Serie

INVESTIGACIN y SISTEMATIZACIN 07

LAS POBLACiONES NAtuRALES dE LA tARA (Caesalpinia spinosa) EN EL ECuAdOR: uNA APROximACiN AL CONOCimiENtO dE LA divERSidAd GENtiCA y EL CONtENidO dE tANiNOS POR mEdiO dE EStudiOS mOLECuLARES y BiOqumiCOS
Programa Regional para la Gestin Social de Ecosistemas Forestales Andinos ECOBONA

Serie
INVESTIGACIN y SISTEMATIZACIN 07

al conocimiento de la diversidad gentica y el contenido de taninos por medio de estudios moleculares y bioqumicos

Las poblaciones naturales de la tara (Caesalpinia spinosa) en el Ecuador: una aproximacin

PROGRAMA REGIONAL ECOBONAINTERCOOPERATION Las poblaciones naturales de la tara (Caesalpinia spinosa) en el Ecuador: una aproximacin al conocimiento de la diversidad gentica y el contenido de taninos por medio de estudios moleculares y bioqumicos Autoras: Alexandra Narvez Trujillo, Directora del Laboratorio de Biotecnologa Vegetal de la Escuela de Ciencias Biolgicas Pontificia Universidad Catlica del Ecuador Amanda Calvo, Laboratorio de Biotecnologa Vegetal de la Escuela de Ciencias Biolgicas Pontificia Universidad Catlica del Ecuador Ana Mara Troya, Investigadora asociada del Laboratorio de Biotecnologa Vegetal de la Escuela de Ciencias Biolgicas Pontificia Universidad Catlica del Ecuador Con los aportes de: Comit Editorial: Fotografas: Edicin: diagramacin: tiraje: iSBN: Carlos Nieto, Juan Carlos Romero Mara de los Angeles Barrionuevo, Galo Medina Archivos ECOBONA, Mario Garca, Lorena Mancero, Mario Larrea. Mauro Guanandi, Archivos Laboratorio de Fisiologa Vegetal Patricio Mena Vsconez, Vernica vila : Activa Diseo Editorial 500 ejemplares 978-9942-

tabla de contenido
PRESENtACiN iNtROduCCiN mEtOdOLOGA Marcador molecular Poblaciones estudiadas
Anlisis de taninos Anlisis estadsticos

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RESuLtAdOS y diSCuSiN CONCLuSiN GLOSARiO REFERENCiAS BiBLiOGRFiCAS

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Reproduccin autorizada si se cita la fuente. Este libro deber ser citado de la siguiente manera: Narvez Trujillo, A., A. Calvo, A.M. Troya. 2009. Las poblaciones naturales de la tara (Caesalpinia spinosa) en el Ecuador: una aproximacin al conocimiento de la diversidad gentica y el contenido de taninos a travs de estudios moleculares y bioqumicos. Serie Investigacin y Sistematizacin No. 7. Programa Regional ECOBONA-INTERCOOPERATION, Laboratorio de Biotecnologa Vegetal Escuela de Ciencias Biolgicas Pontificia Universidad Catlica del Ecuador PUCE. Quito. Quito, enero 2010

www.bosquesandinos.info

PRESENtACiN
La tara, taya o guarango (Caesalpinia spinosa) es una especie forestal originaria de los valles andinos desde Venezuela a Chile y crece bien entre los 1500 y 3000 msnm. La tara produce unas vainas y semillas de las cuales se extrae una serie de productos, entre los ms importantes un tanino utilizado para curtiembre y una goma utilizada en la industria alimenticia. Otras virtudes de la tara son que es un rbol que produce durante 60 aos, y al ser una leguminosa, aporta nitrgeno al suelo, y crece muy bien en suelos pobres. Todas estas caractersticas hacen que la tara se constituya en una excelente alternativa para la recuperacin de reas degradadas en los Andes. El ECOBONA ha priorizado el trabajo con tara a nivel regional porque considera que, adems de ser una especie promisoria para reducir las presiones a los ecosistemas forestales andinos, y de ser un negocio que permite mejorar los ingresos de las comunidades, es una especie endmica en los tres pases en que trabaja (Bolivia, Ecuador y Per). El Per exporta productos derivados de la tara desde hace ms de 60 aos y se ha constituido en el primer productor mundial de harina y goma de tara. Ecuador y Bolivia tambin son productores de tara, pero mientras el Per exporta en productos lo extrado de 25 000 toneladas mtricas de vaina, Ecuador y Bolivia exportan menos de 200 cada uno. En el Per la mayor parte de la produccin es el resultado de procesos de recoleccin de rboles naturales o manejados. En el caso de Bolivia y Ecuador la situacin es un tanto distinta pues el desconocimiento de su potencialidad econmica as como la inexistencia de un mercado formal, han hecho que las poblaciones locales no valoren los remanentes de tara y stos estn desapareciendo. En los tres pases se ha podido observar el inters de actores locales por organizarse y ser ms eficientes en la produccin. La experiencia peruana en los procesos de manejo y transformacin ha sido compartida con los otros dos pases, un ejemplo de intercambio de experiencias sur-sur. En 2009 y gracias a un acuerdo de colaboracin con la Comunidad Andina (CAN) se est
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procurando involucrar a otros actores que aporten a reflexiones mayores con otras especies a nivel regional. Partiendo de este inters, el ECOBONA ha identificado su rol regional en apoyar procesos productivos de tara bajo criterios de sostenibilidad ambiental y beneficio social. En un primer momento a travs de talleres nacionales y regionales, se puso en contacto a expertos y expertas de los diferentes pases lo cual permiti identificar prioridades ambientales, de investigacin, productivas y de comercializacin a nivel regional. En el campo de la investigacin, el Programa Regional ECOBONA ha venido colaborando con el Laboratorio de Biotecnologa Vegetal de la Escuela de Ciencias Biolgicas de la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, entre otros centros de investigacin de la regin. Con esta entidad se han llevado a cabo varios estudios sobre la variabilidad gentica de la especie en Ecuador. En la publicacin que ahora presentamos se incluyen los resultados del anlisis de la variabilidad gentica de cinco remanentes de la especie en el Ecuador as como su contenido de taninos con el objetivo de, tal como dicen sus autoras, aportar al conocimiento integral de la especie para un manejo y conservacin adecuados. Estamos seguros que los resultados de este estudio contribuyen a la generacin de informacin de utilidad para los diversos actores que a nivel regional trabajan para lograr el tan buscado desarrollo sostenible en los Andes. Galo Medina Programa Regional ECOBONA

 Lorena Mancero

Las poblaciones naturales de la tara (Caesalpinia spinosa) en el Ecuador

iNtROduCCiN
Caesalpinia spinosa es un rbol nativo de los Andes (Jrgensen y Len-Ynez 1999) que crece, de forma silvestre o cultivada, en varios pases de la regin andina de Sudamrica. Los nombres comunes de la especie son taya en el Per; divi-divi de tierra fra, cuica o serrano en Colombia, vinillo o guarango en el Ecuador; tara que parece ser el nombre ms conocido internacionalmente en Bolivia, Chile y Venezuela, y acacia amarilla o dividivi de los Andes en Europa ( De la Cruz 2004). La tara tiene una distribucin entre 4 N y 32 S, desde Venezuela hasta el norte de Chile. En el Ecuador est en las provincias de Carchi, Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Azuay y Loja, dentro de un rango altitudinal que va desde los 1 500 msnm hasta 3 000 metros sobre el nivel del mar (Jrgensen y Len-Ynez 1999). Se encuentra principalmente en las formaciones conocidas como valles secos interandinos, en reas que corresponden

Mario Larrea

Mario Larrea

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Introduccin

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de cromo y otros productos txicos en el proceso de curtiembre de cuero; adems, estos compuestos le confieren al cuero tratado resistencia y elasticidad (De la Cruz 2004). Los taninos, adems, son utilizados actualmente industrialmente en la fabricacin de diversos productos como plsticos y adhesivos, galvanizados y galvanoplsticos, as como para la conservacin de aparejos de pesca por su condicin bactericida y fungicida; se usan asimismo como clarificadores de vinos y como sustitutos de la malta para dar cuerpo a la cerveza; en la industria farmacutica tienen un amplio uso teraputico y tambin se utilizan en proteccin de metales, cosmetologa, perforacin petrolfera, industria del caucho, mantenimiento de pozos de petrleo y como parte de las pinturas por su accin anticorrosiva (De la Cruz 2004). Otro producto obtenido de la especie es el cido glico, utilizado como antioxidante en la industria del aceite y en la industria cervecera como un elemento blanqueante o decolorante, as como en productos relacionados con fotografa, tintes, manufactura del papel, farmacia y grabado o litografa (De la Cruz 2004). En la medicina industrial forma parte de medicamentos gastroenterolgicos para curar lceras y de medicamentos cicatrizantes, antiinflamatorios, antispticos, antidiarreicos, antimicticos, antibacterianos, antiescorbticos, odontlgicos y antidisentricos (Mancero 2008). Adems, la

Lorena Mancero

al ecosistema de Matorral Seco Montano (Sierra 1999; Baquero et al. 2004). Segn Baquero et al. (2004), Caesalpinia spinosa, en asociacin con Dodonaea viscosa y Mimosa quitensis, ha determinado el tipo de formacin vegetal Estepa Espinosa Montano Bajo y Bosque Seco Montano Bajo (vase tambin Caadas 1983). Se puede considerar una especie bastante plstica y rstica porque resiste la sequa, las plagas y las enfermedades. Sus variadas cualidades le confirman como una especie que debe ser conservada y explotada de manera sustentable; es una especie andina de uso tradicional desde tiempos prehispnicos, sobre todo en el Per. Entre sus cualidades se destaca la presencia de taninos1 en la vaina, que son considerados una alternativa preferible al uso
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1 Correo electrnico de contacto: anarvaez@puce.edu.ec.

Mario Garca

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Introduccin

semilla es fuente de aceites, goma (usada para dar consistencia a los helados), harina proteica y derivados como jabones, pinturas, barnices, esmaltes, tintes de imprenta, mantecas y margarinas comestibles, pues presenta un contenido de cidos libres de 1,4% (cido oleico); es aceptable comercialmente por su baja acidez (Mancero 2008). Todas las aplicaciones de esta especie le han merecido el nombre de el oro de los Incas, sobre todo en el Per, pas que ha hecho un manejo de la especie para abastecer, en parte, la demanda mundial de los productos. Otros pases de la regin, como Bolivia y el Ecuador, han manifestado su inters en incentivar la plantacin de la especie para entrar al mercado internacional (ECOBONA 2007 a y b).
Lorena Mancero

En el caso del Ecuador, la especie haba sido prcticamente olvidada hasta hace poco tiempo. Las poblaciones silvestres son aprovechadas para cercar los terrenos, para generar sombra en los cultivos y como fuente de lea y produccin de carbn vegetal (Obs. pers. investigacin de campo). El creciente reconocimiento de las variadas propiedades de la especie ha propiciado un paulatino pero inminente inters en la especie como una alternativa para los productores agroforestales, tanto por parte del gobierno (Plan Pro-forestal) como de organizaciones privadas como CONAPROG (Consorcio de Productores de Guarango). Esta ltima es una iniciativa de la Fundacin Desde el Surco que agrupa a productores de los valles bajos de la Sierra del Ecuador dentro de la cadena agroproductiva del guarango. Se ha puesto la meta de plantar al menos cinco mil hectreas en sistemas diversos y agrupar a los plantadores, en un emprendimiento para acopiar, procesar y exportar productos y subproductos del guarango, principalmente taninos y gomas, que tienen una demanda mundial insatisfecha muy grande (Desde el Surco 2008). As, se hace evidente la urgencia de desarrollar en el pas estudios con visin de conservacin y uso apropiado de esta especie particularmente generosa. En vista de que esta especie puede tener usos relacionados con la conservacin y con la produccin comercial, Mancero (2008) caracteriza cuatro sistemas de produccin: 1) Manejo y cosecha en bosques naturales y en rboles existentes en campo, 2) Produccin en sistemas agroforestales, 3) Produccin en sistemas intensivos de monocultivo y 4) Produccin para recuperacin de zonas degradadas o reforestacin. Cada uno de estos sistemas involucra un manejo especial y especfico que no slo tenga una perspectiva silvicultural de manejo de plantaciones (podas, riego, etc.), sino que se sustente en un conocimiento integral de la especie, es decir, uno que incluya caractersticas biolgicas tales como su sistema reproductivo y los procesos de polinizacin, as como el estado de

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Introduccin

Lorena Mancero

Lorena Mancero

debido a que todos los productos comerciales se extraen principalmente de la vaina (Mancero, 2008). Este estudio propone el anlisis de la variabilidad gentica de cinco remanentes de Caesalpinia spinosa en el Ecuador junto al el anlisis de su contenido de taninos, con el objetivo de aportar al conocimiento integral de la especie con miras a un manejo ptimo y una conservacin adecuada. Se pretende conocer la diversidad gentica de esas poblaciones silvestres de tara en el Ecuador con el fin de tener un mejor conocimiento para la seleccin de fuentes semilleras relacionadas con actividades de forestacin en cualquiera de los escenarios productivos que se aplican para esta especie, con el fin de hacer un uso racional y sostenible de los recursos de origen.

conservacin de la especie; entre otras cosas, se necesita conocer la variabilidad gentica que presentan sus poblaciones en las distintas regiones geogrficas en las que se encuentran. Es importante tener la informacin sobre la variabilidad gentica en cualquiera de estos escenarios productivos pues es ah de esta variabilidad de donde nace la capacidad de una especie para adaptarse a cambios ambientales o para desarrollar defensas contra plagas y patgenos. Otro aspecto que tiene una base gentica es la produccin de taninos y de otros productos de inters comercial derivados de la tara. Quienes cultivan tara buscan poblaciones o individuos con alta produccin de taninos para cumplir con la demanda internacional en cuanto a porcentaje de taninos presentes en la vaina, que idealmente debe estar entre el 58 y 62% (Mancero, 2008). En el Per se seala la existencia de ecotipos o variedades de tara que se referencian a la zona de produccin; as, en zonas con suelos menos cidos la tara presenta mayor contenido de taninos. Este aspecto es importante porque la siembra de la tara generalmente se hace a partir de semilla sexual recolectada de fuentes silvestres basada en la identificacin de rboles plus, es decir, aquellos que presentan caractersticas de alto contenido de taninos y/o mayor produccin de vainas; este aspecto es importante

Lo rena Man cero

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 Mario Garca

Las poblaciones naturales de la tara (Caesalpinia spinosa) en el Ecuador

mEtOdOLOGA
Muchos de los cultivos y animales de produccin que se conocen en la actualidad han sido producto de un proceso de seleccin y mejoramiento por parte del ser humano. Esta seleccin se ha basado tradicionalmente en la seleccin fenotpica de caracteres, es decir, de caractersticas observables que sean de inters para quien pretende la mejora; en el caso de la tara, como se ha dicho, estas caractersticas deseables y seleccionables son el alto contenido de taninos y la mayor produccin de vainas. Sin embargo, estas caractersticas morfolgicas son marcadores ambiguos debido a las influencias ambientales. En otras palabras, un rbol que tiene la capacidad gentica de producir mucho tanino y muchas vainas, tal vez no lo hace por ciertas caractersticas no apropiadas del suelo, del clima y/o del manejo. La caracterstica fenotpica (es decir, la que se manifiesta y es observable o medible) tiene una base gentica en el nmero y efecto de los genes implicados en la expresin de un carcter, la localizacin de estos genes y su funcin fisiolgica. Afortunadamente, la aparicin de los marcadores moleculares est ayudando a eliminar tanto los

Laboratorio de Fisiologa Vegetal

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Metodologa

inconvenientes de una seleccin basada en el anlisis exclusivo del fenotipo, como a la identificacin de especies y variedades de una forma ms rigurosa y repetitiva. Los marcadores moleculares son biomolculas (molculas constituyentes de los seres vivos) que se pueden relacionar con un rasgo gentico. Las biomolculas que pueden ser marcadores moleculares son las protenas (antgenos e isoenzimas) y el ADN (genes conocidos o fragmentos de secuencia y funcin desconocida). Los marcadores moleculares tambin son usados actualmente para medir las relaciones entre diferentes grupos taxonmicos y para evaluar la estructura y cantidad de diversidad gentica entre las poblaciones (Lowe et al. 2004). Esto se puede aplicar para seleccionar poblaciones para mejoramiento o para establecer huertos semilleros.
Figura 1. Resumen metodolgico

marcador molecular
La variabilidad gentica en cinco poblaciones naturales de tara distribuidas en la Sierra ecuatoriana se determin usando cuatro combinaciones de iniciadores del marcador molecular AFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados, por sus siglas en ingls) (Vos et al. 1995). El ADN necesario para esta prueba se extrajo de tejidos de hojas jvenes, las cuales fueron colectadas en silica gel con el fin de conservar la calidad del ADN.

1. Extraccin ADN

2. Marcadores moleculares 2.1 Genotipaje - AFLP (X)

3. Cuantificacin taninos (Y)

Sitios de colecta
1. Loja Vilcabamba Loja 2. Cotopaxi Salcedo
Lorena Mancero

X*Y

1 2 3 4
Laboratorio de Fisiologa Vegetal

Polimorfismo (variacin) entre individuos

3. Pichincha Guayllabamba El Chiche 16 4. Imbabura Urcuqu

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Figura 2. Resumen determinacin gentica del fenotipo

Figura 3. Esquema del mtodo de AFLP

Genotipo I. Digestin del ADN con enzimas de restriccin DNA

Metodologa

genes

mRNA
productos orgnicos

Protenas

II. Ligacin de adaptadores

Fragmentos obtenidos

Mario Larrea

clulas
PCR

Primeros selectivos

Genotipo Ambiente

organismos

tejidos/rganos

III. Amplificacin selectiva

III. Anlisis electrofortico

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Muestras

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Poblaciones estudiadas
Los sitios de coleccin se escogieron tras una revisin de la informacin de especmenes registrados en las bases de datos del Missouri Botanical Garden en Saint Louis, EEUU y del Herbario QCA de la PUCE en Quito, Ecuador; se tom tambin en cuenta la informacin suministrada por ECOBONA (2007 a y b).
Metodologa

El muestreo consider una representatividad de la regin norte y de la regin sur de la Sierra del pas, de manera que se reflejara la diversidad presente en los estratos de vegetacin de la distribucin de la especie en el pas. Las localidades muestreadas se presentan en la Figura 4 y son, de sur a norte: Vilcabamba (provincia de Loja), Loja (provincia de Loja), Salcedo (provincia de Cotopaxi), Guayllabamba (provincia de Pichincha) y Urcuqu (provincia de Imbabura). En todas las localidades se muestrearon rboles adultos de ms de tres metros de altura, con troncos de entre 24 cm y 183 cm de dimetro a la altura del pecho y de preferencia en fructificacin. Los individuos seleccionados para el anlisis fueron colectados aleatoriamente pero con al menos 3 m de separacin entre ellos. Debido al tamao pequeo de las poblaciones se tuvo que colectar la mayora de los rboles maduros presentes o todos los individuos presentes, excepto plntulas o rboles muy jvenes (pequeos). En todos los casos se rea Laboratorio de Fisiologa Vegetal liz la georreferenciacin por medio de un aparato GPS.

Anlisis de taninos
La medida de porcentaje de taninos se refiere a los taninos solubles, sin diferenciar el tipo de taninos presentes (catequnicos/condensados o
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Figura 4. mapa de distribucin y distancias de los sitios de coleccin.

Elaboracin: Natalia Valarezo, 2010

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hidrolizables/piroglicos). Para el anlisis de cuantificacin de taninos se contrat a los laboratorios AIICA (Asociacin de Investigacin de las Industrias del Curtido y Anexas) de Barcelona, Espaa quienes siguieron el mtodo del filtro para determinar el porcentaje total de taninos de cada individuo (AIICA 2008). Veintinueve muestras de provenientes de las cinco localidades fueron enviadas para este anlisis.
Metodologa

Anlisis estadsticos
La variabilidad gentica total de una especie en este caso Caesalpinia spinosa se determina considerando el nmero total de individuos en cada una de las poblaciones, la variacin gentica de cada individuo en la poblacin y la variacin gentica de cada una de las poblaciones. La variacin se detecta a nivel de genes y sus variantes (los alelos) y esto se evala con descriptivos estadsticos como: frecuencias allicas y heterocigotos, estimacin de heterocigosidad, porcentaje de loci polimrficos,2 nmero de bandas nicas para cada poblacin, etc. (Lowe et al. 2004). Con base en los datos genticos se puede estimar cun semejantes o dismiles son las poblaciones bajo estudio. Las poblaciones que son ms semejantes entre s tendrn un acervo gentico comn; mientras ms distantes estas poblaciones, los genes y alelos sern diferentes y muchas veces incluso sern nicos para determinada poblacin. La distancia gentica, entonces, se describe como la proporcin de elementos genticos (alelos, genes, genotipos, gametos) que no son compartidos por dos muestras. De esta forma, la distancia gentica (D) vara de cero 0, cuando las frecuencias allicas de una poblacin son idnticas, a uno 1, cuando y slo cuando las dos muestras no compartan elementos genticos entre s (de Vicente et al. 2004). El Anlisis de Coordenadas Principales (PCoA por sus siglas en ingls) permite una representacin grfica de las relaciones entre las poblaciones. Cada eje sucesivo explica proporcionalmente un menor porcentaje de la variacin total, de manera que cuando hay grupos distintos, los 2 3 primeros ejes

tpicamente revelarn la mayor parte de la separacin entre ellos. El resultado es un plot de pocas dimensiones (entre dos y tres) que abarca la mayor cantidad posible de la variacin total, en el cual las distancias entre los puntos dentro del plot sean lo ms cercanas a la matriz original (Joliffe 2002). Para los progra Lorena Mancero mas de forestacin se deben tomar en cuenta estos parmetros, pues las poblaciones que sean seleccionadas como fuentes semilleras debern tener una alta variabilidad y ser representativas de la diversidad total de la especie. El Anlisis de la Variancia Molecular (AMOVA) es un mtodo utilizado para estimar la diferenciacin poblacional directamente desde datos moleculares, que se basa en procedimientos de permutacin (Excoffier et al. 1992). Este anlisis tambin se realiz para el contenido de taninos y para correlacionar ste con la diversidad gentica a travs de la prueba de Mantel (Rousset 1997). A este ltimo anlisis se sometieron las matrices estructuradas a partir de las distancias geogrficas, las distancias genticas y las distancias de porcentajes de taninos de las 26 muestras analizadas para porcentaje de taninos. Se utiliz la matriz estructurada con las distancias geogrficas como factor de correccin de la influencia de las distancias geogrficas sobre la relacin porcentaje de taninos/distancias genticas. El objetivo de estructurar el anlisis de esta forma fue encontrar (o no) correlacin entre las variables de genotipo, fenotipo y factor ambiental (ubicacin geogrfica), y sustentar los resultados obtenidos a partir de las pruebas de Mantel descritas anteriormente.
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Las palabras resaltadas tienen una definicin incluida en el glosario de la pgina XX.