CONCEPTOS y TECNICAS de BIOTECNOLOGIA (FCEyN UBA ) Biotecnologa Industrial Produccin industrial de Metabolitos Biorreactores

Miryan Cassanello PINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA E-mail: miryan@di.fcen.uba.ar

Productos biotecnolgicos: estn en todos los sectores de la

vida diaria: drogas (genricas y no-genricas) productos de belleza procesamiento de alimentos para humanos y animales procesamiento textil y artculos de limpieza aplicaciones industriales: produccin masiva de alcohol suplementos nutricionales Relevancia econmica de los productos generados industrialmente mediante procesos biotecnolgicos Estadstica: ao 2002
(Fuente: Kent y Riegel, 2007)

Productos obtenidos mediante procesos biotecnolgicos

Productos Organismo tpico utilizado Mercado mundial (ton/ao) 20 millones 2.000 230.000 50.000 20.000 300.000 30.000 2.000 2.000 40.000 10.000 10.000 (Fuente: Doran, 1995)

Alcoholes cidos orgnicos

Etanol Butanol/acetone Acido ctrico Acido glucnico Acido lctico

Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Aspergillus niger Aspergillus niger Lactobacillus delbrueckii Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces aureofaciens

Aminocidos Acido Lglutmico L-lisina L-fenilalanina L-arginina Antibiticos Penicilinas Cefalosporinas Tetraciclinas

Producto Enzimas Proteasas -Amilasa Glucoamilasa Pectinasa Polmeros Vitaminas Vacunas Protenas teraputicas Xantanos Dextrano B12 Difteria Ttanos Insulina Interfern-2 Hormona de crecimiento

Organismo tpico utilizado Bacillus spp. Bacillus amyloliquefaciens Aspergillus niger Aspergillus niger Xanthomonas campestris Leuconostoc mesenteroides Propionibacterium shermanii Corynebacterium diphterie Clostridium tetani Escherichia coli recombinante Escherichia coli recombinante Escherichia coli recombinante o clulas recombinantes de mamferos

Mercado mundial (ton/ao) 600 400 400 100 10 5.000 200 10 < 50 kg/ao Pequea < 20 kg/ao 10 Pequea

Glucosa isomerasa Bacillus coagulans

Biologa Bioqumica
Biotecnologa ROJA: Aplicacin en medicina

Ingeniera Qumica Qumica

Biotecnologa AZUL: Aplicacin en organismos marinos

Biotecnologa ROJA

Biotecnologa AZUL

BIOTECNOLOGIA
Biotecnologa VERDE
Biotecnologa VERDE: Aplicacin en agroalimentos

Biotecnologa BLANCA
Biotecnologa BLANCA (o industrial): Aplicacin en la industria en general, productos qumicos, nuevos materiales, biocombustibles, etc.

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

Biotecnologa : actividad multidisciplinaria que comprende la aplicacin de los principios cientficos y de la ingeniera al procesamiento de materiales por agentes biolgicos para proveer bienes y servicios. (Definicin de la OECD) Agentes biolgicos: clulas microbianas, animales, vegetales y enzimas. Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas, productos medicinales, etc. Servicios: especialmente los relacionados con la purificacin de aguas y tratamiento de efluentes.

Bibliografa libros de texto

Bioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, Fikret Kargi, Prentice Hall Int. Series, 2nd Ed. 2002. Kent and Riegels Handbook of Industrial Chemistry and Biotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A. Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007. Principios de Ingeniera de los bioprocesos, Pauline M. Doran, Editorial Acribia S.A, Zaragoza, Espaa. 1995. (Traducido 1998) Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F. Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2nd. Ed. 1986. Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour, Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452 Bioreaction Engineering Principles, Jens Nielsen, John Villadsen, Gunnar Lidn. Springer, 2da. Ed. (2005). ISBN-10: 0306473496; ISBN-13: 978-0306473494

Bibliografa algunos reprints de biotecnologia industrial

Xu, J., Ge, X., Dolan, M.C., Towards high-yield production of pharmaceutical proteins with plant cell suspension cultures. Biotechnology Advances 29 (2011) 278299 Brennan, L., Owende, P., Biofuels from microalgaeA review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable and Sustainable Energy Reviews 14 (2010) 557577 Huang, T-K., McDonald, K.A., Review: Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures. Biochemical Engineering Journal 45 (2009) 168184 Rosche, B., Li, X.Z., Hauer, B., Schmid, A., Buehler, K., Microbial biofilms: a concept for industrial catalysis? Trends in Biotechnology 27 (2009) 636643 Lacaze, G., Wick, M., Cappelle, S., Emerging fermentation technologies: Development of novel sourdoughs. Food Microbiology, 24 (2007) 155160 Gavrilescu, M., Chisti, Y., Biotechnologya sustainable alternative for chemical industry. Research review paper. Biotechnology Advances, 23 (2005) 471499 Butler, M., Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals. Appl Microbiol Biotechnol, 68 (2005) 283291 Kretzmer, G., Industrial processes with animal cells. Appl Microbiol Biotechnol, 59 (2002) 135142

Objetivo de la produccin industrial de clulas o de microorganismos

Producir las mismas clulas o microorganismos (biomasa) en gran escala Producir en gran escala compuestos (intracelulares o extracelulares) resultantes del crecimiento celular (metabolitos)

Metabolitos Primarios

Metabolitos Secundarios

Metabolitos primarios
-Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminos metablicos esenciales. Son casi idnticos en todos los organismos. -Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de actividad biolgica y frecuentemente son commodities 1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos: protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles. 2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa, ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico, ctrico, actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucletidos saborizantes (cidos inocnico y guanlico), polisacridos y polisteres de reserva. Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos

Metabolitos secundarios
-Molculas mas complejas, que participan de caminos metablicos no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en situaciones de stress. -Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de producir alto contenido de actividad biolgica -Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan en los organismos que los producen como: 1. Armas contra otros microorganismos (antibiticos, toxinas, inhibidores enzimticos, pesticidas) 2. Factores de crecimiento (hormonas) 3. Ionforos 4. Agentes de interaccin microbiana 5. Efectores externos

PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o FERMENTACIONES

Procesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los cuales se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas) en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin microorganismos, clulas o enzimas. Biorreactor o Fermentador Operaciones unitarias Operaciones unitarias

Principales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:

Fermentacin Propagacin de los cultivos Esterilizacin Preparacin de medios Separacin Purificacin Tratamiento de efluentes

1) Propagacin de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de inters, o de una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen del medio de cultivo. 2) Fermentacin: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se siembra un tanque de inculos cuyo volumen depende de la escala industrial. Vinoculos~50-1000L y Vfermentador industrial~10-1000 m3).

Principales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:

Fermentacin Propagacin de los cultivos Esterilizacin Preparacin de medios Separacin Purificacin Tratamiento de efluentes

3) Separacin y purificacin: operaciones mecnicas de ruptura de clulas; separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin o sedimentacin; separaciones primarias por extraccin, absorcin, adsorcin, ultrafiltracin; purificacin por extraccin lquidolquido, extraccin en dos fases acuosas o cromatografa de afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto. 4) No tiene relacin directa con el producto pero es una etapa imprescindible por los volmenes involucrados y para preservar el medio.

Seleccin (screening)
En la seleccin del microorganismo/clula, se debe tener en cuenta: 1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable. 2. La velocidad de crecimiento debe ser alta. 3. La cepa debe estar libre de contaminantes. 4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de cultivo de costo reducido. 5. Deben ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo sin prdida de sus caractersticas. 6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto. 7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y de fcil recuperacin a partir del medio de cultivo.

Los nuevos mtodos de screening incorporan tcnicas de ingeniera gentica para crear diversidad.

Preparacin de medios de cultivo Esterilizacin

Los componentes de los medios de cultivo son los efectores externos de naturaleza qumica que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y suministrar energa para el mantenimiento celular. Componentes de un medio de cultivo: 1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes de C, N, S, P, K y Mg 2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o g/L 3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgnicos que no son sintetizados por las clulas y de funcin metablica especfica; se suministran en baja concentracin (vitaminas, algunos aminocidos, etc.)

Preparacin de medios de cultivo Esterilizacin

Los medios pueden clasificarse considerando la naturaleza qumica de los componentes en: 1. Medios sintticos o medios qumicamente definidos 2. Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.) que aportan las sustancias fundamentales pero son qumicamente indefinidas y de composicin variable. Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente a ponerse en contacto con el inculo. Esterilizar significa eliminar toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se lleva a cabo por filtracin o calentamiento.

Separacin y purificacin (downstream): depende de la

eficiencia del proceso y del producto a obtener

Fermentaciones - fermentadores o biorreactores

Es el corazn del proceso y debe optimizarse para evitar posteriores etapas de separacin y purificacin. discontinuas o batch semicontinuas (fed-batch) Fermentaciones continuas Para el diseo de los biorreactores se debe considerar la cintica del crecimiento de las clulas o microorganismos (biomasa) y la velocidad de formacin de los productos deseados. Cintica de crecimiento de biomasa Definiciones Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan Cuantificacin de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuacin de Monod Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato

Cintica de crecimiento microbiano

Sustrato + biomasa mayor cantidad productos + de biomasa extracelulares

S + X
Crecimiento

nX

aumento en el nmero de clulas aumento del tamao de las clulas

El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin autocataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la concentracin de clulas. Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1): X: concentracin msica de clulas (g/L) t: tiempo (h)

1 dX neta X dt

La velocidad especfica neta de crecimiento es la diferencia entre la velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparicin de biomasa por muerte celular o por metabolismo endgeno:

neta = g k d
Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere la concentracin msica. Formas de medir la concentracin de clulas Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuesta rpida. Directos Mtodos Indirectos

Determinacin de la concentracin msica de clulas:

Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en suspensin): Masa de clulas secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado) Volumen de clulas centrifugadas en condiciones estndar Absorcin de luz por clulas en suspensin Mtodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la velocidad de consumo de un sustrato o de formacin de un producto. Productos: etanol, CO2 Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato base de C o N Propiedades fsico-qumicas: viscosidad, pH Ejemplo: seguir la concentracin de ATP, proporcional a la masa de clulas.

luciferina + ATP + O 2 LUZ

luciferasa

Sensible > 10-12 gATP/L

Cintica de crecimiento de un cultivo en batch

Etapas: 1) de latencia o induccin 2) de crecimiento exponencial 3) de desaceleracin 4) estacionario 5) de muerte o declinacin celular 3)4) Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son de Desaceleracin: por consumo de un nutriente esencial o generacin 5) Muerte: baja exponencial:inculo multiplicacin de lmiteinculo el nmero rpida al medio. Depende del con 1) Latencia: adaptacin crecimiento desbalanceado, clulas deben 2) Crecimientotxicos del clulas, difcil definir el las clulas la subproductos activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos, etapa anterior. (edad y a las condiciones hostiles. los crecimiento balanceado (composicin de clulas constante). readaptarsetamao) y dede lanutrientes. Se puede adaptar ex-situ. hormonas) productos desregulacin celular

1) Latencia: adaptacin del inculo al medio. Depende del

inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar ex-situ. 2) Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulas crecimiento balanceado (composicin de clulas constante). 3) Desaceleracin: por consumo de un nutriente esencial o generacin de subproductos txicos crecimiento desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones hostiles. 4) Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular 5) Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con la etapa anterior.

Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas crecen con la misma velocidad la composicin media de las mismas permanece constante. Es vlido para la etapa de crecimiento exponencial. exponencial En este perodo, la velocidad de crecimiento es independiente de los nutrientes y resulta en una cintica de primer orden.

1 dX dX neta t g neta = = neta dt X = X 0e X dt X

Tiempo necesario para duplicar la biomasa:

X = 2X 0

ln(2) d = neta

Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no crecen con la misma velocidad la composicin media se modifica. Esta situacin caracteriza especialmente a la etapa estacionaria El estrs producido por la falta de nutrientes o por la existencia de subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil induce una reestructuracin de las clulas para adaptarse a las nuevas condiciones. Puede ocurrir: La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el nmero de clulas viables. X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertas constituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico). X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulacin celular produciendo metabolitos secundarios.

g neta = g k d

Coeficiente de mantenimiento: se emplea para definir la velocidad especfica de consumo de sustrato para energa de mantenimiento.

1 dS m= X dt m

Energa de mantenimiento: necesaria para mantener la membrana celular activa y el transporte de nutrientes, y para funciones metablicas esenciales como la movilidad y la reparacin de estructuras daadas.

Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducir prdida de masa celular (metabolismo endgeno para adaptarse al medio).

Otras definiciones: Coeficientes de rendimiento: se definen en base rendimiento a la cantidad consumida de otro componente. Rendimiento de formacin de clulas por masa X YX /S = de sustrato consumida (g clulas/g S) S YX/S es un valor constante en la etapa de crecimiento exponencial. Luego de la etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea para otros fines:

S = Sformacion + Sformacion + Senergia + Senergia

de biomasa de productos para crecimiento

para mantenimiento

Tambin se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:

X P Y ; YP/S = = X / O2 DO S

Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aerbicas en glucosa; para la mayora de las bacterias y levaduras: (en condiciones anaerbicas suelen ser menores) Los rendimientos dependen del medio y de la fuente de C. Para la mayora de los casos:

YX /S = 0,4 0,6 g / g ; YX/O = 0,9 1,4 g/g

2

YX /S = 1 0,4 g/g g biomasa g de C consumido

Relacin del crecimiento de biomasa con la formacin de productos: Definimos la velocidad 1 dP especfica de formacin qP = = YP / X g X dt de producto, qP
Se encuentran 3 situaciones: (a) qP asociada al crecimiento celular, ej: produccin de una enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).

q P = g = YP / X

(b) qP parcialmente asociada (etapa de desaceleracin y estacionaria), ej: fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos metabolitos secundarios. q = +
P g

(c) qP no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde la g=0) ej.: metabolitos secundarios como antibiticos.

q P = = cons tan te;

g = 0

Relacin del crecimiento de biomasa con la formacin de productos: 1 dP 1 dX = YP / X g = YP / X qP = X dt X dt

q P = g

Asociada

Parcialmente asociada

q P = g +

No asociada

qP =

Metabolitos primarios

Metabolitos secundarios

Factores que influyen Temperatura del medio

La velocidad de crecimiento disminuye por encima de la Top La velocidad de crecimiento aproximadamente se duplica cada T = 10C

-psicrfilos (Top < 20C) -mesfilos (20<Top<50C) -termfilos (Top > 50C)

Por encima de Top ocurre muerte celular disminuye el nmero de clulas viables cuando la velocidad de muerte supera la de crecimiento. Ambas velocidades siguen una ecuacin tipo Arrhenius con

'g = A exp( E a / RT )
Ea 1020 kcal/mol

k d = A d exp( E d / RT )
Ed 6080 kcal/mol

La muerte celular es ms sensible a T que el crecimiento (importante para la esterilizacin) La T tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero la Top y la Ea suelen ser distintas. Tambin influye sobre el YX/S porque para T>Top, la energa de mantenimiento es mayor baja YX/S Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.

Factores que influyen pH del medio

Rango de pH ptimo

Variacin de la velocidad especfica de crecimiento con el pH. Existe un pH ptimo para cada tipo de clula, generalmente prximo a 7. Se puede incrementar el rango adaptando las clulas por incrementos pequeos.

El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la formacin de producto. Los pH aceptables varan en 1 o 2 unidades respecto del ptimo. El pH ptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8. - levaduras: 3 6 - hongos: 3 7 - clulas vegetales: 5 6 - clulas animales: 6,5 7,5 Algunos organismos pueden regular el pH empleando energa de mantenimiento. El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N, aminocidos, CO2)

Factores que influyen concentracin de O2 disuelto (DO): Es un sustrato importante para las fermentaciones aerbicas. Debido a la baja solubilidad del O2 en agua, puede ser un limitante de la velocidad de crecimiento. La solubilidad del oxgeno en agua depende de la presin, de la temperatura y de las sales disueltas (a presin atmosfrica es 7ppm). La concentracin crtica de oxgeno disuelto CO2,critica es aquella por debajo de la cual comienza a controlar la velocidad de crecimiento: 510% de la concentracin de saturacin para bacterias y levaduras y 1050% de la concentracin de saturacin para hongos (segn el tamao)

Transporte de oxgeno a las clulas

El O2 se introduce por burbujeo y su concentracin depende de la agitacin.

Velocidad de OTR = k L a LG C* C O b O transferencia: 2 2 Velocidad de consumo OUR = q X = g X O2 YX / O de oxgeno (OUR): 2

Factores que influyen otros factores

Potencial redox: afecta las reacciones de xido-reduccin. Esta relacionado con la concentracin de O2, el pH y las concentraciones de otros iones. Potencial de reduccin del medio:

E (mV )= E 0 + 0 ,06 log PO + log H +

2

( ( ) ( ))

Se puede reducir bajando la concentracin de O2 (burbujeo de nitrgeno) o por agregado de agentes reductores (cistena, Na2S, HCl). Concentracin de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser txica para algunas clulas y necesaria para otras. Se regula modificando la concentracin en la corriente de burbujeo. Fuerza inica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el interior de las clulas. Depende de la concentracin y de la carga de los iones en el medio: FI = 1 ci Zi2 2
i

Generacin de calor por crecimiento microbiano

4050% de la energa suministrada por las fuentes de C se convierten en ATP (forma en que las clulas acumulan energa) el resto se libera como calor. El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpas de combustin del sustrato y de la biomasa formada:

CO 2 + H 2 O
Crecimiento microbiano y respiracin 1/YH (kJ/g clula)

+
Ciclo entlpico para calcular el calor generado

celulas
Combustin de las clulas Hc (kJ/g)

Sustrato + O 2 CO 2 + H 2 O
HS YX /S 1 = H c + YH YH = HS YX /SH c YX /S

combustion del sustrato, H S ( kJ / g )

Algunos valores tpicos: Hc ~ 20 25 kJ/g clulas YH ~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol) 0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano) El grado de oxidacin del sustrato afecta fuertemente la cantidad de calor que evoluciona por el metabolismo de las clulas. Para clulas en crecimiento activo, el requerimiento para mantenimiento es bajo la evolucin de calor est directamente relacionada con el crecimiento. Velocidad total de generacin de calor en una fermentacin batch se calcula considerando la velocidad de crecimiento. 1 Q generado = neta X V YH En una fermentacin aerbica, se correlaciona con la velocidad de consumo de oxgeno, dado que es el aceptor final de electrones.
Q generado = 0,12 Q O
2

Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa (b) serpentn externo (c) serpentn interno helicoidal (d) serpentn interno tipo deflector (e) intercambiador de calor externo

Reactor batch de escala laboratorio

Reactor batch de escala industrial

Estequiometra del crecimiento microbiano y formacin de productos Procesos complejos reflejan el transcurso de miles
de reacciones intracelulares. Es importante poder comparar el rendimiento y la generacin de calor que se obtiene empleando distintos sustratos la estequiometra de conversin de sustratos a biomasa y a productos extracelulares se suele representar por ecuaciones pseudoqumicas simples.

CH m O n + a O 2 + b NH 3 c CH O N + d H 2O + e CO 2
CHmOn representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato CHON representa un mol del material celular La composicin del material celular depende del tipo de organismo. Un mol de material biolgico es aquel que contiene un tomogramo de C

Por que una frmula mnima escrita como: CHaObNd ? Composicin elemental de la bacteria Escherichia coli
Elemento % en masa seca

C O N H P S K Na Ca Mg Cl Fe Otros

50 20 14 8 3 1 1 1 0.5 0.5 0.5 0.2 0.3

92% de la masa seca total esta formado por C, O, N, H

Componentes minoritarios no se tienen en cuenta en la frmula mnima

Los coeficientes estequiomtricos y la frmula mnima se calculan planteando balances elementales, la informacin del cociente respiratorio y un balance de electrones disponibles.

CH m O n + a O 2 + b NH 3 c CH O N + d H 2O + e CO 2
Balances elementales:

C: H: O: N:

1= c + e m + 3b = c + 2d n + 2a = c + d + 2e 3b = c

Los balances para H y O pueden no dar informacin correcta por la gran masa de agua que tienen las clulas se requiere informacin adicional. Cociente respiratorio (RQ): moles de CO2 producidos por mol de O2 consumido provee una indicacin del estado metablico y puede emplearse para controlar el proceso. moles CO 2 generados e RQ = = moles O 2 consumidos a

Balance de electrones disponibles: Para las reacciones mas complejas, con formacin de productos extracelulares, se agregan componentes hay un coeficiente estequiomtrico ms y se requiere mayor informacin. Adems, los balances elementales no se relacionan con los cambios de energa involucrados en la reaccin. se desarroll el concepto de grado de reduccin, , para poder plantear balances de electrones y protones en bioreacciones. Grado de reduccin: nmero de equivalentes de electrones disponibles por tomo-gramo de C. Los electrones disponibles son aquellos que se transfieren al O2 al formarse CO2 o H2O.

i,sustratos i i = i,productos i i
i :coef .estequiometri cos ; i :grados de reduccion

Cintica de crecimiento microbiano: Modelos

productos mayor cantidad Sustrato + biomasa + extracelulares de biomasa

S + X

nX

1 dX neta g k d X dt
neta: Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1) g: Velocidad especfica de crecimiento de biomasa (h-1)
kd: constante de muerte celular o disminucin de masa celular por metabolismo endgeno (h-1) X: concentracin msica de clulas (g/L) t: tiempo (h)

Cuantificacin de la cintica de crecimiento: modelos cinticos

Descripcin detallada debera involucrar diferenciaciones en la estructura de la clula y la segregacin del medio de cultivo en unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades fsico-qumicas modelos estructurados-segregados
Modelos Estructurados Tienden a representar la estructura de las clulas. Pueden dividir la clula en sus componentes y considerar las reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zona de la clula, como respuesta a cambios en el medio. Modelos Segregados Tienen en cuenta que el medio no es homogneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoqumicas del medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). Tambin permiten considerar la posibilidad de agregacin de clulas.

MAYOR COMPLEJIDAD

No estructurados Segregados

Estructurados Segregados

Son ms realistas, pero son complejos y demandantes de tiempo de clculo.

No estructurados No segregados

Estructurados No segregados

MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD

El grado de realismo y complejidad de un modelo depende del objetivo se debe elegir el modelo ms simple capaz de representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.

Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados

Modelos No-Estructurados Suponen una composicin fija de la clula (equivalente a suponer crecimiento balanceado). -Son estrictamente vlidos para la etapa de crecimiento exponencial en batch -No andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la clula sea rpida y/o las perturbaciones sean leves.

Modelos No-Segregados

Consideran un medio homogneo.

-Representan adecuadamente muchos casos.

Modelos cinticos de crecimiento: controlados por sustrato

Suponen que la cintica depende solamente de un nico sustrato esencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no afectan. Ms difundido Modelo de Monod

g(h-1)

g =

Ks + S
S (M)

m S

Supone que un nico sistema enzimtico controla el consumo de sustrato y que dicho sistema determina la velocidad de crecimiento de biomasa. biomasa

La premisa es generalmente falsa, pero la ecuacin de Monod ajusta una amplia gama de resultados experimentales y es la expresin ms empleada para el diseo de fermentadores.

g(h-1)

m: mxima velocidad especfica

g =

Ks + S
S (M)

m S

de crecimiento de biomasa g = m cuando S >> K s

Ks: constante de saturacin o de velocidad media

g = 1 m 2

cuando S = K s

Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de crecimiento y baja densidad de clulas. Para cultivos concentrados se usan expresiones similares, modificando Ks:

g =

K S S0 + S
0

m S

g =

K s + K s S0 + S
1 0

m S

Nociones de diseo de fermentadores o biorreactores

La eleccin del tipo de reactor y de la estrategia de operacin define la produccin a obtener y la pureza del producto (nmero y tipo de impurezas, reactivos sin convertir). Tambin determina si se puede lograr un producto de calidad constante y una operacin confiable. En bioprocesos los reactores representan un gran % del capital.
Tipos de reactores comnmente empleados

Discontinuos o batch: una vez que se carga, el proceso ocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos. Continuos (quimiostato): hay alimentacion continua de sustrato y retiro continuo de productos Semicontinuos (Fed-batch): hay ingreso continuo o intermitente de sustratos, sin retiro de productos.

Reactores discontinuos o batch

Produccin de biomasa o de un producto asociado a crecimiento (metabolito primario): En un batch se observan 4 etapas: 1) Preparacin para la nueva operacin (limpieza, esterilizacin, llenado del reactor) 2) Sembrado y perodo de induccin 3) Perodo de crecimiento exponencial 4) Recuperacin del producto del reactor

La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un tiempo muerto, tm, a considerar en el diseo del reactor vara con el tamao del reactor y con el tipo de fermentacin pero generalmente es del orden de las horas (310 hs) tiempo total de operacin para llegar a una concentracin final de biomasa Xf : Xf 1 tc = tm + ln neta X 0

La concentracin final de biomasa, Xf , depende de la cantidad de sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento: kg X f X 0 = YX / S S0 S m3

La mayora de las fermentaciones operan con una relacin Xf/X0 de aproximadamente 1020. La velocidad de produccin de biomasa por operacin del reactor batch, rb , se calcula dividiendo la masa total que podemos formar por el tiempo que lleva la operacin:

rb =

(1/ neta )ln(Xf

YX / SS0

X0 + t m

kg m 3s

Una operacin en un quimiostato en condiciones ptimas conduce a una produccin significativamente superior. De todos modos, la mayora de las fermentaciones son procesos discontinuos.

Por qu? En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento; el crecimiento de las clulas puede incluso inhibir la produccin del producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera solo con velocidades de dilucin muy bajas, muy por debajo de la que lleva a la ptima productividad de biomasa. Para produccin de metabolitos secundarios, la productividad en un batch puede superar significativamente a la de un quimiostato.

Otra razn importante para que se prefiera la operacin discontinua es la inestabilidad gentica. Los microorganismos que se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienen menor velocidad de crecimiento que las originales. Un quimiostato impone una seleccin severa cuando hay mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad de crecimiento.

Por qu? Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad de la operacin. Los reactores batch conducen a productos con mucha variabilidad genera problemas en las etapas de purificacin. Sin embargo en los sistemas continuos una falla mecnica o de control de alguna variable de operacin o de la esterilizacin del proceso puede conducir a problemas severos. Las consecuencias de una falla de operacin son mas graves en un sistema continuo y las prdidas mayores.

La economa de mercado influye en la seleccin del reactor. Un sistema continuo es un sistema dedicado a un dado proceso un nico producto. Muchos productos de fermentaciones se requieren en pequeas cantidades y su demanda es difcil de proyectar. Los sistemas batch son ms verstiles, el mismo reactor puede emplearse para distintos productos.

Cultivos continuos se agrega un medio con nutrientes frescos en forma continua, a un volumen de control que contiene las clulas. Se retiran continuamente productos y parte de las clulas. -Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P permanecen constantes en un dado punto del reactor. -Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para el crecimiento de las clulas y para la formacin de productos calidad uniforme de los productos -Pueden ser una herramienta importante para determinar como un microorganismo responde al medio, y para generar un producto en condiciones ptimas. Sistemas con mezclado Quimiostato perfecto: Tanques Sistemas para continuos idealmente Turbidistato lograr cultivos agitados (TCIA) continuos Flujo Pistn Ideal (FPI): mezclado radial perfecto y mezclado axial nulo; poco empleado, salvo para inmovilizados

Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controlado

por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las condiciones qumicas del medio son constantes.

Turbidistato: la concentracin de clulas en el reactor se mantiene

constante. La alimentacin se regula mediante el monitoreo de la densidad ptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la turbidez supera un lmite prefijado. El volumen se mantiene constante retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega. Se usa menos que el quimiostato porque es ms elaborado y porque el medio cambia. Puede ser muy til para seleccionar subpoblaciones que puedan soportar condiciones de stress, porque la concentracin de clulas se mantiene constante.

FPI (Flujo Pistn Ideal):

como no hay retromezclado, los elementos de fluido con clulas activas no pueden inocular elementos de fluido nuevos aguas arriba se requiere el reciclo continuo de clulas para inoculacin continua del medio fresco alimentado.

L(+G,S)

L(+G,S)

Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posicin en el reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch. Equipos con clulas inmovilizadas (trickling filters) se asemejan a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en tratamiento de efluentes.

Fotobiorreactor tubular helicoidal de 1000 L (Murdoch University, Australia)

Recuperacin de microalgas a partir del medio de cultivo por filtracin Cyanotech Corporation (www.cyanotech.com), Hawaii, USA.

Cultivos continuos: Quimiostato ideal Es un tanque agitado que se opera con circulacin continua (TCIA) del medio de cultivo. La mayora requiere control (pH, T y CO2). Se alimenta medio estril (X0= 0) a un tanque perfectamente agitado (y aireado si es fermentacin aerbica). Se deja salir la suspensin de clulas para mantener las concentraciones y el volumen de lquido constante.

Fv S0, X0, P0

Fv S, X, P Las concentraciones a la salida del reactor son iguales a las del interior por la hiptesis de mezclado perfecto Volumen de lquido = volumen de reactor = V

Burbujeo de gas

Balances de masa Ecuaciones de diseo Planteando balances de masa para los distintos componentes, se obtienen las ecuaciones de diseo.
Masa que Masa que Masa Masa Masa sale del VC entra al VC consumida generada acumulada con los con los + dentro del dentro del = dentro del productos reactivos V.C. V.C. V.C.

Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO

Un quimiostato opera en estado estacionario de acumulacin de masa:

se cancela el trmino

Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada del V.C. con + dentro del V.C. = al V.C. con + dentro del V.C. los productos los reactivos

Quimiostato - ecuaciones de diseo

Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada del V.C. con + dentro del V.C. = al V.C. con + dentro del V.C. los productos los reactivos

Fv S0, X0, P0

Fv S, X, P

Balance de masa de clulas:

FV X = FV X 0 + V neta X

FV X = FV X 0 + V g k d X
FV: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h)

Gas

Definiendo el factor de dilucin como caudal/volumen: D = FV/V

DX = DX 0 + g k d X

DX = DX 0 + g k d X

Si se alimenta medio estril (X0= 0) y el mecanismo endgeno es despreciable

D = g

Importancia de este resultado: En un quimiostato en D= g EE, alimentado con medio estril y en condiciones en las que el metabolismo endgeno es despreciable, la velocidad o factor de dilucin, D, iguala a la velocidad de crecimiento de clulas se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parmetro independiente modificando las variables de operacin el quimiostato es una herramienta experimental poderosa

Si la velocidad de crecimiento sigue la expresin de Monod

D = g =

m S
Ks + S

S: concentracin de sustrato limitante del crecimiento de biomasa en EE

Si se impone un factor de dilucin D > m , las clulas no se podrn reproducir lo suficientemente rpido para mantenerse se lavan, o se vaca el quimiostato (washout)

BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo endgeno):

Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada del V.C. con + dentro del V.C. = al V.C. con + dentro del V.C. los productos los reactivos

FVS

1 1 + Vg X M + Vq P X YP /S YX /S

FVS0

Formacin de biomasa

Formacin de producto

FV: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h) S: concentracin de sustrato limitante del crecimiento (g/L) V: volumen del reactor (L) g: velocidad especifica de crecimiento de biomasa (1/h) X: concentracin de biomasa (g/L) qP (gP/gclulas/h): velocidad especfica de productos extracelulares YMX/S (g clulas/gS) : mximo rendimiento de biomasa a partir de S YP/S (gP/gS) : rendimiento de producto extracelular a partir de S

Concentracin msica de clulas en estas condiciones (EE y sin

metabolismo endgeno):

D S0 S

= X

M YX /S

+ X

qP YP /S

Como adems g = D , si la formacin de M X = YX /S S0 S productos extracelulares es despreciable:

Estrictamente, YX /S depende de la concentracin de sustrato y de la velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0
La productividad en un fermentador continuo se obtiene como el producto del factor de dilucin por la concentracin de clulas, DX (g/Lh)

Productividad en un quimiostato, suponiendo vlida Monod (EE sin

metabolismo endgeno ni formacin de productos extracelulares): se obtiene del

producto del factor de dilucin por la concentracin de clulas, DX (g/Lh):

M X = YX /S S0 S

D = g =

Ks +S

mS

S=

m D

DK s

D2Ks M DX = YX /S DS0 m D

La velocidad de dilucin que maximiza la produccin de biomasa se obtiene de derivar DX con respecto a D e igualar a cero:

D op ( X )

Es muy difcil lograr una operacin estable para D m. Generalmente, se usa un valor de D algo menor que Dop(X) como solucin de compromiso para mejorar la estabilidad con buena productividad.

Ks 1 = m K s + S0

D = m , o sea al punto de lavado

Normalmente Ks<< S0 Dop(X)

Reemplazando la expresin de Dop en la ecuacin que da la productividad de biomasa DX:

DX )op

D op K s M = YX /SD op S0 m Dop

Se obtiene la mxima productividad de biomasa que se puede alcanzar en un quimiostato en EE, sin metabolismo endgeno y sin formacin de productos extracelulares:

DX )op

Ks M 1 = YX /S m K s + S0

S + K K K +S s s s 0 0

))

Normalmente Ks<< S0 DX)op YX /S mS0

Efecto del factor de dilucin sobre la concentracin de clulas, D (1/h) S (kg/m ) concentracin de sustrato y la productividad. 0.06 0.006
3

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6

S0

X (kg/m )

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 -1 D (h )

0.12 0.24 0.31 0.43 0.53 0.6 0.66 0.69 0.71 0.73

0.013 0.033 0.04 0.064 0.102 0.122 0.153 0.17 0.221 0.21

X (kg/m3) 0.427 0.434 0.417 0.438 0.422 0.427 0.434 0.422 0.43 0.39 0.352

DX (kg/h.m ) 0.3
0.2 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 D (h-1) 0.8
3

S (kg/m )

Algunas aplicaciones de los sistemas continuos: - produccin de algunas protenas - tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean microorganismos o enzimas inmovilizadas. - produccin de etanol - produccin de productos asociados a crecimiento, especialmente en gran escala (por ejemplo, cido lctico)
Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en bioprocesos Quimiostato con reciclo La generacin de biomasa es autocatalitica mayor concentracion de biomasa lleva a mayor velocidad de crecimiento. Para lograr en un quimiostato una concentracin de biomasa mayor, se pueden reingresar al reactor las clulas que salen.

Quimiostato con reciclo: el reciclo de clulas incrementa la productividad y tambin la estabilidad en algunos sistemas, dado que minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes, muy sujeto generalmente a las variaciones en la alimentacin).

Fv S1,cX1,P1

Fv S0,X0,P0

: relacin de reciclo basada en caudales volumtricos. Fv(1+) c: factor de concentracin S1,X1,P1 relacin de la concentracin de clulas en la corriente Fv de reciclo sobre la que S1,X2,P1 sale del reactor

Gas

Separador de clulas: puede ser por filtracin, centrifugacin o sedimentacin

Balances de biomasa :
Masa que Masa que Masa Masa Masa sale del VC entra al VC consumida generada acumulada con los con los + dentro del dentro del = dentro del productos reactivos V.C. V.C. V.C.

(1+ ) FV X1

(FV X 0 + FVcX1 )
fresca reciclo

V neta X1 = 0
Fv S0,X0,P0 Fv(1+) S1,X1,P1 Fv S1,X2,P1

En EE: dX1/dt = 0 y si se alimenta medio estril X0=0

Fv S1,cX1,P1

V neta X1 = (1+ ) FV X1 FV cX1

neta = D(1+ c )

Gas

Fv S1,cX1,P1

Fv S0,X0,P0

Fv(1+) S1,X1,P1 Fv S1,X2,P1

neta = D[1+ (1 c)]

Como c > 1 (1-c) < 0

neta < D

V Gas

Cuando hay reciclo, el quimiostato puede operar con una velocidad de dilucin mayor que la de crecimiento

BM sustrato limitante (en EE):

Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada del V.C. con + dentro del V.C. = al V.C. con + dentro del V.C. los productos los reactivos

1 1 (1+ )FVS1 + Vg X1 M + Vq P X1 = FVS0 + FVS1 YP /S YX /S

Formacin de biomasa Formacin de producto

BM sustrato limitante (en EE y en ausencia de productos extracelulares):

1 1 (1+ )FVS1 + Vg X1 M + Vq P X1 = FVS0 + FVS1 YP /S YX /S 1 V g X1 M = FV S0 + S1 (1+ )FVS1 YX /S

X1 =

M YX /S S0 S1

)
X1 =
M YX /S S0 S1

Si k d = 0 g = neta = D[1+ (1 c)]

1+ (1- c )

La concentracin de clulas en un quimiostato en EE con reciclo se incrementa por el factor 1/[1+(1-c)]

Si es vlida Monod y para kd=0

S=

g =

mS
Ks +S

neta = D[1+ (1 c)]

m [1+ (1-c)]D

K s [1+ (1- c )]D

K s [1+ (1- c )]D S X1 = 0 [1+ (1-c)] m [1+ (1- c)]D

M YX /S

X1,cr X1,sr

Velocidad de generacin de biomasa

Fv S1,cX1,P1

Fv S0,X0,P0

Fv(1+) S1,X1,P1

c = 2 ; = 0.5
V con reciclo Gas
Fv S1,X2,P1

sin reciclo

Quimiostatos mltiples en cascada: en algunas fermentaciones, particularmente para la produccin de metabolitos secundarios (ej.: un antibitico), conviene separar las etapas de crecimiento de biomasa y de formacin del producto deseado pues las condiciones ptimas son diferentes con mltiples quimiostatos, se pueden fijar condiciones distintas en cada uno: pH, temperatura, conc. de nutrientes

por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener: -Un primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa -Un segundo tanque donde se promueva la formacin de producto(*) (*) el crecimiento ser desbalanceado y un modelo no-estructurado no es el ms apropiado. Los resultados sern aproximados.

Quimiostatos mltiples en cascada: Primer quimiostato

S1 =

Fv,S0,X0 Fv,X1,S1 Fv,X2,S2

Fv,S0,X0

m D1

K s D1

M X1 = YX /S S0 S1

X1 S1 V1

X2 S2

V2

en EE, vlido Monod y con metabolismo endgeno despreciable

Segundo quimiostato

BM de biomasa FV X1 FV X 2 + V2 neta , 2 X 2 = V2

dX 2 dt

= 0 en EE

X1 X 2 X1 = neta , 2 X 2 neta , 2 = D 2 1 X V2 2 FV

Como X1 < X2

neta,2 < D2

Ejemplo de aplicacin de un sistema multietapa con agregado de una corriente: cultivo de clulas modificadas por ingeniera gentica En general se agregan promotores a los sistemas con clulas que contienen ADN recombinante para inducir la produccin de la protena de inters. La presencia del promotor favorece la produccin de la protena pero reduce la velocidad de crecimiento de las clulas que contienen plsmidos, respecto de las que lo han perdido. un quimiostato de una nica etapa tendr problemas de inestabilidad gentica. empleando un sistema de 2 etapas: Primer quimiostato para produccin de clulas (sin promotor) Segundo quimiostato para produccin de la protena (c/promotor): Se logra mantener la estabilidad gentica por el continuo agregado de clulas frescas.

Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch: En este tipo de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador en forma continua o intermitente. Muy apropiado para mitigar problemas de inhibicin por sustrato Xf,Sf,Pf S0,X0,P0 Fv,S0 (X0)

V0 X0,S0,P0 1)Carga

V X,S,P 2)Realimentacin

Vf Xf,Sf,Pf 3)Recuperacin del producto

1) Desde la carga hasta el momento de la realimentacin peridica, el sistema se comporta como un batch: X = X + Y M S S
0 X /S

(0 )

Xm es la mxima X a alcanzar con S0 , que se da M X m = YX /SS0 cuando S << S0 y para la cual tambin X0 << Xm

Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:

Cuando X Xm , se agrega una corriente de Fv,S0 (X0) nutrientes frescos con un caudal volumtrico Fv y de una concentracin S0. La variacin de volumen es: dV = Fv V = V0 + (Fv ) t dt V Durante la realimentacin, el BM de biomasa X,S,P es: dV dX d(VX ) =V +X FV X 0 + V neta X = 2)Realimentacin dt dt dt entra + se genera = se acumula

dX dX FV X dV = X 0 + neta X = DX 0 + X neta D X neta D dt V V dt dt

Como el sustrato se consume casi todo dX/dt 0 neta D (condicin de estado cuasi-estacionario). Luego: Como D porque V, neta va disminuyendo continuamente.

Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch: BM para el sustrato: Vg X Vq X d(VS) Fv,S0 (X0) FVS0 P = M dt YX / S YP / S entra se consume = se acumula Si no consideramos la formacin de V productos y dado que la masa de sustrato se mantiene siempre g (XV ) X,S,P baja y constante: FVS0 = M 2)Realimentacin YX / S

d(XV ) M M = neta (XV ) FVS0 YX / S (XV )= X 0 V0 + FVS0 YX / S t dt (es igual en ausencia de metabolismo endgeno)

Es decir, la masa de clulas generadas es linealmente proporcional al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un fed-batch.

Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:

Variacin de las concentraciones de biomasa, sustrato y producto, y de la velocidad de crecimiento y volumen del cultivo en funcin del tiempo, para el primer ciclo de un reactor alimentado (fed-batch):

V (mL) 1000 X (g/L) P (g/L)

800

(h-1)
0.6
V (mL)

600

0.4

400

(h )
-1

0.2 200
X (g/L) P (g/L)

0 0 0.5 1 1.5

t2 (h)

Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilizacin de microorganismos tiene aplicacin si los productos son extracelulares Ventajas sobre los cultivos con clulas en solucin:

Proveen una alta concentracin de clulas Las clulas se usan en forma continua y se eliminan costosos procesos de recuperacin y reciclo de clulas Se eliminan el problema del washout a altas velocidades de dilucin Se pueden lograr altas productividades Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores rendimientos y una mejor performance del biocatalizador En algunos casos mejora la estabilidad gentica En algunos casos disminuye el dao por abrasin de las clulas

Sistemas con microorganismos inmovilizados Desventajas respecto de los cultivos en solucin:

El problema ms grave es que no se pueden emplear para productos que no sean excretados de las clulas La inmovilizacin generalmente conduce a problemas de limitaciones por transferencia de masa El sistema se torna muy heterogneo por las limitaciones de transporte y es difcil de controlar Si las clulas estn vivas, el crecimiento y la evolucin de gases ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.
Los mtodos de inmovilizacin son similares a los que se utilizan para enzimas. Se complica con las clulas vivas.

Activa: captura o unin de clulas por Inmovilizacin mtodos fsicos o qumicos Pasiva: formacin de biofilms, crecimiento de mltiples capas de clulas sobre un soporte slido

Tambin se pueden emplear reactores de membrana, generalmente tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor de carcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable. Las clulas se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los tubos, a los cuales difunde el producto. Un buen soporte debe ser rgido y qumicamente inerte; debe contener a las clulas firmemente y tener alta capacidad.

Fermentadores: Equipos comnmente empleados

Tanques agitados Columnas de burbujeo Air-lift o reactor de arrastre Lechos rellenos Esquema de un tanque agitado H/D~36

Esquema de una columna de burbujeo H/D~12

Tanques agitados de escala laboratorio

Tanques agitados de escala laboratorio con clulas inmobilizadas

Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2-20 litros)

Global Medical Instrumentation http://www.gmi-inc.com

Fermentadores de escala banco-piloto (V ~ 15-75 litros)

Fermentadores de escala piloto V ~ 100-1000 litros

Biorreactor de escala piloto

Planta piloto de bioprocesos

Esquema de un tanque agitado de mayor escala

Variables que se controlan en un biorreactor industrial

Esquema de un fermentador tipo tanque agitado de escala industrial (100m3).

H ~ 15 m de alto D ~ 4,2 m de dimetro Tiene lneas de vapor para realizar la esterilizacin in situ de las vlvulas, caeras y sellos. Se debe esterilizar tambin el aire que ingresa por filtracin o por calentamiento.

Biorreactor de escala industrial

Reactor tanque industrial -generalmente de acero inoxidable 316L SS, puede operar presurizado. -debe minimizar zonas muertas y permitir la insercin de sensores -relacin de aspecto H/D=2.53.0 para crecimiento de bacterias porque mejora la transferencia de oxgeno. Para clulas animales se usan tanques de baja relacin de aspecto H/D=1.5 para facilitar el mezclado -se debe poder vaciar totalmente -si tiene menos de 500L pueden ser de vidrio

Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la agitacin que inducen

Agitacin inducida por turbinas radiales del tipo Rushton

Agitacin inducida por turbinas axiales

Interior de un tanque agitado

Reactor tanque agitado: efecto de los baffles

Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vrtices que se forman por la agitacin. Se los ubica levemente desplazados de la pared para disminuir la formacin de zonas estancas.

Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L

400rpm sin baffles

400rpm con baffles

vrtice

Agitacin y distribucin de gas en reactores agitados

La determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno y el calor liberado son claves para el diseo de los fermentadores. La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersin de gas, que es funcin del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al aumentar la velocidad de agitacin.
> RPM

Influencia de la velocidad de agitacin sobre la turbulencia y la dispersin de gas inducida por agitacin mecnica en un reactor de laboratorio de 2L.

300 rpm

450 rpm

750 rpm

Fraccin gaseosa (adimensional)

Tomografa de una seccin del reactor agitado. Jets gaseosos de los inyectores de gas Perfil de velocidades (cm/s) del lquido en un reactor gas-lquido agitado. Se observa la formacin del vrtice caracterstico de las turbinas radiales.

Reactor agitado en suspensin de escala banco: 20cm de dimetro y de alto (volumen ~ 8L)

Reactor tanque agitado:

Problemas ocasionados por la evolucin de espuma: -peligro de contaminacin -complica la circulacin de gases vrtice -complica el mezclado -cambian las velocidades de transferencia masa y de calor

Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo Columna de burbujeo de escala banco: V~10L

Columnas de burbujeo Regmenes de flujo en columnas de burbujeo: depende del caudal de gas y del distribuidor que se emplee

Columnas de burbujeo para el cultivo de algas

Configuraciones comunes de fermentadores

Configuraciones de recirculacin interna inducida por el flujo de aire Air-lift

Air-lift con insercin de aire en el tubo central

Air-lift con insercin de aire en el anillo y mezclado en el tubo central

Air-lift con insercin de aire en el tubo central y recirculacin inducida

Reactor air-lift de laboratorio con entrada de aire en el anillo circular

Zona donde se produce la separacin entre el gas que se libera hacia el exterior del reactor y el lquido que recircula Riser: zona donde se hace la inyeccin de aire, el flujo es ascendente y contiene burbujas Downcomer: zona donde el lquido desciende, a lo sumo tiene pequeas burbujas disueltas

Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles de velocidades, energa cintica y tensin de deformacin

Escala banco (0,2 x 2)m

Shear Stress

Kinetic Energy

Reactor de tipo air-lift circulante

Airlifts de forma triangular para el cultivo de algas (planta piloto de cogeneracin de energa del MIT)

Configuraciones comunes de fermentadores Reactores de lecho fijo uso frecuente en tratamiento de efluentes y en producciones dedicadas Reactores trickle-beds o de lecho a goteo Cocorriente Contracorriente Columnas de burbujeo rellenas

Inmovilizacin pasiva (biofilms): Los biofilms son grupos de clulas que crecen en multicapas sobre soportes slidos. El soporte puede ser inerte o biolgicamente activo. La formacin de biofilms es comn en equipos de fermentacin industriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos). La interaccin entre las clulas y el soporte puede ser muy compleja. Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de los sistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa. Las condiciones dentro de un biofilm grueso varan con la posicin y afectan la fisiologa de las clulas porque los nutrientes difunden hacia el interior del film y los productos hacia fuera. El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos van a dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentracin de biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que pueden ser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr. Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento de biomasa y otro para la formacin de productos.

Estrategias de escalado:

-Multiplicacin -Reglas de uso -Anlisis del rgimen y escalado hacia menor tamao
La multiplicacin implica replicar muchas veces el resultado que se obtiene en un reactor de escala relativamente pequea, en lugar de llevar a cabo el proceso en un reactor de mayor tamao.

Produccin de cido glucnico

Produccin de gluconato de sodio con A. niger

Produccin de antibitico

Produccin de lisina (10000 ton/ao) en 20 fermentadores de 250 m3

Drogas medicinales

Reglas de uso : basadas en anlisis dimensional y criterios de similaridad de algunos parmetros

% de uso en la industria 30 30 20 20

Criterio de escalado Potencia/Volumen kLaLG Velocidad en la punta del agitador Concentracin de oxgeno

Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; dimetro del agitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado por el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds

Anlisis del rgimen y escalado hacia menor tamao

La concentracin de oxgeno es diferente en distintas zonas del reactor. Se puede simular considerando varios reactores con distinta alimentacin de oxgeno

Modelo del sistema que supone dos compartimientos con distinta concentracin de oxigeno