PRUEBAS MICROBIOLGICAS MS USADAS E EL CONTROL MICROBIOLGICO DE LOS ALIMENTOS I. INTRODUCCIN.

Desde antiguo se sabe que los alimentos son un excelente transmisor de enfermedades infecciosas. Incluso hoy en da, a pesar de que existe mayor informacin acerca de los microorganismos y su transmisin, an as, la transmisin de microorganismos por alimentos es un gran problema. El aumento de nuevos patgenos transmitidos por alimentos atrae a los medios de comunicacin sobre la seguridad de los alimentos, haciendo que los consumidores seamos ms conscientes de dichas transmisiones y as exigimos alimentos cada vez ms seguros. Por otra parte, el desarrollo microbiano destruye grandes cantidades de alimentos, causando problemas econmicos y una considerable prdida de importantes nutrientes En todo Control Microbiolgico de calidad destacan dos aspectos: Calidad Higinico - Sanitaria: que no se distribuyan microorganismos patgenos para la salud. Calidad Comercial: presencia de microorganismos alterantes, que alteren el producto hacindolo no comestible (aunque no sean patgenos) La calidad microbiolgica de los alimentos es fundamental porque influye en su conservacin y vida de anaquel y, sobre todo, porque los microorganismos presentes en ellos, pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por alimentos. La deteccin en el laboratorio de los microorganismos patgenos puede ser muy compleja, muy lenta y/o muy costosas para determinaciones rutinarias, adems es concluyente cuando se encuentra un microorganismo patgeno, pero puede haber casos en que no se detecte por razones circunstanciales como el clima o la cantidad de individuos infectados que estn contaminando. Por esas razones, las norma en materia de alimentos, generalmente establecen la calidad microbiolgica en trminos de microorganismos indicadores. Los principales microorganismos indicadores son: Indicadores de condiciones de manejo de eficiencia de proceso Mesofilos aerobios Cuenta de hongos y levaduras Cuenta de coliformes totales

Indicadores de contaminacin fecal Coliformes fecales E. Coli

II. OBJETIVOS.
Ensear al estudiante el significado y las operaciones a seguir en la ejecucin de las pruebas microbiolgicas mas utilizadas en el control microbiolgico de los alimentos. Ejecutar las pruebas microbiolgicas mas usadas en el control microbiolgico

de los alimentos

III. REVISIN BIBLIOGRAFICA.

ORIGEN E IMPORTANCIA PATOLGICA DE PRESENTES EN LOS PRODUCTOS DE CONSUMO ORIGEN Segn su procedencia podemos agruparlos en dos categoras: Origen endgeno: ya estn presentes en el producto o materia prima antes de su obtencin o procesado. Seran aquellos que constituiran la micro biota normal de esas materias primas. Hay que destacar, en el caso de alimentos de origen animal, los microorganismos productores de zoonosis: infecciones causadas por parsitos que afectan a animales, pero que se transmiten tambin al hombre. Tambin podemos citar la micro biota de la leche, las levaduras de la superficie de las uvas... Tanto los animales como los vegetales tienen su micro biota tpica, que puede pasar finalmente al producto. Muchas veces esta microbiota es deseable, puesto que interviene en las caractersticas del producto final. Sin embargo otros muchos son indeseables, por dos razones: cuando queremos aadir al producto nuestros propios cultivos iniciadores y cuando esta microbiota puede degradar y alterar el producto. Por tanto, hay que eliminar o controlar esta micro biota mediante tcnicas de conservacin. Origen exgeno: microorganismos que no existen en el producto o materias primas en el momento de la obtencin, sino que se sumaron posteriormente a l , a partir del ambiente , durante la obtencin , el procesado , transporte ... Dentro de este grupo , hay que destacar los que pueden resultar patgenos y pueden pasar al producto . Esta microbiota exgena est formada principalmente por microorganismos saprofitos ( aquellos que viven a expensas de la materia orgnica muerta ) . Para controlarlos hay que saber de donde proceden . Pueden contaminar las materias primas o el producto , a partir de 5 lugares : A partir del suelo : suele ser la fuente de contaminacin con una mayor variedad de microorganismos y en cantidades elevadas. Por eso , una prctica habitual en las industrias es el lavado de las materias primas , para eliminar restos de polvo , tierra ... Tambin se puede proteger toda la lnea de produccin , para evitar que las corrientes de aire que levantan polvo lleguen al producto . A partir de la materia fecal : cuando los residuos fecales no son tratados adecuadamente , pueden pasar al suelo o al agua y de ah a plantas y animales , aportando una gran cantidad de microorganismos que por su origen podran ser LOS MICROORGANISMOS

patgenos para el hombre . Esa contaminacin es habitual como consecuencia de una prctica , la fertilizacin de las cosechas con aguas residuales A partir del agua : el agua puede estar contaminada con materia fecal . las aguas naturales no slo contienen microorganismos propios , sino que tambin los que proceden del suelo , de animales y de la materia fecal . Desde un punto de vista microbiolgico , interesa un agua de caractersticas adecuadas al tipo de producto que se va a elaborar , puesto que puede ser el origen de microorganismos alterantes y patgenos . Por eso , el agua que se usa en la produccin de productos de consumo debe cumplir las normas microbiolgicas que se usan para el agua de bebida . Por tanto , a la hora de montar una industria es necesario que tenga un abastecimiento hdrico de calidad . A partir del aire : la contaminacin a partir del aire es importante tanto desde el punto de vista econmico como sanitario . Sin embargo , el aire desempea un papel de vehculo transmisor , ya que no tiene una microbiota tpica . Los microorganismos del aire llegan a l por medio del polvo , tierra , salpicaduras de agua , de la actividad animal y humana o por hongos esporulados que crecen en paredes ... Como consecuencia, la contaminacin de microorganismos del producto puede ser muy grande . Algunos de estos microorganismos pueden ser especialmente patgenos , como los causante de infecciones respiratorias . Por la elaboracin y manipulacin del producto : contaminacin adicional por el equipo empleado en la preparacin del producto , material de empaquetado y personal . La higiene y limpieza en la fbrica son fundamentales . De hecho , la higiene es una parte esencial en la elaboracin del producto . las superficies del equipo empleado se ensucian inevitablemente y deben limpiarse adecuadamente . Esta suciedad permite el crecimiento microbiano , de tal manera que hace ms fcil que los microorganismos pasen al producto en cantidades elevadas . En cuanto al personal, puede contaminar fcilmente el producto durante la elaboracin y manipulacin . De hecho , este uno de los procesos ms habituales de contaminacin , que ha recibido una atencin desde el punto de vista de la salud pblica . Los microorganismos patgenos pueden proceder de personas infectadas en situaciones diversas , incluido el perodo de incubacin . Durante la enfermedad aguda , la mayora de las bacterias y virus que provocan enfermedades entricas son eliminadas en gran nmero a travs de las heces y orina . Objetivos del Control Microbiolgico de Calidad: Inocuidad : que no contengan patgenos o toxinas que causen trastornos Aceptabilidad / vida comercial : no debe contener niveles de microorganismos suficientes para convertirlo en alterado , desde el punto de vista organolptico , en un tiempo inadmisiblemente corto . Estabilidad : debe tener una calidad constante cada vez que se produce , con respecto a 1 y 2 .

MTODOS TRADICIONALES DEL ANLISIS MICROBIOLGICO

En Microbiologa , el fundamento de la deteccin de microorganismos por mtodos clsicos de anlisis es de dos tipos :

cia/ausencia La mayora de los mtodos microbiolgicos estn diseados para detectar o enumerar, por los mtodos ya vistos , tipos especficos de microorganismos que denominaremos microorganismos diana . Los otros microorganismos que pueden estar presentes en la muestra , no deben de ser detectados ni deben de interferir en el proceso analtico , estos son los microorganismos no diana o tambin llamados interferentes , microbiota competitiva o microbiota de fondo . Si un microorganismo no diana es identificado errneamente como diana , produce un falso resultado positivo ( falso-positivo ) y un falso-negativo es la identificacin incorrecta de un microorganismo diana cuando no da lugar a una reaccin caracterstica tpica , es decir , no se detecta . Examen microscpico directo: Cuando se analiza microscpicamente un producto , no se debe de aprovechar la posibilidad de descubrir la presencia de microorganismos observando la muestra directamente al microscopio , es un procedimiento muy sencillo , ya que se puede montar la preparacin con una pequesima cantidad de muestra , ponerle una gota de agua y el cubre . As , resulta fcil ver levaduras y mohos y a veces con paciencia ver bacterias . Pero esta tcnica es muy limitada , ya que slo se examina una pequesima porcin del producto , con lo que el lmite de deteccin es muy elevado "10 . Adems , no permite la identificacin de los microorganismos , salvo que se utilice fluorescencia . Se aplica sobre todo a lquidos , porque es ms fcil hacer la preparacin . Mtodos de cuantificacin de poblaciones microbianas : Existen varias formas de cuantificar las poblaciones microbianas , las cuales se pueden agrupar en dos tipos de procedimientos : mtodos directos y mtodos indirectos . son los que permiten estimar directamente el nmero de clulas de la muestra .

clulas , sino otros parmetros relacionados con la cantidad de poblacin , como por ejemplo el peso seco , cantidad de protenas , cantidad de clorofila Mtodos directos : Permiten obtener directamente el nmero de clulas en un volumen , cultivo ... Pero este nmero de clulas puede ser de dos tipos : slo viables o clulas totales ( vivas y muertas ) . Para el recuento de viables existen varias posibilidades: Tcnicas de recuento en placa : Es el mejor mtodo para determinar clulas vivas . Se realiza sembrando un determinado volumen de la muestra sobre placas con medio de cultivo , el cual debe

permitir el crecimiento o de una gran cantidad de microorganismos o slo de los que nos interesan . Se basa en la hiptesis de que todas las clulas formarn una colonia y que todas las colonias surgen de una sola clula ( aunque no va a ser as exactamente) Dentro de los medios de cultivo tenemos : medios selectivos , medios enriquecidos y medios diferenciales . En general , todos los medios de cultivo son selectivos , porque no permiten el crecimiento de todos los microorganismos . Recuento por siembra en superficie : a partir de la dilucin madre se hacen las seriadas , de ellas se toma una parte y se aade a la placa que tiene el medio de cultivo slido y con un asa se extiende la siembra por la superficie de la placa y despus de incubada se hace el recuento . Las ventajas son que permite ver la morfologa , color y textura de las colonias y adems es el mejor mtodos para el crecimiento de aerobios estrictos , la desventaja es que lleva ms tiempo , hay que usar el asa de Drigalski que hay que esterilizar y adems slo permite sembrar volmenes muy pequeos ( hasta 0'1 ml ) . Recuento por siembra en inclusin : se siembra en placas Petri vacas y a continuacin se aade el medio de cultivo fluido todava y con movimientos circulares ligeros se homogeniza . Por lo que los microorganismos crecen dentro del agar una vez solidificado . Recuento por filtracin de membrana : un volumen conocido se filtra a travs de una membrana estril de 0'22 micras , con lo que las bacterias quedan retenidas en el filtro y despus es el filtro el que se coloca sobre el medio de cultivo y se incuba . Para facilitar la filtracin cuando el volumen de muestra es muy pequeo , esta se disuelve en un volumen indeterminado de una solucin estril . Este volumen no influye en el recuento porque est estril , y se est filtrando toda la muestra , por lo que slo se recuenta lo que hay en 1 ml de muestra . Mtodo de las gotitas de agar : la muestra se diluye realizando diluciones seriadas en tubos con el medio de cultivo slido , pero fundido , y luego se transfiere a una placa Petri gotitas de 0'1 ml de cada dilucin , se incuba y se cuentan las colonias con una lupa de 10 aumentos . Este mtodo suele ser ms rpido que los mtodos convencionales de recuento en placa y gasta mucho menos material . Tcnicas del nmero ms probable ( tambin de viables ) : la tcnica consiste en sembrar en distintos tubos , conteniendo un medio de cultivo lquido apropiado , distintos volmenes de la muestra problema . Una vez realizada la incubacin de los tubos , se valora aquellos en los que se produjo crecimiento de los microorganismos que nos interesa cuantificar , anotando el nmero de tubos de cada dilucin realizada que dieron positivos. Con este resultado se va a unas tablas estadsticas realizadas para esto (tablas del NMP ) , que dan el nmero ms probable de microorganismos considerados por unidad de volumen , junto con el intervalo de confianza para este valor . A veces, este mtodo se considera semicuantitativo , porque slo da una estima . Recuento microscpico con cmara de recuento: cuando nos interesa realizar un recuento de clulas totales , uno de los mtodos ms usados es el de la cmara de contaje usando un microscopio . es un mtodo directo, ya que determina directa y exactamente el nmero de clulas en un determinado volumen. Para ello, se coloca una suspensin de los microorganismos en las cmaras de recuento, las cuales permiten determinar el nmero de partculas

que hay en un determinado volumen . Las partculas se cuentan visualmente, con ayuda de un microscopio.

IV. MATERIALES Y METODOS

Tubos de ensayo Pipetas Bao Mara Muestra(jugo de guineo manzana con leche) Placas petri Estufa de incubacin Agar recuento mechero

Para operar y calcular el recuento bactriano tomamos los siguientes pasos: Mezclar en placas estriles 1 ml. De la serie de diluciones con 15 ml.del medio de cultivo, conservado a mas o menos 50C luego de solidificado, adicionar una capa fina de medio de cultivo a manera d capa selladora (mas o menos 5 ml.). Luego incubara 37C por 24-48 horas. Despus de contar el nmero de colonias que se han desarrollado en las placa petri que contienen entre 30 y 300 colonias.

V. RESULTADOS
Medio de cultivo: agar recuento Tipo de siembra: incorporacin Dilucin: 3, 4, 5 Temperatura tiempo de incubacin: 37C ; 24- 48 horas 4A : 10 colonias 5A : 2 colonias

(Rango de 30 a 300) N=

Medio de cultivo: URSA Tipo de siembra: incorporacin Dilucin: 2, 3, 4 Temperaturatiempo de incubacin: 37C ; 24- 48 horas 2A: 79 colonias 3A : 7 colonias 4A : 1 colonia

N= 7.9x

VI. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

Utilizando el medio de cultivo URSA, nos damos cuenta que el numero de poblacin es mucho mayor al del agar recuento. Despus de haber incubado por 24 horas, reafirmamos qe existe un numero desmenuzado de de microorganismos tanto con el medio de agar recuento como el de URSA

VII.BIBLIOGRAFA
http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/2Indicadores_6422.pdf http://html.rincondelvago.com/control-microbiologico-de-calidad.html

MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CONTAMINACIN FECAL I. INTRODUCCION

Las materias fecales del hombre y de los animales contienen una gran variedad de microorganismos enteropatgenos como Campylobacter, Salmonella, Shigella, Yersinia, Aeromonas, Pasteurella, Francisella, Leptospira, Vibrio, protozoarios y varios grupos de virus. Cuando estos microorganismos son descargados en aguas naturales, su presencia denota contaminacin fecal y constituyen un riesgo de trasmisin de enfermedades para la poblacin humana. Si hablamos de los alimentos los ms sobresalientes causantes de la contaminacin fecal son los coliformes, colifecales, y Escherichia colli.

II. OBJETIVOS
Ensea al estudiante las tcnicas e interpretacin de los microorganismos indicadores en los alimentos. Analizar y reconocer los diferentes microorganismos indicadores de la contaminacin fecal.

III. REVISIN BIBLIOGRAFICA DETECCION DE ESCHERICHIA COLI Y DE COLIFORMES

Principios generales: Del origen fecal de esta bacteria se concluye que su presencia en un alimento indica que ste ha tenido contacto con, y por tanto est contaminado por, materia de origen fecal. La supervivencia de estas bacterias en medios no entricos es limitada por lo que su presencia indica una contaminacin reciente. Por estas razones, E. coli es el microorganismo ndice ideal para la deteccin de contaminaciones recientes. La identificacin del grupo coli-aerogenes se hace mediante la deteccin de microorganismos capaces de fermentar lactosa a 42 en presencia de un 2% de bilis y de cristal violeta. En alimentos tratados tambin conviene comprobar la presencia de coli-aerogenes mediante la produccin de gas en verde brillante con 2% de lactosa, aunque esto no

indica claramente contaminacin fecal debido a los mltiples orgenes de las bacterias de este grupo. No es recomendable el uso del concepto de coliformes fecales definido por las que crecen en presencia de sales biliares a 40-42 porque el grupo no est definido taxonmicamente y las diferencias experimentales en los procesos de deteccin son muy crticas.

ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO D DE LANCEFIELD

Principios: Los estreptococos del grupo D de Lancefield son microorganismos Grampositivos de origen entrico. El grupo est formado por enterococos (Streptococcus faecalis y S. faecium) y por S. bovis y S. equinus. Todos los estreptococos de este grupo se encuentran en las heces. Son microorganismos muy resistentes a los tratamientos trmicos, de congelacin o de desecacin, y a tratamientos con detergentes y desinfectantes. Su supervivencia en ambientes libres es muy alta. Por todo ello no pueden usarse como ndicadores de contaminacin fecal reciente, aunque son tiles en el anlisis de alimentos tratados trmicamente y que tienen una baja actividad de agua. Tambin son tiles para determinar la eficacia de los sistemas de desinfeccin y de limpieza. Los estreptococos del grupo D de Lancefield pueden usarse como ndices de patgenos entricos muy resistentes, como puede ser el virus de la hepatitis A.

ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO Mitis-Salivarius

Estos microorganismos corresponden al grupo de indicadores de contaminacin por contenido del tracto buco-farngeo. Es importante su determinacin en aquellos alimentos preparados para colectividades (empresas de catering, grandes restaurantes). El mtodo de deteccin se basa en el empleo de agar nutritivo tamponado que contenga telurito, sacarosa, azul tripn y cristal violeta. La incubacin se realiza a 37C. En este medio de cultivo las bacterias de este grupo forman colonias de color azul plido o azul, y las de otros estreptococos de color azul oscuro o negro.

DETECCION DE Bacillaceae
Prueba para evaluar la contaminacin post-tratamiento: En un alimento tratado trmicamente de forma adecuada las nicas bacterias que pueden, en la prctica, estar presentes son las que hayan sobrevivido el tratamiento en forma de esporas. Por esto, el recuento de viables ha de ser el mismo cuando se hace de forma estndar que cuando se hace sometiendo previamente la muestra a un tratamiento equivalente al de esterilizacin (80c, 1 min). Cuando se realiza la medida de esta manera y se observan diferencias stas son debidas a contaminacin post-tratamiento ya que el tratamiento a 80C durante 1 min. elimina todas las formas vegetativas sin daar las esporas ms termosensibles, y activa, simultneamente, la germinacin de las esporas presentes en el alimento. Esporas de termorresistencia elevada: hay esporas que son muy termorresistentes y que pueden sobrevivir en conservas appertizadas. Para detectarlas se realiza una dilucin de la muestra en un caldo de infusin de cerebro y corazn y se la somete a

un tratamiento de 120C durante cuatro minutos. Las colonias supervivientes se recuentan tras una incubacin a 50C.

IV. MATERIALES Y MTODOS

Placas petri Tubos de ensayo Pipetas Estufa de incubacin Bao Mara Agar rojo violeta con sales biliares Caldo lactosado verde brillante bilis al 2 %

Tomamos en cuenta los siguientes pasos: Para coliformes: mtodo recuento en placa Mezclar en placas petri estriles, 1.0ml.de la serie d disoluciones con mas o menos 15ml del medio de cultivo y mezclar. Una vez solidificado recubrir la mezcla con mas o menos 5 ml del medio estril. Luego llevar a incubacin a 37C x 24-48 horas; luego de este tiempo contar las colonias de la palcas que contienen entre 30 300 colonias, el numero de colonia violetas rodeadas de un precipitado rojo violeta, y deducir el numero de coliformes por gramo o ml de muestra. Coliformes totales Pipetear tres veces 10 ml del homogeneizado del alimento, en tres tubos de ensayo con CLVBB al 2 % de doble concentracin Pipetear tres veces 1 ml del homogeneizado en tres tubos de ensayo con CLVBBA simple concentracin Hacer lo mismo con las diluciones siguientes

V. RESULTADOS
Diluciones 100: 3 1000: 0 10000: 1 La poblacin tomando en cuenta el NMP es la siguiente Valor de tabla de NMP: 39 Dilucin intermedia: 1000 Poblacin en gr o ml= 39/100x1000 N=390 col. /gr. O ml

VI. DISCUSIONES CONCLUSIONES

La prueba sali negativa, adems certificamos que los microorganismos encontrados es de Escherichia colli. Esta prueba negativa se debe a que la prueba con caldo voges proskauer y agar citrato sali dicha de esta forma La poblacin encontrada es considerada, aunque a pesar de ello puede causar enfermedades debido a la ingesta de este microorganismo por mas pequea que sea

VII. BIBLIOGRAFIA
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/13deteccion%20de%20indicadores%20e%20indices.htm