocite aglomerate n cilindri - indic prezena unor procese inflamatorii ale parenchimului renal, cu focare glomerulare sau interstiiale. Au valoare diagnostic important n pielonefrite. - Grsoi: - cu granulaii mari, glbui, se ntlnesc n sindroame nefrotice sau n proteinurii masive. - Pigmentari, hemoglobinici, mioglobinici, bilirubinici apar n condiii speciale (n hemoglobinurii de efort, n sindromul de strivire). Cilindrii adevrai trebuie difereniai de formaiunile similare care nu au o semnificaie patologic: Pseudocilindri seamn cu cilindri adevrai, fiind alctuii din urai, fosfai, sruri minerale sau din germeni ce simuleaz cilindrii granuloi (dar sunt solubili n acid acetic 3%) Cilindroizii, formaiuni cilindrice constituite din mucusul precipitat n tubii renali (aspect de panglic cu dungi, unul din capete despicat, uneori) Alte elemente Flor microbian, levuri, Trichomonas vaginalis Spermatozoizi Elemente neoplazice: celule atipice izolate sau conglomerate Material i metod a. Urin: 20 ml b. Centrifug c. Microscop cu ocular de 10x i obiectiv de 40 d. Lame de sticl pentru microscop e. Eprubete f. Pipete efilate Se recolteaz circa 20 ml de urin ntr-o eprubet, se centrifugheaz i lichidul supernatant se ndeprteaz avnd grij s nu tulburm sedimentul depus pe fundul eprubetei.

Se depun 2-3 picturi de sediment pe lama de sticl i se examineaz la microscop. Sedimentul urinar se examineaz mai nti cu un obiectiv mic ntr-o orientare general. Pentru un examen mai amnunit se va folosi un obiectiv mai puternic.

Sedimentul urinar neorganizat 1-acid uric; 2 urat de amoniu 3 - acid hipuric; 4 - oxalat de calciu

Sedimentul urinar neorganizat 1 - fosfat amoniaco magnezian; 2 - fosfat de magneziu 3 - fosfat de calciu 4 - sulfat de calciu; 5 - carbonat de calciu; 6 - fosfai teroi

Sedimentul urinar neorganizat 1 - colesterol; 2 tirozin; 3 - leucin; 4 - cistin

Sedimentul urinar organizat

Sedimentul urinar - celule

II. ANALIZA BIOCHIMIC A SNGELUI II.1. ASPECTE GENERALE Analiza biochimic a sngelui constituie unul din principalele mijloace de investigare n laboratorul clinic. Variaiile componenilor plasmatici sau eritrocitari pot da indicaii preioase asupra unor modificri la nivel celular.

Sngele este un lichid biologic cu compoziie heterogen cuprinznd masa celular reprezentat de elementele sale figurate i dintr-o soluie apoas n care acestea sunt suspendate, numit plasm. Se lucreaz pe snge integral, plasma sau ser. n primele dou cazuri recoltarea se face pe anticoagulani, care sunt diferii ( NaCl, citrat de sodiu, EDTA-disodic ). Plasma reprezint fraciunea din snge din care au fost ndeprtate elementele figurate prin centrifugare. Serul se obine din sngele recoltat fr anticoagulant. Serul reprezint fraciunea de snge integral din care au fost ndeprtate elementele figurate. O tulburare a sngelui sau plasmei ne duce la o lipemie, o coloraie verzuie la icter, iar o coloraie roz la o recoltare proast, care a dus la hemoliz. Deproteinizarea sngelui reprezint ndeprtarea proteinelor sanguine cu ageni deproteinizani diveri i ndeprtarea precipitatului format prin filtrare sau centrifugare. Recoltarea sngelui Pentru efectuarea determinrilor biochimice sngele se recolteaz de regul prin puncie venoas. n cazul determinrilor ultramicro, ori la determinarea hematocritului, se poate utiliza snge capilar, recoltat din pulpa degetului. Este recomandabil ca recoltarea s se fac dimineaa, pe nemncate. Totui, micul dejun influeneaz rezultatul numai la determinarea glicemiei, a lipidelor serice, a aminoacidemiei, a fosforului anorganic, n timp ce restul determinrilor se pot efectua chiar dac bolnavul a dejunat (excluznd binenteles o mas copioas). Folosirea plasmei sau a serului prezint importan n unele cazuri, cum ar fi determinarea unor enzime care se afl i n trombocite i deci eliberate n cursul coagulrii) fosfataza acid, lactat-dehidrogenaza i aldolaza). Folosirea serului sau a sngelui integral se poate face dac componentul de analizat are aceeai concentraie n eritrocite i n plasm (glucoza,azotul ureic). Serul sau plasma lipemic influeneaz determinrile fotometrice, mai ales dac msurtorile se fac n domeniul 300-500 nm. Unii autori recomand efectuarea unei probe n alb, dilund cu o soluie de NaCl 0,9% serul la volumul final al reaciei de culoare. Acest procedeu nu este corect, fiindc gradul de turbiditate este modificat n cursul reaciei de culoare.

Serul sau plasma icteric influeneaz prin culoarea proprie msuratorile n domeniul 400-500 nm; se poate face o corecie prin efectuarea unei probe n alb. Determinrile trebuie efectuate ct mai rapid posibil dup recoltarea sngelui. Dac aceasta nu este posibil se vor congela serurile (nu se vor pstra la 40C).Trebuie inut cont de aceast indicaie special la determinarea urmtoarelor componente; glucoza, valorile scad prin pstrarea sngelui; fosforul anorganic seric crete (determinarea se va face la cel mult 3 ore de la recoltare); potasiul seric crete dac eritrocitele nu sunt separate de ser n decurs de 60 de minute de la recoltarea sngelui; bicarbonatul trebuie determinat n decurs de o or; pH-ul sngelui crete n decurs de 4 ore de la 7,4 la 8; dac sngele ajunge n contact cu aerul, CO2 difuzeaz din eritrocite i clorul din ser i ia locul. Deci la determinarea clorului se va evita contactul cu aerul; n privina precauiilor care trebuie luate la determinarea enzimelor acestea sunt descrise la capitolul de enzime. Ca exemple de anticoagulante folosite n laboratorul clinic, amintim: oxalat de sodiu, citrat de sodiu, EDTA sodic, heparinat de sodiu, heparinat de litiu, heparinat de amoniu.

II.2. PH-ul SANGVIN O proprietate important a sngelui este nivelul de aciditate i de alcalinitate. Aciditatea crete cnd nivelul componenilor acizi din snge este ridicat sau cnd nivelul componenilor alcalini din snge scade. Capacitatea aceasta a sngelui de a menine o stare de normalitate i permanenta balan ce exist ntre cele dou extreme reprezint, de fapt, echilibrul acido-bazic. Balana ntre aciditate i alcalinitate este precis controlat, pentru c pn i o mic abatere de la normal poate afecta serios multe organe.

Organismul folosete diferite mecanisme pentru a controla echilibrul acido-bazic al sngelui. Un mecanism pe care corpul l utilizeaz pentru a controla pH-ul sngelui implic eliberarea de dioxid de carbon din plmni. Dioxidul de carbon, care este uor acid, este un produs al metabolizrii oxigenului ( de care au nevoie toate celulele ) i prin urmare este produs constant de celule. La fel ca i ceilali produi rezultai n urma metabolizrii, dioxidul de carbon este excretat n snge. Sngele l transport n plmni de unde este expirat. Pe msur ce dioxidul de carbon se acumuleaz n snge, pH-ul sngelui scade. Creierul regleaz cantitatea de dioxid de carbon care este expirat prin controlul ce-l manifest asupra vitezei i profunzimii respiraiei. Cantitatea de dioxid de carbon expirat, i implicit pH-ul sngelui, crete pe masur ce crete viteza i profunzimea respiraiei. Prin corectarea acestora, creierul i plmnii sunt capabili s normalizeze pH-ul sngelui. Rinichii sunt, de asemenea, capabili s afecteze pH-ul sngelui prin excreia excesului de acid sau de baz. Rinichii au abilitatea de a schimba cantitatea de acid sau de baz care este excretat, dar fac aceste ajustri mai incet dect plmnii, aceast compensare dureaz mai multe zile. Un alt mecanism care controleaz pH-ul sngelui implic folosirea sistemelor tampon, care intervin n cazul unor schimbri brute ale echilibrului acido-bazic. Sistemele tampon sunt reprezentate de cuplu : baz slab i acid slab, care - la pH normal - exist n echilibru. Sistemele tampon lucreaz n aa fel nct s reduc la minim schimbrile pH-ului dintr-o soluie, prin ajustarea proporiei de acid i de baz. Cel mai important sistem tampon din snge este format din acid carbonic ( un acid slab format din dioxid de carbon dizolvat n snge ) i ionul bicarbonat ( baza slab corespunztoare ). Acidoza i alcaloza sunt cele dou stri de anormalitate ale echilibrului acido-bazic. n acidoz, sngele are prea mult acid ( sau prea puin baz ) ceea ce duce la o scdere a pH-ului sngelui. n alcaloz, sngele are prea mult baz (sau prea putin acid ) ceea ce duce la o cretere a pH-ului sngelui. Acidoza i alcaloza nu sunt boli, dar adesea sunt rezultatul unei mari varieti de disfuncii. Prezena acidozei sau a alcalozei reprezint un indiciu important pentru medici pentru a identifica problemele serioase care exist. Acidoza i alcaloza sunt calificate ca fiind metabolice sau respiratorii, dependent de cauza lor primar. Acidoza metabolic i

alcaloza metabolic sunt cauzate de un dezechilibru ce apare n producia de acizi sau baze i n excreia lor de ctre rinichi. Acidoza respiratorie i alcaloza respiratorie au ca i cauz primar dezechilibre la nivelul plmnilor sau al respiraiei. Majoritatea proceselor metabolice din organism genereaz direct sau indirect cantiti apreciabile de ioni H+, ceea ce face ca ele s fie considerate n ansamblu drept procese productoare de acizi. Dintre acestea fac parte, n primul rnd, cile catabolice fundamentale ale principiilor imediate ( glucide, lipide, proteine ). Astfel, glicoliza, calea iniial de degradare a glucozei din metabolismul glucidic, conduce la formarea de acid piruvic sau de acid lactic. Fiecare molecul de glucoz ( cu 6 atomi de C ) conduce la cte dou molecule de acid piruvic sau lactic i fiecare din aceti acizi elibereaz prin disocierea carboxilului lor ioni de hirogen. Mai mult dect att, dac degradarea glucozei este continuat pe cale aerob prin antrenarea acidului piruvic la decarboxilare oxidativ i apoi ciclul Krebs, are loc o producere suplimentar de protoni, provenind din acidul carbonic format n cantitate apreciabil pe seama decarboxilrilor care au loc n cursul acestor procese. n metabolismul lipidelor, degradarea trigliceridelor are ca rezultat nc de la prima etap de desfacere hidrolitic a acestora - eliberarea acizilor grai constitutivi. Ulterior degradarea -oxidativ a acizilor grai duce la formarea corpilor cetonici ( acid -hidroxibutiric i acidul acetoacetic ) precum i la cantiti apreciabile de bioxid de carbon care ca i n cazul precedent - genereaz ioni H+ din acidul carbonic corespunztor. n cazul metabolismului proteic, formarea ureei ultimul catabolit al proteinelor din organismul uman - este un proces generator de acizi : 2NH4+ + HCO3 H2N-C-NH2 + 2H2O + H+ De asemenea, degradarea oxidativ a aminoacizilor, provenii din proteine, este i ea generatoare de acizi. Spre exemplu, din degradarea oxidativ a metioninei se elibereaz n final - cantiti apreciabile de protoni. Hrana, datorit unor componeni alimentari, reprezint i ea o surs de ioni H+ n organism. Spre exemplu, fosforul din alimente - n urma degradrilor hidrolitice i oxidative din organism - este transformat n acid fosforic (sau anionul H2PO4 care disociaz ca acid). Astfel, prin oxidarea complet a fosfolipidului complex numit lecitin rezult

cantiti mari de protoni. Dei obinerea de baze n organism are loc n mai mic msur, produsul final de oxidare n majoritatea degradrilor este baza anionic , HCO3, care se formeaz n cantiti apreciabile. Pe de alt parte, majoritatea alimentelor vegetale din hran sunt considerate surse alcalinizante, tocmai pentru c n urma degradrilor genereaz componente anionice de tipul bicarbonatului. innd seama de cele menionate aici, se ntelege c organismul este confruntat, n permanen, cu numeroase tendine acidifiante i alcalinizante care-i amenin pstrarea constant a pH-ului mediului intern. mpotriva acestor tendine organismul se apr prin utilizarea sistemelor tampon i prin alte mecanisme fiziologice. Parametrul mediului intern numit pH (reprezint logaritmul cu semn schimbat al concentraiei ionilor de hidrogen) este unul dintre parametrii biologici a crui valoare normal pentru organismul uman, este cuprins ntre limite foarte apropiate: 7.35-7.42. Variaia foarte restrans a valorii normale a pH-ului, n comparaie cu variaia valorii altor parametri ai homeostazei mediului intern, rezult din faptul c majoritatea enzimelor ce controleaz metabolismul celular au un pH optim de aciune, cu limite foarte apropiate i dependent de valorile lui extracelulare. SISTEME TAMPON. ECUAIA HENDERSON HASSELBACH. Acizii sunt substane care cedeaz H+, iar bazele sunt compui care accept H+. O pereche tampon este alcatuit dintr-un acid slab (puin disociat) i o sare a acestui acid cu un cation reactiv. Principalele astfel de sisteme tampon de la nivelul sngelui sunt reprezentate de: H2CO3 / NaHCO3; NaH2PO4 /Na2HPO4; Hemoglobin acid / Oxihemoglobinat de K; Protein acid / Proteinat de Na. Procesul de tamponare const n nlocuirea unui acid puternic, de ctre un acid slab, avnd drept consecint meninerea relativ constant a ionilor de hidrogen. Un exemplu de tamponare ar fi adaosul de acid clorhidric la sistemul acid carbonic / bicarbonat : HCl + NaHCO3 H2CO3 + NaCl Astfel, acidul tare (HCl) este transformat ntr-o sare de sodiu, iar

H+ sunt captai de anionul HCO3 (baza), formnd acidul carbonic. Acesta disociaz doar n mic masur, gradul de disociere fiind diminuat i de prezena anionilor bicarbonat provenii din disocierea srii tampon ( NaHCO3 ), conform legii maselor: [H2CO3] = K , [HCO3][H+] Creterea concentraiei de HCO3 va deplasa spre stnga sensul reaciei H2CO3 HCO3 + H+ , astfel scade disocierea acidului carbonic i eliberarea de H+. n acest fel ocul de H+ produs de acidul tare este amortizat de sistemul tampon care capteaz H+ sub form nedisociat n acceptorul de H+ (baza), care n cazul de fa este HCO3. Din ecuaia de mai sus se poate evalua concentraia ionilor de hidrogen : [H2CO3] + [H ] = K [HCO3] ntruct concentraia ionilor de hidrogen [H+] din lichidele biologice este foarte joas (de ordinul 107) s-a convenit ca msura acestei concentraii s fie exprimat de o valoare logaritmic. Noiunea de pH poate fi deci definit ca fiind : a) logaritmul negativ al [H+] b) logaritmul valorii reciproce a [H+]. De exemplu, dac [H+] = 107 pH = -log 107; respectiv pH = 7; sau 1/107 = 7.

Aplicnd noiunile de mai sus la relaia : 1 1 [HCO3] pH = log = log ( x ) [H+] K [H2CO3] respectiv : 1 [HCO3] pH = log + log

K [H2CO3] Notnd log 1/K cu simbolul pK se ajunge la expresia : [HCO3] pH = pK + log [H2CO3] care reprezint ecuaia lui Henderson i Hasselbach i este valabil pentru orice sistem tampon sub forma generalizat : [A] pH = pK + log [AH] n cazul tamponului bicarbonat / acid carbonic pK = 6.1, deci : [HCO3] pH = 6.1 + log [H2CO3] Atunci cnd raportul ntre [HCO3] i [H2CO3] este de 20, iar log 20 = 1.3, pH = 6.1 + 1.3 = 7.4. Astfel, pentru existena unui pH normal raportul ntre concentraiile de bicarbonat i de acid carbonic trebuie s fie 20 / 1 (de exemplu 24 mEq bicarbonat i 1,2 mEq acid carbonic) ori de cte ori scade numrtorul (bicarbonatul) sau crete numitorul (acidul carbonic) valoarea acestui raport scade i se va ajunge la o deviere spre latura acid, respectiv o scdere a pH-ului; invers, creterea bicarbonailor sau scderea acidului carbonic vor duce la o cretere a pH-ului, adic la o deviere spre latura alcalin. De reinut este faptul c exprimarea logaritmic a concentraiei ionilor de hidrogen, sub forma valorilor de pH poate creea o fals impresie asupra gravitii perturbrii echilibrului acido-bazic. De exemplu o scdere a pH-ului cu doar 0.3 (de la pH 7.4 la pH 7.1) indic de fapt o cretere la valori duble ale concentraiei ionilor de hidrogen de la 40 nmoli / l la 80 nmoli / l (sau sub alt form de exprimare de la 4108 la 8108). Concentraia ionilor de hidrogen are un puternic efect asupra funcionrii sistemelor enzimatice din organism. Ionul de hidrogen este puternic reactiv i se va combina cu baze sau cu ioni cu sarcin negativ, la concentraii foarte mici. Proteinele conin multe sarcini negative i grupri bazice n structura lor. Astfel, o schimbare a valorii pH-ului va modifica gradul de ionizare al proteinelor, ceea ce le poate afecta buna

funcionare. La o concentraie foarte mare a ionilor de hidrogen, structura proteinei poate fi distrus complet (vorbim aici despre proteina denaturat). Pentru a-i manifesta activitatea n condiii optime, valoarea pHului trebuie s se ncadreze ntre anumite limite (este vorba despre un interval foarte strmt). Pentru majoritatea enzimelor acest pH optim este apropiat de intervalul fiziologic al plasmei (pH = 7.35 - 7.45 sau [H+] = 35 - 45 nmoli/l). Fig.1 prezint un grafic tipic care arat variaia activitii enzimatice n funcie de pH. Se observ c activitatea este maxim la valoarea fiziologic a pH-ului ( 7.4 ). activitatea enzimatic

pH 7.4 Cu toate c majoritatea enzimelor funcioneaz normal n jurul valorii fiziologice a pH-ului, exist cteva enzime care prefer o concentraie mai ridicat a ionilor de hidrogen (la un pH mai mai sczut). Cea mai important enzim din aceast categorie este pepsina, care se gasete n mediul acid din stomac - pH 1.5 - 3 sau [H+] = 3-30 milioane de nanomoli/l. Deoarece enzimele au numeroase funcii, un pH anormal ar genera o serie de perturbri care s afecteze diferite sisteme ale organismului. Astfel, perturbri ale pH-ului pot afecta respiraia i funcia cardiac, pot interveni n coagularea sangelui i n metabolismul medicamentelor. Meninerea constant a concentraiei ionilor de hidrogen are o importan vital pentru metabolismul celular. Din acest motiv nivelul intra- i extracelular al ionilor de hidrogen este precis controlat.

Modificri minime ale titrului acestor ioni produc alterri ale ratei reaciilor chimice intracelulare, unele fiind ncetinite, iar altele accelerate. Aciunea H+ se exercit n special asupra enzimelor, fa de care au un efect denaturant. La enzimele, n al cror centru activ se afl grupri ionizabile acide sau bazice, acestea interacioneaz direct cu ionii H+ sau OH, rezultatul fiind creterea sau scderea gradului lor de disociere. MECANISME DE REGLARE A ECHILIBRULUI ACIDO BAZIC pH-ul sngelui arterial este 7.4, iar cel venos i al lichidului interstiial este de 7.35, datorit unei cantiti suplimentare de CO2 eliberate de esuturi. PH-ul intracelular este uor mai redus dect cel plasmatic, variind ntre 6.9 i 7.4. Scderea debitului circulator i hipoxia cauzeaz acumularea intracelular de acizi i scderea pH-ului celular. Limita inferioar a pH-ului sanguin compatibil cu supravieuirea este de 7, iar cea superioar de 7.7. Scderea pH-ului sanguin sub 7.4 definete starea de acidoz, n timp ce creterea peste aceast cifr, corespunde strii de alcaloz. Trebuie precizat, nc de la nceput, faptul c sistemele care controleaz echilibrul acido-bazic sunt interdependente. Aa cum s-a aratat meninerea unui pH ct mai aproape de normal este un lucru vital, de aceea perturbrile ce apar la un sistem vor influena i celelalte sisteme. Mecanismele de compensare se desfoar cu viteze diferite si rmn active perioade diferite. Meninerea constant a pH-ului mediului intern este realizat prin mecanisme: fizico-chimice: sistemele tampon biologice: plmni, rinichi, ficat, tub digestiv, tegumente. Sistemele tampon sunt prezente n toate umorile organismului; ele se combin imediat cu acizii sau cu bazele, pevenind modificrile mari de concentratie ale H+. Intervenia lor se produce n cteva fraciuni de secund. Cnd nivelul sanguin al H+ crete peste valorile normale este stimulat centrul respirator, care va modifica frecvena respiratorie. Accelerarea ritmului respirator nltur CO2 i readuce pH-ul la normal. Zilnic prin plmni se elimin 15000 mmoli de dioxid de carbon (corespunznd la 15000 mmoli de H2CO3), rezultai din metabolizarea complet a hidrailor de carbon i a lipidelor. CO2 de provenien

metabolic reprezint sarcina acid volatil. Plmnii au nevoie de 1-12 minute pentru a readuce la normal pH-ul modificat. Rinichii intervin n excreia sarcinii acide nevolatile, n reabsorbia bicarbonatului filtrat i n amoniogenez. Rinichii au cea mai mare capacitate de neutralizare a variaiilor de pH dintre sistemele de control ale echilibrului acido-bazic, dar necesit cteva ore pn la cteva zile pentru a restabili [H+]. FUNCIONAREA SISTEMELOR TAMPON Un sistem tampon este amestecul n soluie a dou substane cu aciuni complementare, n sensul c una dintre ele se opune scderii pHului determinat de adaosul unui acid, iar cealalt mpiedic creterea pHului, cauzat de adugarea unei baze. Aceste dou substane din compoziia oricrui sistem tampon pot fi un acid slab i sarea lui cu o baz tare (se opune aciunii acizilor) sau o baz slab i sarea ei cu un acid tare (se opune aciunii bazelor). Un tampon este un compus care limiteaz variaiile concentraiilor de hidrogen (i, astfel, ale pH-ului) cnd ionii de hidrogen sunt adugai sau scoi din soluie. Pentru a nelege mai uor ne putem gndi la sistemul tampon ca la un burete. Cnd ionii de hidrogen sunt n exces, buretele absoarbe excesul, iar cnd rezerva de ioni scade, buretele poate fi stors pentru a elibera ioni de hidrogen. HA H+ + A n momentul n care se adaug ioni de hidrogen n solutia tampon, ei se combin cu A (baza conjugat) i reacia este mpins spre stnga. i se formeaz mai mult HA dect prin scoaterea excesului de ioni de hidrogen din soluie. n mod similar, pe msur ce ionii de hidrogen sunt extrai din soluie prin adaugarea unei baze puternice, reacia se deplaseaz spre dreapta, refcnd concentraia ionilor de hidrogen i reducnd cantitatea de HA. Efectele sistemelor tampon pot fi, de asemenea, ilustrate grafic. Dac un acid tare este adugat ncet ntr-o soluie tampon i concentraia ionilor de hidrogen este msurat, se obine o situaie precum cea prezentat n fig.2. Se observ c pe o anumit poriune a curbei nu are loc nici o modificare. Chiar dac adugm o cantitate mare de acid, variaiile [H+] i ale pH-ului sunt mici. Importana sistemelor tampon alcaline este mai redus, deoarece n organismul uman produii de catabolism sunt n majoritate acizi.

Acizii, respectiv bazele pot fi tari sau slabi n funcie de capacitatea lor de disociere n soluie. Un acid tare este acela care disociaz n totalitate, indiferent de pH-ul mediului, elibernd mari cantiti de protoni n soluie (exemplu: HCl). Acizii slabi au o tendin mai redus de a disocia i de aceea elibereaz mai puini ioni de hidrogen (exemplu: H2CO3). Analog o baz tare este aceea care reacioneaz rapid cu H+, ndeprtndu-i complet din soluie (ex.OH ). Un exemplu de baz slab este ionul bicarbonat, ntruct acesta se combin mult mai lent cu H+, dect ionul hidroxil. Majoritatea acizilor i bazelor din organism sunt acizi i baze slabe. Ori de cte ori un acid puternic ptrunde n snge (de exemplu, acidul lactic n timpul efortului muscular), el reacioneaz cu sarea sistemului tampon, devenind astfel inactiv i cu aceast ocazie deplaseaz radicalul acid (HCO3), transformndu-l n acid carbonic, liber n plasm. Plmnul ndeprteaz H2CO3 n exces sub form de CO2 , astfel c pH-ul sanguin este meninut constant. V acid

[ H+ ]

II.3. COMPUI MINERALI N PLASM Este recomandabil ca exprimarea concentraiei electroliilor s se fac n mEg/litru. Avantajul acestei exprimri reiese din exemplul urmtor: dac n plasm concentraia clorului este 360 mg%, iar a sodiului 325mg%, s-ar prea c concentraia clorului este mai ridicat dect a sodiului; dar exprimat n mEg vom avea 142 pentru sodiu i 100 pentru clor, deci clorul este echivalent doar cu 2/3 din sodiul plasmatic. De notat c fraciunea ionizat a calciului poate fi msurat doar aproximativ n condiiile laboratorului clinic.n cazul magneziului gradul

de ionizare este n funcie de concentraia proteinelor i de pH, iar pentru fosforul anorganic raportul H2PO4-/HPO4-2 este dependent de pH. n cazul proteinelor nu se cunoate precis gradul de ionizare. Din acest motiv, exprimarea sub form de mEg/l nu este ntotdeauna indicat. Conversia din mg% n mEg/l se poate calcula folosind formula: mEg/l (mVal/l) = mg/100ml x 10 x valena / greutate atomic Folosind aceast formul s-au calculat factorii de conversiune, care permit o mai uoar conversiune din mg% n mEg/l, pentru electroliii serici. II.3.1. DOZAREA SODIULUI I POTASIULUI Cantitatea de sodiu, la o persoan de 70 de kg este de 3.700 nmoli din care 75% este sodiu schimbabil. 1/4 din cantitatea de sodiu este cunoscut ca fiind neschimbabil, ceea ce nseamn c este ncorporat n esuturi cum ar fi osul, unde nu este supus schimburilor permanente. Majoritatea sodiului nlocuibil se afl n lichidul extracelular. Concentraia de sodiu n lichidul extracelular (care include att plasma ct i lichidul interstiial) este de 140 nmoli/l. Aportul de sodiu se face n special sub form de NaCl prin ap potabil i alimente. Absorbia lui mpreun cu absorbia de Na+, coninut n sucurile digestive se face aproape complet n prima jumtate a ileonului i este practic terminat n colonul distal. La o persoan sntoas, cantitatea de Na+ total nu se schimb chiar dac absorbia de Na+ scade sau crete n 24 h. Pierderile de Na+ sunt i ele variabile. Practic excreia urinar de Na+ este paralel cu absorbia. Cea mai mare parte din Na+ se elimin pe cale urinar, adic 95%. n timpul transpiraiei se elimin 0,5% iar prin materiile fecale 4,5%. Este foarte important acest aspect din punct de vedere clinic, n special n practica pediatric. Secreia de Na+ este controlat de ctre doi hormoni: aldosteronul i peptidul natriuretic atrial. Potasiul este un electrolit localizat cu predominan intracelular, astfel c variaiile potasiului plasmatic dau doar indicaii aproximative asupra cantitii totale de potasiu din organism. 2% din potasiul total este distribuit ntre spaiul interstiial i cel plasmatic. Concentraia seric este de 4,5 mEq/l. Se gsete fixat de

proteine ndeplinind astfel un rol plastic. K+ are un rol important n fenomenele de membran, n procesele de permeabilitate, influeneaz transmiterea influxului nervos i excitabilitatea neuromuscular. Pentru dozarea acestor dou elemente se folosete astzi fotometria de flacr, metoda fizic foarte rapid, care nu necesit dect cantiti foarte mici de snge. Metodele chimice mai vechi sunt foarte laborioase, necesit cantiti importante de snge, motiv pentru care nu se mai folosesc astzi. Principiu. Proba se introduce n flacr i pentru o temperatur constant a flacrii n anumite condiii, intensitatea radiaiei emise este proporional cu concentraia metalului n soluie. Se determin intensitatea liniei emise, selecionate cu ajutorul unor filtre (de interferen, specifice fiecrui metal). Aparatura : fotometrul cu flacr, vase din material plastic pentru pstrarea soluiilor etalon i efectuarea diluiilor, pipete, baloane cotate sau biurete. Reactivi : Ca regul general, toi reactivii vor fi pstrai n flacoane de polietilen i nu n vase de sticl, fiindc silicaii din sticl cedeaz mai mult sau mai puin ionii de sodiu i potasiu n soluie. La prepararea soluiilor etalon se va folosi ap bidistilat sau tridistilat. Soluiile etalon se prepar din NaCl i KCl uscate n prealabil timp de 24 de ore la 1100C ntr-o etuv i lsate s se rcesc ntr-un exicator. 1. Soluie etalon NaCl: 7,35 g NaCl, 5 ml formaldehid 40% i ap bidistilat ad 1000 ml. Soluia conine 3mg Na/ml i se dilueaz 1/500 la folosire. 2. Soluie etalon KCl:1.91g KCl, 5 ml formaldehid 40% i ap bidistilat ad 1000 ml. Soluia conine 1mg K/ml i se dilueaz 1/100 n momentul folosirii. Tehnica de lucru 1. Dozarea se poate face pe ser sau plasm. n primul caz decolarea cheagului nainte de centrifugare produce o uoar hemoliz, ceea ce introduce o eroare important, avnd n vedere c hematiile conin de 20 de ori mai mult K dect plasma. Dac se lucreaz pe plasm, sngele se va recolta pe anticoagulant lipsit de Na si K (heparinat de litiu i amoniu) i se vor separa hematiile n prima or dup recoltare, astfel se obin valori fals crescute pentru K. Practic se recolteaz 5 ml snge pe cteva picturi de heparinat de litiu, eventual direct ntr-un tub de centrifug. 2. Diluiile serului sau ale plasmei variaz n funcie de aparat. Diluiile se aleg n funcie de curba de etalonare utilizat (fcut cu

soluiile etalon). Se recomand ca diluiile s se fac cu foarte mare grij, iar pentru msurarea apei bidistilate se recomand folosirea unei biurete, n acest caz eroarea de msurare a volumului fiind constant. Practic, se poate proceda n felul urmtor: se pipeteaz 0,1 ml ser ntr-un flacon de material plastic i se adaug 9,9 ml ap bidistilat dintro biuret de 10 ml. Se agit bine. Se ia 1 ml din aceast soluie (1/100), se introduce n alt flacon i se adaug 4 ml ap bidistilat din biuret. Se obine astfel diluia de 1/500. Pentru adaptarea ultramicroanalitic se iau 50l ser i 4,95 ml ap pentru diluia 1/100. Din aceasta se ia 1 ml i se adaug 4 ml ap (diluia 1/500). Valori normale : Vrsta Na (mEg/l) K (mEg/l) n.nscui 130-139 3,5-5,1 48 ore 130-146 3,9-4,7 5 zile 135-146 3,8-5,1 Luna1 139-146 4,1-5,3 Lunile 5-7 137-155 3,8-5,3 Lunile 11-15 135-144 3,8-5,4 2-3 ani 138-145 3,5-4,7 Aduli 135-150 3,4-5,4 II.3.2. DOZAREA CALCIULUI Calciul se afl n plasm sub trei forme: a. calciu ionic b. calciu legat de proteine c. o mic fraciune complexat cu citratul. Calciul ionic reprezint fraciunea de care depinde excitabilitatea neuromuscular, avnd deci importan patogenetic. n laboratorul clinic nu exist nc metode de rutin pentru dozarea calciului ionic. Astfel de msurtori se pot face cu electrode ion selective care nu au intrat nc n practic. Din determinarea calciului total i a proteinelor se poate evalua doar n mod aproximativ calciul ionizat dup o nomogram, numit nomograma ZEISSLER. Pe baza acestei nomograme s-a elaborat urmtoarea formul de

calcul: mgCa ionizat/100ml = (6xCa-P/3 ) / 6 + P , n care: Ca calciul total n mg/100ml P proteinemia n g/100 ml. Valorile normale pentru calciul ionic sunt de 4,2-5,2 mg/100ml, respectiv 2,1-2,6 mEg/l. Calciul total se poate determina prin cele trei metode amintite la dozarea calciului urinar. Valorile normale pentru calciu total sunt cuprinse ntre 9-11,6 mg/100ml. II.3.3. DOZAREA MAGNEZIULUI Este un cation localizat predominant intracelular. Peste 300 de sisteme enzimatice sunt influenate de magneziu. El ndeplinete un rol important n metabolismul intermediar al glucidelor, lipidelor, i proteinelor i favorizeaz absorbia calciului, potasiului, fosforului i sodiului. Reducerea concentraiei de magneziului extracelular provoac modificri ale permeabilitii de membran. Magneziul seric se gsete n concentraie de 1,92-2,3 mg/dl. Aproximativ 30% din magneziul ingerat este absorbit la nivelul intestinului subire i distribuit esuturilor activ Exist variate metode de dozare a magneziului n lichidele biologice. Determinarea prin spectrofotometrie de absorbie atomic; este specific i foarte sensibil. Determinarea prin fotometrie de flacr este posibil doar cu anumite tipuri de aparate, iar exactitatea nu este suficient demonstrat. Tehnicile bazate pe precipitarea Mg ca fosfat de magneziu i amoniu sau cu 8-hidroxi-chinoleina sunt nespecifice i laborioase. Metodele care se bazeaz pe formarea unui colorant rou de ctre Mg i galben de titan prezint dezavantajul instabilitii culorii obinute i a specificitii insuficiente. Metoda complexonometric este privit cu rezerv. Metoda fluorometric este specific, sensibil i rapid, ns necesit aparatur special. Metoda de elecie n aceast situaie este cea care utilizeaz colorantul Mann i Yoe, reactiv de culoare specific pentru magneziu, care prezint avantajul sensibilitii i

rapiditii. Metoda cu galben de titan. Principiu. n soluie puternic alcalin, magneziul din ser formeaz particule coloidale de Mg(OH)2. Colorantul galben titan este absorbit pe aceste particule i formeaz un complex colorat n rou care este apoi stabilizat cu alcool polivinilic i fotometrat la 540 nm. Reactivi 1. Soluie stoc galben titan. Se dizolv 0,5g galben de titan n 100 ml ap bidistilat. Reactivul este stabil i se pstreaz n sticle de polietilen. 2. Reactiv galben titan (soluie de lucru ). Se dilueaz 2 ml din soluia stoc la 100 ml cu ap bidistilat. Se prepar proaspt de fiecare dat. 3. NaOH 7,5% 4. Reactiv alcool polivinilic: se dizolv 1g alcool polivinilic n 400ml ap bidistilat, nclzindu-se uor. Se rcete i se aduce la 1000 ml cu ap bidistilat. Soluia este stabil i se pstreaz n sticle de polietilen. 5. Standard de Mg (soluie stoc). Se dizolv 8,358g clorura de magneziu hidratat sau 8,8178g acetat de magneziu cristalizat cu 4 molecule de ap, n ap distilat i se aduce volumul la 1000ml. 6. Standard de lucru. Se dilueaz 1 ml din soluia precedent la 200 ml cu ap distilat. Se prepar de preferin proaspt. Aceast soluie conine 5g ioni de Mg/ml. Tehnica de lucru Se pregtesc 4 eprubete pentru prob, proba n alb i dou probe standard (standard1 i standard 2 ), n care se adaug reactivii conform urmtorului tabel: Reactivi (ml) Ap bidistilat Ser S de lucru Alc.polivinilic R.2 R.galben titan NaOH 7,5% P 2,8 0,2 -0,5 0,5 1 Pa 3 0,5 0,5 1 S1 2 1 0,5 0,5 1 S2 2 1 2 0,5 0,5

Dup 5 minute se citesc extinciile probei i probelor standard la 540 nm fa de proba n alb. Coloraia este stabil o or. Calcul Pentru calcul se folosete standardul a crui extincie este cea mai apropiat de extincia probei de analizat. Pentru standardul 1: Ep/Es1 x 0,005 x 100/0,2 = mg Mg/100 ml Ep/Es x 2,5 = mg Mg/100ml Pentru standardul 2: Ep/Es2 x 0,01 x 100/0,2 = mg Mg/100ml Ep/Es x5 =mg Mg/100ml Valori normale: 1,8-2,9 mg/100ml ( 1,5- 2,4 mEg/l) II.3.4. DOZAREA CLORULUI Clorul reprezint principalul anion al plasmei i poate fi dozat prin titrare cu azotat de mercur sau de argint, prin metode colorimetrice sau poteniometrice. Procedeul titrimetric Schales si Schales Principiu: Ionii de clor sunt determinai prin titrare n mediu acid ( pH sub 3) cu azotat mercuric, cu care formeaz clorura mercuric nedisociat. Ct vreme sunt prezeni ionii de clor, ionii de Hg+2 reacioneaz pentru a forma HgCl2. La punctul final ionii de Hg+2 n exces reacioneaza cu indicatorul (difenilcarbazona) dnd o coloraie violet. Tehnica de lucru Se pipeteaz n 2 pahare Erlenmeyer de 25 ml urmtoarele soluii: Reactivi (ml) Ser Standard clorura Sol.H2SO4 Ap distilat Difenilcarbazona Proba 0,1 1 pic. 1 2 pic. Standard 0,1 1 pic. 1 2 pic.

Se agit uor pentru amestecarea componentelor i se titreaz cu o soluie de azotat de mercur o,o1N pn la prima apariie a unei culori violete, dar persistente. Se noteaz volumul de soluie n ml.

Reactivi: 1. Soluia de azotat de Hg 0,01 N: 1,083g de oxid rou de mercur sunt dizolvai n 11 ml HNO3 conc. i se dilueaz cu ap bidistilat la 1000ml. Soluia se mai poate prepara i din azotat mercuric, din care se dizolv 1,6g n 10 ml HNO3 i cca 700 ml ap , dup aceea se aduce volumul la 1000ml, 2. Soluia indicator difenilcarbazona 0.01 M: se prepar ct mai puin soluie n proporia: 5 mg difenilcarbazona la 2 ml metanol sau etanol 950. Se pstreaz n frigider n flacon de culoare brun de preferin din polietilen i se utilizeaz timp de o lun. Dup aceast perioad culoarea soluiei se schimb din portocalie-roietic n galben, iar detectarea punctului final devine dificil. 3. Soluia H 2SO4 conc. i 53 pri de ap. 4. Soluie standard clorura de potasiu 0,1N: se dizolv 7,455g KCl ( uscat i rcit n exicator) n ap bidistilat i se completeaz cu ap la 1000 ml dup ce se adaug 1 ml cloroform. Se conserv un an la frigider, n vas de polietilen. 5. Soluie de wolframat de Na 10%. Calcul Fiecare ml soluie azotat mercuric corespunde la 0,01 echivaleni de clor. De aceea avem: mEg clor/l = (1000 x ml azotat mercuric x 0,01) / 0,1 sau: ml azotat mercuric x 100 = mEg/l ml azotat mercuric x 586 = mg NaCl/100ml ml azotat mercuric x 354,5 mg Cl/100 ml Aceast formul este valabil dac la titrarea soluiei de KCl s-a folosit 1 ml azotat mercuric. Dac acest volum difer de 1 ml se va utiliza formula: mEg Cl/l = [ml azotat mercuric(proba) / ml azotat mercuric (standard) ] x 100 Valori normale: n mEg/l. Nou-nscut 48 de ore 5 zile 102-112 luna 1 lunile 5-7 lunile 11-15 96-116 95-118 95-110 96-120 102-107

2-3 ani 101-108 aduli 97-108 Exprimat n mg NaCl/100 ml concentraia normala n ser este pentru aduli de 580-630. Dozarea clorului globular i plasmatic Raportul clor globular/plasmatic, nu aduce dect puine date practice, notndu-se o cretere a raportului n acidoz i o scdere n alcaloz. Folosind metoda Schales i Schales se procedeaz n felul urmtor: 1. Se determin hematocritul i se noteaz cu g valoarea n procente a elementelor figurate i cu p valoarea n procente a volumului plasmei. 2. Se determin clorul plasmatic folosind volumul de lucru indicat la ser, lund ns n loc de ser 0,1 ml plasm. 3. Se determin clorul total lund urmtoarele cantiti: 0,4 ml snge total, 3,2 ml ap distilat, 0,2 ml acid sulfuric 2/3N, 0,2 ml wolframat de sodiu, se amestec bine, i se centrifugheaz. Se transfer 2 ml din supernatantul clar ntr-un pahar Erlenmeyer pentru titrare, se adaug 2 picturi indicator difenilcarbazona i se efectueaz titrarea. La exprimarea rezultatului se va nmuli numrul de ml azotat mercuric utilizai numai cu 50 n loc de 100, fiindc 2 ml supernatant corespund la 0,2 ml snge. 4. Se calculeaz acum valoarea clorului globular dup formula: Clglobular = (Cl total x 100) (Cl plasmatic x p ) / g Raportul eritroplasmatic va fi: clor globular/ clor plasmatic. Valori normale: clor plasmatic: 365mg% 100-105 mEg/l clor globular: 180 mg% 50-52 mEg/l raport eritroplasmatic: 0,50 0,52.

II.4. OSMOLARITATEA PLASMEI Osmolaritatea (presiunea osmotic) este dat de numrul de molecule solvite n plasm. Aceste particule dizolvate de care depinde presiunea osmotic se numesc osmoli (un mol = un osmol). Pentru moleculele care disociaz fiecare ion reprezint un osmol. n cazul plasmei sau serului, osmolaritatea se exprim n miliosmoli, care pentru electrolii corespund cu miliechivalenii. Presiunea osmotic a plasmei poate fi m[surat n funcie de scderea punctului de congelare al apei distilate (punct crioscopic). Punctul crioscopic scade cu 0,010C pentru fiecare 5,4 miliosmoli. De exemplu pentru o scdere a punctului crioscopic de la 00C la 0,560C corespund 272 milosmoli (milimoli). Determinarea osmolaritii poate fi efectuat astzi cu mare precizie i rapiditate (n cteva minute) cu ajutorul osmometrelor automatizate care furnizeaz rezultate directe n miliosmoli la litru. Valorile normale obinute cu aceast metod sunt

de 285-290 miliosmoli/litru. Conform calculului (suma anionilor i cationilor), osmolaritatea ar fi de 300-310 miliosmoli. n general, coninutul n sodiu al serului furnizeaz o msur destul de corect a osmolaritii. n absena unei retenii azotate sau a unei hiperglicemii severe, osmolaritatea (miliosmoli/l) = 2,1 x concentraia sodiului mEg/l. n caz de azotemie marcat se poate calcula numrul de milimoli (miliosmoli) dai de uree nmulindu-se valorile ureei serice (mg/100ml) cu 10 i mprindu-se la 60 (greutatea molecular a ureei). Pentru a afla numrul de milimoli dai de glucoz, valorile glicemiei n mg/100 ml se nmulesc cu 10 i se divid cu 180 (greutatea molecular a glucozei). Ex: Glicemie = 360 mg/100ml. (360 x10) / 180 = 20 milimoli dai de glucoz. Scznd numrul de milimoli dat de uree i glucoz din valorile obinute cu ajutorul osmometrului se obine numrul de milimoli dat de electrolii (respectiv miliechivaleni electrolii). INTERPRETAREA MODIFICRILOR PATOLOGICE ALE ECHILIBRULUI HIDROMINERAL Modificrile patologice ale metabolismului apei i sodiului realizeaz urmtoarele aspecte mai caracteristice: a. Pierderea n exces a apei (deficitul de ap), care se poate instala n caz de: secreie sudoral excesiv, diarei cu scaune fluide, vrsturi abundente, diabet insipid, aport insuficient. Se constat o scdere a volumului extracelular, hemoconcentraie, o cretere a sodemiei i a presiunii osmotice. Ureea sanguin poate fi uor crescut. b. Pierderea n exces a srurilor (deficitul de sodiu), se constat n: pierderi de ap i sodiu ( vrsturi, diaree, transpiraii) urmate de administrarea de ap per os sau n perfuzii; pierderi renale de sruri n boala lui Addison sau n lips de rspuns al tubilor renali de aldosteron (pseudo-Addison). Laboratorul evideniaz o hemoconcentraie i o cretere moderat a ureei. Mai trziu apar hiponatremia i scderea presiunii osmotice. c. Retenie n exces a apei ( excesul de ap) survine n dou situaii n care mecanismele homeostatice sunt inadecvate: n caz de administrare necontrolat de lichide srace n sodiu la un bolnav cu insuficien renal; administrarea de lichide hipotone pe fondul unei

secreii crescute de vasopresin (bolnavi infectai, stri postoperatorii). Laboratorul evideniaz o scdere a sodiului plasmatic i binenteles o hemodiluie. d. Excesul de sruri survine rareori n form pur; poate fi ntlnit dup administrarea intravenoas de soluii hipertonice la bolnavii anurici sau la naufragiaii care ingereaz ap de mare. Se constat o hipernatremie i o cretere a presiunii osmotice. e. Retenia de ap i sruri duce la o cretere a lichidului interstiial i realizeaz edemele cu mecanisme de producere difereniat n funcie de condiiile de apariie (ciroze, afeciuni renale, insuficien cardiac). De notat c n astfel de situaii concentraia plasmatic a sodiului nu este crescut fiind mai adeseori sczut. n schimb sodiul extracelular total determinat cu sodiu marcat este mult crescut. Modificrile concentraiei sodiului plasmatic urmeaz de regul variaiile osmolaritii, constatndu-se hipersodemie n hipertoniile osmotice i hiposodemia n hipotonie osmotic. Clorul plasmatic scade dup pierderi saline (stenoz piloric cu vrsturi incoergibile) i crete n unele acidoze (acidoza hipercloremic). Anomaliile metabolismului potasiului realizeaz: a. Depleia de potasiu, care poate surveni n: vrsturi, diaree, fistule intestinale; pierderi pe cale urinare n caz de insuficien a procesului de reabsorbie tubular a potasiului (de ex. n perioada poliuric a unei insuficiene renale acute sau n diabet zaharat, cu poliurie i acidoz, tratat cu insulin).Pierderi urinare de potasiu survin i n caz de hiperaldosteronism. Alcalozele evoleaz de regul cu hipopotasemie. n caz de deshidratare i reducere a volumului lichidului extracelular, depleia n potasiu poate fi mascat i se evideniaz abia dup refacerea volumului plasmatic n urma administrrii de lichide. b. Hiperpotasemiile care survin atunci cnd viteza de ieire a potasiului din celule depete posibilitile de excreie. Creterea potasiului seric se ntlnete n special n insuficienele renale acute cnd potasemia poate depi 7 mEg/l. Creteri moderate se constat n insuficiene suprarenale, n caz de tratament cu inhibitori ai aldosteronei (aldosteron) sau dup administrri terapeutice, la un bolnav oliguric.Acidozele evolueaz de regul cu hiperpotasemie. Anomaliile metabolismului calciului, fosforului i magneziului

pot fi grupate astfel: Hipocalcemiile pot interesa fraciunea calciului ionic. Scderi ale calciului legat de proteine survin n hiperhidratri, sindrom nefrotic i denutriie i nu au efect asupra excitabilitii neuromusculare. Scderi ale calciului ionic survin n hipoparatiroidism (asociate cu o cretere a fosfailor), n rahitism i osteomalacie (asociate cu o cretere a fosfailor i bineneles a ureei sanguine). Hipercalcemiile, datorate creterii fraciunii legate de proteine, survin n deshidratri cu hemoconcentraie. Creteri de calciu ionic se ntlnesc mai ales n hiperparatiroidism (asociate cu scderi ale fosfailor i creterea fosfatazei alcaline). Creteri moderate pot fi depistate n tireotoxicoz, supradozaj de vitamine D precum i dup ingestie de cantiti mari de preparate de calciu sau de lapte. Scderea magneziului se poate constata n urma diareelor i vrsturilor, n unele cazuri de hiperparatiroidism, n hiperaldosteronism, dup diuretice i n unele ciroze alcoolice n special n crizele de delirium tremens. Creterea magneziului seric se ntlnete rareori n mod izolat. Ea poate fi constatat n insuficien renal alturi de retenia altor substane. II.5. DOZAREA GLUCOZEI Dozarea glucozei este o metod de rutin n laborator. Determinrile se fac pe eantioane de snge, care au fost recoltate n condiii bazale, fie n tuburi coninnd fluorur de sodiu, un inhibitor de glicoliz, fie din sngele capilar. Pentru a obine rezultatele imediat se pot utiliza testele rapide larg rspndite la pacienii diabetici. Mult vreme dozrile de glucoz s-au bazat pe proprietatea reductoare a acestei hexoze (reducerea hidroxidului cupric, reducerea fericianurii). Trebuie precizat ns c substanele reductoare din snge cuprind alturi de glucoz i ali compui cum ar fi glutationul, acidul ascorbic, glicuronizii i acidul uric, etc. Din acest motiv valorile glicemiei obinute prin astfel de metode sunt cu aproximativ 10 mg ( i n unele condiii chiar cu 20 mg) mai ridicate dect rezultatele obinute prin metoda enzimatic specific cu glucozooxidaza. n ultimii ani s-au introdus ns metode rapide colorimetrice bazate pe reacii directe ntre glucoz i un cromogen (orto-toluidina, antrona) i care dau rezultate

mai apropiate de valorile obinute prin dozarea enzimatic specific a glucozei. Pentru a preveni glicoliza n sngele recoltat este recomandabil ca recoltarea sngelui pentru determinri de glucoz s se fac pe florura de sodiu (aproximativ 10 mg/ml snge). 1. Metode reductive Metodele reductive se bazeaz pe caracterul reductor al glucozei asupra unor oxidani blnzi, ioni metalici: Cu+2 , Bi+3, Ag +,Hg+2, Fe+3 . a. Metoda Nelson Glucoza reduce CuSO4 n mediu alcalin la Cu2O, care reacioneaz cu arsenomolibdatul de amoniu formd un compus colorat, colorimetrabil. b. Metoda Hagedon-Jensen Glucoza reduce fericianura la ferocianur, iar excesul de fericianur oxideaz I- la I2, care se titreaz cu Na2S2O7 n prezena amidonului. c. Aciunea glucozei asupra iodului Glucoza reduce I- la I2, iar excesul de iod se titreaz cu tiosulfat de sodiu.n general aceste metode reductive sunt metode laborioase, nu foarte sensibile i nu sunt specifice. 2. Metode enzimatice Acestea sunt cele mai specifice, se preteaz la automatizare i sunt rapide. a. Metoda enzimatic cu glucozoxidaz Glucozooxidaza (GOD) catalizeaz oxidarea glucozei dup ecuaia:
2 G + H 2O acidglucon+ H 2O2 ic H 2O2 + DH2 D + 2H 2O

G glucoza DH2 - colorant reductor D colorant oxidat Glucozooxidaza este o enzim bacterian FAD-dependent. Astfel reacia poate fi scris:
G + FAD gluconolac + FADH 2 tona

glucono lactona H 2O acid gluconic +

FADH 2 + O2 FAD + H 2O2

Oxigenul eliberat, de peroxidaza POD din apa oxigenat format, oxideaz orto-dianisidina, formnd un compus colorat, a crui coloraie este proporional cu concentraia glucozei. b. Metoda enzimatic cu glucozo-dehidrogenaz Gluco-dehidrogenaza este o enzim NAD-dependent, care catalizeaz oxidarea glucozei la acid gluconic. Reaciile care au loc sunt urmtoarele:
G + NAD + glucono lactona NADH + H + +

glucono lactona H 2O acid glicinic +

3. Metode bazate pe obinerea de furfural Glucoza n mediu acid i la cald pierde o molecul de ap transformndu-se n derivat furfuralic. Acesta se poate condensa cu otoluidina formnd compui colorai, care se pot colorimetra. Aceast metod este sensibil, specific pentru aldohexoze i se preteaz la automatizare. Dozarea glucozei o-toluidin Glucoza formeaz n prezena o-toluidinei n mediu de acid acetic, la cald, un compus colorat n verde, care se dozeaz fotometric. Tehnica de lucru n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Ser Standard glucoza Ap distilat o-toluidina P 0,1 3 S 0,1 3 M 0,1 3

Eprubetele astupate se in pe o baie de ap adus la fierbere timp de 8 minute. Dup rcire (8 mi) se citesc Ep i Es fa de martor la o lungime de und de 630 nm. Calcul mg glucoza/100 ml snge = Ep/Es x 100 n condiii normale glucoza sanguin variaz ntre 80-120 mg/100ml snge integral.Glicemia variaz fiziologic cu alimentaia i n

funcie de unii factori externi: frig, emoie, effort muscular.Scderea exprimat a glucozei sanguine (hipoglicemia) se constat de cele mai multe ori dup administrarea unor doze excesive de insulin i alte preparate hipoglicemiante (de ex. Tolbutamid). Hipoglicemii se constat i n adenoame ale insulelor Langerhans (Insulinom) precum i insuficiene hepatice grave, insuficiena hipofizar sau insuficiena suprarenal. Hiperglicemia trectoare se poate observa postprandial sau n legtur cu stri emoionale sau dup administrarea de catecolamine. Hiperglicemiile de durat sunt caracteristice pentru diabetul zaharat clinic manifest. n formele de diabet asimptomatic (chimic), glicemia a` jeun este adeseori normal iar defectul metabolic se evideniaz prin probe de ncrcare. Cea mai des utilizat prob de ncrcare const n administrarea pe cale oral a 50 g glucoz ( sau 1g/kg greutate corporal) dizolvat n 250 ml ap i urmrirea glicemiei din 30 n 30 de minute, pe timp de 2 ore sau 2 ore . La subieci normali creterea maxim a glicemiei dup ncrcare nu depete 160 mg/100 ml, iar la dou ore de la administrarea glucozei, glicemia trebuie s fie sub 120 mg/100 ml. n diabetul zaharat nivelul maxim al hiperglicemiei atinge cifre mari dup 1-2 ore, iar revenirea la o valoare apropiat de cea iniial dureaz 3-5 ore. La subiectul prediabetic timpul de revenire a glicemiei la valoarea iniial se situeaz ntre normal i diabetic. Glucoz nmol/l

Aspectul curbelor de glicemie realizate prin testul de toleran la glucoz Tolerana fa de glucide este sczut n diabet, hiperadrenalism, acidoz, caexie, boli hepatice, boli infecioase. Tolerana crescut apare n boala lui Addison, hiperinsulinism.

II.6. DOZAREA LIPIDELOR SERICE Implicarea lipidelor n etiologia aterosclerozei, hipertensiunii i n general a bolilor cardiovasculare este un fapt unanim acceptat, cu toate c exist controverse legate de regimurile alimentare.Astfel analiza colesterolului i a altor lipide a devenit o analiz foarte solicitat. n organism lipidele se gsesc sub form de: a. structuri, cum sunt membranele celulare, mitocondriale. b. depozite, n tesutul adipos c. transport, cum sunt lipidele plasmatice n funcie de structura lor chimic, lipidele se mpart n: a. acizi grai, avnd catene de atomi de carbon i hidrogen cu lungimi variabile cuprinse ntre: 4-22 atomi de carbon. Acizii grai pot fi saturai sau mono-, di-, tri, tetranesaturai n funcie de numrul dublelor legturi. Acizii grai pot fi liberi (neesterificai) i esterificai cu gliceroli. b. Trigliceridele sau grsimile neutre conin glicerol i cte

trei acizi grai per molecul (esterificai). c. Fosfolipidele au o structur mai complex, coninnd pe lng glicerol i acizi grai, acid fosforic i o baz azotat (de ex. Colina). d. Hormonii e. Acizii biliari, care au ca i precursor colesterolul Lipidele, se mai pot clasifica n: chilomicroni, formai din: trigliceride, fosfolipide, esteri ai colesterolului, colesterol liber, proteine. acizi grai liberi (AGL) reprezint forma de mobilizare a grsimilor din esutul adipos i de transport spre ficat i esuturile consumatoare de energie. Lipoproteinele reprezint forma de transport a lipidelor sintetizate n ficat pe seama lipidelor alimentare sau a AGL. Se pot separa prin ultracentrifugare sau electroforez n trei fraciuni principale: - alfa-lipoproteine densitate: 1,7-1,2 (HDL) - beta-lipoproteine 1,0-0,06 (LDL) - prebeta-lipoproteine 0,965-1,0 (VLDL) DOZAREA LIPIDELOR TOTALE Serul se nclzete cu acid sulfuric concentrat fr precipitarea prealabil a proteinelor, i apoi se trateaz cu reactiv: acid fosforicvanilin. Lipidele serice dau o culoare roz prin reacia sulfo-fosfovanilic. Reactivi: 1. Reactiv de culoare (H3PO4 11,9M + vanilina 8mM) Se dizolv 5g KH2PO4 n 90 ml H2SO4 conc.Dup rcire, se adaug ncet 70 ml ap, agitnd cu grij. Se adaug 240 ml vanilin. 2. Standard: 100mg lipide/100 ml. (75 mg colesterol n 100 ml acid acetic glacial sau 1g ulei de msline n 100 ml alcool absolut) 3. Acid sulfuric concentrat Tehnica de lucru. n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi(ml) Ser Standard Ap distilat Acid sulfuric conc. P 1 2 S 1 1 2 M 2

Se agit eprubetele i se in 10 minute ntr-o baie de ap n fierbere. Se rcesc, dup care se preleveaz cte 1 ml din fiecare eprubet n alte 3 eprubete: P, S i M la care se adaug 1 ml reactiv de culoare. Se msoar Ep i Es fa de martor la 520 nm. Calcul mg lipide totale/100 ml ser = Ep/Es x 1000 Interpretare Valorile normale ale lipidelor totale variaz n funcie de factorii genetici, de modul de via i alimentaie. Se admite ca valori normale: 500-700 mg/100 ml snge, ntre care: - trigliceride: 50-150mg% - fosfolipide: 150-220mg% - colesterol total: 150-220mg% - AGL: 12-16mg% - glicerol: 0,6-1,5mg% - corpi cetonici: 1,5-3mg% Copiii sub un an au valori sub 300mg%. Variaii patologice: - Hiperlipemii primare sau familiale cauzate de un deficit cu caracter genetic n metabolismul lipidic. - Hiperlipemii secundare ce apar n diabet, alcoolism, insuficiena renal, cronic, sindromul nefrotic, hipotiroidism, acromegalie, sindrom Cushing, boala lui Addison, glicogenoze, hipercalcemie, graviditate, obstrucia cilor biliare, porfirii. - Hipolipemii primare cauzate defitul genetic n procesul de biosintez a lipoproteinelor. - Hipolipemii secundare apar n denutriii severe, anemii severe, hipertiroidism, ciroze avansate, insuficien hepatic. Determinarea lipidelor totale prin metoda turbidimetric Principiu. Lipidele din serul deproteinizat cu alcool izopropilic dau cu acidul tricloracetic o opalescen a crei intensitate este proporional cu concentraia lipidelor din ser. Reactivi: 1. Alcool izopropilic 2. Acid tricloracetic 10% 3. Standard. Se dizolv 5 mg triolein/ml n alcool izopropilic. Tehnica de lucru

n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Ser Standard Alcool izopropilic P 0,1 2 S 0,1 2 M 2

Se agit 2-10 minute, apoi se las n repaus. Se centrifugheaz 5 minute la 3000 turaii/minut. Supernatant Acid tricloracetic 0,5 3 0,5 3 0,5 3

Se agit, se las n repaus 60 de minute, iar citirile se fac la 450nm, n cuve de 1cm fa de martor. Calcul mg lipide% = Ep/Es x 500 II.7. DOZAREA COLESTEROLULUI Determinarea colesterolului total prin metoda Rappaport Colesterolul se gsete n snge, fie liber, fie esterificat, legat de alfa- i beta-globuline. Principiu Colesterolul formeaz cu acidul sulfuric i anhidrida acetic compui intens colorai n verde. n prezena acidului sulfosalicilic se poate lucra fr deproteinizare, proteinele rmnnd n soluie. Reactivi: 1. Reactiv de culoare.Se amestec 305 ml anhidrid acetic cu 195 ml acid acetic glacial rcind sub robinet. Se dizolv 5,5 g acid sulfosalicilic n acest amestec. Se conserv o lun la temperatura camerei n sticl brun. 2. Acid sulfuric concentrat 3. Standard colesterol: 250mg/100ml Tehnica de lucru Se pipeteaz n 3 eprubete urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Ser P 0,1 S M -

Standard Reactiv de culoare

2,5

0,1 2,5

2,5

Coninutul celor 3 eprubete se agit energic, se las 5 minute la temperatura camerei, apoi se adaug n fiecare eprubet cte 0,5 ml acid sulfuric concentrat. Se agit puternic i se las 10 minute la temperatura camerei. Se msoar extincia probei de analizat ai probei standard n raport cu martorul la 620nm. Calcul mg colesterol/100 ml ser = Ep/Es x 250 Dozarea colesterolului liber i esterificat Principiu Se precipit colesterolul liber cu digitonina. Rezultatul obinut se scade din colesterolul total obinndu-se colesterol esterificat. Reactivi: 1. Amestec de alcool etilic 960 i acetona n proporie de 1:1 2. Soluie digitonina 1% n alcool etilic 50% (98,15 ml ap distilat + 100 ml alcool etlic 960 ) 3. Soluie clorur feric 0,05% n acid acetic glacial 4. Acid sulfuric concentrat. 5. Acetona p.a. 6. Soluie standard colesterol 200mg%. Tehnica de lucru ntr-o eprubet de centrifug se msoar 9 ml amestec alcool etilicaceton i se adaug 1 ml ser. Se agit eprubeta, apoi se introduce ntr-o baie de ap unde se fierbe timp de 2 minute. Dup rcire se centrifugheaz. Din supernatant se msoar 1 ml n alt eprubet de centrifug adugndu-se 1 ml soluie de digitonin 1%. Se agit puternic, iar dup 10 minute se centrifugheaz timp de 5 minute la 3000 turaii / minut.Supernatantul se ndeprteaz i se adaug 2 ml aceton, se agit puternic eprubeta, apoi se centrifugheaz timp de 10 minute la 3000 turaii/minut.Supernatantul se ndeprteaz. Peste precipitat se adaug 10 ml soluie clorur feric 0,05%, precipitatul se dizolv. Se iau 3 ml amestec din soluie peste care se adaug 5 ml soluie de acid sulfuric concentrat. Se rcete i se citete la fotometru la 570 nm. Se pregtete n paralel i o prob standard, n condiii asemntoare folosind soluia

standard de colesterol n loc de ser.Proba martor se prepar din 5 ml soluie de clorur feric 0,05% i 3 ml acid sulfuric concentrat. Calcul mg colesterol liber/100 ml = Ep/Es x 200 Valori normale: pn la 50 de ani 150-280 mg/100ml ser Variaii patologice: Crescut: ateroscleroz, diabet zaharat, obezitate, hipotiroidii, sindrom nefrotic, mixedem, alcoolism. Sczut: insuficiene hepatice grave (ciroz), unele maladii infecioase severe, pneumonie, febra tifoid, endocardit, hipertiroidism, Raportul colesterol esterificat/colesterol total = E/T = 0,65 0,75. Raportul E/T prezint interes practic n diferenierea i prognosticul icterelor, n ateromatoza, n infarct miocardic i accidente vasculare cerebrale. II.8. DOZAREA UREEI SERICE Ureea este produsul final de catabolizare al aminoacizilor. Acumularea de amoniac liber n snge ca urmare a proceselor de dezaminare este duntoare, cel mai sensibil fiind sistemul nervos central. Principala cale de detoxifiere la om i la majoritatea mamiferelor este formarea ureei. Biosinteza ureei are loc aproape exclusiv n ficat i se elimin prin rinichi. Concentraia n limite normale se menine datorit echilibrului dintre funcia ficatului, care o sintetizeaz i aceea a rinichiului care o excret. n laboratorul de analize clinice, ureea se determin prin mai multe metode: gravimetric, gazometric, enzimatic, colorimetric. Dozarea ureei serice prin metoda enzimatic Principiu Ureea este hidrolizat de ureaz la amoniac i dioxid de carbon.n prezena amoniacului, rezultat n urma reaciei de descompunere a ureei, fenolul este oxidat de hipocloritul de sodiu la un compus albastru, a crui intensitate se accentueaz n prezena nitroprusiatului de sodiu. Coloraia albastr obinut este proporional cu concentraia de amoniac, respectiv de uree. Reactivi: 1. Suspensie ureeaz 0,5%

2. Soluie standard de uree: 40mg/100ml 3. Soluie fenol 150mM i nitroprusiat de sodiu 0,47mM. 4. Soluie de hipoclorit de sodiu 0,013M n hidroxid de sodiu 0,13M. Tehnica de lucru: n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) P S M Ureaza 0,1 0,1 0,1 Standard uree 0,1 Ser uree 0,1 Se incubeaz 30 de minute la temperatura camerei, dup care se adaug: Fenol nitroprusiat 2 2 2 Hipoclorit de sodiu 2 2 2 Dup 30 de minute se citete extincia probei i a standardului fa de martor la 620nm. Calcul: mg uree% = Ep/Es x 40 Interpretarea rezultatelor Valorile normale sunt cuprinse ntre 20-40mg uree/100ml ser, respectiv 10-20mg Nureeic/100ml ser. Variaiile ureei serice sunt legate de funcia renal. Se nregistreaz creteri n glomerulonefrite acute i mai ales n uremie. Dei este un test mai puin sensibil dect clearece-ul glomerular, rmne totui un test simplu i sigur n explorarea funciei rinichiului. Scderea ureei serice se nregistreaz n insuficiena hepatic; dar nu are ns semnificaie diagnostic, fiind preferate alte teste de explorare ale funciei hepatice, mult mai sensibile. Variaii fiziologice n snge Valoarea ureei sanguine este dependent de aportul proteic alimentar, de volumul de urin excretat i de starea de funcionare a rinichiului. Variaii patologice n snge n general, valoarea ureei sanguine variaz n acelai sens cu azotul neproteic. Valori crescute apar n: - insuficiena renal acut i cronic

- anurii extrarenale: insuficiena cardiac, boli infecioase acute, hemoragii gastro-intestinale, encefalite, diabet zaharat sever, boala Addison. Valori sczute se ntlnesc n stadiul final al insuficienei hepatice decompensate (coma hepatic).

II.9. DOZAREA ACIDULUI URIC Acidul uric rezult din catabolismul bazelor purinice, adenina si guanina din molecula acizilor nucleici. Determinarea acidului uric nu este att de folosit ca cele ale ureei i creatininei. Creterea frecvenei determinrilor de acid uric se datoreaz mai mult interesului foarte mare pentru catabolizarea acizilor nucleici, acidul uric fiind produsul final al catabolismului purinelor. Creterea concentraiei serice a acidului uric este cunoscut sub numele de hiperuricemie. Acidul uric i uraii sunt moleculele relativ insolubile, care precipit rapid n soluiile apoase ca de exemplu n urin sau n lichidul sinovial. Consecina acumulrilor de acid uric const n apariia gutei. Principiu Acidul uric n mediu alcalin, reduce acidul fosfowolframic, cu formarea unui complex (albastru de wolfram), care poate fi colorimetrat. Oxidarea acidului uric este cantitativ n condiiile reaciei rezultnd alantoina i dioxid de carbon. Reacia este neglijabil interferat de cofein i compui sulfidrici. Eliminarea interferenei acidului ascorbic se face prin condiiile ridicate de pH ale reaciei. Reactivi: 1. Deproteinizant: soluie de wolframat de sodiu 2. Standard stoc. Soluie stabilizat de acid uric de concentraie

1mg acid uric/ml. Standardul de lucru: 0,5 ml standard stoc se dilueaz la 10 ml cu ap, rezultnd o concentraie de 5mg acid uric/100ml. 3. Carbonat de sodiu anhidru sau cristalizat. Se cntrete 14 g de carbonat de sodiu anhidru, respectiv 38g de carbonat de sodiu cristalizat i se dilueaz n 100 ml ap rezultnd o soluie cu o concentraie 14g carbonat/100ml. 4. Fosfowolframat- soluie apoas de wolframat de sodiu i acid fosforic. 5. Material biologic (ser sanguin sau urin). Pentru dozarea acidului uric din urin, aceasta se recolteaz timp de 24 de ore ntr-un recipient, care conine 10 ml NaOH 5% pentru a mpiedica precipitarea urailor. n vederea analizei, urina se dilueaz 1/50 cu ap distilat. Tehnica de lucru Se pipeteaz n eprubete de centrifug urmtorii reactivi: Reactivi (ml) P M S Ser 0,5 Ap distilat 3.5 Acid sulfuric 0.5 Deproteinizant 0.5 Se omogenizeaz produsul i se centrifugheaz la 4000 turaii/min. timp de 10 minute, dup care se decanteaz: Supernatant 3 Standard 3 Ap distilat 3 Sol. carbonat 1 1 1 Fosfowolframat 0.1 0.1 0.1 Dup agitare, probele se las n repaus 15 minute, dup care se citesc exticiile probei i a standardului fa de martor la 710nm. Calcul mg acid uric/100ml ser = Ep/Es x 5 Interpretarea rezultatelor Valorile normale n ser sunt cuprinse ntre: - 3 8mg% pentru brbai i

- 2,5 7mg% pentru femei. Creteri ale acidului uric apar n retenii azotate, paralel cu creteri ale ureei i creatininei. Concentraia de acid uric seric este mai mare la brbai dect la femei. Chiar i n limite normale, acidul uric seric este la limita solubilitii lui. Prezena proteinelor servete la meninerea moleculelor n soluie. Hiperuricemiile pot fi mprite n funcie de mecanismul lor de producere n primare i secundare. Cauzele principale sunt: - excreia redus de acid uric n 90% din cazuri; - n 10% din cazuri, producia mrite. n afara insuficienei renale, acidul uric crete n: - infecii, gut, cancer i dup tratament cu citostatice. II.10. DOZAREA CREATINEI I CREATININEI Creatina sau acidul N-metilguanidin acetic rezult n esuturi n urma unui proces de biosintez dintre glicocol i arginin cnd se formeaz glicociamina care, metilat, trece n creatin. Creatinina este anhidrida creatinei i este produsul de excreie al creatinei. Creatina poate trece n creatinin prin nclzire ndelungat cu acid clorhidric, ceea ce permite dozarea concomitent a creatinei i creatininei. Creatinina se poate determina prin dozarea, pe de o parte, a creatinei i, pe de alt parte a creatinei i creatininei. Astfel, se poate determina indicele creatinic din raportul: Creatina / (creatin + creatinin) = 0,5. Dozarea creatininei prin metoda colorimetric Jaffe` Creatinina formeaz cu acidul picric, n mediu alcalin, un complex de culoare roie-portocalie, care se poate colorimetra. Reactivi: 1. Soluie wolframat de sodiu 10% 2. Soluie acid sulfuric 2.3N 3. Soluie saturat de acid picric 4. Soluie hidroxid de sodiu 10% 5. Soluie picrat alcalin. Se prepar din 10 volume de soluie saturat de acid picric cu 2 volume de hidroxid de sodiu 10%. 6. Soluie de creatinin standard stoc. Se dizolv 100mg creatinin

n 100 ml HCl 0,1N. 7. Soluie standard de lucru.Se dilueaz 1 ml soluie stoc la 100 ml ap distilat.1ml conine 0,01 mg creatinin. Tehnica de lucru ntr-o eprubet de centrifug se pipeteaz 2 ml ser, 2 ml ap distilat, 1 ml wolframat de sodiu 10% i 1 ml acid sulfuric 2/3N. Dup agitare se centrifugheaz la 3000 turaii/minut, timp de 5 minute. Dup aceasta se pregtesc trei probe dup cum urmeaz: Reactivi (ml) Supernatant ser Sol.standard Ap distilat Picrat alcalin P 3 1,5 S 3 1,5 M 3 1,5

Eprubetele se agit i dup 10 minute se citete extincia probei i a standardului fa de martor la 530nm. Calcul: mg creatinin/100ml ser = Ep/Es x 0,03 x 100, n care: 0,03 concentraia soluiei etalon n cei 3 ml luai n lucru 100 exprimarea n mg/100 innd cont de diluia serului luat n lucru (1 ml ser). Dozarea creatinei ( creatinina total ) Se trece creatina n creatinin prin nclzire ndelungat n prezena HCl. Creatinina total se dozeaz prin metoda Jaffe`, iar diferena dintre creatinina total i cea dozat fr o prealabil nclzire reprezint valoarea creatinei serice. Reactivi: toi reactivii necesari pentru dozarea creatininei soluie HCl 5N Tehnica de lucru Se deproteinizeaz serul aa cum s-a artat la metoda Jaffe`, se pipeteaz 3 ml supernatant la care se adaug 0,5 ml HCl 5N, se astup eprubeta i se nclzete timp de 24 de ore la 600C ntr-o etuv. Dup rcire se adaug 2,5 ml din soluia de picrat alcalin. Se prepar proba standard din 3 ml soluie standard de lucru, 0,5 ml HCl 5 N, 2,5 ml picrat alcalin. Se prepar i o prob n alb nlocuind soluia standard cu ap distilat. Dup 10 minute se citete extincia probei de analizat i a

probei standard fa de proba n alb la 520nm. Calcul: mg creatinin total/100ml ser = Ep/Es x 3 creatinina total creatinina (dozat prin metoda Jaffe`) = creatinina derivat din creatin x 1,16, n care: 1,16 = factor de conversie al creatininei n creatinina. Valori normale: femei: 0,6 0,9 mg creatinina/100 ml ser brbai: 0,7 1,1 mg creatinina/100ml ser Variaii patologice: Crescut: boli caracterizate prin distrugerea intens a masei musculare, miopatii, polimiozite. Sczut: insuficiena renal cronic. II.11. DETERMINAREA PROTEINELOR TOTALE DIN SER Nivelul proteinelor totale serice reflect sinteza lor de ctre ficat sau pierderi datorit unor boli renale. Scderea proteinemiei poate fi datorat unei insuficiene hepatice, dar i unei malabsorbii sau deficit alimentar. La aceast scdere poate fi implicat i o insuficien renal sau prezena unui edem. Creterea proteinemiei este mai rar i apare n stri de deshidratare sau boli hiperimunoglobuline. Dozarea proteinelor prin metoda Gornall Proteinele reacioneaz cu Cu+2 n mediu alcalin i dau compleci colorai n violet. Intensitatea culorii se msoar spectrofotometric i este proporional cu cantitatea de protein din prob. Reactivi: 1. Reactivul Gornall: tartrat dublu de Na i K 45g, KI 5g, CuSO4 . 5H2O 15g i NaOH 8g, care se dizolv ntr-un litru de ap distilat. 2. Soluie standard de protein 10mg/ml 3. Ser. Tehnica de lucru n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Ser dil.1/10 Standard M P 1 S 1

Ap distilat R.Gornall

1 4

Se incubeaz 15 minute la temperatura camerei, apoi se citete Ep i Es la 540nm fa de martor. Calcul: mg protein/ml = Ep/Es x 200 Reacia este liniar numai ntr-un domeniu limitat de concentraii. De aceea este necesar efectuarea unei curbe de etalonare conform tabelului de mai jos: Reactivi Standard Ap R. Gornall M 1.0 4 1 0,2 0.8 4 2 0.4 0.6 4 3 0.6 0.4 4 4 0.8 0.2 4 5 1.0 4

Dup 15 minute la temperatura camerei se citete extincia la 540 nm la spectrofotometru, reglnd valoarea zero fa de martor. Valorile de extincie obinute se reprezint grafic pe hrtie milimetric i se trece o dreapt printre puncte. Pentru a determina concentraia probei necunoscute cunoscnd extincia, se duce o paralel la abscisa din punctul corespunztor de pe ordonat pn intersecteaz dreapta trasat. Din acel punct se coboar o perpendicular. Punctul de intersecie va reprezenta cantitatea de protein din prob. innd cont de diluie se determin concentraia n mg/ml, iar nmulind cu 100 n mg/100ml. Interpretarea rezultatelor Valorile normale ale proteinelor totale sunt cuprinse ntre 7-9%. Creteri ale concentraiei proteinelor serice se nregistreaz n afeciuni cu sinteza crescut a anumitor fraciuni proteice (imunoglobuline n hepatita cronic). Scderi se nregistreaz n afeciuni care decurg cu pierderi de proteine (sindrom nefrotic), fie n boli cu sintez deficitar (insuficiena hepatic). TESTE DE DISPROTEINEMIE Testele de disproteinemie, numite i teste de floculare, teste hepatice sau teste de labilitate seric, cuprind un grup de teste empirice,

care prezint valoare diagnostic n explorarea metabolismului proteic. Stabilitatea proteinelor plasmatice depinde de sarcina lor electric, respectiv de raprtul albumin/globulin. Dac la serul proaspt se adaug diferii ageni ( sruri ale metalelor grele, compui organici, chiar i ap distilat) acesta va prezenta fenomene de turbiditate, floculare sau coagulare a proteinelor. Modificrile observate cu aceti reactivi vor fi diferite n funcie de acest raport sau chiar de modificarea cantitativ a unei fraciuni globulinice. Testele de disproteinemie, numite i teste hepatice au valori cantitative, electroforeza proteinelor cu determinarea cantitativ a fiecrei fraciuni fiind incomparabil superioar. Totui ele se execut rapid, sunt simple, necesit un laborator echipat modest, rezultatele sunt rapide i pot prezenta informaii preioase. Interpretarea unei suferine hepatice pe simpla utilizare a acestor teste este riscant, ns mpreun cu alte analize (electroforeza,analize serice, bilirubina) contribuie ns substanial la diagnostic. Testul cu timol (MAC LAGAN) Precipitarea proteinelor depinde de raportul albumine/globuline, ele avnd sarcini electrice diferite i, ca atare stabilitate coloidal diferit. Flocularea este cu att mai intens cu ct raportul albumine/globuline este mai mic. Valorile normale sunt cuprinse ntre 0-4 uniti Mag Lagan. Dei nu este un test hepatic propriu zis este pozitiv i n alte afeciuni ca: reumatism poliarticular acut, cancer, tuberculoz, este preios n diferenierea icterelor. Testul este pozitiv n icterul infecios (hepatita epidemic) i negativ n icterul mecanic sau hemolitic fr afectare hepatic. Testul cu ZnSO4 (KUNKEL) Valorile normale sunt cuprinse ntre 2-8 uniti. Dei cele dou teste sunt mult asemntoare, cel cu ZnSO4 reflect n primul rnd gamaglobulinele, n timp ce testul cu timol reflect schimbarea beta- i gamaglobulinelor, ca i a fosfolipidelor.

II.12. DOZAREA HEMOGLOBINEI N SNGE (METODA DRABKIN) Principiu Fericianura de potasiu oxideaz Fe+2 din hemoglobin la Fe+3. Aceasta face ca toate felurile de hemoglobin din snge (exceptnd verdohemoglobina) s treac n methemoglobin, iar methemoglobina pe msur ce se formeaz, se combin cu cianura de potasiu trecnd n cianmethemoglobin, derivatul de hemoglobin cel mai stabil. Reactivi: 1. Reactivul Drabkin. 0,14g fosfat monopotasic, 0,2g KCN i ap distilat ad. 1000ml (pH = 6,4). Soluia se pstreaz n flacoane de sticl brun bine nchise. Se pstreaz la frigider timp de 2 luni. 2. Standard de cianmethemoglobin. Tehnica de lucru n dou eprubete de hemoliz se pipeteaz cte 5 ml reactiv Drabkin. n una din eprubete se pipeteaz cu o micropipet 0,02 ml soluie standard de hemoglobin, iar n cealalt se pipeteaz 0,02 ml snge (venos sau capilar). Se omogenizeaz eprubetele prin agitare, apoi dup 20 de minute se citete extincia probei de analizat i a probei standard fa de proba n alb (ap distilat) la 540 nm. Calcul: hemoglobina/100ml ser = Ep/Es x 13 ,unde 13=conc standardului Observaii: pH-ul trebuie s fie 7,2-7,5. La pH acid, precipit proteinele, iar la pH alcalin, precipit lipidele. Valorile normale sunt:

- femei: 11 15g/100ml ser - brbai: 13-17g/100ml ser.

II.13. DOZAREA BILIRUBINEI SERICE Majoritatea hemului catabolizat provine din hemoglobin. n timp de 24 de ore aproximativ 3 x 109 hematii sunt distruse de ctre celulele sistemului reticuloendotelial (localizate mai ales n splin, ficat i mduva osoas), elibernd 6g hemoglobin. n aceleai celule hemul este catabolizat n continuare fiind n prealabil desprins de pe lanurile globinelor (hidrolizate de proteaze la aminoacizi). Un numr mult mai mic de hematii (mai ales din cele mbtrnite) hemolizeaz n torentul circulator al sngelui, proces ce se accentueaz n condiii patologice. Hemoglobina eliberat n snge este legat de o protein seric din clasa alfa-2-globulinelor, mpiedicnd eliminarea ei prin rinichi i astfel blocajul renal. Hemul oxidat la hemin este legat de o protein din ser, hemopexima, din clasa beta-globulinelor. n cazul depirii capacitii de legare a hemopexinei intervine albumina seric formnd cu hemina methemoglobina. Celulele sistemului reticulului endotelial capteaz agregatele ce conin hemin, reducnd-o enzimatic. Hemul sufer apoi aciunea unui sistem enzimatic microzomal inductibil, hemoxigenaza, care utilizeaz O2 i NADPH. Se rupe astfel ciclul ce unete pirolii, se elibereaz Fe+3 i atomul de C dintre nucleele I i II sub form de CO. Nucleele pirolice formeaz un lan unit prin trei puni metinice biliverdina. La rndul ei biliverdina este redus de ctre biliverdinreductaza la bilirubin, o substan colorat n galben. Aceasta este eliberat n snge i fiind insolubil circul legat de albumin. n 24 de ore se formeaz n jur de 300 mg bilirubin care realizeaz o concentraie de 0,2 0,7 mg/dl. Depirea capacitii de legare a albuminei duce la difuzia bilirubinei n esuturi, pe care le

coloreaz (icter). Hepatocitele capteaz bilirubina de pe albumin cu ajutorul unui sistem de transport facilitat din membrane. n microzomii hepatocitelor bilirubina este conjugat cu 12 resturi de acid glicuronic, formnd mono- i diglucuronizi, hidrosolubili. Dozarea bilirubinei se face cel mai frecvent cu ajutorul unei reacii de cuplare cu un diazoderivat.

Fig.

Structura bilirubinei i a bilirubinei conjugate

Bilirubina se gsete n ser att sub form liber (BL) ct i sub form glicurono sau tauroconjugat (BL). Bilirubina conjugat este hidrosolubil i cu acidul sulfanilic diazotat formeaz un complex colorat albastru la pH>7, sau rou la

pH<7. Bilirubina liber, nu este hidrosolubil, ea fiind meninut n soluie apoas (ser, plasm) prin legarea ei de proteinele circulante (albumine). Bilirubina liber nu reacioneaz direct cu reactivul sulfanilic diazotat. Reacia are loc dup scindarea proteinelor circulante, care se face cu aa numiii acceleratori (cofein,uree, benzoat de sodiu). Serul tratat cu acceleratori va da complexul colorat cu acidul sulfanilic diazotat, valorile obinute reprezentnd astfel bilirubina total. Diferena BT BL = BC, reprezint bilirubina conjugat. Reactivi: 1. Soluia A. 1g acid sulfanilic se dizolv n 15 ml acid clorhidric conc., apoi se completeaz cu ap distilat la 1000 ml. 2. Soluia B. Nitrit de sodiu 0,5%. 3. Soluie de cofein. 20g cofein, 30 g benzoat de sodiu i 50 g acetat de sodiu cristalizat, se dizolv prin nclzire uoar n 400 ml ap distilat. 4. Soluie de NaCl 0,9%. Tehnica de lucru n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Ser nehemolizat Ap distilat Sol. Cofein Sol.NaCl 0,9% R.diazo (A+B) P - BD 1 3.5 0.5 P -BT 1 3,5 0.5 M 1 0,5 3,5 -

Se agit eprubetele i dup 5 minute se citete extincia bilirubinei totale i a bilirubinei directe fa de proba n alb la 530 nm n cuve de 1 cm. Calcul: Bilirubina total mg% ml ser = Ep ( total) x 6,34 Bilirubina direct mg% ml ser = Ep (direc) x 6,34 Bilirubina indirect mg% ml ser = BT BD Valori normale: -BT = 0,2 0,8 mg/ml ser -BD = 0 0,2 mg/ml ser -BI = 0,1 0,6 mg/100ml ser

Variaii patologice: crescut: -bilirubina conjugat (BD) : icter mecanic, ciroze. -bilirubina liber (BI): icter hemolitic -bilirubina liber i conjugat: icter hepatocelular. Observaii: Dac valoarea extinciei este mai mare de 1, sau se face diluia serului, innd cont la calcul de aceasta, sau se citete n cuva de 0,5 cm i se nmulete valoarea extinciei cu 2.

III. ANALIZA BIOCHIMIC A HORMONILOR Sistemul nervos i sistemul hormonal, fiecare prin mijloacele proprii dar interdependente au rolul de a coordona rspunsurile celulelor, esuturilor la semnalele venite din mediul extern sau intern. n sistemul hormonal comunicarea molecular se face ntre o celul (endocrin) care produce i secret o molecul semnal (hormon) i o alt celul situat la distan (celula int), hormonul fiind transportat ntre celula secretorie i celula int prin sistemul circulator. Sistemul hormonal e alctuit din glande endocrine, hormoni circulani i esuturile int. De regula hormoni sunt produi de celule sau grupuri de celule specializate unuia sau a mai multor hormoni (glande endocrine). Totui toate celelalte esuturi (ficat, rinichi, inim etc.) au capacitatea de a elibera molecule semnal pentru alte celule. O celul apt s rspund la un semnal hormonal e denumit celula inta pentru acel hormon. Unii homoni acioneaz n mod specific numai asupra unui tip de celule, pe cnd ali constituie semnale externe pentru o varietate mai mare de celule. Transportul hormonilor e pe cale sanguin. Hormoni peptidici i catecolaminele circul n plasm n stare liber. Hormoni steroidici, hormoni tiroidieni i vitamina D i formele sale active sunt liposolubile i sunt transportai de proteine specifice din plasm. Proteinele de transport au specificitate nalt pentru un hormoni sau un grup de hormoni. Clasificarea hormonilor 1. Hormoni tiroidieni Glanda tiroid produce doi hormoni : -tetraiodtironina T4 -triiodtironina T3 Structura: Sunt derivai iodurai cu un compus ipotetic, derivate de la tirozina si tironina.

Aceti hormoni conin iod i funcia tiroidian e intim corelat cu metabolismul acestui element. 2. Hormoni medulosuprarenali: Glandele suprarenale sunt alctuite din dou regiuni distincte cu origini embriologice, avnd structuri i funcii diferite. Poriunea cortical ( 90% din gland) se dezvolt din mesoderm i produce hormoni de natur steroidic, corticoizi, iar medulara este de origine nervoas i elaboreaz substane numite catecolamine. Medulosuprarenala elaboreaz compui numii catecolamine: dopamine noradrenalina (norepinefrina) i adrenalina (epinefrina). Medulosuprarenala elibereaz n snge adrenalina (80% din secreia total) i noradrenalina (20%). Noradrenalina ndeplinete i funcia de neurotransmitor la nivelul terminaiilor nervilor postganglionari simpatici, (terminaii adrenergice) i sngele cuprinde o fraciune din noradrenalina eliberat pe aceasta cale, cea care nu a fost receptat imediat la nivelul sinapselor. Adrenalina nu este sintetizat n celulele cromofine extramedulare, dar poate fi prezente n aceste celule prin captare din plasm. Dopamina este absent n snge, se gasete n anumite regiuni ale sistemului nervos central. Are rol de neurotransmitor la nivelul unor terminaii nervoase (dopaminergice). Adrenalina i noradrenalina acioneaz asupra unor varieti mare de esuturi, care cuprind receptori pentru aceti hormoni. Prin aciunile asupra sistemului circulator, asupra metabolismului energogen, prin reglarea secreiei unor hormoni, catecolaminele au roluri importante n adaptarea organismului la agresiuni interne sau externe, fizice sau psihice (frig, emoii, hipoglicemie ). Efectele metabolice, mediate n principal de ctre adrenalina, au ca rezultat creterea consumului de oxigen i a produciei de cldur la nivelul majoritii esuturilor. 3. Hormoni corticosuprarenali: Cortexul suprarenalei, la adult este alctuit din trei zone distincte histologic, un strat exterior (zona glomerular), unul median (zona fasciculate) i unul de mineralocorticoizi.

Zona fasciculat i zona reticular produc glucocorticoizi i androgeni. Zona extern i cele dou zone interne se comport ca dou uniti separate prin produsele secretate i prin mecanismele reglatorii. Hormonii corticali sunt steroizi (corticosteroizi) C 21 (mineralocorticoizi i glucocorticoizi) C19 (androgeni). n cortexul suprarenalei se afl un numr mare de steroizi, dar aceia care sunt secretai n cantiti suficiente pentru a exercita aciuni hormonale sunt: cortizonul (glucocorticoid), aldosterona (mineralocorticoid), dehidroepiadrenosterona i androstendiona (androgeni). Aciune: Cortisolul exercit asupra metabolismului intermediar multiple aciuni, anabolice i catabolice, dup natura esutului, a strii organismului, n funcie de concentraiile altor hormoni. Aciunea cea mai clar este stimularea gluconeogenezei hepatice i efluxul de glucoz asupra proteinelor hepatice cortisolul are aciune anabolic. Cortisolul inhib trecerea glucozei sanguine n esutul adipos, n muschi, ceea ce duce la hiperglicemie. La nivelul esutului adipos, cortisolul exercit actiune lipolitic, cu eliberare de glicerol i acizi grai n snge. Din contra n organele centrale (trunchi) cortisolul favorizeaz depunerea de grsimi. n afara efectelor metabolice, la concentraii mai mari dect cele fiziologice, cortisolul (hidrocortizona) exercit aciuni antiinflamatoare i imunosupresive care stau la baza utilizrii terapeutice a corticosteroizilor sau a compuilor nrudite obinui prin sintez. Aldosterona: Participa la meninerea homeostazei hidrice i electrolitice. esutul principal, int, pentru aldosterona, este rinichiul, la nivelul cruia determin retenia ionilor de Na i n mod secundar, promoveaz eliminarea renal a ionilor de H, K, i NH4. Retenia de sodiu antreneaz i retenia osmotic de ap. De asemenea, aldosterona regleaz transportul electroliilor prin celulele epiteliale de la nivelul glandelor salivare, glandelor sudorifere, si intestinale. Aciunea aldosteronei la nivelul tubilor renali (distali i colectori) Const n promovarea transportului transcelular de sodiu din lumenul tubilor n spaiul interstiial. Controlul secreiei de aldosteron are loc prin mechanisme distincte de acelea care opereaz n cazul glucocorticoizilor. Acest control se

realizeaz prin sistemul renin-angiotensin care are un rol deosebit n reglarea fluidului extracelular i al presiuni sanguine. 4. Hormoni sexuali: Sunt hormoni steroizi, reprezentai de hormoni testiculari care poart numele de androgeni i hormoni ovarieni care sunt estrogeni i progesterone. Hormoni androgeni: Sunt hormoni sexuali masculini sintetizai de celulele interstiiale (Leydig) din testicul. Principalul hormon androgen testicular este testosterona, dar testiculul mai secret cantitate mic de dihidrotestosteron. Ali steroizi produi de cortexul suprarenalei intermediari n sinteza testosteronei din testicul sunt : dehidroepiandrosterona, androstendiol, androstendiona Aciune: Testosterona controleaz procesele fundamentale necesare dezvoltrii i funcionrii organelor sexuale, apariiei i intreinerii caracterelor sexuale secundare, spermatogenezei. Androgenii stimuleaz sinteza proteic, aciune deosebit de puternic la pubertate, care duce la dezvoltarea oaselor i musculaturii scheletice. Hormonii ovarieni: Aceti hormoni sunt de dou grupe: estrogeni i progesterone. Pe lang sinteza ovarian, estrogenii se mai formeaz n cantiti mici n adrenale, testicul i alte esuturi ca: ficat, piele. n timpul gestaiei unitatea feto-placentar sintetizeaz cantiti mari de progesteron. Reacii de identificare a hormonilor steroizi Reacia de identificare a foliculinei. Reacia Kober Foliculina prin tratare cu acid sulfuric concentrat prezint o coloraie portocalie. Reactivi: 1. Soluia foliculina ( estrona) 2. Acid sulfuric concentrat. Tehnica de lucru

Se introduce ntr-o eprubet 1 ml soluie de foliculin i se prelinge pe pereii eprubetei nclinate acid sulfuric concentrat. Producerea unei coloraii portocalii indic prezena estronei. Reacii de identificare pentru catecolamine Reacta de identificare a adrenalinei cu clorura de fier (III) Adrenalina, datorit prezenei nucleului de pirocatechina, d o coloraie verde cu clorura de fier (III). Reactivi: 1. Soluie de adrenalina 1% 2. Soluie de FeCl3 1,5% Tehnica de lucru Intr-o eprubet se iau aproximativ 1 ml soluie adrenalin la care se adaug 1-2 picturi soluie de FeCl3 1,5%. Apariia unei coloraii verzi indic prezena adrenalinei. Reacia de identificare a adrenalinei prin oxidare Sub aciunea agenilor oxidani, n mediu acid, adrenalina se oxideaz la adrenocrom, de culoare roie. In mediu alcalin produsul de oxidare se transform in adrenolutina, de culoare galben. Reactivi: 1. Soluie de adrenalin 1% 2. Ap oxigenat 3. NaOH 1g% 4. HCl 0,1N Tehnica de lucru Intr-o eprubet se msoar, n ordine, 1ml adrenalin 1%, 0,5 ml H2O2 si 0,5 ml HCl 0,1N. Apare o coloraie roie (adrenocrom); prin alcalinizare cu NaOH 1% se observ virarea culorii n galben-portocaliu (adrenolutina).

IV. ANALIZA BIOCHIMIC A SUCULUI GASTRIC IV.1. ASPECTE GENERALE Sucul gastric este un lichid limpede, transparent, cu reacie acid, provenit din secreia unei varieti de celule din mucoasa gastric. Celulele epiteliului parietal secret n special acid clorhidric pentru crearea mediului acid. Celulele mucoase ale glandelor gastrice i celulele peptice secret n special carbonai acizi i cloruri care neutralizeaz parial aciditatea imprimat de acidul clorhidric. Recoltarea Recoltarea sucului gastric se face n mod obinuit dimineaa, pe nemncate sau dup o excitaie produs fie de un prnz de prob, fie de ctre diverse substane cu aciune stimulatoare, adecvat ca: alcoolul etilic, histamina, cofeina i insulina. Sucul gastric pur, aa cum este obinut de la om pe nemncate, prin sonde speciale sau prin fistul gastric, prezint urmtoarele caractere fizice i compoziie chimic: Volum n 24 de ore aprox.2000ml Aspect uor opalescent Culoare incolor Miros fad,uor acru Gust acru pH 0.92 1.50 Greutate specific 1.002 1.009 Reziduu uscat 0.5 1g% Substane organice 0.4 0.5g% Substane minerale 0.5 0.6 g% HCl liber 0.4 0.5g% Aciditate total 0.45 0.065g% Clor total 0.5 0.6g% Cloruri 0.5 0.58g% Proteine 0.4g% Azot din:aminoacizi, acid uric, amoniac de ordinul mg Pepsina 7 9 unitati Matte

Renina

n dilutie 1:160

IV.2. DOZAREA ACIDITII SUCULUI GASTRIC n laborator se face determinarea aciditii libere, aciditii combinate i aciditatea total. Aciditatea liber este dat de acidul clorhidric liber, care se gsete sub form ionizat, precum i o serie de acizi organici cum sunt: acidul lactic, acidul butiric i acidul acetic, care se gsete n cantiti foarte mici n sucul gastric normal. Aciditatea combinat exprim cantitatea de acid clorhidric combinat cu proteinele sub form de clorhidrat de proteine cu substanele proteice din alimente, cu mucusul salivar ct i cu mucusul i secreia celulelor parietale din mucoasa gastric. Aciditatea total este dat de nsumarea celor dou aciditi (liber i combinat) ct i de srurile acide (fosfai monobazici) ce sunt prezente n compoziia sucului gastric. Principiu Dozarea aciditii libere i totale se face cu o soluie de NaOH 0,1N n prezena indicatorului Toppfer-Linossier, care este format din dimetilazobenzen i fenolftalein. Reactivi: 1. Reactiv Topper-Linossier 2. Sol.NaOH 0,1N Tehnica de lucru ntr-un pahar Erlenmeyer se pipeteaz 10ml din sucul gastric luat spre analiz, filtrat n prealabil prin tifon sau vat pentru ndeprtarea eventualelor resturi de alimente. Se adaug 5 picturi din reactivul Toppfer-Linossier i 5-6 ml de ap distilat. n prezena acidului clorhidric liber, amestecul se va colora n rou. Se titreaz cu soluia de NaOH 0,1N pn cnd culoarea vireaz n galben-portocaliu.Se noteaz cantitatea de hidroxid de sodiu folosit care reprezint volumul folosit pentru dozarea aciditii libere i se noteaz cu n. Se continu titrarea cu soluia de hidroxid de sodiu pn la apariia unei coloraii galben-deschis i apoi roie-portocalie. Se noteaz aceast cantitate de hidroxid cu m i corespunde aciditii combinate. Calcul HCl liber g/1000 = n x 0,00365 x 100

HCl combinat g/1000 = m x 0.00365 x 100 Aciditatea total n g/1000 = (n + m) x 0.00365 x 100 IV.3. DETERMINAREA SNGELUI DIN SUCUL GASTRIC Sngele n cantitate mare prezint un aspect cafeniu ce se poate observa cu ochiul liber. n cantitate mai mic se poate pune n viden prin reacia Weber, reacia Adler sau reacia Mayer. Cercetarea urmelor de snge n sucul gastric se face pe probele de suc gastric nefiltrat, neutralizat n prealabil cu o soluie de carbonat acid de sodiu 1%. Reacia Mayer Este o reacie calitativ de punere n eviden a prezenei sngelui n sucul gastric. Reactivi: 1. Amestec de alcool etilic i acid acetic 2. Reactivul Mayer.Se prepar prin dizolvarea n 50 ml ap distilat a 10g KOH, 1g fenolftalein la care se adaug 5g zinc pulbere. Soluia se aduce la fierbere pn se decoloreaz i se filtreaz fierbinte. Tehnica de lucru Se pipeteaz ntr-o eprubet 2 ml suc gastric de analizat, filtrat n prealabil i se aduce la fierbere. Dup aceasta coninutul eprubetei se rcete i se adaug 2 ml amestec de alcool etilic-acid acetic, 0,5 ml reactiv Mayer i 2-3 picturi de ap oxigenat. n prezena sngelui, va aprea o coloraie roie caracteristic. Reacia Adler Benzidina sub form de leucoderivat este oxidat datorit aciunii peroxidazice a hemoglobinei n prezena apei oxigenate i n mediu acid la un compus chinoidinic. Tehnica de lucru ntr-o eprubet se pun 1-2 ml suc gastric, se adaug un vrf de spatul de benzidin, 5-10 picturi de acid acetic glacial. Se amestec bine, se adaug cteva picturi de ap oxigenat 3%. n prezena sngelui apare o culoare verde sau albastr n raport cu cantitatea de hemoglobin coninut n sucul gastric.

V. ANALIZA BIOCHIMIC A LICHIDULUI CEFALORAHIDIAN V.I. ASPECTE GENERALE Lichidul cefalorahidian se formeaz n celulele plexului coroid i ocup spaiul dintre piamater i arahnoid. Spaiile lichidiene conin o cantitate de 140-160 ml LCR la adultul tnr, n medie 140 ml. La sugar cantitatea de LCR este de 40-60 ml i ea depete 100 ml ctre vrsta de 5 ani. LCR este supus continuu uniu proces de rennoire, aproximativ 0,30,5 ml/min; aceasta nseamn c la fiecare 6-12 ore este remprosptat ntrega msa de LCR. Componentele lichidului cefalorahidian provin din plasm prin difuzie liber i printr-un proces de secreie. Astfel n tabelul urmtor vom prezenta concentraiile componenilor plasmei i al lichidului cefalorahidian: Component Sodiu Potasiu Calciu Magneziu ClHCO3HPO4SO4Proteine Uree Acid uric Glucide reductoare Bilirubina Acizi organici L.C.R.mg% 325 10 5 3 449 40 2 0.5 30 24 0.5-2.6 72 0.2 urme Plasma mg% 325 20 10 3 360 60 1 1 7000 30 4 90 0.8 urme

Recoltarea lichidului cefalorahidian

Se face prin puncie lombar, suboccipital sau ventricular, n eprubete perfect curate i sterilizate. Dup recoltare, n primul rnd se efectueaz examenul microbiologic i citologic, care necesit un produs steril iar restul probei se ntrebuineaz pentru examenele fizice i chimice. Lichidul cefalorahidian normal este incolor i limpede. n unele afeciuni, el este colorat n galben, roz sau verzui. Aceast culoare se datoreaz prezenei bilirubinei saau biliverdinei i este indiciul unei hemoragii la nivelul sistemului nervos central. Lichidul cefalorahidian poate fi colorat n rou datorit sngelui care poate proveni n mod accidental datorit unei puncii greit executate, fie datorit unei afeciuni. n mod normal, lichidul cefalorahidian este transparent i clar. n unele afeciuni poate fi opalescent datorit prezenei n cantitate mare a leucocitelor, fie datorit albuminei sau prezenei microorganismelor. Lichidul cefalorahidian este tulbure n meningitele purulente. Un aspect particular l prezint n cazul meningitei tuberculoase cnd probele vor forma o pelicul de fibrin la suprafa. Densitatea normal a lichidului cefalorahidian este foarte apropiat de aceea a apei i anume 1.006-1.008. Densitatea crete n unele afeciuni patologice. Ea se determin cu areometre de dimensiuni mici. Cele mai frecvente determinri care se efectueaz pe lichidul cefalorahidian i care prezint interes pentru diagnostic sunt: determinarea proteinelor, a glucozei, clorurilor, ureea, permeabilitatea fa de nitrai i comportarea fa de soluiile coloidale. Examenul chimic se face numai pe lichid cefalorahidian centrifugat. Schema explorrii LCR: A. examinarea direct: transparena culoare fluiditate prezena unor formaiuni heterogene B. examinarea biochimic: - dozarea cantitativ a proteinelor totale - determinri calitative: - R. Pandy - R. Nonne-Appelt - testul cu ZnSO4 - electroforeza

- reactia Adler - dozarea glicorahiei - dozarea clorurilor - dozarea ionilor alcalini - dozarea calciului - dozarea acidului lactic C. examinarea citologic: determinarea urmelor de celule determinarea urmelor de eritrocite examen calitativ D. examinarea serologic E. examinarea bacteriologic (obligatoriu in meningite): a) frotiu colorat b) culturi c) antibiograma F. examinarea virusologic

V.2. IDENTIFICAREA PROTEINELOR 1. Reacia Pandy O soluie saturat de fenol d o opalescen cu un lichid cefalorahidian n care concentraia proteinelor depete limita normal. ntr-o eprubet de hemoliz se pipeteaz 1 ml lichid cefalorahidian i se adaug cu un tub efilat cteva picturi de soluie saturat de fenol. Pe un fond negru se observ formarea unei opalescente sau a unui precipitat n masa lichidului. n mod normal lichidul rmne clar sau uor opalescent. Opalescena este slab = reacie + (slab pozitiv) Tulbure intens = Reacie ++ (pozitiv) Tulbure lptos = Reacie +++ (intens pozitiv) Reacia Pandy este pozitiv n meningite, n unele boli infecioase (tifos, pneumonie), paralizie progresiv i tumori ale mduvei spinrii. 2. Reacia Nonne-Appelt Globulinele din lichidul cefalorahidian precipit cu o soluie saturat de sulfat de amoniu (85%). ntr-o eprubet de hemoliz se pipeteaz 1 ml lichid cefalorahidian i 1 ml soluie saturat de sulfat de amoniu astfel nct s se formeze 2 straturi de lichid distinct suprapuse. n prezena globulinelor, se observ formarea unui inel de precipitat la limita de separare dintre cele dou straturi, sau se agit uor eprubeta, se las n repaus 3-5 minute, dup care se observ pe un fond negru. Absena precipitatului sau apariia unui inel cu foarte slab opalescen indic o reacie negativ. Opalescena sau prezena unui inel de intensitate slab = reacie + Opalescena clar cu tulburarea lichidului = reacie ++ Precipitarea sau inel pronunat = reacie +++ Reacia Nonne-Appelt este pozitiv n unele cazuri de leziuni ale sistemului nervos central, n meningita luetic n care caz globulinele cresc cantitativ ntre 1-4g%o, n toate procesele infecioase meningiene.

V.3. IDENTIFICAREA GLUCOZEI

Glucoza din lichidul cefalorahidian reduce reactivul Fehling cu formarea de oxid cupros colorat n rou-crmiziu. Determinarea hipoglicorahiei La 2 ml lichid cefalorahidian se adaug 0.2 ml reactiv Fehling. Se nclzete pe baia de ap la fierbere. Un lichid care conine ntre 20-30 mg glucoz la 100 ml (hipoglicorahie) prezint o proprietate reductoare slab sau nul, astfel c lichidul rmne colorat n albastru. Un lichid cefalorahidian normal coloreaz amestecul n portocaliu. Determinarea hiperglicorahiei Dac inversm proporiile de reactivi care sensibilizeaz reacia i se iau ntr-o eprubet 0.6 ml lichid cefalorahidian, 2 ml ap distilat i 1 ml reactiv Fehling, se menine pe baia de ap 1 minut, vom obine urmtoarele rezultate: culoarea soluiei rmne albastr dac lichidul este normal sau conine o cantitate mic de glucoz. Culoarea portocalie apare numai dac lichidul cefalorahidian conine peste 70 mg glucoz/100ml. n mod normal glicorahia variaz ntre 55 i 70 mg/100ml, are o valoare cuprins ntre jumtate i 2/3 din glicemie. Acest raport, n cazuri normale, rmne constant, iar variaiile glicorahiei sunt aceleai cu ale glicemiei. Valori crescute numai pentru glicorahie se ntlnesc n afeciuni cerebrale: tumori, encefalite, abcese. Glicorahia scade mult n meningita tuberculoas.

V.4. DOZAREA CLORURILOR

Clorurile din lichidul cefalorahidian se determin prin metoda argentometric, tratnd cu o soluie de azotat de argint n exces i titrnd excesul de azotat de argint cu sulfocianura de potasiu, n prezen de alaun ca indicator. Reactivi: 1. Soluie de azotat de argint N/50 2. Acid azotic concentrat. 3. Soluie de alaun feric 5% 4. Soluie de sulfocianuraa de potasiu N/50 Tehnica de lucru La 1 ml lichid cefalorahidian centrifugat se adaug 10 ml soluie de azotat de argint. 2,5 ml acid azotic concentrat i 2 ml alaun feric 5%. Se titreaz excesul de azotat de argint pn la apariia unei coloraii roiiportocalii persistente timp de 1 minut. mgNaCl la 100ml LCR = (10-N) x 1,17 x 100,n care N = ml KSCN N/50 folosii la titrare. n lichidul cefalorahidian normal,clorurile variaz ntre 7.20-7.50 la 1000 ml. Clorurile cresc n lichidul cefalorahidian paralel cu creterea lor n snge, nefrite, abcese i tumori cerebrale. Valori sczute se ntlnesc n meningite acute netuberculoase unde scderea lor sub 5g/1000 ml indic un prognostic grav, precum i n staza rahidian.

VI. LICHIDELE PATOLOGICE DE PUNCIE

Examenul lichidelor de puncie (pleural, ascitic, pericardic) ofer date importante de diagnostic pozitiv i diferenial. Recoltarea lichidelor patologice de puncie se face prin: toracocentez, paracentez sau puncie pericardic, n condiii aseptice, n eprubete sterile. Lichidul recoltat se supune unui examen: - macroscopic - microscopic - bacteriologic - chimic Cantitatea, n mod normal redus, de lichid coninut n spaiul dintre suprafaa parietal i visceral a seroaselor cavitii pleurale, peritoneale i pericardice poate crete n cursul diverselor procese patologice locale sau de vecintate, formnd adevrate revrsate. Dup mecanismele de producere i proprietile fizico-chimice, revrsatele seroase se mpart n transudate i exsudate. Transudatele se produc datorit unui obstacol mecanic circulator, pe cnd exsudatele sunt consecina diverselor procese inflamatorii sau neoplazice. Mecanismele patogene implicate n dezvoltarea transudatelor sunt reprezentate de perturbarea echilibrului dintre presiunea hidrostatic i presiunea coloidosmotic. Exsudatele inflamatorii, fa de care trebuie luat n considerare diagnosticul diferenial cu procesele maligne, survin n contextul unei infecii tuberculoase, bacteriene sau n legatur cu o embolie pulmonar. Clasificarea revrsatului ca exsudat sau transudat este primul pas n stabilirea etiologiei acestuia. Determinrile biochimice din revrsate se efectueaz ntotdeauna concomitent cu determinrile din snge; recoltarea sngelui trebuie fcut ntr-un interval de timp foarte apropiat de momentul punciei (+/o jumtate de or). Reacia Rivalta Este un test de orientare rapid pentru diferenierea transudatelor i exsudatelor. Tehnica: ntr-un pahar conic, coninnd 100 ml ap distilat i 2 picturi de acid acetic glacial (n lipsa acestuia, oet) se picur lichidul de cercetat, ct mai aproape de suprafaa apei.

Dac reacia este pozitiv se formeaz o serie de nori albi albstrui, asemntori cu fumul de igar. Caractere difereniale ntre transudate i exsudate CRITERII Transparen, culoare, aspect Miros Densitate Proteine totale (g/100 ml) TRANSUDAT EXSUDAT Clar, glbui citrin, Uor opalescent fluid tulbure purulent Inodor 1010 - 1018 0,5 3 - nefroz: sub 1 - ciroz: sub 2,5 insuficien cardiac: sub 2,5 Absent Negativ Sub 100 Rare Rare Rare Sub 100 sau

Uneori fetid 1018 - 1025 38 - tuberculoz: 3 5 - infecii bacteriene: 3 8 - neoplasme: 3 8 Prezent Pozitiv (+, ++, +++) 500 - 40000 Variabile Numeroase Relativ frecvente 50 - 100

Formarea de cheag Reacia Rivalta Celule/mm3 Hematii Leucocite Celule endoteliale Glucoz (mg/100 ml)

Lichide pleurale n boli care afecteaz organele i aparatul respirator. Transsudatul se poate ntlni n insuficiena cardiac congestiv, ciroza hepatic, sindromul nefrotic etc. Exsudatul apare n pneumonii, neoplasme, tromboembolismul pulmonar, colagenoze, tuberculoza pulmonar, sindromul Dressler, maladiile subdiafragmatice. Lichide ascitice

Ascita reprezint acumularea de lichid n cavitatea peritoneal care poate fi seros, serohemoragic, chilos sau chiliform, gelatinos. Mrirea de volum a abdomenului este semnul principal privind dezvoltarea unei ascite. Cantitile mici de lichid de ascit pot fi asimptomatice. Creterea volumului produce distensie abdominal, discomfort, anorexie, grea, arsuri, dureri, jen respiratorie. Mai mult de 90% din cazuri sunt datorate cirozei, neoplasmelor, insuficienei circulatorii congestive, tuberculozei. Lichidele pericardice Pericarditele reprezint afeciuni cu caracter inflamator, acut sau cronic, ale celor dou foie pericardice. n condiii fiziologice, pericardul conine o cantitate minim de lichid (20-30ml). n pericardite se pot acumula cantiti diferite de lichid, cu viteze diferite. n majoritatea cazurilor pericardita repprezint o consecin sau o complicaie a unor boli generale. Cele mai frecvente cauze ale pericarditelor: 1. infecioase: virale, microbiene, tuberculoase, micotice, parazitare. 2. neinfecioase: neoplasm, infarct miocardic acut, uremie.

VII. ANALIZA BIOCHIMIC A SALIVEI

VII.1. ASPECTE GENERALE Saliva reprezint un mijloc de diagnosticare pentru multe boli orale i sistemice. Constant, saliva este un lichid ce asigur dinilor i mucoasei bucale o protecie antibacterian, un rezervor de ioni, un efect lubrifiant i un factor tampon al pH-ului. La toate acestea se adaug i funcia de prima barier antioxidant. Secreia salivar provine din trei perechi de glande mari: parotide, submandibulare (sau submaxilare), sublinguale i din glandele accesorii rspndite n mucoasa bucal (labiale, palatinale, linguale, sublinguale). Salivonul reprezint unitatea de baz a glandelor salivare. Se compune dintr-un acin, un duct intercalar, continuat cu un duct striat i cu un canal excretor. Glandele parotide sunt constituite din celule seroase, cele submandibulare conin att celule seroase ct i celule mucoase, iar n structura celor sublinguale predomin celulele mucoase. n 24 de ore omul secret 1000-1500 ml saliv. Debitul secretor salivar sporete de 8-20 ori n timpul digestiei bucale. n perioadele interdigestive secreia este de 0,5 ml/min, iar valori mai reduse se constat n timpul somnului. Contribuia glandelor submandibulare la secreia salivar de repaus este de 69%, a glandelor parotide de 26% iar a glandelor sublinguale de 5%. Dup stimularea secreiei salivare, fluxul de saliv provenit din glandele parotide poate crete la om, de 100 de ori. Saliva se prezint ca un lichid transparent, filant (datorit mucinei), uor opalescent (din cauza fragmentelor de celule epiteliale i leucocitelor din saliv). Densitatea salivei variaz ntre 1,003-1,008 (hipotonic n comparaie cu plasma). Cnd saliva se recolteaz sub parafin (pentru a nu permite degajarea CO2) n perioadele interdigestive, pH-ul su este cuprins ntre 6 i 7, mai frecvent 6,8 (aadar pH uor acid). Compoziia salivei difer n funcie de tipul alimentelor ingerate. Alimentele uscate de exemplu, determin secreia ndeosebi a glandelor parotide (secreia apoas). n formarea bolului alimentar n schimb, are importan secreia glandelor submandibulare i sublinguale, bogat n mucin. Saliva conine: 99,4% ap, 0,6% reziduu uscat. Reziduul uscat este format din 0,2% substane anorganice i 0,4% substane organice.

Substanele anorganice din saliv sunt reprezentate mai ales de cloruri, bicarbonai, fosfai de sodiu, de potasiu sau de calciu. Ori de cte ori concentraia K+ din saliv scade, se reduce i secreia salivar. Concentraia Na+ n saliv crete n paralel cu debitul salivar. Srurile de calciu (carbonari sau fosfai) din saliv, sunt solubile n mediu acid. ntr-un mediu alcalin ele pot precipita n interiorul canalelor excretoare, dnd natere la sialolii (calculi salivari). Saliva alcalin bogat n mucin favorizeaz precipitarea srurilor de Ca sub forma tartrului dentar. Sulfocianatul de K (KSCN) numit nc rodanat de K, este un produs de excreie salivar. Odat cu sulfocianatul de K salivar se elimin o parte dintre radicalii sulfocianai, rezultai din metabolismul proteinelor. Sulfocianatul de K are i un rol antiseptic. La fumtori se constat o concentraie mai mare de sulfocianat de K n secreia salivar. Substanele organice din saliv sunt: enzimele, proteinele, substanele azotate neproteice, substanele neazotate, resturile celulare descuamate din epitelii i leucocitele. Dintre enzimele salivare cea mai important este ptialina (amilaza salivar), provenit din celulele seroase ale acinilor glandulari i din celulele granulare ale duetelor intercalare. Enzima acioneaz asupra amidonului fiert sau copt precum i asupra glicogenului pe care le descompune n dextrine. Celulele situate n apropierea papilelor circumvalate din mucoasa lingual (glande Ebner) formeaz lipaza, ce hidrolizeaz trigliceridele. Enzima i exercit aciunea n absena srurilor biliare i la un pH sczut (pH = 4), condiii ntlnite n stomac. O alt enzim salivar este lizozimul (muramidaz), care avnd proprietatea de a decompune capsula heteroglicozidic (acidul muramic) a unor microbi (stafilococi, streptococi, bacili proteus, brucele etc), permite ptrunderea de tiocianat n bacterii i totodat distrugerea acestora. De asemenea unele enzime proteolitice i fosfataze (acid i alcalin) identificate n saliv se gsesc asociate cu ali constitueni ai acesteia. n saliv s-a pus n eviden i activitatea enzimelor: peroxidaza, catalaza, ureaza, lipaza, anhidraza carbonic. Lactoferina, prezent n saliv, fixeaz fierul, ndeplinind un rol bacteriostatic. O protein bogat n prolin protejeaz smalul dentar i se combin cu taninurile toxice.

Prin epiteliul glandelor salivare se secret i imunoglobulina A (lgA) cu rol n aprarea mucoasei bucale. Aglutinogenii sistemului ABO sunt prezeni la 80% din populaie, avnd importan n medicina legal. Dintre substanele azotate neproteice n saliv se gsesc: ureea n concentraie de 75-90% fa de ureea sanguin, acidul uric, creatinin i aminoacizi. n uremie, prin saliv se elimin ureea, iar n unele intoxicaii prin saliv se ndeprteaz din organism plumb, mercur, iod, bismut, metale care se depun n parte pe gingie, unde formeaz aa numitul lizereu gingival. n cursul inflamaiei gingivale, curgerea lichidului crevicular n saliv i mrete compoziia cu produi ai rspunsului inflamator. Acetia pot avea un rol n controlul sau modelarea reaciilor oxidative din cavitatea bucal. Cercetrile ce se efectueaz pe saliv se bucur de o atenie din ce n ce mai mare n practica medical. Saliva i-a dovedit valoarea diagnostic n depistarea diferitelor droguri, datorit posibilitii de recoltare neinvaziv i nenociv. Tehnologia modern vine n sprijinul diagnosticului prin utilizarea testelor biochimice rapide.

VII.2. DETERMINAREA AMILAZEI SALIVARE Amilaza salivar este o -amilaz, foarte stabil n mediul bucal, cu pH optim 6,8 i temperatura optim de 40 0. Trebuie precizat faptul c

amilaza salivar i pstreaz activitatea enzimatic i la alte valori de pH situate de o parte i de alta a neutralitii. Determinarea cu iod-amidon Prin aciunea alfa-amilazei asupra amidonului se rup legturile 1,4glucozidice, amidonul fragmentndu-se progresiv n glucide cu molecule mai mici: dextrine (amilo-, eritro-,acrodextrin), maltotetroz, maltotrioz, maltoz i n final glucoz. Amidonul d cu iodul un compus de adiie de culoare albastr. Intensitatea culorii iod-amidon msurat fotometric este proporional cu concentraia amidonului rmas dup incubaia cu enzima i deci invers proporional cu activitatea enzimatic. Reactivi: 1. Colidin 200mM. Se dilueaz 27 ml de colidin n 1000ml de ap distilat, fiart i rcit. Se titreaz cu HCl 0,2N n prezena metiloranjului. Se ajusteaz la nevoie , pentr a fi exact 0,2M. 2. Acid clorhidric 0,1N. 3. Tampon pH 7,5, colidin 50mM, HCl 25mM, NaCl 50mM. Se amestec 250ml colidin stoc (200mM) cu 250 ml ap, 225 ml HCl 0,1N i 2,92g clorur de sodiu. Se verific pH-ul s fie 7,5, se ajusteaz la nevoie i se aduce la 100ml cu ap. 4. Amidon 6,2mM n acid sorbic 18mM. Se prepar o soluie saturat la rece de acid sorbic (20g n 1000ml) care se las s stea o sptmn, apoi se filtreaz. Se suspend 500mg amidon n 30 ml soluie de acid sorbic, apoi se adaug 150ml soluie de acid sorbic fierbinte, amestecnd continuu. Se repet de dou ori adugarea a cte 150 ml acid sorbic fierbinte, se las s se rceasc i se aduce la 100ml. Se conserv n camer. 5. Substrat tamponat, amidon 3,1mM: se amestec volume egale de amidon 6,2mM i tampon. Nu se conserv. 6. HCl 0,5N. 7. Iod, soluie stoc: se dizolv 1,8g iodur de potasiu i 180 mg iod n 100 ml ap. Se conserv n camer n flacon brun. 8. Iod, soluie de lucru: se dilueaz soluia stoc de iod 1/200 cu ap. Nu se conserv. Materialul de analizat Saliv n diluii de 1/10-1/10000, care se stabilesc prin ncercare

preliminar. Tehnica de lucru Saliva se pipeteaz cu o micropitet de 0,02 ml. Reactivi (ml) Tampon substrat HCl 0,5N P S 1,0 1,0 0,5 Se las 5 minute la 37 0C. Saliv 0,02 0,02 Se incubeaz 30 de minute la 37 0C. HCl 0,5 N 0,5 Iod, soluie de lucru 10,0 10,0 Se msoar extinciile probelor Ep i Es fa de ap distilat la 570 nm, n cuv de 1 cm. Calcul Es-Ep / Es x 5166 = U.I. activitate enzimatic Observaie Determinarea amilazei salivare se poate efectua i din ser sau urin. Valori normale. Ser: 230-2700U.I. Urin: valorile depind de diurez, n general sub 5500 U.I., dar pot s ajung i pn la 8000 U.I. Determinarea amilazei salivare cu soluie Lugol Amilaza salivar hidrolizeaz la temperatura corpului amidonul fiert sau copt. Se evideniaz cantitatea de amidon fiert, sol. 0,1% exprimat n ml, care este hidrolizat de 1 ml saliva, n timp de 30 de minute la temperatura de 370 C. Material necesar Soluie de amidon fiert 0,1%, sol.Lugol (2g KI, 1g de iod se completeaz pn la 100 ml ap distilat). Tehnica de lucru ntr-o eprubet se recolteaz 1-2 ml saliv, care se dilueaz de 10 ori cu ap distilat. Se iau apoi 10 eprubete care se numeroteaz de la 110. n fiecare eprubet se introduce 1 ml de ap distilat. n prima eprubet se adaug 1 ml saliv diluat (1/10) care se amestec bine cu

apa distilat existent n eprubet. Se trece din eprubeta 1 n a 2-a eprubet 1 ml i se amestec bine coninutul. Din eprubeta a 2-a se trece 1ml n eprubeta a 3-a,etc., iar din ultima eprubet se arunc 1ml amestec. Se obine astfel o saliv cu o diluie de 1-10. n toate cele 10 eprubete se adaug cte 1 ml ap distilat i 2 ml sol.0,1% amidon. Coninutul eprubetelor este bine amestecat i sunt apoi puse 30 de minute la termostat sau baie de ap la 370 C. Dup 30 de minute sunt scoase i rcite la un curent de ap, adugndu-se n fiecare eprubet cte 1-3 picturi din sol. de iod-iodurat. Se agit din nou coninutul eprubetelor i se observ culoarea fiecruia. Culoarea albastr indic lipsa hidrolizei amidonului, cea roie demonstreaz hidroliza parial a amidonului cu apariia produilor intermediari (dextrina), iar culoarea galben semnaleaz hidroliza complet a amidonului. Calculul se face n baza diluiei salivei din eprubeta n care solutia nu mai are culoarea albastr. De exemplu dac eprubeta a 5-a este prima n care nu mai apare culoarea albastr (deci amidonul a fost hidrolizat), diluia salivei n aceast eprubet este de 1/32. Intruct am lucrat cu o saliv diluat 1/10, diluia total n eprubeta a 5-a este de 1/320. Ori dac 1/320ml saliv hidrolizeaz 2 ml amidon soluie 0,1%, atunci 1 ml saliv va hidroliza x ml soluie de amidon 0,1%. X = 1x 2 / 1/320 = 640 uniti diastazice n conditiile date.

VII.3. DOZAREA UREEI SALIVARE METODA CU UREAZ Principiu Ureea se afl n saliva adultului n proporie de 75 90% din coninutul de uree al sngelui. Deoarece ureea trece prin simpl difuziune din snge n saliv, n anumite situaii n care recoltarea sngelui nu se poate face, dozarea ureei se face din saliv i se aplic

corecia necesar. n scopul dozrii, ureea este hidrolizat de ureaz, o enzim cu specificitate de substrat absolut, la CO2 i NH3. n prezena amoniacului, fenolul este oxidat de hipocloritul de sodiu la un compus albastru, a crui intensitate se accentueaz n prezena nitroprusiatului de sodiu. Culoarea albastr obinut este direct proporional cu concentraia amoniacului, respectiv a ureei. Reactivi: 1. Suspensie ureeaz 0,5mg/ml 2. Soluie standard de uree: 40mg/100ml 3. Soluie fenol 150mM i nitroprusiat de sodiu 0,47mM. 4. Soluie de hipoclorit de sodiu 0,013M n hidroxid de sodiu 0,13M. Tehnica de lucru n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) P S M Suspensie ureaz 0,2 0,2 0,2 Standard uree 0,02 Saliv 0,02 Se incubeaz 30 de minute la temperatura camerei sau 15 minute la 37 C, dup care se adaug: Fenol nitroprusiat 5 5 5 Hipoclorit de 5 5 5 sodiu
o

Dup 30 de minute se citete extincia probei i a standardului fa de martor la 620nm, n cuva de 1 cm. Calcul: mg uree/100 ml saliv = Ep/Es x 40 Interpretarea rezultatelor Valori normale: 13-20 mg/100 ml la aduli 20-36 mg/100 ml la copii Creteri al ureei salivare se ntlnesc n: - glomerulonefritele acute - diabet - consum bogat de proteine Semnificaie diagnostic deosebit are n afeciunile renale, cnd creterea ureei salivare este nsoit de scderea ureei urinare. n diabet

sau consum bogat de proteine, crete i nivelul ureei urinare. Scderea ureei salivare se produce n insuficien hepatic, fr a avea ns o semnificaie diagnostic deosebit.

VII.4.DOZAREA AMONIACULUI SALIVAR Principiu n prezena amoniacului, fenolul este oxidat de hipocloritul de sodiu la un compus albastru a crui intensitate se accentueaz n prezena nitroprusiatului de sodiu. Culoarea obinut este direct proporional cu concentraia amoniacului. Reactivi 1. Soluie standard amoniac 40 mg/100 ml

2. Soluie fenol 150mM i nitroprusiat de sodiu 0,47mM. 3. Soluie de hipoclorit de sodiu 0,013M n hidroxid de sodiu 0,13M. Tehnic de lucru n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Saliv Standard amoniac Ap distilat Fenol nitroprusiat Hipoclorit de sodiu P 0,02 5 5 S 0,02 5 5 M 0,02 5 5

Dup 30 minute la temperatura camerei se citesc extincia probei i extincia standard fa de martor la 620 nm, n cuva de 1 cm. Calcul mg amoniac/100 ml saliv = Ep/Es x 40 Interpretarea rezultatelor Valori normale: 2 10 mg/100 ml saliv Creteri ale concentraiei amoniacului salivar, ca de altfel i a celui seric, se ntlnesc n afeciuni hepatice cnd ureogeneza este diminuat.

VII.5. DETERMINAREA ACTIVITII FOSFATAZEI ACIDE SALIVARE Metoda colorimetric cu paranitrofenilfosfat Principiu Fosfataza acid este o monoesteraz cu pH-ul optim de aciune 4,8. Pentru determinarea activitii enzimatice se msoar colorimetric cantitatea de p-nitrofenol rezultat prin aciunea enzimei asupra p-

nitrofenilfosfatului utilizat ca substrat. O2N- O PO3H2 ----------> O2N- OH + H3PO4 p-nitrofenolul este colorat n galben n mediul alcalin. Reactivi 1. Soluie tampon substrat ( p-nitrofenilfosfat 5,5x10-3, tampon citrat 0,05M, pH = 4,8), dizolv 0,41 g acid citric, 1,125 g citrat de sodiu i 165 mg p-nitrofenilfosfat sare de sodiu n 100 ml ap distilat; pH-ul soluiei trebuie s fie 4,8. 2. NaOH 0,02N. Se dizolv 0,8 g NaOH n aproximativ 200 ml ap distilat, iar apoi se completeaz la 1000 ml. Tehnica de lucru n 2 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Tampon substrat pH = 4,8 Saliv
0

P 0,20

M 0,20

0,04 Se agit i se incubeaz 30 minute la 37 2,00 2,00 0,04

C. NaOH 0,02N Saliv

Se omogenizeaz i se citete extincia probei fa de martor la 405 nm, n cuva de 1 cm. Dac extincia depete valoarea de 0,780 se repet determinarea, utilizndu-se saliv diluat cu o soluie de NaCl 0,9%, iar la calcul se va ine seama de factorul de diluie. Calcul mU/ml = 101 x E405 Interpretarea rezultatelor Valorile normale ale fosfatazei acide salivare se situeaz ntre 33 45 mU/ml, fiind mai mari dect valorile serice, ceea ce sugereaz i o contribuie bacterian la aportul total al acestei enzime. Valoarea activitii fosfatazei acide crete n afeciuni parodontale, creterea avansnd cu gravitatea bolii.

VII.6. DETERMINAREA ACTIVITII FOSFATAZEI ALCALINE SALIVARE Metoda colorimetric cu paranitrofenilfosfat Principiu Fosfataza alcalin este o monoesteraz cu pH-ul optim de aciune 10,5, ce catalizeaz reacii de forma: R O PO3H2 + H2O ----------> R OH + H3PO4 Enzima este puin specific, acionnd asupra diferiilor esteri ai acidului fosforic. Pentru determinarea activitii enzimatice se utilizeaz

ca substrat p-nitrofenilfosfatul, un produs sintetic. Prin hidroliza acestuia se elibereaz p-nitrofenolul, compus colorat n galben n mediul alcalin. Intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia pnitrofenolului, i implicit cu activitatea enzimatic. O2N- O PO3H2 ----------> O2N- OH + H3PO4 Reactivi 1. Soluie tampon substrat ( p-nitrofenilfosfat 5,5x10-3, tampon glicocol 0,05M, pH = 10,5). Se dizolv 375 mg glicocol, 10 mg MgCl26H2O i 165 mg p-nitrofenilfosfat sare de sodiu n 42 ml NaOH 0,1N, apoi se completeaz cu ap la100 ml. Soluia este stabil o sptmn la + 4oC. 2. NaOH 0,02N. Se dizolv 0,8 g NaOH n aproximativ 200 ml ap distilat, iar apoi se completeaz la 1000 ml. Tehnica de lucru n 2 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) P M Tampon substrat pH = 10,5 0,20 0,20 Saliv 0,02 Se agit i se incubeaz 30 minute la 37 0C. NaOH 0,02N 2,00 2,00 Saliv 0,02 Se omogenizeaz i se citete extincia probei fa de martor la 405 nm, n cuva de 1 cm. Dac extincia depete valoarea de 0,780 se repet determinarea, utilizndu-se saliv diluat cu o soluie de NaCl 0,9%, iar la calcul se va ine seama de factorul de diluie. Calcul mU/ml = 200 x E405 Interpretarea rezultatelor Valorile normale ale fosfatazei alcaline salivare se situeaz ntre 21 35 mU/ml, fiind ceva mai mici dect valorile serice ale fosfatazei alcaline. La unele persoane limitele sunt mai mari, fapt ntlnit pentru multe componente normale ale salivei. Creteri ale activitii enzimei n saliv se produc n diversele forme de parodontopatii, acestea fcnd un paralelism cu gradul distruciei tisulare.

VII.7. DOZAREA COLORIMETRIC A FOSFATULUI ANORGANIC SALIVAR Principiu Fosforul este prezent n saliv att ca fosfor total, ct i ca fosfor anorganic. Prezena n saliv alturi de ionii de calciu are o importan deosebit deoarece contribuie la mpiedicarea solubilizrii smalului. De altfel, produsul ionic al ionilor de Ca2+ i PO43 este foarte apropiat de cel pe care l au aceti ioni n soluie saturat de fosfat tricalcic. Fosforul anorganic din saliv formeaz cu molibdatul de amoniu n mediu acid, fosfomolibdat de amoniu care prin reducere cu acid ascorbic

d o coloraie albastr cu maxim de absorbie la 7 00 nm. Culoarea se datoreaz formrii albastrului de molibden. Agentul reductor trebuie preparat extemporaneu, deoarece se oxideaz rapid. Reactivi 1. Soluie molibdat de amoniu: se dizolv 25 g molibdat de amoniu n 300 ml ap distilat, se adaug 75 ml H2SO4 concentrat i se completeaz, dup rcirea amestecului, cu ap distilat la 500 ml. 2. Acid ascorbic 1% 3. Soluie standard fosfat: se dizolv 0,4394g KH2PO4 n 1000 ml ap distilat (1 ml soluie conine 0,1 mg P). Se face o diluie de 1/10, iar soluia va avea concentraia de 0,01 mg P/1 ml. Tehnica de lucru n 3 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi: Reactivi (ml) Saliv diluat 1/10 Standard P Ap distilat Molibdat de amoniu Acid ascorbic M 3,0 0,8 0,2 P 0,5 2,5 0,8 0,2 S 1,0 2,0 0,8 0,2

Se citete extincia probei i standardului fa de martor la 700 nm dup 15 minute de repaus la temperatura camerei. Calcul mg P/ 0,05 ml saliv = EP / ES x 0,01 mg P/ 100 ml saliv = EP / ES x 20 Interpretarea rezultatelor Fosfatul total se afl n saliv n concentraie de 15 25 mg/100 ml, din care: 6 22 mg fosfor anorganic 0,5 10 mg fosfor organic Scderea fosfatului anorganic salivar duce la apariia cariilor, iar creterea la formarea calculilor dentari i tartrului.

BIBLIOGRAFIE
1. Cristea-Popa E., Popescu A., Truia E., Dinu V., Tratat de 2. 3. 4.

5.

Biochimie Medical, Ed. Medical-Bucureti, 1991. Felszeghy E., Abraham A., Biochimie, Ed. Didactic i Pedagogic Bucureti, 1972 Lehninger A.L. Biochimie, Ed.Tehnic Bucureti, 1987 Gilu D., Antonescu A., Dobjanschi L., Gilu R.D., Gilu L., Compendiu de Biochimie medical, Ed. Imprimeriei de Vest Oradea, 2002. Gilu L. Proinov I., Biochimie, Ed. Universitii din Oradea, 1999

6. Mihele D., Biochimie clinic, Ed.Medical Bucureti, 2001. 7. Thierry Grisar, Elements de biochimie humaine normale et

pathologique, partium I, Les Editions de lUniverite de Liege, 2004 8. rmure Cornelia, Biochimie structural i metabolic vol.I, Ed.Dacia Cluj-Napoca, 1996 9. Vrana K.E., Biochemistry, Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia,1999. 10. Mody Eugen, Funduc I., Alexandrescu R., Dobreanu M., Biochimie clinic, Editura All Educational, Timioara, 2000 11. Dobjanschi Luciana, Antonescu A., Bogdan N., Codreanu I., Gilu D., Murean M., Gilu L., Lucrri practice de biochimie, Editura Imprimeriei de Vest, Oradea, 2001 12. Mihele Denisa, Biochimie clinic metode de laborator, Editura Medical, Bucureti, 2000 13. Bettelheim F., Landesberg J., Laboratory Experiments for general, organic&Biochemistry, Saunders Golden Sunburst Series, 1997 14. Mandel I.D. - The role of saliva in maintaining oral homeostasis, JADA., 1989, 119:298-304. 15. Dorofteiu M. Fiziologie, Editura Casa Crii de tiin, Cluj Napoca, 2002. 16. Guyton A.C., Hall J.E. - Textbook of medical Physiology, Editura Elsevier Saunders, Philadelphia, 2006. 17. Ganong W.F. - Review of Medical Physiology Lange Medical Books, Mc Graw-Hill, New York, 2005. 18. Battino M., Ferreiro M.S., Gallardo I., Newman H.N., Bullon P. The antioxidant capacity of saliva. Journal of Clinical Periodontology, 2002, 29:189-194. 19. Edgar W.M. - Saliva: its secretion, composition and functions, Br Dent J., 1992, 172:305-12.