FACULTAD DE TECNOLOGA MDICA CURSOS: HISTOLOGA, EMBRIOLOGA Y GENTICA HUMANA

PRACTICA N 5: ESTUDIO DE MITOSIS EN CLULAS DE RAZ DE CEBOLLA

(Allium cepa )
Lic. Vctor A. Tomasto Marcani
FUNDAMENTO TERICO: La mitosis es el proceso por el que las clulas se dividen de forma que el material gentico se reparte por igual entre las dos clulas hijas, y as las dos son genticamente iguales. En las plantas la mitosis se produce sobre todo en los meristemos, que son los tejidos que permiten el crecimiento de la planta y que se encuentran, entre otros lugares, en los extremos de los tallos y de las races. La raz de la cebolla es un buen material para observar este proceso, puesto que en el meristemo apical las clulas se dividen a gran velocidad, lo que aumenta la probabilidad de detectar clulas en mitosis. Los cromosomas, como la mayora de los componentes celulares, son invisibles al microscopio si no les aplicamos una tincin especfica. La orcena, colorante morado que usaremos en este caso, est compuesta en realidad de dos componentes, que se aaden en momentos diferentes. La orcena A reblandece la lamela celular y la orcena B completa el proceso de tincin del material cromosmico al adherirse a estas estructuras. OBJETIVOS: Estudiar la divisin celular en clulas somticas. Adiestrarse en el uso de tcnicas de observacin microscpica. Aprender mtodos para observar la mitosis al microscopio compuesto. Observar y reconocer las fases de la mitosis en clulas reales. MATERIALES: Del Alumno: Cebolla Vaso Palillos mondadientes Lminas portaobjetos Laminillas cubreobjetos Lpiz con borrador Pinzas Gillette, bistur o tijeras Papel de filtro o higinico blanco Campo Del Laboratorio: Fijador Carnoy Alcohol etlico al 70% Reactivo Orcena A Reactivo Orcena B Tubos de ensayo con tapa Matraz de Erlenmeyer Frasco lavador Pinzas de madera Mechero de alcohol Microscopio PROCEDIMIENTO Enraizado: Tres o cinco das antes de la prctica en el laboratorio debes hacer crecer las races de la cebolla. Para ello, pon una cebolla seca sobre un vaso de precipitados con agua, sujeta con dos o tres palillos. Slo la parte inferior debe quedar en contacto con el agua. Guardar en oscuridad y a temperatura ambiente, cambiando diariamente el agua. Al cabo de los 3 5 das aparecern numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 o 4 cm de longitud. Para facilitar la aparicin de las races se raspa ligeramente con un Gillette la zona del disco radicular del bulbo para eliminar las raices y el tejido seco. Cosecha: Corta unos 2 - 3 mm del extremo de las raicillas (ah se encuentran las clulas en divisin). Por lo general, en el trpico, las horas ptimas de actividad mittica van desde el amanecer hasta las 10:30 a 11 am, con un ptimo alrededor de las 9 o 10 de la maana. En el laboratorio las raices se cosechan a las 9 y 30 a.m.. Fijacin: Colocar de inmediato, las raicillas cortadas, en un tubo de ensayo que contenda 2 ml de fijador Carnoy. Tapar. Fijar por 24 horas, a 4 C. Luego, las races fijadas pueden almacenarse en alcohol etlico al 70 % a 10 C. Lavado: Lavar las races para eliminar el fijador. Para ello coloque las races en un matraz de Erlenmeyer con agua destilada por 5 minutos. Realice tres cambios de agua destilada, para un total de 15 minutos de proceso de lavado.

FACULTAD DE TECNOLOGA MDICA CURSOS: HISTOLOGA, EMBRIOLOGA Y GENTICA HUMANA

Maceracin: Elimine el agua destilada del matraz y aada 2 - 3 ml de orcena A Orceina. Sujeta el matraz con una pinza de madera y calienta a la llama del mechero durante unos minutos, dando suaves pasadas y evitando la ebullicin. Controlar la temperatura con el dorso de la mano. Retira de la llama el matraz si observas la emisin de vapores tenues. Dejar enfriar por 3 4 minutos y repetir 2 veces mas el proceso de calentamiento enfriamiento. Evita que la orcena se acerque al borde del matraz , puesto que podra arder al contacto con la llama. Si la orcena se evapora, aade unas gotas. Es muy importante evitar que la muestra se queme. La maceracin provoca la disgregacin celular del tejido meristemtico, por degradacin de la lamela media de la pared celular, permitiendo una buena separacin de las clulas. Este paso es muy sensible al tiempo transcurrido: si se deja actuar demasiado el reactivo orceina A, ste digiere completamente la lamela media y penetra en el interior celular comenzando la degradacin del protoplasto y su contenido; por el contrario, si el tiempo de accin del la orcena A no es suficiente, no se lograr la degradacin de la lamela media y la consecuente disgregacin del tejido meristemtico y las clulas no podrn disponerse en una monocapa luego de su separacin, por lo que los resultados sern lminas con clulas superpuestas donde es imposible distinguir las diferentes fases mitticas. Lavado: Lavar las races para eliminar el reactivo orceina A, utilizando 3 cambios de agua destilada de 5 minutos cada uno, para un total de 15 minutos de proceso de lavado. Terminado el lavado, aadir al matraz 2 ml de Orceina B. Es importante el lavado del reactivo orceina A, pues ste interfiere con la coloracin de los cromosomas. Disgregacin: Aadir una gota de reactivo orceina B en una lmina portaobjetos, luego colocar una raz del matraz de Erlenmeyer, cortar con un gillette y conservar los 2 mm terminales del lado del meristema (del lado de la caliptra o cofia) y eliminar el resto de la raz. Colocar una laminilla cubreobjetos, y con ayuda de un lpiz con borrador dar un pequeo golpe sobre el preparado para disgregar la raz. El meristemo se distingue por ser ms blanco.

Eliminar, en lo posible, la caliptra terminal, dejando lo ms limpio y disgregado posible el tejido meristemtico. Coloracin: Dejar actuar la orceina B por 5 minutos, cuidando en todo momento que el material no se seque y monitoreando bajo la lupa el avance del proceso de coloracin. Squash: Usando el borrador del lpiz, golpear el centro de la laminilla y de alli continuar en espiral hacia fuera hasta lograr distribuir uniformemente el meristemo de la raz. Coloque un trozo de papel higinico sobre el cubreobjetos, y con ayuda de la yema del dedo pulgar presionar fuerte y cuidadosamente. Esta tcnica se llama tambin "extendido por aplastamiento". El squach permite la distribucin en monocapa de las clulas del meristemo. Tambin elimina exceso de reactivo. Recuerde que mientras est ms aplastado, las clulas se separarn ms unas de las otras y se encontrarn en el mismo plano, distinguindose mejor las distintas fases de la mitosis. Si la preparacin est bien asentada no hay peligro de rotura por mucha presin que se realice. Observacin: Examine al microscopio el preparado, haciendo uso de los objetivos 4X, 10X y 40X. Seleccin: Seleccione su mejor preparado, rotule con sus datos y entregue al profesor para su revisin y calificacin. RESULTADOS: Grafique las etapas del procedimiento y los resultados de la prctica. CUESTIONARIO: 1. Caractersticas de la interfase: 2. Caractersticas de la profase: 3. Caractersticas de la metafase: 4. Caractersticas de la anafase: 5. Caractersticas de la telofase: 6. Por qu los cromosomas se tien de morado? 7. Cuntos cromosomas tiene la clula de cebolla? 8. Qu componente del reactivo Orceina A reblandece la lamela? 9. Qu funcin cumple el reactivo Orceina B? 10. Cul es la composicin del fijador Carnoy? 11. Mencione 10 diferencias entre mitosis y meiosis 12. Comparacin entre mitosis en clulas vegetales y animales. 13. Diferencias entre citocinesis y cariocinesis. 14. Diferencias entre citocinesis en clula vegetal y animal. 15. Qu es el fragmoplasto y placa celular?

FACULTAD DE TECNOLOGA MDICA CURSOS: HISTOLOGA, EMBRIOLOGA Y GENTICA HUMANA

GRAFICAR SUS OBSERVACIONES:

INTERFASE (1000 X) Caractersticas: ... ... ... ....... ... ....... ... ... ... ...

PROFASE (1000 X) Caractersticas: ... ... ... ....... ... ....... ... ... ... ...

METAFASE (1000 X) Caractersticas: ... ... ... ....... ... ....... ... ... ... ...

ANAFASE (1000 X) Caractersticas: ... ... ... ....... ... ....... ... ... ... ...

TELOFASE (1000 X) Caractersticas: ... ... ... ....... ... ....... ... ... ... ...

BIBLIOGRAFA: ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...