Sunteți pe pagina 1din 39

Universitatea din Bucureti Facultatea de Chimie Catedra de Chimie Analitic

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONTROLUL ANALITIC AL UNOR POLUANI DIN PROBE DE MEDIU UTILIZND SENZORI CHIMICI I BIOCHIMICI

Doctorand: Mdlina Petrua BUCUR Coordonator tiinific : Profesor Dr. Andrei Florin DNE

Bucureti -2006-

V invitm s participai n ziua de 19 ianuarie a.c. ora 12 n amfiteatrul P1(Grigore Popa) al Facultii de Chimie la susinerea public a tezei de doctorat intitulat:

CONTROLUL ANALITIC AL UNOR POLUANI DIN PROBE DE MEDIU UTILIZND SENZORI CHIMICI I BIOCHIMICI

elaborat de:

Petrua Mdlina BUCUR


n vederea acordrii titlului tiinific de DOCTOR, n TIINE EXACTE, domeniul CHIMIE.

Comisie: Preedinte: Referenti:

Prof. dr. Dumitru Oancea Prof. Dr. Jean-Louis MARTY Prof. Dr. Ionel Ctlin POPESCU Prof. Dr. Gabriel Lucian RADU

Coordonator tiinific: Prof. Dr. Andrei Florin DNE

Mulumiri
n tez sunt prezentate rezultatele obinute de-a lungul a 5 ani de cercetare tiinifica n cadrul Centrului de Metode Automate de Analiz al Universitii din Bucureti i al Centrului de Fitofarmacie al Universitii din Perpignan. Adresez sincere mulumiri: Domnului Profesor Andrei Florin Dne, coordonatorul tiintific al acestei teze, pentru sprijinul, sfaturile tiinifice i ncrederea acordat de-a lungul stagiului de doctorat, precum i pentru atmosfera amiabil din cadrul laboratorului de Metode Automate de Analiz. Domnului Profesor Jean-Louis Marty, Universitatea din Perpignan, pentru ansa acordat de a lucra n cadrul echipei sale n perioada unui stagiu Erasmus Socrates, pentru sfaturile tiinifice, electrozii i enzimele pe care le-am primit efectuate la Bucureti. Domnului Profesor Anton Ciucu pentru sprijinul acordat n obinerea unei burse Erasmus-Socrates la Universitatea din Perpignan-Frana. Domnului Profesor Didier Fournier (Universite Paul Sabatier, Toulouse, Franta) pentru amabilitatea de a-mi furniza acetilcolinesteraza din Drosofila melanogaster. D-nei C.P. II Dr. Mihaela Badea pentru amabilitatea de a-mi corecta mai multe articole i D-nelor conf. Dr. Mihaela Cheregi i Lector Dr. Emilia Iorgulescu pentru discuiile tiintifice i sprijinul moral acordat n timpul stagiului de doctorat. pentru experimentele

D-nului Dr. Slawomir Kalinowski de la Universitatea Olsztyn, Polonia, pentru realizarea poteniostatului i a softului pentru determinrile amperometrice. D-nei Lise Barthelmebs, Matre de Confrence, care a supervizat activitatea mea din cadrul stagiului la Universitatea din Perpignan i care a avut rbdarea de a-mi corecta un articol. D-nei Dr. Silvana Andreescu, d-nului Thierry Noguer, Matre de Confrence si d-nului Gerard Jeanty pentru atmosfera agreabil din cadrul laboratorului din Perpignan i pentru sfaturile tiintifice n domeniul biosenzorilor. D-nului Profesor Radu Setnescu i d-nei Profesor Tana Setnescu pentru colaborarea excelent pe care am avut-o cu domniile lor. Colegilor mei de laborator Cristina Rizea, Alexandru Chivulescu, Marian Verziu, Daniela Neagu i Cristina Bratu pentru atmosfera prieteneasc i pentru schimburile tiinifice fructuoase pe care le-am avut cu acestia. Deosebit recunotin prinilor i soului pentru sprijinul moral acordat pentru realizarea acestei teze.

CUPRINS
(numerotarea paginilor este cea din teza de doctorat)

INTRODUCERE 1 I. PARTEA DE LITERATUR 4 I.1. SENZORI CHIMICI I BIOCHIMICI 4 4 I.1.1. Aspecte generale. Clasificare I.1.2. Senzori chimici 8 I.1.2.1 Senzori electrochimici 8 I.1.2.1.1 Modificatori utilizai n realizarea senzorilor electrochimici 9 I.1.2.1.2. Tipuri de electrozi 25 I.1.2.2. Alte tipuri de senzori chimici 37 I.1.3. Senzori biochimici 41 I.1.3.1. Componente biologice 42 I.1.3.1.1. Anticorpi (Ac) 42 I.1.3.1.2. Enzime 43 I.1.3.2. Metode de imobilizare a enzimelor 45 I.1.3.2.1. Imobilizarea enzimelor n matrice sol-gel 45 I.1.3.2.2. Imobilizarea enzimelor prin adsorbie 48 I.1.3.2.3. Includerea enzimelor n matrice polimeric 48 I.1.3.2.4. Electropolimerizarea 49 I.1.3.2.5. Cuplarea covalent 49 I.1.3.2.6. Reticularea 49 I.1.3.2.7. Imobilizarea enzimelor utiliznd legturi de afinitate 50 I.1.3.2.8. Imobilizarea enzimelor pe membrane lipidice i n lipozomi 53 I.1.3.3. Biosenzori imunologici 54 I.1.3.4. Biosenzori enzimatici 55 I.1.3.4.1. Traductori electrochimici folositi la realizarea de biosenzori enzimatici 55 I.1.3.4.2. Biosenzori bazai pe colinesteraze pentru detecia pesticidelor 57 I.2. METODE DE PRELUCRARE A PROBELOR N VEDEREA EFECTURII ANALIZELOR 68 I.2.1. Extracii cu solveni organici 68 I.2.2. Utilizarea biosenzorilor n prezena solvenilor organici 70
1

I.2.3. Influena oxidrii insecticidelor organofosforice asupra sensibilitii determinrilor bazate pe biosenzori

73

II. PARTEA ORIGINAL 75 II.1. Determinarea insecticidelor organofosforice utiliznd un biosenzor poteniometric bazat pe acetilcolinesteraz (AChE) 77 77 II.1.1. Introducere 78 II.1.2. Reactivi i aparatur II.1.3. Protocolul optim de imobilizare a AChE 79 II.1.4. Principiul de detecie 80 II.1.5. Procedeul de msurare 80 II.1.6. Rezultate i discuii 81 II.1.6.1. Caracteristicile biosenzorilor bazai pe utilizarea AChE imobilizat pe membrane de ester de celuloz 81 II.1.6.2. Determinarea insecticidelor organofosforice utiliznd biosenzorul cu AChE imobilizat pe membrana de ester de celuloz cu dimensiunea porilor de 0,45 m 86 II.1.6.3. Determinarea insecticidelor organofosforice din probe reale utiliznd biosenzorul poteniometric bazat pe AChE 90 II.1.7. Concluzii 90 II.2. Imobilizarea acetilcolinesterazei (AChE) utiliznd procedeul sol-gel 92 II.2.1. Introducere 92 93 II.2.2. Reactivi i aparatur II.2.3. Determinarea spectrofotometric a activitii enzimatice a AChE 94 II.2.4. Fabricarea electrozilor screen-printai 97 II.2.5. Construcia biosenzorului 99 II.2.5.1. Prepararea soluiilor de sol-gel 99 II.2.5.2. Protocolul optim de imobilizare a AChE 99 II.2.6. Principiul de msurare amperometric i modul de lucru pentru efectuarea determinrilor 100 II.2.7. Rezultate i discuii 103 II.2.7.1. Optimizarea metodei de imobilizare 103 II.2.7.2. Stabilitatea operational i de stocare a biosenzorilor cu AChE imobilizat n matrice de sol-gel 105 II.2.7.3. Influena concentraiei de substrat asupra rspunsului biosenzorilor 111
2

II.2.7.4. Determinarea insecticidelor organofosforice cu enzima imobilizat n sol-gel 113 II.2.8. Concluzii 121 II.3 Preconcentrarea i oxidarea insecticidelor organofosforice utiliznd o coloana cu XAD2 n vederea analizei lor cu un biosensor bazat pe AChE 123 123 II.3.1. Introducere 124 II.3.2. Reactivi i aparatur II.3.3. Construcia biosenzorului 125 II.3.4. Modul de lucru pentru determinrile amperometrice utiliznd biosenzorii realizai 126 II.3.5. Modul de lucru pentru preconcentrarea insecticidelor 128 II.3.6. Modul de lucru pentru oxidarea insecticidelor adsorbite pe coloan 128 II.3.7. Rezultate i discuii 128 II.3.7.1. Caracterizarea biosenzorului realizat 128 II.3.7.2. Selecia solventului organic pentru eluarea insecticidului de pe coloan cu XAD2 131 II.3.7.3. Curbele de inhibiie 137 II.3.7.4. Influena oxidarii insecticidelor organofosforice asupra biosenzorului 141 II.3.7.5. Detecia insecticidelor din probe reale 141 II.3.8. Concluzii 146 II.4. Ameliorarea limitelor de detecie ale biosenzorilor bazai pe AChE prin utilizarea unei enzime extrase din Drosophila melanogaster 148 II.4.1. Introducere 148 II.4.2. Reactivi i aparatur 148 149 II.4.3. Imobilizarea acetilcolinesterazei II.4.4. Modul de lucru pentru efectuarea msurtorilor amperometrice 150 II.4.5. Rezultate i discuii 151 II.4.6. Concluzii 158 II.5. Determinarea Cu (II) prin voltametrie de stripping anodic utiliznd un electrod din past de carbon modificat cu salicilaldoxim 159 II.5.1. Introducere 159 II.5.2. Reactivi i aparatur 159
3

160 II.5.3. Principiul metodei de analiz a cuprului 160 II.5.4. Prepararea electrodului II.5.5. Modul de lucru pentru efectuarea determinrilor 161 II.5.6. Rezultate i discuii 161 II.5.6.1. Compoziia electrodului 161 II.5.6.2. Comportarea voltametric a Cu(II) pe electrodul pasta de carbon modificat 162 II.5.6.3. Efectul timpului de reducere 162 II.5.6.4. Efectul timpului de acumulare 166 II.5.6.5. Performanele analitice 166 II.5.6.6. Studiul interferenelor 167 II.5.6.7. Analiza probelor reale 168 169 II.5.7. Concluzii III. CONCLUZII GENERALE 170 REFERINE BIBLIOGRAFICE 174

* Numerotarea tabelelor, figurilor si cea a indicatiilor bibliografice este cea din teza de doctorat
4

Cuvinte cheie Acetilcolinesteraza (AChE), biosenzori bazai pe AChE, electrozi screen-printai, inhibiie enzimatic, insecticide organofosforice, clorpirifos metil oxon, paraoxon, diclorvos, imobilizare n sol-gel, imobilizare prin reticulare, analiza selectiv a insecticidelor, AChE din Drosophila melanogaster (Dm), AChE din ipar electric, voltametrie de stripping anodic, determinarea Cu(II), electrod chimic modificat cu salicilaldoxim.

Rezumat I. PARTEA DE LITERATUR


n partea de literatur sunt prezentate aspecte generale ale senzorilor chimici i biochimici i o clasificare a acestora. Au fost trecui n revist senzorii chimici, cu accent pe cei electrochimici, precum i pe n utilizarea realizarea modificatorilor acestora. S-a i a mediatorilor electrochimici fcut referire la

componentele biologice utilizate pentru obinerea biosenzorilor, precum i o prezentare detaliat a unor metode de imobilizare a enzimelor. Au fost prezentate sistemele enzimatice bazate pe colinesteraze, utilizarea acestora pentru determinarea pesticidelor, precum i metode de prelucrare a probelor (extracii), utilizarea biosenzorilor n prezena solvenilor organici i metode de oxidare a pesticidelor.

II. REZULTATE ORIGINALE


n teza de doctorat s-au realizat i studiat senzori chimici i biochimici pentru controlul analitic al unor poluani din probe de mediu. Au fost dezvoltai i optimizai parametrii operaionali de funcionare ai unor biosenzori n vederea determinrii unor insecticide organofosforice i s-a pus la punct o metod de preconcentrare i oxidare a insecticidelor. S-au realizat i studiat parametrii de lucru ai unui senzor chimic pentru determinarea cuprului din probe complexe.
6

II.1 Determinarea unor insecticide organofosforice utiliznd un biosenzor poteniometric bazat pe acetilcolinesteraz (AChE) n acest capitol este prezentat determinarea a doi compui organofosforici, utiliznd un biosenzor poteniometric reutilizabil. AChE a fost imobilizat pe o membran de ester de celuloz folosind n acest scop glutaraldehid i albumin seric bovin (BSA). Membrana a fost apoi fixat pe un electrod de sticl cu suprafaa plat. Gradul de inhibiie al enzimei este dependent de concentraia de pesticid din proba de analizat. Enzima inhibat a fost reactivat utiliznd piridin-2-aldoxima metiiodur (2-PAM). n figura 26 este prezentat schema de imobilizare a AChE pe membrana de ester de celuloz.
Soluie 1: AChE 17 mUI / 10 L Soluie 2: 2% BSA / 10 L Soluie 3: 3% glutaraldehid/ 10 L depunere & uscare

depunere & uscare depunere & uscare

Membran de ester de celuloz (0,45 m, 0,22m)


Figura 26. Schema protocolului de imobilizare a enzimei.

AChE catalizeaz reacia de hidroliz a substratului, acetilcolina, cu obinerea produilor de reacie colin i acid acetic. Acesta din urma genereaz o variatie a pH-ului soluiei din
7

membran care este msurat cu ajutorul electrodului de sticl. Cnd insecticidul inhib enzima imobilizat pe membran se poate observa o reducere a variaiei de pH n prezena substratului (Figura 27).
Insecticid
Cl
-

CH3
+

O CH2 CH2 O C CH3 + H2 O


AC hE

Cl

CH3
+

CH3 N

CH3 N

CH2 CH2 OH + CH3 COOH

CH3

CH3

Acetilcolin

Colin

Variaie de pH Electrod de sticl

Figura 27. Principiul de detecie poteniometric al insecticidelor organofosforice folosind un biosenzor cu AChE.

Biosenzorul bazat pe AChE imobilizat pe o membran de ester de celuloz prezint o bun stabilitate operaional i de stocare. Insecticidele organofosforice utilizate n aceste experimente au fost: etil paraoxon i diclorvos (figurile 34, 36). Dup fiecare msurtoare de inhibiie enzimatic, reactivarea enzimei a fost fcut prin incubarea biosenzorului timp de 10 min ntr-o soluie 2-PAM 0,02 mol/L preparat n tampon fosfat 0,002 M, pH=8. Comparnd procentele de inhibiie obinute la aceleai concentraii de paraoxon respectiv diclorvos s-a constatat o capacitate mai mare de inhibiie a paraoxonului asupra enzimei dect cea a diclorvosului. Limita de detecie obinut cu biosenzorii construii a fost de 0,5 M pentru diclorvos i 0,1 M pentru etil paraoxon. Metoda a fost uor de aplicat pentru analiza direct a probelor de ap potabil din reeaua de alimentare a municipiului Bucureti. De altfel aceast
8

metod nu impune pre-tratamente ale probei i biosenzorul poate fi uor utilizat de personal cu calificare medie pentru a putea identifica i evalua toxicitatea probelor analizate [298,299].

I%

100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 paraoxon (M)

Figura 34. Curba de inhibiie a biosenzorului bazat pe AChE pentru paraoxon. Condiii de lucru: tampon fosfat 0,002 M la care s-a adugat 0,1 M KCl, pH=8; 17 mUI AChE/membrana, timp de incubare 20 minute.
100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 Diclorvos (M)

Figura 36. Curba de inhibiie a biosenzorului bazat pe AChE pentru diclorvos. Condiii de lucru: tampon fosfat 0,002 M la care s-a adugat 0,1 M KCl, pH=8; 17 mUI AChE/membran; timp de incubare 20 minute.

I%

II.2 Studiul imobilizrii acetilcolinesterazei (AChE) utiliznd procedeul sol-gel n acest capitol s-a urmrit imobilizarea AChE n matrice sol-gel n vederea realizrii unui biosenzor amperometric pentru detecia insecticidelor organofosforice. Am optimizat condiiile de imobilizare a AChE n matrice sol-gel pentru dezvoltarea unui biosenzor amperometric cu mediator tetracianochinodimetan (TCNQ). n acest sens n cadrul laboratorului Centre de Phytopharmacie al Universitii din Perpignan au fost produi electrozi screen-printai ncercndu-se asocierea metodei de imobilizare n sol-gel cu traductorii screen-printai. Au fost folosite dou tipuri de precursori MTMOS i TMOS. Soluia de sol-gel a fost obinut prin amestecarea precursorilor TMOS i MTMOS cu o soluie 1 mM de HCl, PEG600 i ap. Amestecul astfel obinut a fost sonicat timp de 20 minute pentru omogenizare i apoi pstrat la 4oC timp de 12 ore nainte de utilizare pentru a avea loc hidroliza silanilor. n urma experimentelor efectuate s-a determinat o compoziie optim de sol-gel pentru imobilizarea AChE (Tabelul 17).
Tabelul 17. Compoziia optim de sol-gel Sol-gel TMOS 20 L MTMOS 10 L H2O 44 L HCl 40 L PEG600 5 L

10

n tabelul 18 este prezentat compoziia optim pentru depunerea stratului sensibil.


Tabelul 18. Compoziia optim pentru depunerea stratului sensibil.

Soluie enzimatic 25L

Strat sensibil Sol-gel 25L

Pudr de grafit cu TCNQ + 3%HEC 25 L

Determinarea activitii enzimei imobilizate precum i testele de inhibiie au fost realizate prin msurtori amperometrice ntr-o celul cu un volum de 10 mL folosind o soluie agitat. Electrozii screen-printai au fost modificai cu un mediator electrochimic sensibil pentru oxidarea compuilor tiolici: TCNQ, care permite efectuarea determinrilor la un potenial redus, de +100 mV vs Ag/AgCl (figura 42).
Acetiltiocolina +H2O AChE tiocolin +acid acetic +100 mV vs Ag/AgCl 2eTiocolina (red) TCNQ (ox)

Tiocolina (ox) + 2H+

TCNQ (red)

Figura 42. Detecia amperometric a tiocolinei produs n reacia de hidroliz enzimatic a acetiltiocolinei.

Pentru detecia insecticidelor, msurtorile de inhibiie au fost realizate n trei etape: (i) msurarea de trei ori a rspunsului iniial al biosenzorului la injectarea acetiltiocolinei i calcularea mediei celor
11

trei determinri; (ii) incubarea senzorului timp de 10 respectiv 20 minute n soluie de insecticid; (iii) msurarea rspunsului rezidual de trei ori i calcularea mediei celor trei determinri. Procentul de inhibiie este calculat astfel: I% =(I0 I)/I0 x100 inhibiie; I = valoarea curentului dup inhibiie. Pentru imobilizarea AChE au fost testate diferite amestecuri de TMOS, MTMOS, PEG600, HCl 1 mM i H2O pentru obinerea de precursori hidrolizai. n acest fel s-a realizat un studiu al stabilitii operaionale a biosenzorilor. Pentru a prepara stratul sensibil n vederea construirii biosenzorilor au fost folosite trei amestecuri de reactivi i anume: (i) pudr de grafit cu TCNQ n HEC, (ii) AChE n tampon i (iii) precursorii hidrolizai notai cu A, B, C i D. Pentru obinerea stratului sensibil, au fost testate opt variante ntre amestecurile (i-iii) pentru a determina condensarea sol-gelului astfel nct enzima s fie ncapsulat pe suprafaa electrozilor cu o stabilitate operaional corespunztoare. Astfel au fost obtinui biosenzorii notai cu A1, A2, A3, B1, B2, C1, C2 i D1. A fost studiat stabilitatea operaional a biosenzorilor i cele mai bune rezultate au fost obinute pentru biosenzorii A3 i C2. Pentru biosenzorul A3 media rspunsului n cazul unui singur biosenzor a fost de 114,9 3 nA, (n=12) iar pentru C2 de 149,3 3 nA (n=12), concentratia de substrat n celula fiind de 1 mM. (18) I% = procentul de inhibiie; I0 = valoarea curentului nainte de

12

O alt caracteristic studiat a fost stabilitatea la stocare a biosenzorilor cu enzima imobilizat n sol-gel. Rezultate bune au fost obinute prin conservarea biosenzorilor la congelator la o temperatur de 20 oC n vid. S-a studiat i influena concentraiei de substrat asupra rspunsului biosenzorilor A3 i C2 (figura 54). Concentraia de substrat aleas pentru msurtori ale activitii enzimatice a fost de 1 mM. Reprezentarea 1/I ca o funcie de 1/[ATCh] prezint o dependen liniar din care s-au calculat constantele Michaelis aparente pentru biosenzorul A3, kmap =0,14 mM i pentru biosenzorul C2, kmap =0,1 mM. Pentru testele de inhibiie au fost utilizai biosenzori de tip A3 i C2 care au prezentat o stabilitate operaional i de stocare satisfctoare. n acest studiu s-au utilizat trei insecticide i anume paraoxonul utilizat n mod uzual ca insecticid de referin, clorpirifosmetil oxon unul dintre cele mai toxice insecticide i diclorvos.
I (nA) 180 130 80 30 -20 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 ATCh (mM) biosenzor C2 biosenzor A3

Figura 54. Influena concentraiei de substrat asupra rspunsului biosenzorilor bazai pe AChE de tip A3 i C2. Condiii de lucru: tampon fosfat 0,1 M la care s-a adugat KCl 0,1M, pH=8, 2 mUI/AChE/electrod, 100 mV vs Ag/AgCl.

13

Pentru fiecare din biosenzori s-a putut observa dup etapa de incubare o scdere a semnalului ceea ce implic o scdere a activitii AChE imobilizate pe electrod. n figurile 57, 59, 61, 63, 65, 67 sunt prezentate curbele de inhibiie pentru cele trei insecticide utiliznd cei doi biosenzori A3 i C2.
120 100 80 60 40 20 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 paraoxon (M)

Inhibitie%

10 minute 20 minute

Figura 57. Influena concentraiei de paraoxon asupra rspunsului biosenzorului de tip A3 cu AChE imobilizat n sol-gel; fiecare punct experimental este media a patru msurtori.
Inhibitie % 100 80 60 40 20 0 0 0.5 1 1.5 Paraoxon (M) 10 minute 20 minute

Figura 59. Influena concentraiei de paraoxon asupra asupra rspunsului biosenzorului de tip C2 cu AChE imobilizat n sol-gel; fiecare punct experimental reprezint media a patru msurtori.

14

Cele mai bune rezultate au fost obinute cu biosenzorul C2 la un timp de incubare de 20 minute. Pentru paraoxon a fost obinut o limit de detecie de 0,008 M.
120 Inhibitie% 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 Diclorvos (M) 10 minute 20 minute

Figura 61. Influena concentraiei de diclorvos asupra rspunsului biosenzorului de tip A3 cu AChE imobilizat n sol-gel; fiecare punct experimental este media a patru msurtori.

n cazul diclorvosului s-a obinut o limit de detecie de 0,02 M.


120 Inhibitie % 100 80 60 40 20 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Diclorvos (M) 10 minute 20 minute

Figura 63. Influena concentraiei de diclorvos asupra biosenzorului de tip C2 cu AChE imobilizat n sol-gel; fiecare punct experimental este media a patru msurtori.

Cea mai bun limit de detecie a fost obinut n cazul clorpirifos-metil oxonului i anume 0,001 M.
15

Inhibitie %

100 80 60 40 20 0 0 0.1 0.2 0.3 Clorpirifos metil oxon (M)


10 minute 20 minute

Figura 65. Influena concentraiei de clorpirifos metil oxon asupra rspunsului biosenzorului de tip A3 cu AChE imobilizat n sol gel; fiecare punct experimental este media a patru msurtori.
100 Inhibitie % 80 60 40 20 0 0 0.1 0.2 0.3 Clorpirifos metil oxon (M)
10 minute 20 minute

Figura 67. Influena concentraiei de clorpirifos metil oxon asupra rspunsului biosenzorului de tip C2 cu AChE imobilizat n sol gel; fiecare punct experimental este media a patru msurtori.

Comparnd procentele de inhibiie obinute la aceleai concentraii de paraoxon, diclorvos i clorpirifos-metil oxon s-a constatat o capacitate mai mare de inhibiie asupra enzimei a clorpirifos metil oxonului urmat de paraoxon i diclorvos.

16

II.3. Preconcentrarea i oxidarea insecticidelor organofosforice utiliznd o coloana cu XAD2 n vederea analizei lor cu un biosenzor bazat pe AChE Scopul acestui studiu a fost acela de a mbunti limitele de detecie precum i selectivitatea analizelor efectuate cu ajutorul biosenzorilor. Cu ajutorul unei coloane care conine XAD2, insecticidele organofosforice pot fi preconcentrate i oxidate. Extracia n faz solid este larg utilizat pentru determinarea insecticidelor putnd fi adoptat i pentru biosenzori, condiia fiind aceea ca solventul organic utilizat la eluia insecticidului s fie compatibil cu enzima i traductorul. n funcie de hidrofobicitatea solventului organic i de eventualul efect pe care metoda de imobilizare o are asupra enzimei, activitatea enzimatic poate fi puternic afectat. Enzima a fost imobilizat ntr-o matrice sol-gel optimizat n capitolul anterior [236]. Biosenzorul obinut prezint o bun stabilitate operaional pentru mai mult de 12 msurtori ale activitii. Media rspunsului pentru un singur biosensor a fost de 243 4,4 nA (n=12) (concentraie final n celula 1mM substrat) prezentnd o bun reproductibilitate a rspunsului biosenzorului (RSD=1,8). Rspunsul biosenzorului crete cu creterea concentraiei de substrat pn la atingerea unui platou (saturarea enzimei). A fost investigat n acest studiu i eventuala influen pe care incubarea biosenzorului n tampon fosfat ce conine solveni organici o poate avea asupra alurei
17

graficelor la concentraii diferite de substrat. Pentru fiecare grafic au fost utilizai biosenzori diferii. Din figura 70 se poate observa c graficele obinute la incubarea biosenzorilor timp de 10 minute n tampon fosfat coninnd 10% ACN, metanol i respectiv etanol nu prezint schimbri semnificative ale alurii n comparaie cu graficul obinut cu biosenzorul care nu a fost n contact cu solveni organici. S-a studiat efectul prezenei solventului organic asupra activitii AChE prin incubarea biosenzorului timp de 10, 15, i 20 minute n soluie de tampon fosfat 0,1 M care conine 5, 10, 15 % (v/v) ACN, etanol i metanol (figura 71). S-a constatat c efectul de denaturare a enzimei crete cu creterea timpului de incubare al biosenzorului.
I (nA) 500 400 300 200 100 0 0 1 2 3 ATCh (mM) PBS PBS+ACN 10% PBS+Et-OH 10% PBS+Met-OH 10%

Figura 70. Efectul incubrii biosenzorilor n soluii de tampon fosfat 0,1 M care conin 10% ACN, 10% Et-OH i 10% Met-OH asupra graficului de calibrare pentru ATCh. Timp de incubare 10 minute. Condiii de lucru: tampon fosfat (PBS) 0,1 M la care s-a adugat 0,1 M KCl; 2mUI AChE/electrod; potenial aplicat +100 mV vs Ag/AgCl.

18

Raspuns relativ (%)

140 120 100 80 60 40 20 0 ACN ACN ACN Met Met Met Et 5% 10% 15% 5% 10% 15% 5% Et Et 10% 15%

10 min 15 min 20 min

% solvent organic

Figura 71. Efectul concentraiei de solvent organic (%, v/v) precum i a timpului de incubare asupra rspunsului biosenzorului. ACN: acetonitril; Met: metanol; Et: etanol. Rezultatele sunt media a trei msurtori independente. Condiii de lucru: tampon fosfat 0,1 M, pH = 8; 0,1 M KCl; 1 mM ATCh, potenial aplicat: + 100 mV vs Ag/AgCl

Pentru un timp de incubare al biosenzorului de 10 minute n soluie de tampon fosfat ce conine 5% (v/v) solvent organic procentul de variaie al activitii enzimei este mai mic de 10% i din acest motiv s-a considerat c prezena acestui procent de solvent organic are o influen mic asupra AChE. n tabelul 23 este prezentat reproductibilitatea biosenzorului la testele de inhibiie. Studiile de recuperare ale paraoxonului i diclorvosului adsorbite pe coloana ce conine XAD2 au fost realizate conform urmtoarelor etape: (i) trecerea a 50 mL de soluie 10-7 M paraoxon respectiv diclorvos prin coloan; (ii) eluarea cu solvent organic a insecticidului reinut pe coloan; (iii) colectarea de fracii a cte 0,5 mL i analiza acestora.
19

Tabelul 23. Reproductibilitatea biosenzorului la inhibiie. Reproductibilitatea biosenzorului la inhibiie Concentraia Insecticid insecticidului RSD (M) Paraoxon n 5 x 10-7 6,3% tampon fosfat (63 4% inhibiie, n=5) Paraoxon n 5 x 10-7 7,4% 5% (v/v) ACN (43,2 3% inhibiie, n=5) Paraoxon 2,5 x 10-7 11,7% dup preconcentrare (60 7% inhibiie, n=5) Diclorvos n tampon 2,5 x 10-7 8,4% fosfat (32,3 2,7% inhibiie, n=5) Diclorvos n 5% (v/v) 2,5 x 10-7 9,5% ACN (20 1,9 % inhibiie, n=5) Diclorvos dup 2,5 x 10-7 11% preconcentrare (55,6 6,1% inhibiie, n=5)

Fraciile eluate au fost diluate n tampon fosfat la un volum final de 10 mL i apoi analizate cu biosenzorul cu AChE. S-a constatat c la utilizarea ACN, primii 0,5 mL (prima fracie) au fost suficieni pentru eluarea insecticidelor adsorbite n timp ce volume mai mari de solvent au fost necesare n cazul etanolului (1 mL adic 2 fracii) i pentru metanol (1,5 mL-trei fracii). Lund n considerare aceste rezultate, ACN a fost ales pentru eluarea insecticidelor adsorbite pe coloana cu XAD2. Concentraia de 5% (v/v) ACN a fost aleas ca fiind optim pentru mediul de incubare. Au fost obinute trei grafice de inhibiie pentru diclorvos i respectiv paraoxon n urmtoarele condiii de lucru: (i) incubarea biosenzorului n soluie de tampon fosfat 0,1 M, pH=8; (ii) incubarea biosenzorului n soluie de tampon fosfat ce conine 5% (v/v) ACN

20

pentru a observa reducerea sensibilitii acestuia datorit solventului organic. Dup preconcentrarea probei pe coloana cu XAD2 prima fracie de 0,5 mL eluat de pe coloana a fost diluat la 10 mL cu tampon fosfat, mprit n dou i analizat cu doi biosenzori diferii. Graficele de inhibiie obinute (figurile 72 i 74) prezint o alur similar. Aa cum se poate observa din grafice, procentele de inhibiie cresc cu concentraia de insecticid pn cnd este atins un platou. Se observ o diferen ntre procentele de inhibiie ale paraoxonului i diclorvosului datorat toxicitii net diferite pe care insecticidele o au asupra AChE.
I (%)
100 80 60 40 20 0

10

10-7 M paraoxon

Figura 72. Curbele de inhibiie pentru paraoxon obinute cu biosenzorul cu AChE imobilizat n sol-gel dup 10 minute de incubare n soluie tampon fosfat; tampon fosfat cu 5% (v/v) ACN i rezultatele obinute la analiza primei fracii de 0,5 mL eluat cu ACN de pe coloana cu XAD2 pe care s-a preconcentrat insecticidul. Fracia eluat n ACN a fost diluat la 10 mL cu soluie tampon fosfat.

Pentru paraoxon, curba de calibrare obinut n tampon fosfat este liniar pn la 10-7 M (R2=0,9955, n=3 pentru fiecare
21

determinare) cu o limit de detecie de 5 x10-8 M. Curbele de calibrare pentru acelai insecticid ns coninnd 5 % (v/v) ACN este liniar de la 8x10-8 (limita de detecie) la 2,5x10-7 M (R2=0,9852, n=3 pentru fiecare determinare). Efectul inhibitor mic al acetonitrilului i reducerea procentului de inhibiie msurat cu biosenzorul incubat n 5%(v/v) ACN este vizibil la concentraii mici de insecticid. Curba de inhibiie obinut dup trecerea soluiilor standard de insecticid prin coloan a fost liniar ntre 2,5x10-8 (limita de detecie) i 2,5x10-7 M (I% = 172,31 x conc (M) + 18,692; R2 = 0,9522, n=4).
I (%) 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 -6 10 M diclorvos

Figura 74. Curbele de inhibiie pentru diclorvos obinute cu biosenzorul cu AChE imobilizat n sol-gel dup 10 minute incubare n soluie tampon fosfat; tampon fosfat cu 5% (v/v) ACN i rezultatele obinute la analiza primei fracii de 0,5 mL eluat cu ACN de pe coloana cu XAD2 pe care s-a preconcentrat insecticidul. Fracia eluat n ACN a fost diluat la 10 mL cu soluie tampon fosfat.

Pentru diclorvos, curba de inhibiie n tampon fosfat este liniar de la 8x10-8 (limita de detecie) la 2,5 x 10-7 M (R2=0,994,
22

n=3). n cazul incubrii biosenzorului n soluii standard de diclorvos preparate n tampon fosfat ce conine 5% (v/v) ACN, partea liniar a graficului este cuprins ntre 10-7(limita de detecie) i 5 x10-7 M (R2 = 0,9945, n=3). Utilizarea etapei de preconcentrare permite obinerea unui grafic de calibrare la concentraii mai mici a crui parte liniar este cuprins ntre 2,5 x10-8 M (limita de detecie) i 2,5 x10-7 M (I% = 172,1 x conc(M) + 9,9641; R2 = 0,9844, n=4). Studiile de oxidare eterogen a insecticidelor au fost realizate utiliznd metil paration oxidat la metil paraoxon. Studiile de inhibiie ale biosenzorilor bazai pe AChE de ctre metil paraoxonul obinut prin oxidarea eterogen a metil parationului au fost comparate cu studii de inhibiii realizate cu soluii standard de etil paraoxon. Aceast comparaie a fost realizat pentru a se estima eficacitatea oxidrii metil parationului i efectul de denaturare a enzimei produs de reactivul folosit la oxidare. Oxidarea compuilor organofosforotionai a fost fcut n sistem eterogen. Studiile preliminare au fost realizate pentru a investiga i gsi parametrii optimi pentru minimalizarea efectului negativ pe care oxidantul l are asupra biosenzorului. n acest sens prin coloan au fost trecui 20 mL NBS de concentraie 10-2 M preparai n ap distilat. Apoi prin coloana au fost trecui 5 mL de ACN direct sau dup o etap de splare a coloanei cu 20 mL ap distilat sau 10 mL soluie tampon fosfat 0,1M. Fracii cu volume de 0,5 mL au fost recuperate de pe coloan n tuburi Eppendorf, diluate
23

cu tampon fosfat pn la un volum final de 10 mL i analizate cu biosenzorul. n toate cele trei cazuri s-a putut constata un efect denaturant important n cazul primei fracii eluate, denaturare datorat probabil prezenei agentului oxidant n ACN eluat. Astfel rspunsul biosenzorului scade cu 90% dup incubarea n fracia ce conine ACN eluat de pe coloan fr etapa de splare, cu 34% la incubarea acestuia n ACN eluat de pe coloan dup splarea acesteia cu 20 mL apa distilat i cu circa 23% la incubarea n fracia de ACN eluat dup splarea coloanei cu 10 mL soluie tampon fosfat 0,1M. Indiferent de metoda de splare utilizat, procentul de inhibiie msurat pentru cea de-a doua fracie recuperat de pe coloan a fost de aproximativ 4%, ceea ce este comparabil cu procentul obinut n cazul incubrii biosenzorului n tampon fosfat ce conine 5% (v/v) ACN. La studiul inhibiiei unei soluii de 2,5 x 10-6 M paration in tampon fosfat nu s-a nregistrat nici un efect inhibitor asupra biosenzorului iar dupa ce proba de paration a fost oxidata s-a obtinut o inhibitie de 89%. Acest lucru este foarte important deoarece reprezint o mbuntire a calitii de avertizare pe care biosenzorii enzimatici o au pentru ntreaga clas de insecticide i nu numai pentru un anumit grup. Metoda analitic propus poate fi uor adaptat pentru analiza unor probe lichide complexe cum ar fi produsele alimentare i i propune s fie un dispozitiv de alarm i de identificare a probelor potenial contaminate. Pentru analiza probelor reale,
24

insecticidele adsorbite pe coloan sunt recuperate cu numai 0,5 mL ACN, dar numai 0,25 mL sunt necesari pentru analiza cu biosenzorul cu AChE. Probe de ap au fost colectate din rul Arge i Dmbovia. Acestea au fost filtrate i analizate n aceeai zi utiliznd procedeul bazat pe extracia insecticidelor pe coloan. Probele au fost analizate direct i dup introducerea n acestea a unor concentraii cunoscute de paraoxon respectiv diclorvos (tabelul 26) [307,308].
Tabelul 26. Inhibiia exprimat n procente i gradul de regsire al unor cantiti cunoscute de insecticid introduse n probe la analiza unor probe reale. Rul Arge Rul Dmbovia Inhibiie (%) Grad de Inhibiie Grad de regsire (%) (%) regsire (%) Analiza <10 <10 directa a probelor 1x10-7 M paraoxon adugat 2.5x10-7 M paraoxon adugat 1x10-7 M diclorvos adugat 2.5x10-7 M diclorvos adugat 37 53 25 53 106 80 87 100 43 60 30 52 141 96 116 98

25

II.4 Ameliorarea limitelor de detecie ale biosenzorilor bazai pe AChE prin utilizarea unei enzime extras din Drosophila melanogaster n acest capitol s-a investigat posibilitatea ameliorrii limitelor de detecie ale biosenzorilor bazai pe AChE prin utilizarea de enzime provenite din dou surse: ipar electric (AChE-eel) i din Drosophila melanogaster (AChE-Dm). Enzimele au fost imobilizate ntr-o matrice sol-gel obinut printr-un procedeu optimizat prezentat n capitolul II.2. Imobilizarea enzimei s-a fcut pe suprafaa unui electrod screen-printat. Imobilizarea AChE-eel i AChE-Dm n matrice sol gel a condus la biosenzori caracterizai de o stabilitate operaional pentru cel puin 12 msurtori ale activitii enzimatice. Media rspunsului pentru un singur electrod cu AChE-eel imobilizat n sol-gel la injectarea a 50 L ATCh 100 mM (1 mM concentraie final n celul) este de 243 4,4 nA (n=12) ceea ce nseamn c biosenzorul prezint o bun reproductibilitate a rspunsului senzorului (RSD = 1,8 %). Electrodul cu AChE-Dm prezint o cretere a rspunsului la 393 7,8 nA prezentnd i acesta o bun reproductibilitate a rspunsului senzorului (RSD = 2%). n figura 78 este prezentat influena concentraiei de substrat asupra rspunsului biosenzorilor cu AChE-eel respectiv AChE-Dm. Rspunsul biosenzorilor crete cu concentraia de substrat pn cnd platoul este atins (saturarea enzimei). Variaia rspunsului a fost semnificativ la injectarea

26

concentraiilor mici de substrat, platoul fiind obinut n jurul valorii de 1 mM ATCh.


I (nA) 500 400 300 200 100 0 0 0.5 1 1.5 2 ATCh (mM) AChE wt AChE eel

Figura 78. Influena concentraiei de substrat asupra rspunsului biosenzorilor cu AChE-eel respectiv AChE-Dm. Condiii de lucru: tampon fosfat 0,1M/0,1M KCl, pH=8, potenial aplicat 100 mV vs Ag/AgCl.

A fost studiat diferena ntre inhibiiile produse asupra biosenzorilor construii cu AChE-eel i AChE-Dm de ctre dou insecticide organofosforice: paraoxon i diclorvos. La studiul inhibiiei produse asupra enzimei de ctre paraoxon respectiv diclorvos, s-a observat c biosenzorii bazai pe AChE-Dm sunt mai sensibili dect cei construii utiliznd AChE-eel (figurile 81 i 83). La msurtorile de inhibiie cu biosenzorul cu AChEDm a fost observat o sensibilitate remarcabil a enzimei pentru cele dou insecticide organofosforice limitele de detecie obinute fiind cu mult mai bune dect cele obinute n cazul biosenzorului cu AChE-eel.

27

Inhibitie %

100 80 60 40 20 0 0 0.5 1 1.5 Paraoxon (M)

Inhibitie%-AChE-eel

Inhibitie %

100 80 60 40 20 0 0 0.1 0.2 0.3 Paraoxon (M)

Inhibitie%-AChE-Dm

Figura 81. Curbele de inhibitie pentru paraoxon obinute cu biosenzorii cu AChE-eel i Dm. Timp de incubare 10 minute. Condiii de lucru: tampon fosfat 0,1M/0,1M KCl, pH=8, potenial aplicat 100 mV vs Ag/AgCl.

Din comparaia procentelor de inhibiie pentru cele dou insecticide, se poate observa c biosenzorul cu AChE-Dm este mai sensibil la diclorvos dect la paraoxon, iar pentru biosenzorii construii cu AChE-eel, paraoxonul este un inhibitor mai puternic dect diclorvosul [311].

28

Inhibitie%

120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 Diclorvos (M) Inhibitie%-AChE-eel

Inhibitie %

120 100 80 60 40 20 0 0 0,02 0,04 0,06 Diclorvos (M) Inhibitie%-AChE-Dm

Figura 83. Curbele de inhibiie pentru diclorvos obinute cu biosenzorii cu AChE-eel i AChE-Dm. Timp de incubare 10 minute. Condiii de lucru: tampon fosfat 0,1M/0,1M KCl, pH=8, potenial aplicat 100 mV vs Ag/AgCl.

Aceste diferene ntre procentajele de inhibiie sunt explicate de constantele ratei de inhibiie [310] a fiecrei enzime pentru cei doi inhibitori (tabelul 27).
Tabelul 27. Comparaie ntre constantele ratei de inhibiie i limitele de detecie pentru cele dou insecticide Limita de Detecie ki (M-1 x min-1) Diclorvos Paraoxon Diclorvos Paraoxon AChE -Dm 1,9 1,5 5x10-10 M 2,5x10-9 M AChE -eel 0.026 0.3 8x10-8 M 5x10-8 M 29

II.5 Determinarea Cu (II) prin voltametrie de stripping anodic utiliznd un electrod din past de carbon modificat cu salicilaldoxim n acest studiu este descris realizarea unui electrod past de carbon modificat cu salicilaldoxim i sunt studiai parametrii de lucru ai acestuia. Electrodul a fost aplicat pentru determinarea Cu (II). Metoda de determinare a Cu(II) prin voltametrie de stripping anodic const din: (i) etapa de preconcentrare din soluia de prob agitat cu formarea complexului Cu(II) salicilaldoxim pe suprafaa electrodului; (ii) etapa de preelectroliz n care ionii de Cu2+ din complexul cupru salicilaldoxim au fost redui la cupru elementar adsorbit pe suprafaa electrodului i (iii) etapa de redizolvare n care metalul adsorbit pe suprafaa electrodului este redizolvat prin oxidare anodic. nlimea picului anodic msurat n etapa (iii) este determinat de concentraia de Cu(II) din prob. n figura 86 este prezentat primul ciclu (la inregistrarea unei voltamograme ciclice) pentru electrodul modificat cu salicilaldoxim nainte i dup acumularea cuprului. Aa cum se poate observa din figur picul produs de analit apare la 0,20 mV (vs Ag/AgCl). S-a studiat efectul concentraiei de salicilaldoxim din pasta de carbon asupra acumulrii cuprului i s-a determinat raportul optim modificator/pudr de carbon ca fiind 1:4. Ali parametrii optimizai au fost: (i) timpul de reducere stabilit la 100 sec; (ii) timpul de acumulare stabilit n urma experimentelor la 3 minute.
30

curent (A)

150 125 100 75 50 25 0 -400 -200 -25 0 -50


potential (mV)

A B

200

400

Figura 86. Voltamogramele ciclice obinute cu electrodul pasta de carbon modificat cu salicilaldoxim : A - analiza unei soluii standard de 10 ppm Cu(II); B proba de comparaie fr preconcentrarea Cu(II).

Rspunsul voltametric a fost liniar n domeniul de concentraii 0,1 i 10 ppm pentru un timp de acumulare de 3 minute n circuit deschis (fara aplicarea unui potential). Ecuaia dreptei de calibrare a fost: y = 8,4153x 1,04 iar coeficientul de corelare R2 = 0,9872. Limita de detecie a fost determinat ca fiind 0,1 ppm Cu(II). Suprafaa electrodului poate fi utilizat pentru 8-10 analize cu un RSD=8,5%, n=8, pentru o soluie standard de Cu(II) de 10 ppm. Selectivitatea electrodului past de carbon modificat cu salicilaldoxim a fost studiat prin analiza unor soluii standard de interfereni n concentraie de 50 ppm n amestec cu 3 ppm Cu2+. Ionii studiai au fost Zn(II), Cd(II), Mo(IV), Pb(II), Mn(II), Sn(II). Rezultatele obinute au fost comparate cu analiza standard a soluiei de 3 ppm Cu2+. Cu excepia Mo(IV) la ceilali ioni studiai nu s-a observat nici o modificare n rspunsul pentru cupru. n cazul

31

Mo(IV) a fost obinut un pic la un potenial de 165 mV ns acesta nu interfer n determinri. Metoda optimizat a fost aplicat probelor reale (vin i ap rezidual). Rezultatele obinute au fost comparate cu cele obinute prin spectrometrie de absorbie atomic [167,312]. III. CONCLUZII O prim direcie de cercetare abordat n cadrul prii originale a tezei a constat n realizarea unui biosenzor poteniometric bazat pe AChE pentru determinarea unor insecticide organofosforice. Acesta a prezentat urmtoarele caracteristici: (i) stabilitate operaional pentru minimum 15 msurtori (ii) stabilitate de stocare: 2 luni la 200C. Pentru studiile de inhibiie au fost utilizate dou insecticide: paraoxon i diclorvos. Dup inhibiie biosenzorul poate fi reutilizat dup reactivarea enzimei cu 2-PAM. Metoda a fost uor de aplicat pentru analiza direct a probelor de ap potabil din reeaua de alimentare a municipiului Bucureti. O alt direcie de cercetare a constituit-o realizarea de biosenzori amperometrici pentru detecia insecticidelor organofosforice. ntr-o prim etap a fost optimizat metoda de imobilizare a AChE ntr-o matrice sol-gel. Biosenzorii astfel realizai au prezentat o stabilitate operaional pentru minimum 12 msurtori i o stabilitate de stocare de 4 luni la 200C. Studiile de inhibiie au fost realizate utiliznd trei compui organofosforici i anume: paraoxon, diclorvos i clorpirifos metil oxon.
32

n cadrul prii experimentale a tezei a fost optimizat i o metod de preconcentrare i de oxidare n faz eterogen a insecticidelor organofosforice utiliznd o coloan cu XAD2. S-a studiat efectul prezenei solventului organic asupra activitii AChE prin incubarea biosenzorului timp de 10, 15, i 20 minute n soluie de tampon fosfat 0,1 M care conine 5, 10, 15 % (v/v) ACN, etanol i metanol. S-a demonstrat c limita de detecie pentru paraoxon i diclorvos a fost mbuntit de la 5x10-8 i 8x10-8 M pentru studiile de inhibiie realizate n soluie tampon, la 2,5x10-8 i respectiv 2,5x10-8 M dup utilizarea etapei de preconcentrare. De asemenea metoda permite detectarea insecticidelor organofosforotionate (P=S) prin oxidarea lor n forma oxonic (P=O) care este mult mai toxic. Oxidarea compuilor organofosforotionai a fost fcut n sistem eterogen. Metoda de analiz propus a fost aplicat pentru probe reale colectate din rurile Arge i Dmbovia. Probele au fost analizate direct i dup adugarea unei cantiti cunoscute de insecticid. O alt posibilitate de ameliorare a limitei de detecie a biosenzorilor bazai pe AChE investigat a fost utilizarea unor enzime provenite din surse diferite: ipar electric (AChE-eel) i Drosophila melanogaster (AChE -Dm). Limitele de detecie obinute pentru biosenzorii realizai folosind AChE-Dm sunt semnificativ mbuntite comparativ cu cele obinute n cazul utilizrii enzimei disponibile comercial AChE-eel: de la 5x10-8 M la 2,5x10-9 M n cazul paraoxonului i de la 8x10-8 M la 5x10-10 M pentru diclorvos.
33

n ultimul capitol al prii originale a fost construit i studiat un electrod past de carbon modificat cu salicilaldoxim cu ajutorul cruia s-a determinat Cu (II) prin voltametria de stripping anodic. Au fost optimizai parametrii de lucru: (i) timpul de reducere stabilit la 100 sec; (ii) timpul de acumulare stabilit n urma experimentelor de 3 min.; (iii) Suprafaa electrodului poate fi utilizat pentru 8 analize, (RSD=8,5%, n=8); Electrodul realizat prezint o bun selectivitate iar limita de detecie a fost de 0,1 ppm. Acesta a fost aplicat pentru analiza unor probe reale. BIBLIOGRAFIE SELECTIV 167. A. F. Dne, D. Neagu, M. P. Dondoi, N. Iliescu, Rev. Chim., vol. 55, nr. 1, 2004, pag. 1. 236. B. Bucur, M. P. Dondoi, A. F. Dne, J.-L. Marty : Anal. Chim. Acta, 539, 2005, pag. 195. 298. M. P. Dondoi, A. F. Danet, M. C. Cheregi, M. Badea, B. Bucur : Euroanalysis XIII, 5-10 sept., 2004, Salamanca, Spania. 299. M. P. Dondoi, A. F. Dne, B. Bucur, M. C. Cheregi, Rev. Chim., vol. 56, nr. 4, 2005, pag. 327. 307. M. P. Dondoi, B. Bucur, A. F. Dne, C. N. Toader, L. Barthelmebs, J.-L. Marty: Anal. Chim. Acta, 578, 2006, pag. 162. 308. M. P. Dondoi, B. Bucur, A. F. Danet, J-L. Marty, G. L. Radu, 11th International Conference on Electroanalysis 11-15 june 2006 Bordeaux, Franta.

34

310.Y. Boublik, P. Saint-Aguet, A. Lougarre, M. Arnaud., F. Villatte, S. Estrada-Mondaca., D Fournier.: Protein Engin., 15(1), 2002, pag. 43. 311. M. P. Bucur, A. F. Dne, J.-L. Marty: Rev. Chim., vol. 57, nr. 8, 2006, pag. 781-789. 312. A. F. Danet, M. P. Dondoi, N. Iliescu, D. Neagu: Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering RICCCE 13, 16-20 sept. 2003, Bucuresti, Romania.

35