CINTICA ENZIMTICA: AMILASAS

Resumen
Se determinaron los parmetros cinticos de amilasas provenientes de solucin salival
mediante la degradacin del sustrato de almidn de yuca y malta bajo condiciones de
temperatura y concentracin de enzima constantes.
Los valores de los parmetros segn la linealizacion de Lineweaver Burk son
Vmax= 8,54Brix y Km= 130,08 min.
Introduccin
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan informacin directa acerca
del mecanismo de la reaccin cataltica y de la
especificidad de la enzima.
La medida de la cintica se realiza siempre en las
condiciones ptimas de pH, temperatura,
presencias de cofactores etc. Adems con
concentraciones saturadas de sustrato la
velocidad de reaccin observada es la velocidad
mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse
midiendo la aparicin de los productos o la
desaparicin de los reactivos. Al seguir estas
velocidades de aparicin o desaparicin en
funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de
avance de la reaccin, o simplemente, la cintica
de la reaccin. A medida que la reaccin
transcurre, l la velocidad de acumulacin del
producto va disminuyendo porque se va
consumiendo el sustrato de la reaccin.
Para estudiar la cintica enzimtica se mide el
efecto de la concentracin inicial de sustrato
sobre la velocidad inicial de la reaccin,
manteniendo la cantidad de enzima constante.
El almidn est formado por dos tipos de
molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos
polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma
por cadenas lineales de glucosas unidas por
enlaces - C1-C4, mientras que la amilopectina
tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones
C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La -
amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa
como en la amilopectina, dejando dextrinas
lineales y ramificadas (oligosacridos) como
productos.
Objetivos
Objetivo General
Determinar la cintica enzimtica de las amilasas.
Objetivos especficos
Calcular los parmetros enzimticos de las
amilasas.
Demostrar la degradacin de almidn por parte
de las amilasas.
Metodologa
Se enumer tres vasos de precipitacin. Despus,
se coloc en todos los vasos 50 ml de agua
destilada y 25 g de almidn y se solubiliz el
almidn.
Se ajust el pH a 5,5 (pH de la solucin no fue
necesario ser ajustado) y se coloc en el bao
termosttico a 60C durante 15 min.
Se puso en dos vasos 3 g de malta, y el vaso 3
sirvi como patrn de comparacin.
Se agit constantemente las mezclas y se midi la
concentracin de azcar inicial en el brixiometro.
Y se tom y midi una muestra cada 10 minutos
hasta que la concentracin se mantuvo constante.
Diagrama de proceso



Clculos y Resultados

Tabla 1.- Tratamientos (T).
T Sustratos Enzima
1
Almidn de
yuca+malta seca
Si
2
Almidn de
yuca+malta seca
No
3 Almidn de yuca No
[Fuente: Laboratorio de ingeniera de las Enzimas.
Autor: Chamorro, Ynez].

Datos experimentales obtenidos
Tabla 2.- Resultados de concentracin de
sustratos a diferentes tiempos en los distintos
tratamientos.
t
(min)
T1
(Brix)
T2
(Brix)
T3
(Brix)
0 15 10 5
10 15 10 5
20 19 10 5
30 20 10 5
40 20 10 5
50 20 10 5
[Fuente: Laboratorio de ingeniera de las Enzimas.
Autor: Chamorro, Ynez]


Grfica de los datos obtenidos


Grfico 1.- Concentracin de sustrato (Brix) en
funcin del tiempo (min).
Linealizacin de la reaccin
( )
( ) 23 , 15 117 , 0
int
+ =
=
=
+ =
u
u
Ln C
ercepto b
pendiente a
b Ln a C

Velocidad de reaccin para cada tiempo
( )
( )
u
u
u
u
A
+
=
+ =
A
A
=
23 , 15 117 , 0
23 , 15 117 , 0
Ln
r
Ln C
C
r

Mxima razn de reaccin (Vmax) y
constante de Michaelis Menten (Km)
| |
b aX Y
V S V
Km
V
O
+ =
+ =
max
1 1
max
1

y = 0.1171x + 15.238
R = 0.7788
0
5
10
15
20
25
0 20 40 60
S
u
s
t
r
a
t
o

(

B
r
i
x
)

Tiempo (min)
( ) ( )
08min 130,
Brix 4 5 , 8 Brix min 0,117
max
max
Brix 4 5 , 8 max
Brix 15,23
1
max
1
max
max
1
max
1 -
=
=
=
=
=

=
=
=
=
Km
Km
V a Km
V
Km
a
V
V
b
V
V
b
V
Km
a

Ecuacin de formacin inicial de producto
segn la ecuacin de Michaelis Menten

| |
| |
| |
| | S Brix
S
V
S V
S Km
V
Menten Michaelis de Ecuacin
O
O
+

=
+

54 , 8
min 08 , 130
max



Grfico 2.- Soluciones de sustrato: A)
Tratamiento 1, B) Tratamiento 2, C) Tratamiento
3. [Fuente: Laboratorio de ingeniera de las Enzimas.
Autor: Chamorro, Ynez]

Discusin
La saliva es una sustancia involucrada en parte de
la digestin y por lo tanto est compuesta de
enzimas tales como las amilasas. Por lo tanto se
prepar una solucin de saliva con el fin de
obtener amilasas. Las amilasas obtenidas de la
solucin salival se colocaron sobre almidn de
yuca y malta como sustrato y se determin la
cintica enzimtica de estas enzimas por medio
de la degradacin del almidn de yuca. La
solucin de almidn que en un principio se
observ muy viscosa con la degradacin
enzimtica de las amilasas disminuy su
viscosidad. La concentracin de azucares
determinada mediante el refractmetro fue
aumentando en funcin del tiempo, hasta
alcanzar una concentracin constante, la que
indic que la actividad enzimtica finaliz.
En los tratamientos 2 y 3 (en los cuales la no se
aadi enzima) la concentracin de azcares
permaneci constante en el tiempo (Tabla2).
Mediante la linealizacin de la ecuacin de
Michaelis Menten se determin la mxima razn
de reaccin (Vmax) y la constante de Michaelis
Menten (Km), obtenindose valores de 8,54Brix
para Vmax y 130,08 min para Km.
Cuestionario
Si despus de realizar la hidrlisis del
almidn aadimos lugol a las soluciones;
podramos detectar almidn sin hidrolizar?
Si, ya que gracias a lo coloracin azulada que
obtiene el almidn al ponerse en contacto con el
lugol, sabramos que la reaccin enzimtica es
positiva si la prueba de lugol es negativa ya que
el almidn habra sido hidrolizado por la enzima
amilasa.
Se puede realizar una hidrlisis bsica del
almidn?
El glucgeno si puede ser hidrolizado ya sea por
enzimas o por cidos minerales.
En la hidrlisis cida los enlaces se rompen al
azar, conformacin intermediaria de todos los
posibles oligosacridos y la conversin final de
stos en glucosa. La hidrlisis de los enlaces
glucosdicos del glucgeno puede ser tambin
llevada a cabo por la enzima -amilasa, que
cataliza la hidrlisis especfica de los enlaces (1-
4) (no son afectados los enlaces (1-6). Los
productos finales de la hidrlisis enzimtica del
glucgeno son glucosa, maltosa e isomaltosa.
Escriba las diferencias y semejanzas entre
almidn y glucgeno, es posible hidrolizar
el glucgeno?
Glucgeno y Almidn [Semejanzas]
- Polmeros de-D-glucosa.
- Son la forma en la que
sedepositanloscarbohidratos (glucosa) en
las clulas animalesy vegetales.
- Presente en msculo esqueltico y
tejidoheptico.
- Presentanramificacionescada 10 o
msunidades.
- Poseen enlaces 1-4 entre cada residuo y
enlaces 1-6 entre cada ramificacin.
Glucgeno y Almidn [Diferencias]
- El glucgeno es de origen animal y el
almidn es de origen vegetal.
- El almidn es soluble en agua el
glucgeno no.


Qu son errores sistemticos? Existieron
en la realizacin de la prctica.
Se denomina error sistemtico a aquel que es
constante a lo largo de todo el proceso de medida
y, por tanto, afecta a todas las medidas de un
modo definido y es el mismo para todas ellas.
Estos errores tienen siempre un signo
determinado y las causas probables pueden ser:
- Errores instrumentales (de aparatos)
- Error personal
- Errores de mtodo de medida.

Probablemente este tipo de error se presento en
la medida de concentracin de azucares con el
refractmetro ya que el mtodo de medida no es
el mas adecuado para determinar con exactitud la
concentracin de azcar degradado. Este mtodo
mide de manera general los slidos solubles en la
solucin.

Qu son errores aleatorios? Existieron en
la realizacin de la prctica.

Error aleatorio es aquel error inevitable que se
produce por eventos nicos imposibles de
controlar durante el proceso de medicin.
Este error pudo no existir en la prctica, ya que
se controlaron todas las variables: concentracin
de enzima, concentraciones de sustrato y
temperatura.
Conclusiones
De amilasas obtenidas de una solucin salival se
determin la cintica enzimtica de las estas
enzimas sobre almidn de yuca y malta como
sustrato registrando los cambios en la
concentracin de azcares mediante un
refractmetro y los cambios notables en la
viscosidad al final de la reaccin cataltica.
Los parmetros enzimticos de las amilasas se
calcularon mediante la ecuacin de linealizacin
de Lineweaver Burk, obteniendo Vmax=
8,54Brix y Km= 130,08 min.
Se demostr la degradacin de almidn por parte
de las amilasas por cambios en la viscosidad de la
solucin de almidn y los cambios en la
concentracin de azcares (Brix).
Bibliografa
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