Sunteți pe pagina 1din 28

ORGANIZAREA MEMB RANELOR CELULARE

DE
r^4, MOLECALE I^4,

O STUCTURA FANCTTONAL/{

LIPIDELE MEMBRANARE
Asoecte senerale
4U50vo din materialul organic al membranelor. Sub aspect molecular ele reprezintd componenta structurald de bazd a membranelor celulare (raportul molecular lipide/proteine fiind de -50/1). Aga cum stipuleazd modelul in mozaic fluid al organizirii membranelor, lipidele sunt in membrane sub formd de bistrat, cu capetele hidiofile la exterior gi cozile hidrofobe in i1ter1g, bistrat care prezintd proprietdfi fluide, manifestate bidimensional. tr'uirt au o distribufie (dispunere) asimetricd gi sunt de o mare eterogenitate. Agadar, membranele "t-fipiJ"le celulare
structurate
structurate pe-un bistrat lipidic bidimensional, asimetric Ei eterogen.

Lipidele reprezintd

sunt

prezenta aici, in principiu, pentru structura gi funcfionalitatea memb.*.i ^""fui*" se-aprica qi membranelor din interiorul celulelor, aganumitele endomembrane, cele care structureazd organitele citoplasmatice delimitate de membrane.

aspectele legate de eterogenitatea componentei lipidelor membranare, dispunerea"lor asimetricd in cadrul bistratului gi comportamentul lor fluid, manifestat bidimensional, cu scopul de a infelege cum acestea asiguri funclionarea membranelor. tnformaliile se vor nuanfa qi ne vor u.;otu ra ,nui bine cum opercazd membranele celulare, prin abordarea ulterioarl a aspecteloi legate de proteinele membranare ca 9i prin discutarea componentei glucidice a membranetor. oe punc"tat ca toi ce vom

In cele ce urmeazd vom cauta si argumentem aceste afirmafii de ordin general, detaliind

irprr!"*

diferen{d(e) specifi cd(e)' . Lipidele membranare reprezintd o categorie larg6 de substanle organice relativ insolubile in apd' solubile in cei mai mulfi solvenfi organici, cu caracter amfifil, *ult" dintr" ele fiind esteri ai unor

In problema definirii lipidelor membranare, nu ne propunem un enun! cu valabilitate absolut6. interesul nostru, asrfet incdt s6 avem aceiaei "oerationard.pentru percepfie a noliunii. Vom structura aceastd definilG dupd modelul logic al definirii p.i, g"n p;oxim gi

i::li::t*.ill'f:3:j:I1,:

9i definirea clard. Pentru exitinderea demersului intelectual al acestei notJde subsol, sd Jxernplirr.i* pentru fiecare tip din cele patru. Penru definifiile genetice am.putea Propune una "r'a-"nni6i Pentru ce esre. Romaniaii uo* rpun", nomdnia este o fari europeantr formattr printru-un proces indelungat de unire a unor ldri medievale mici, mai int6i a Moldo'vei cu lara romaneascd, in a c9_Ia.iumatate a ' * secolului al XIX-lea' proces finalizat prin adtrugarea Ardealului qi nasa.auiei ra l pi,i rrri iaruoi ,o"ai'rr. " ca cxemplu de definifie ostensivtr str incercdm aplicarea la oceania, .prrara, ci.."riu este o regiune de insule din oceanul Pacificintre care se afli papua Noua Guinee, Insurire Marshar, samoa, Noua

I logica qtiinfa care ne inv-afa.cum s{ gdndim corect, pe. baza unor structurtrri rafionale ale cuno$tinfelor, stabilefte patru modalit4i de construcfie a definigiilor pentru nofiuni (fiinp, obiecte, fenomene;. Aiesie fatru moauitati conduc la patru tipuri de definifii care sunt (r) definifiile genetice (constructive) prin care se indica rnodulin lare a luat fiinli nofiunea; (;;) definifiile ostensive (demonstrative, sau prin indicare) prin care se enumeri cafiva dintre membrii (preferabil reprezentativi) clasei din care face parte nofiunea de definit; (ii, deliniliiie enumerative prin ,ur" .. .nur"raioli memurii crasei; (iv) definifiile prin gen proxim gi difercnftr(e) specific5(e) prin care, mai ?ntdi se stabiie-qte. o .o,.goJ.-,nri r.:.gd de nofiuni cdreia ii aparline pi cea pe care dorim si o y'efinim (genul proxim), dupd care se identifici qi se enfmeri atdtea caracteristici specifice no(iunii pe care urmlrim sd o definim, cate sunt necesare pentru o extragere tara amuiguitali ain

g"*ip.*i*

ffiin

'

ffilj$:r"#**f":

putem exemplifica pentru {drile scandinave ri

;";;;ril;;:

Zeerandi.

Tirire scandinave sunt Norvegia, suedia,

care se define$te.

Nu vom da exemplu de definifie prin gen proxim diferenl6(e) specificS(e), 5i deoarece folosim metoda in text la definirea Iipidelor rrcmbranare, dar vom remarca faptul ci toate celelalte tipuri d; definitii se aoresearide regul{, unor inifiati (in istorie, sau geografie pentru exemplele folosite)' pe cind tipul oe definigie ce tace subiectul ur"ri.iiur" ore unul instructiv, care poate ajuta infelegerea 5i unora mai pufin, sau deloc iniliali' Definilia c:n froxim. !i diferenfe ,pr.in." este cel mai a". uiiiiruri in qtlir1", daci nu in exclusivitate. Prin acest tip de definitie se pot defin-i chiar gi oriqnuinleil, JL-p* tot Logica ne spune ca sunr greu de definit' condifia este ca cel care defineqte si cunoasci foarte "u." bine ceea ." t Jiefineasca. p.i't u ,rit inrt uili, acest tip de definifie este elocvent din punct de vedere formator, "bui" creind o irugin. srg".tiua pentru obiectul,""i "1r" nofiunea, fenomenul

Dr. Mhcea Leabu- Lipidele membranare. curs pentru studenliitn medicind alcooli polihidroxilici cu acizi gragi (acizi carboxilici cu lan! alifatic liniar, adici o cateni liniard confinind mai mulli atomi de carbon). Se observi cd definilia este foarte cuprinz[toare sub aspectul speciilor moleculare pe care le poate include, din punct de vedere al structurii chimice. S[ nu uitdm insd cE interesul nostru este de naturd biologici, aga c6, privind din aceasti perspectivd, mai multe intrebdri pot frdm6nta dorinla de a pdtrunde logic domeniul. Care ar fi acestea? l. De ce lipide (in structura de bazd a biomembranelor)? 2. Care dintre lipide (participd la structurarea membranelor)?
De ce (dispunere in) bistrat? Si le luflm pe rdnd gi sI punctim aspecte care sd ne ajute in a gEsi rispunsuri acestor intrebdri, cu rdsfringere asupra infelegerii funclionalit6fii membranelor.

3.

Lipidele componente ideale pentru stracturarea membranelor (De ce lipide?) Caracterele fizico-chimice ale lipidelor le definesc drept molecule ideale pentru
structurarea de membrane, a cdror principalI menire este aceea de a separa doud compartimente apoase (interiorul celulelor de mediul inconjurdtor). De ce le definesc drept molecule ideale? Pentru cd structura gi caracterul lor amfipat induce proprietdli amfifile arhitecturii pe care o organizeazd, partea hidrofobi putdnd crea o barier6, iar partea hidrofilE conferind capacitatea de a

acomoda mediile apoase aflate de o parte gi de cealalt[, adicl interiorul, respectiv exteriorul celulei. Lipidele sunt molecule mici cu posibilitdli mari de mobilitate, astfel inc0t structurile pe care le pot asambla nu sunt rigide. Sunt molecule relative insolubile in medii apoase, prezent6nd tendinf[ de asociere spontan5, ceea ce conferd structurilor pe care le formeazi tenacitatea de a-gi pastra integritatea, sau de a se reface rapid, atunci c6nd sunt agresate mecanic. Tendinfa spontane de asociere implicd un consum energetic minim, ceea ce reprezintd un avantaj in economia celulari. Degi sunt molecule mici, structura lor este deosebit de complexd (chiar numai rememorind defini1ia, dar gi, cum se va vedea in cele ce urmeaz6, cdnd vom rdspunde intrebdrii "Care dintre lipide?"). Aceastd complexitate chimicd vom realiza ci este exploatati fericit de celuli (vezi la "Rolul lipidelor membranare"). Dacd ar fi sd punctdm pentru inceput avantajele ce rezultd in privinfa structuririi membranelor, notdm cf, defectele, ce ar putea apdrea in structura lor, sau in structurarea bistratului, sunt ugor de acceptat gi, ulterior, de corectat, fhrd a induce efecte biologice catastrofale (caracterul amfifil nu se pierde). Mai mult, modelarea lor structural6, dupi cum va reiegi mai jos (vezi la "Rolul lipidelor membranare"), care se face printr-un bagaj enzimatic adecvat, consistent qi bine elaborat, folosegte integrdrii celulei in contextul biologic in care se afli gi funcfioneazl,. Clasifrcarea lipidelor membranare (Care ilintre lipide? ) Prin ceea ce vom include in rispunsul la intrebarea: "care dintre lipide?" vom substanlia caracterul eterogeu al structurii membranelor celulare. a Biochitilia descrie o mare diversitate de clase de lipide, grupate in doui mari categorii: lipide complexe, caracterizate prin prezenta tn structura lor a acizllor graqi (acilgliceroli, fosfogligeride, sfingolipide, ceruri) gi lipide simple (steroizi, prostaglandine gi terpene). Ne putem inteba, pe bun[ dreptate, daci toate aceste clase de lipide pot fi int6lnite in structura membranelor celulare. Ei bine, r[spunsul este: NU! In membranele celulare lntilnim numai trei tipuri de lipide pe care le putem clasifica, in funcfie de structura lor chimici globali, in:

1. fosfolipide; 2. colesterol; 3. glicolipide.

ele sunt din clasa sfingolipidelor (vezi despre sfingolipide mai jos, la clasificarea in funcfie de poliolul din sructur6). Iati, in aceasta primd clasificare a lipidelor membranare, o primi dovadd a eterogenitifii fipidelor membranare. Ideea de eterogenitate a lipidelor membranare spore$te insa, daci ne-am propune s6 abordim chiar 9i numai complexitatea tipurilor de lipide din ilura fosfolipidelor, mai bine reprezentate lipide din membranele celulare, sub aspectul abundenpi. Acestea ""i^" se pot clasifica, in funcfie de poliolul din structurd ?n:

Enumerarea este in funclie de abundenla in care apar. Fosfolipidele reprezintd 70-75Vo dintre lipidele membrane, colesterolul20-25vo, iar glicolipidele l-10?o. o menliune de frcut, in b-seture cu glicolipidele din membranele celuleloi animale, este aceea c6

(i) (ii)

fosfoslingozide (sfingofosfaride, sau simplu sfiisozilte) - dac6 poliolul este sfingozini, de fapt un aminodiol cu un lanl alifatic (aceasta inlocuiegie unul ditre acizii graqi din coada hidrofobd a fosfolipidelor rezultate, cel de al doilea fiind inserat printr-o legdtura amidici Ia gruparea amino a sfingozinei).

fosfogliceride (glicerofosfatide) -dacd poriolul este glicerind;

se extin; gi urupru sfingozidelor. - Structura de principiu a unui fosfoglicerid este reprezentatd grafic, in mod intuitiv, in Fig. l. Seobservicdpe scheletul polialcoolului (glicerina) se afld grefati pe de o parte (lahidroxilii din pozigiile I 9i 2) doud lanfuri alifatice provenind de la acizii gragi eiterificali cu gruparile hidroxil (acestea formdnd coada hidrofobd a lipidului membranar), i* p" de altr purt" [tu iia.oxilul din pozifia 3) o moleculi, notatl simbolic cu X, atagatd prin intermediul unei giupiri fosfat, impreund formdnd partea esenfiald a capului hidrofil.

analiza detaliilor referitoare la structura lor chimicS. in cele ce urmeaz6, vom discuta deipre eterogenitatea structurald a fosfogliceridelor, dar menlionam ci unele aspecte

Dar eterogenitatea fosfolipidelor membranare nu se termin[ aici. Ea se nuan! eazL pi,n

Fig. 1. structura schematici, de principiu a unui fosfoglicerid. in verde este reprezentat miezul glicerolului; in galben'sunt reprezentaie lanfurile alifatice ale acizilor gragi; cu X, in albastru, esteieprezentata p;rtea variaoiu iin capul hidrofil.
In funcfie de restul X din capul hidrofil, fosfogliceridele

se

impart in:

(i) fosfatidilcoline (prescurtare intemafionald PC, denumire uzuali lecitinl), c6nd X este colini (Frg. 2); (fi) fosfatidiletanolamine (pE), X fiind etanolamini; (iii) fosfatidilserine (PS), la care X este serind;

(iu) fosfatidilinozitoli (P!, in care X este inozitol; (v) acid fosfatidic @A), cu X-ur fiind, simplu, un atom de hidrogen.

fosfatidilcolinelor sau fosfatidiletanolaminelor, care in pozilia I a glicerinei au iterificat un alcool gras nesaturat cu dubla legaturi intre Cl gi C2, numite plasmalogene gi reprezentind -lyVo dintre fosfolipide in creier, mugchi, testicol, rinichi. De remarcat ca in mugchiul cardiac nivelul plasmalogenilor ajunge la 50vo specul0ndu-se cd ar putea proteja miocardul fale de efectul radicalilor oxigen singlet.

Echivalentul fosfatidilcolinelor pentru sfingofosfolipidele membranare sunt sfingomielinele (SM). De amintit aici (pentru sporirea ideii he ercrogenitate a fosfolipidelor membranare) 9i: /) fosfolipidele in care doud molecule de acid fosfitidic sunt condensate la hidroxilii laterali ai unei a treia molecule de glicerina, structurdnd cardiolipine (difosfatidil (fosfolipide specifice membranei mitocondriale interne); 2) fosfoliiidele echivalente

$"!"oti),

CAt privegte abundenfa sub care tipurile de fosfolipide apar in structura bistratului, pC, sM, PE 5i PS sunt majoritare, reprezentad fiecare intre 20 gi zsur. pI pA reprezinti pinala l?o 9i fiecare; ln ciuda acestui fapt (sau poate tocmai de aceea) aceste doud fosfolipifu ,urt implicate in procese celulare deosebit de importante (vezi la ,.Rolul lipidelor membranari").

\u;
o.op

d-o

)
)

iq
(

)\ \(

)i

9 o=:

)uf*0oq, lekithos care in limba greaci inseamnd gdlbenug de ou, intrucat acesta are un conlinut foarte bogat de
cuvAntul
lecitinS.

Fig. 2. structura fosfatidircorinei (1-stearir-2-oreir{osfatidircorini). Lecitina, denumirea uzuall a acestui fosfoglicerid, vine de la

Ne afldm acum in situafia de a putea puncta aspecte legate de dispunerea asimetrici a fosfolipidelor in membrane (Fig. 3). Experimental s-a dovedit pc qi sM sunt preponderent distribuite in foifa externd a bistratuluirin timp ce PE, PS pi pI sunt, "a dupe datele existente p6ni in prezent, exclusiv in foila internd. Mai mult, aparigia Ps tn roila externe a uisuafrrtui reprezinta o dovadr timpurie a intrrrii celulei ?ntr-un proces apoptotic. De usemenea, activarea plachetelor sanguine este insolit6 de aparilia PS in foitra extirna a bistratului lipidic membranar [l]. colesterolul este, tn general, egal distribuit intre ambele foip ale bistratului. cri"oripio"ie se afli numai in foila externd a bistratului lipidic.. De curind, distribu,tia asimetricd a iosfolipidelor bisnaului lipidic membranar este investigat[ in anumite patologii 31, afectarea ei fiind insolitr [2, de defecte in funcfionarea normal5 a celulelor.

SPATIUL EXTRACELULAR

ffi$effieffi$ffiM
CITOSOL
Fig' 3. Lipidele membranare sunt asimetric distribuite intre cele doud foile ale bistratului. semnificafia simbolurilor: - cotesterot; -fosfatiditcotini; -fosfatiditetanotamini;

fi

diversitatea tipurilor de acizi grapi care intra in structura lor. Acegtia au un num5r par de atomi de carbon cuprins inlr.e 12 qi24 (cn-Cz+).La cei cu mai pufin de 12 atomide carbon solubilitatea ln apd a Iipidelor pe care Ie formeazi cre$te prea mult, ceea ce poate afecta integritatea bistratului gi rolul de barierd al acestuia. eciziigraii cu mai mult de 24 de atomi de ca6on in moleculd sporesc prea mult hidrofobicitatea tiiiaetor, ingroagd bistratul reduc6nd

[ - fosfatidirserini; ft' ldeea


h
..1

-.riigori.rin.,

eterogenitaili r8[rotlpia"tor membranare este substanliatd

$ -gricoriJiJ.

gi

de

cre$terea interacfiunilor la nivelul cozilor hidrofobe. Agadar din motive de eficienf6 in funcfionare acizii gragi evidenfiafi a structura lipidele membianare confin intre 12 gi 24 de atomi de carbon. Ei pot fi acizi gragi saturafi sau nesatura{i, cu catena hidrocarbonati neramificatd. in ceea ce priveEte pozi{ionarea lor in structura glicerofosfatidelor putem face urmdtoarele aflrmafii:

eficienfa sub aspectul proprietdlilor de permeabilitate seiectiva gi

ii

reduce fluiditatea prin

1' tn pozilia I

2'

a glicerinei, de reguld, se afld esterificat un acid gras saturat. Cei mai des intAlnili sunt (i,) Cqa, acidul miristic, (ii) Crc, acidul palmitic qi (iii) c1s, acidul stearic. O ordine a frecvenfei sub care apar ar fi: Cro > C,, > C,o. ln pozilia 2 a g.licennei, de. reluld, este esterificat un acid gras nesaturat. cei mai des intalni$ sunt (i/ Crr,r', acidut oleic, (ii) C1s,2, acidul linoleic Ai (iii) C,ss, acidut Iinolenic. Trebuie sd amintim aici, pentru rolul sdu deosebit de important tii)';,,Rolul lipidelor membranare"), acidul arahidonic, sau acidul eicosatetraenoic (czo:+).

regul6, saturafi.

De menfionat, in incheierea acestui comentariu, cd acizii gragi din sfingolipide sunt, de

a trece la aspecte mai detaliate asupra organizarii lipidelor qi cum aceasta se rdsfringe asupra comportamentului bistratului la nivelul lipidic ai funcfionalitifii sale, merit5- de punctat, p"nt* o ultimd aigumentare a amplei eterogenitdli a lipidelor membranare faptul cd, ludnd in tonsiderare cele do"ua poritii a" ert"rin"u." giJour."i
Inainte de
membranelor
in simbolistica notlrilor abreviate a acizilor graqi, prima cifri din indicele inferior reprezintii numIrul de atomi de carbon din moleculd, .:" reprczintf, simbolul pentru prezenta dubtelor legituri, iar u Jrr. rlrirezinta numtrrul a" arul"-r"gutm aln molecultr' In biochimie notaliile pot fi muh rnai detaliate p.itru indicar"a "iau rrprin*,ui a pozi;iei dublelor leglturi in lanful alifatic, insl in economia discufiei noastre 5i in infelegerea implicagiilor biologi"", u..ri" I.mlii nu sunr semnificative. 5
2

20 de acizi gragi mai des intAlnili, num6rul de diverse fosfolipide din fiecare tip (pCJE, pS, pI, SM) poate atinge valoarea de 400. Bineinleles cd aceste valori teoretice nu se regdsesc in realitate dintr-o multitudine de motive de constrangere specifice sistemelor biologice.

Structura de bistrat rezolvd dezideratul esenfial al organizdrii membranei (De ce bistrat?) Vom incerca sd precizSm aici cdteva argumente logice pentru a rdspunde intrebarii ,pe ce bistrat?". Bistratul este cea mai simpld structurare a lipidelor care poate inchide un volum mare de mediu hidrofil, spre a-l separa de un altul, tot hidrofil (capetele hidrofile la exterior, put6nd acomoda cele doud medii hidrofile; cozile hidrofobe in interior, in ad6ncimea structurii, conferind rolul de barierd). Agadar este o structur[ care poate corespunde dezideratelor celulelor de a fi separate de mediul inconjuritor gi de a-gi menfine intr-o manierl eficientd homeostazia intern6. Asamblarea in bistrat se poate face spontan, fiind deci favoizatienergetic, iar bistratul nu poate prezenta, din considerente termodinamice, capete libere. Acest lucru conferi membranelor tenacitate in pdstrarea integrititii structurale gi refacerea rapid6 a acesteia chiar in cazul unor

gi dispunerea asimetricd a componentelor acestuia conferi proprietdli fizico-chimice diferite celor doud fefe ale membranei; mai mult, asiguri comportament independent celor doud fe,te ale membranei, dar gi solidar, atunci c6nd nevoile celulei o cer, aceasta av6nd cdile de a controla comportamentul (independent, sau solidar) al
componentelor membranare.

distrugeri datorate agresiunilor mecanice. Structurarea sub formd de bistrat

Stareafizicd a bistratului lipidic Discufia asupra stirii fizice a bistratului lipidic igi propune si ne dea o imagine intuitivi privind efectele structurii bistratului asupra funcfionirii membranelor. Bistratul lipidic este fluid, intr-o continud dinamic[, cu efect asupra inter-relafiilor dintre moleculele care il compun, interrelalii care sunt intr-o permanent[ modificare. Fluiditatea bistratului lipidic este o rezultant1 a diverselor posibilitdfi de migcare a lipidelor ce il alc[tuiesc. tn ce constil aceasti diversitate? Lipidele membranare pot executa urmdtoarele tipuri de migcdri:
1. Mipclri intramoleculare, pe care lipidele le realizeazd,in raport cu propria lor structurd (in raport cu propria lor axd), spafiul ocupat de ele putdnd fi aproximat cu un cilindru al cirui bazi are o suprafalS de -60 A' {razd de -4.4 A) gi cu indltimea de -30 A. Aceste migcrri pot fi: o De rota{ie, cu o frecvenld de lOe rotalii/s; aceste migcdri izvordsc din capacitatea lanfurilor acizilor graEi de a se roti in jurul legdturilor C-C, capacitate care se iasf.ange asupra comportamentului intregii molecule, prin cuplurile de forfe pe care le indui; rezultanta acestui ,,zbucium" intern molecular este migcarea de rotafie a moleculei lipidice

raport cu altele. Acestea pot fi:

in ansamblu. De flexie a cozilor hidrofobe, cu o frecvenld de 108 flexii/s; aceste miqcdri trebuie inlelese tot ca rezultat al migclrilor din interiorul moleculelor de lipid, la nivelul cozilor hidrofobe ale acizilor gragi nesaturafi, care, datoriti impiedicdrilor datorate prezen.tei celuilalt acid gras Cin structuri, nu pot executa, de reguld, dqc6t migc6ri asemdndtoare gtergitorului de parbriz; efectul la nivelul intregii molecule este acela al migcdrii de flexie a 2. Migciri intermoleculare, care implicd schimbarea pozi{iei moleculelor de"oiii. unele in lipid

Mi$ciri de transla{ie (difuzie lateralS), miEcdri ale lipidelor in planul membranei, in aceiaqi foitl a bistratului, unele printre altele; frecvenfa acestei miqclri este de 107 schimbiri de direclie/s. Trebuie menfionat faptul cd prezen[a colesterolului in bistrat determind o diminuare a mobilitdlii laterale. Mi$ciri "flip-flop", adicd migclri de trecere a lipidelor dintr-o foild a bistratului in cealalti; aceste migclri presupun o risturnare a moleculei in planul membranei, pentru a-

gi pistra capul hidrom U


endomembrand

pur" logic; exista niverul "" migcarea- de " frecvent gi anume -cdreia membrana reticulului endoplasmic (v ezi ra "Reticulu I enaoprasmic;;y.

f*::":^tl*:Y:.rymbranei;j*"y:ltu..u:estor miscdri (o datd pe luni pentru fiecare moleculi individuali),


la

"*t"

.ru ,,flip-flop"

este foarre micd, practic nultr

*!lo"

,r*ii

Plutele lipidice pot fi asemuite unor sloiuri de forme, dimensiuni qi organizdri variate ce plutesc in oceanul lipidic mai pulin specific organizat. caveolele reprezinia o Iorme de plute lipidice, ce se dispun individual, sau in ciorchini la nivelul membranei. Eterogenitatea plutelor lipidice a fost evidenliatd prin interpretarea rezultatelor diferitelor metode
de obfinere:

explici bidimensionalitatea stirii fluide a bistratului lipidic, siructura de bazd. a membranelor celulare' Migcirile lipidelor se manifestd practic numui in cadrul aceluiagi strat al bistratutui. Deasemenea, frecvenfa extrem de redusd a migcdrilor "flip-flop" are ca efect menflnerea distribufiei asimetrice a moleculelor de lipide in ceie doua straturi, distribufie construita de celula cu mare consum energetic odat6 cu biogeneza de novo a membranelor (vezi la .Reticulul endoplasmic"). Manifestarea bidimensionaid a fluiditarii bistratului lipidic d6 membranei celulare caracterul de structura cu proprietrti mezomorfe, proprietifi specifice cristalelor lichide. Acest comportament mezomorf este accentuat de capacitatea lipidelor de a structura microdomenii bogate in sfingolipif (nart9 dintre ele glicolipide), cotesterot gi anumite proteine membranare. Aceste microdomenii sunt denumite "plute tipidice" (lipid rafts) gi au deosebita importan !d, atdt structurala (organiznazd structuri specializaie ale me]rnbranei, cum ar fi caveoi"l.;, .at gi metabolicd -tinand laolaltd molecule gi macromolecule destinate a funcliona impreund in complexe supramoleculare [4]. Pentru a infelege mai bine ;ructurarea microdomeniilor de membrana, sd menfiondm cr lipidele, a$a cum nu sunt echilibrat repartizateintre cele dou6 foile ale bistratului, nu sunt omogen amestecate nici in cadrul fiecarei foife a bistratului, ci se asociazi inn-u1 mod neomogen pe baza unor considerente fizice. plutele lipidice fie planare, fie invaginate sub forma caveolelor (numite vezicule plasmalemale in celula endotelial6) se caracteizeazd printr-o fluiditate mai micd ?n comparalie cu restul bistratului. prezentaplutelor gi !9i0t9e eterogenitatea lor suslin gi nuanfeazd ideea de mozaic nriJ r r.g-irariiii"#ur*"ror.

Revenind la tema acestei secliuni,

sE

punctdm cf, absenla practicd a migcdrilor ..flip-flop,,

diferili detergenli neionici;


sonicarea preparatelor de membrane gi analizarea fracfiunii ugoare;

analizeimunocitochimice.

Degi rezultatele experimentale sunt, in anumite limite, variate, suger6nd diversitatea compozilional5 a plutelor lipidice, se pot totugi extrage cdteva caracteristici generale: - colesterolul este de 3-5 ori mai abundent dec6t in restul membranei gi reprezintd 33-50Vo din totarul lipidelor ra acest niver; - sfingolipidele (SM 9i glicolipidele) sunt imbogr{ite gi reprezint6 30-35vo din',e lipidele din plute; glicerofosfolipidele sunt srmc (in comparafie cu restul membranei) ; s30vo pentru PC + PE,'epreientate fald de -50Vo inrestul membranei; - linidgl,e specifice foipi interne a bistratului (ps, pD sunt slab repr#ntate la nivelul plurelor lipidice; - in foifa internd de la nivelul plutelor, lipidele conlin preferenfial acizi gragi saturafi (asta ar putea realiza necesarul derigiditate corespunzltor celei a foilei
Anticipdnd, vom merliona aici cd plutele lipidi-ce sscaracterizeazi gi prin capacitatea de lipidelor membranare in microdomenii accentueazd aspectul de mozaic fluid al membranelor.
1 1s-lgmera anumite tipuri de proteine membranare. AEadar, menfionand inc6
externe, unde sfingolipidele sunt bogat reprezentate).

odati,'irgnirar"a

In ciuda acestor organizdri eterogene, capacitatea lipidelor de a se migca in "aa*t bistratului este doar nuanfatii pe intinsul suprafelei membranei Ei nu anulata. AceastA capacitate de miEcare a lipidelor in cadrul membranei determind proprietatea membranelor numit6 tluiditate. Fluiditatea membranelor poate fi modulatd (modificati, reglat6) de mai mulli factori. Acegti factori pot fi de naturd frzicd, sau chimici. Ca factori fizici amintim temperatura gi presiunea. Fluiditatea membranelor este direct proporfional6 cu temperatura qi invers proporfionald cu presiunea. Efectivitatea acestor factori fizici in modularea fluiditdtii membranare este insi limita6, dupi cum u$or ne putem da seama. Nici presiunea gi nici temperatura nu pot varia larg in condilii fiziologice. Mult mai pregnant este efectul factorilor chimiii in modularea fluiditdlii membranei. Acegtia, in funcfie de provenien!6, se pot clasifica in (i) factori chimici intrinseci, sau (ii) factori chimici extrinseci. Factorii chimici intrinseci, pe care celula ii folosegte in modularea fluiditdfii membranei in funcfie de necesitdli, sunt cantitatea de acizi gragi nesaturali din structura fosfolipidelor, sau a glicolipidelor gi/sau cantitatea de colesterol din structura bistratului. Fluiditatea membranei este direct propo(ionald cu procentul de acizi gragi nesaturafi din structura lipidelor bistratului (cregte cantitatea de acizi gragi nesaturafi, cregte gi fluiditatea), in timp ce cretterea procentului de colesterol duce la rigidizarea membranei (micgorarea fluiditefii). Agadar, fluiditatea membranei este invers propo(ional[ cu cantitatea de colesterol din bistrat. Cum trebuie infelese sugestiv motivele acestor efecte ale colesterolului gi acizilor gragi nesaturali asupra fluiditd,tii membranei celulare? Descriptiv, geometria angulari a cozilor acizilor gragi nesaturafi are ca efect dep6rtarea spafiali a lipidelor gi micporarea interacliunilor intre acestea atdt la nivelul porfiunii hidrofobe, cdt gi al capetelor hidrofile. in ceea ce privegte efectul colesterolului, dir motive structurale (datoriti geometriei spafiale), acesta spore$te tdria interacfiunilor atdt la nivelul cozilor hidrofobe, cat $i al capetelor hidrofile, anulAnd efectul acizilor gragi nesaturafi. Factorii chimici extrinseci se clasificd la rAndul lor in (a) fizinlagici (hormoni sau mediatori chimici liposolubili), (b) patologici (metabolili liposolubili ai unor agenfi patogeni, substanle chimice toxice, liposolubile), sau (c) terapeutici (medicamente liposolubite). trrtutte analgezice, ca gi unele anestezice, fiind compugi liposolubili, aclioneazd gi prin modificarea fluiditeFi membranelor neuronale. Dovezi experimentale recente dovedesc fapiul cd, allturi de efectele datorate modificdrii fluiditafii membranare, anestezicele gi/sau analgezicele aclion eazd Si prin modificdrile conformalionale induse la nivelul unor proteine transmembranare, afectdndu-le
func[ia.

+.

Dupi cum vom vedea, fluiditatea membranelor este modulatd gi nuanfati gi de celelalte componente ale membranelor: proteinele gi structurile glucidice.

Rolul lipidelar

cd, fdrd bistrat lipidic nu pot exista membrane celulare. Acesta reprezintd componenta structurald de bazd, a lor, funcfia structurall a lipidelor membranare organizate in bistrat fiind esenfiald. Bistratul lipidic confera membranei celulare rolul de barierS, aceaste menire a lipidelor membranare fiind enunlatd incd de la dovedirea prezenfei lor in structura membranei. Dar lipidele membranare nu se afli nici pe departe acolo numai din considerente structurale. Ele sunt implicate in importante funclii metabolice, acele funclii care unesc celula cu mediul inconjuritor, o integreazd pe aceasta in "ambianfa biosocialf,". Mai mult, echilibrul dintre diferitele tipuri de lipide din membrane influenfeazd comportamentul normal al celulei, iar modificarea lui poate atrage devialii patologice. De aceea, lipidele membranare pot reprezenta finte terapeutice [5]. Glicolipidele sunt implicate in fenomene de recunoaqtere gi semnalizare intercelulari (vezi la'Componenta glucidici a membranei").

m embranare DupI cum am ariltat pdnl acum, rezultd

Detalii referitoare
reguri, aceste modinciri se petrec ca urmare a unor procese dc semnariz*", *;;;;;l'ifii rezurtari u"liorano secunzi gi declanqand numeroase procese prin semnaleror receprate. Exist, mai multe tipuri de fosfolipaze,:are au proprietatea a" u .rii"'*-diverse molecule din structu.a complexi a fosfolipidelor (Fig. 2). Acestea sunt:

f"ff::.il"i*il:.ir:::,*.::::T",^*::,_*,,u*it"i'ioi{;;"
.*'""tri;i".i,po;

;#:,:il.:;

o"r\
-O

o..\,X
\
D

lizofosfatide: (iry' fosfolipaza B (prescurtare internafionaH pLB), care poate scoate acizi gragi din ambele pozifii din structura fosfotipiieror, cumuldnd acriviratea pLAl pLA2;
asupra lizofosfatidelor.

fosfolipaza Al (prescurtare international6 PLAI), care yidul gras din pozifia t a glicerinei; (ry' fosfotipaza AZ (priscurtare iiternationUa PLA2), care deta$a7,a acidul gras din pozilia Z a gileiinei, cu formare de
e)!!er^ea7a

(i)

$i

aclioneaza

in

il;;

fosfat, c u
:,

^(iuj

fosfolip^;; C:' ;*".9rrfu-".: Iegrura dintre glicerind


el
i

(v) fosfolipaza D, care ellmind


PA.

berarea diacilgliceronf

.rrui niarl'l X, cu eliberarea

o. iOa Cl ;

gi

*
3

Fig.'2' Locurire specifice de acfiune a diferiteror tipuri de fosforipaze, ra nivelut morecureror de fosforipide. er-ioriorip aza A1; A2 fosfo_ lipaza AZ; B - fosfotipaza B; C _ tosfotip"r" C; O _ fosfotipaza D. Pentru exemplificarea efectelor punctam urmdtoarele ro"tarli r" capitolul ..semnarizarea transmembranard',):

ii

(a) Fosfolipaza A2 poate elibera acidul arahidonic, carc este precursor pentru patru clase de substanle cu roruri dintre cere mai diverse..Acestea a. i*iLdondine;2. rromboxani;3. prostacicline; 4. reucotrie,ne) sunr oblinute prin_comprex" ;;;;;* de zare (cubagaje enzimatice adecvate) a acidului arahidonic, -metabori dupd elibera."u'ru-Jin fosfolipidele care il contin. Primele trei tipuri rezultd pe calea ciclooxigena iei, ceaa"-u fut u pe calea lipooxigenazei. "ras5 (b) Fosfatidilinozitolii sunt implicali in mecanisme de transmitere transmembranarr gi intracelulard a semnalelor' cdnd un"t"'*oi""ule.semnal 0,g"rrii'.. leagE de receptorii specifici din membranele celulare, P[ intrd intr-o secvenld de reaclii-denumita cascada fosfoinozitidelor (Fig' 3)' in aceastji cascadr PI sun"t ioifui rorro.itut" pu, p", i. r"rr"inozitolfosfali (plp), sub acgiunea fosfatidilinozitol kinazei3 pi "u t<inaza;, cu cbnsu.'J" arp, apoi la fosfoinozitol_dis_ fosfali (PrP2), sub acliunea Btp tinazei, oe ur"*"nlu consum de ATp. Asupra fosfaridirinozitor-4,5-dis-fosfaturui formar aclioneaz.d speciRca pentru fosfatidilinozitoli) cu eriberarea de Ipr (inozitoi-tl+jlt iirorrur.) gi DAG. Ipr actioneazd ca mesager secund inducdnd cre$terea ca2* in cirosol si rapide 9i de scurtr durati (exemplu, contraclia muscular6). La randut sdu, DAG este implicat in

-* fornw"*-c$il;;d;; I ."rar.i";i;;ffiil ff#:

3 a

ffilTJi:$ilitli;,ig'ffX1j*#,:fi;*j'l;;'e*';;".
9

se soldeazi cu grefarea de fosfat pe diferite substrate. Atenlie! in denumirea acestorm.etabolilise fblosesc particuleledis, iespectir raril ,r?r sau ri, deoarece

Prin kinaze desemntrm acele enzime a ctrror activitate

io,iJli'""'liil"umirea

fiecarereziduu fosfar compus,or in care-iosratur se

Dr. Mircea l*aba - Lioidele membranare, curs oentru studenrtitn medicind lungi durati (exemplu, semnalizarea prin c6ile proteinkinazei C).
declangarea unor rdspunsuri celulare mai lente gi de

fosfatidil inozitol (Pl)


pt kinaze

p-ATP oo"
(P
I

oo" fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat

fosfatidilinozitol-4-fosfat I -ATP PIP kinazd

P)

Fig. 3. Cascada fosfoinozitidelor.


(

Pl Pr)

Acfiunea secven[ial5

fosfatidil-

$pqfM

iosfolipazi C pq*ru fasfoitw ilid

LC-B)

specificitate pentru fosfoinozitoli, elibereazi lP3 gi DAG, care sunt


+ inozitol1,

inozitol kinazelor duce la formarea PlPz; Ulterior fosfolipaza C-p, cu

diacilglicerol(DAG)
transmembranarS.

4,Strisfosfat

(l

Pr)

procese de

mesageri secunzi

in

anumite semnalizare

Ca

si rezumlm cele prezentate despre lipidele membranare punctim:

l.
2.

Lipidele membranare organizeazd structura de bazd, a biomembranelor, bistratul lipidic, structuri cu proprietd[i fluide, manifestate bidimensional Ei caracteizat atit prin eterogenitate compozilionalI, cdt gi prin asimetrie; Bistratul lipidic asigurd func{ia de barierd a membranelor, f[r[ a-i conferi caracter de barieri absolutd, adicd flri a impiedica selectivitatea acestei structuri in interacfiunea
celulei cu mediul;

3. Departe de a avea numai un rol structural,


Bibliografie specffici

lipidele membranare particip[

la

funclia

metabolicA a membranei celulare in procese de semnalizare.

1. 2.

3. 4. 5.

Fox JE. (1996) Platelet activation: new aspects. Haemostasis. 26: lO2-13 l. Zwaal RFA, Schroit AJ. (1997) Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmerry in blood cells. Blood. 89: I l2l-l 132. Kuypers FA. (1998) Phospholipid asymmetry in health and disease. Curr Opin Hematol.5: 122-131. Pike, LindaJ. (200a) Lipid Rafts: Heterogeneity on the High Seas. Biochcm J.378,281-292. Escriba PV. (2006) Membrane-lipid therapy: a new apprcach in molecular medicine. Trends Mol Med. 12, 34-43.

Bibliografie generali
1. MOLECULAR BIOLOGY OF TIIE CELL, autori: B. Alberts, D. Bray, J. Irwis, M. Raff, K. Roberts, J.D. $Iatson, Carland Publishing Inc., New York & London, 1989 (edifia all-a), 1994 (editij'a III-a), Garland Science, New York, 2002 (edifia a IV-a); autori: B. Alberts, A. Johnson, J. trwis, M. Raff, K. Roberts, P.Walter, Garland Science, New York,2008 (edifia a V-a). 2. MOLECULAR CELL BIOLOGY, autori: H. Lodish, A. Berk, S.L. Zpunky, P. Matsudaira, D. Baltimore, J. Damell, W.H. Freeman and Company, New York, 2000 (edifia a IV-a).

l0

PROTEINELE MEMBRANARE
Aspecte generale Modelul mozaic-fluid de organizare a membranelor biologice ne arate c6, aldturi de lipidele structurate sub formi de bistrat, la construc,tia acestor componente celulare participa $i Proteinele Raportul mo.lecylar intre Iipidele gi proteinele." d.atui"rc membranele celulare este in medie de aproximativ 50/1. Acesi raport este ugor de infeles flnand ";ral;-frptul ci, de fqo-le,compozilia sub aspectul masei de material organic Ia nivelul membranelor este de -40vo lipide gi -50vo proteine, iar lipidele sunt molecule- cu greutate molecular[ mic[ in timp ce

hidrofobi este amplificatl. comentariile de mai sus asupra complexit5lii realitilii biologice in privinfa raportului lipide/proteine in membrane, ne permit enunlim reguli de principiu care sugereaz6 -si corespondenla intre acest raport gi funclionalitatea membrun"L A"rrt" (i) cu c6t funciiile metabolice ale unei membrane (sau po4iuni reguli sunt: --.""u ce se defineqte ca microdomeniu sau domeniu - dintr-o membrand) sunimai accentuate, cu at6t continutul de proteine al acelei membrane este mai ridicat; (ii) cu cdt rolul de barieri al unei membrane trebuie sE se manifeste mai pregnant, cu at6t conflnutul in lipide este mai crescut. ^ In abordarea studiului proteinelor membranare plec[m de la ceea ce gtim deja despre caracteristicile qi comportamentul fizico-chimice ale membranei, a$a cum am vizut cr sunt induse de ins69i prezenla,lipidelor in structura debazd,bistratul lipidic. Completarea cu prteine a organizirii moleculare a membranelor celulare nu'unut"-a ci amplificd gi/sau nuanfeazd eterogenitatea, asimetria gi comportamentul de fluid bidimensional al structurii. vom c6uta s5 argumentdm, prin prezentarea aspectelor legate de prezenlaproteinelor in membrane, afirmafia din fraza anterioari. Pentru substanfierea ideii de eterogenitate, vom proceda la aceiagi strategie folosit[ la prezentarea eterogenitefli lipidelor membranare: discutaria diversita,tii ae tipu.i ie proteine in membrane prin clasificarea lor pe diverse criterii.

insi diversr, existdnd gi excep{ii de la aceste valori. De exemplu la nivelul tecii de mielini, unde func{ia de barierd a membranei este esenfial[ rolului structurii, procentul de mas[ pentru lipide este de -80, iar cel al proteinelor de numai -20. Deevidenfiat, pentru situalia diame!3!oPus6, compozi{ia de la nivelul membranei mitocondriale interne unde l-ipidele reprezint[ -20?o, iar proteinele -80vo. Funcfa metabofice a acestei membrane este deosebit de accentuati, chiar daci ar fi sr men[iondm doar activitatea complexelor proteice imp.llcate in transportul-elec-tronilor (lanful transportor de electroni, numit gi lanful respirator vezila cursul ,,Mitocondria"), respectiv activitatea ATP-sintazei, complexul proteic care produce ATP' l^a nivelul membranei mitocondriale interne insa, ta fel die i*po.tunte qirunclia ae barier5' Poate de aceea aici se afl[ cardiolipinele, fosfolipide "ste deosebite, cdpatru lanfuri in coada hidrofobi (patru acizi graEi in moleculi), deci cu proprietifi amfifile alifatice a cdror componenti

proteinele sunt macromolecule. Realitatea biologici este

Clasificdri ale proteinehr membranare


primn clasificare a proteinelor membranare se face in funcfie de pozifia lor fatd de bistratul lipidic, care permite impdrfirea acestora in doui mari categorii:

1' Proteine

2'

periferice, sau extrinseci: acele proteine care se afld atagate de o parte sau de alta a bistratului lipidic, interacfiondnd cu &petele hidrofile ale lipidelor; Proteine integrale, sau intrinseci: acele proteine care sunt cufundate in bistratul lipidic,
strlbatdndu-l complet sau partial.

Dn Mircea Leabu

Proteinelc membranare. curs pentru studentii in medicind

Partea lipidici r6mdne in foila externe a bistratului gi poart[ numele de ancord glitofosfatidilinozitolicd. Nu sunt deocamdati clar elucidate funcsiie acestor proteine modificate prin glipiare. Unele dintre endoproteine se pot asocia tranzitoriu gi reversibil bistratului lipidic prin reaclii de acilare (miristilare, palmitilare, farnesilare, geranil-geranilare), radicalul acil fiind cufundat in foila interni a bistratului [2] (vezi CASETA). Aceste modificiri reversibile sunt importante pentru exprimarea functiilor acestor proteine. Mai mult, unele dintre ele, cum ar fi proteinele G mici pot tranzita, pe baza acestor modificiri, din starea de protein6 citosolici in starea de protein[ periferici pentru exercitarea func{iilor (vezilasemnalizarla celulari).
CASETA.

fluid privind organizarcamembranelor I I ]. Protcinele periferice reprezint5, in general, -25Vo din proteinele unei membrane, se exEag din membran[ cu solutii saline sau agenfi chelatori, au caracter hidrofil, dup6 extragere nu sunt asociate cu lipide 9i igi pistreazd solubilitatea in ap6. in funclie de foi(a UistratutuilipiOic cireia ?i sunt asociate se clasific[ in (i) ectoproteine (proteine periferice asociate foi,tei externe a bistratului, agadar expuse la exteriorul membranei celulare sau pe fala luminall a membranelor organitelor) gi (ii) endoproteine (proteine periferice asociate foifei interne a bistratului, agadar expuse pe versantul citoplasmatic al membranelor Ei endomembranelor). Au fost evidenfiate ataqiri mai ferme ale proteinelor periferice la bistratul tipidic, prin conjuglri (stabilirea de legituri covalente) cu componente lipidice. Pentru unele ecto]roteine a fost evidenliatd o cuplare prin carboxilul terminal la gruparea amino a etanolaminei din cap6tul liber al structurii glucidice al glicofosfatidilinozitolilor. Fenomenul se nume$te glipiare t1-a!.

Eviden$erea, descrierea gi denumirea acestor doud categorii de proteine membranare au fost fhcute in deceniul opt al secolului XX, la numai doi ani dupa introducerea modelului mozaic

Proteinelecareigiexercit6func[iabiologiciexclusivpeunaoi,.@toi

lipidic sunt adesea asociate de lipidele membranare din monostratul lipidic expus fie mediului extracelular, fie celui intracelular. De exemplu, o serie de proteine intracelulare (endoproteine) cu rol in transmiterea semnalelor din mediul extracelular in citosol se fixeazi covalent de lipidele membranare pe fala citoplasmatic[ a membranei plasmatice. Fixarea covalentii a proteineior se poate realiza de catenele acizilor gragi, fie de gruplri prenil (famesil sau geranil-geranil). Astfel, au fost eviden$ate urmitoarele modalitl{i de ataqare covalenti a proteinelor nilarosotuUite, dupi sinteza lor in citosol, de lipidele membranei plasmatice: (;) miristilarea, prin formarea unei leg[turi amidice intre gruparea amino-terminald apa(indnd unui rest de glicind ie la capdtul catenei polipeptidice gi gruparea carboxil a unui acidului miristic; (ir) palmitilare, formarea unei legdturi tip tioester intre un rest de cistein[ din interiorul catenei polipeptidice gi gruparea carbJxil a acidului palmitic); (iii) prenilare, const0nd in formarea unei legdturi tioeter intre un rest de cisteind (pozilionat inilial in pozilia a patra de la capltul carboxi+erminal qi ulterior in pozifie terminald, dupi fixarea de gruparea lipidicd gi clivarea celor trei aminociii de la extremiiatea catenei
polipeptidice) qi o grupare prenil (3-metil-2-buten-t -il). Deseori ata$area proteinei printr-o singurl ancord lipidicl
necesard fixarea suplimentarl de o ancori lipidicd secundard. De exemplu, membrii famiiiel de proteine Ras (proteine G mici cu funcfie GTP-azicd,,cu rol in semnalizare) sunt recrutate la nivelul membranei plasmatice prin fixarea de o grupare prenil iombinat[ cu fixarea de acidul palmitic).

nu este suficient de ferma, fiind

Prenilarea proteinelor este mediat[ de trei tip_yri de enzime, respectiv farnesiltransferaza gi geranilgeraniltransferazele de tip I qi II. in ultimii ani inhibitorii farneziltransferazei s-au dovedit candidaf; terapeutici importanfi pentru tratamentul unor forme de cancer gi al unor infec,tii cu parazili aparfinind Senul_ui Plasmodium, agentul infec$os al malariei, gi genului Trypanosoma (specia T. brucei), agentul infecfios al ,,bolii somnului".

De menfionat ci at6t proteinele membranare acilate, cdt gi cele glipiate au tendinta de a se acumula in caveole sau plute lipidice (microdomenii de membrana difinite gi discutaie pa4ial mai sus la lipidele membranare).

Proteinele integrale reprezinti, de regul[, -75Vo din proteinele unei membrane, se pot extrage din structura bistratului lipidic prin folosirea de detergenfi (adicn dup[ distrugerea

integritr{ii bistratului lipidic), dupi extragere rimdn asociate cu lipide, sunt insolubile in ap6 (dializarea detergentului duce la precipitarea lor prin floculare) qi au caracte, u11ntn (porfiunea hidrofobi fiind reprezentatd de zona imersatd in bistratul lipidic, po4iunea/po4iunile hidrofilr/tridrofi le reprezentdnd structurile expuse in afara bistratului lipidic). Proteinele integrale care traverseaz[ complet bistratul lipidic sunt denumite proteine hansmembranare gi reprezinti cea mai ,* purt" u prot"in"tor intrinseci. Cele care sunt pa4ial cufundate in bistratul Iipidic nu au primii o denumire specifici. Mai mult, acestea din urmr au fost considerate panr prin ultimul ieceniu al secolului'XX a fi p.u"ti" i.Lristente. se spea{a in favoarea acestei idei pe considerente structurale gi termodinamice. Explica{i a era cE nu p-utea fi adoptati aceste proteine o conformape care si asigure hidrofobicitate in por{iunea de pliere a 9" "1* polipeptidic in interiorul lanfului uistratuiui rrpror"lT, nlo?Lrur de fat[ sunt cel pufin doud proteine integrale candidate Ia imersare par,tial6 in bistratul"rtr#]i rnembranelor clrora le aparfin: citocromul D5 din membrana reticulului endoplasmic ai caveolina,la nivelul membranelor celulelor ce pot structura caveole ca formagunispecializate de membrand (de exemplu celule musculare netedi, celule endoteliale, atitudinii comunitdf,i stiinfifice in privinfa acestei riiuu6i, "nt"r*ii" "rci-schimuarea oupa ,uport*", dovezilor experimentale legate de aranjamentul ielor doud proteine in'membiun", dinamicii cunoagterii in biologia celulard qi al modulul rapio "rt un exemplu al in care conceptele pot evolua in acest
domeniu.

Revenind la proteinele transmembranare, acestora li se definesc trei domenii structurale: (i) un ectodomeniulporfiunea expus6 pe versantul extern al membran ei), (ii)un endodomeniu (poqtiunea expus[ pe versantul intem al membran ei) qi (iii) un domemniu transmembranar (po4iunea ce stribate bistratul lipidic). in ceea ce priveEte modul de organizare structura6 a ecto- qi endodomeniilor lan$rile proteice se pot impacheta in aceste zone atdtin po4iuni de ohelixuri-cdt 9i in p-pliuri, aga cum se intdmpli cu toate prot"in.t". situalia este oarecum diferit' penru domeniul transmembranar. Pentru acesta, pdna prin deceniul 9 al secolului XX, a existat rccepSunea ci nu poate fi structurat decdt sub formr de o-helix, astfel incdt sa poata ri mascate citre axul acestuia por.tiunile hidrofile ale lan-tului polipeptidic, iar Ia exteriorul ,eu ,e fie expuse par'tile hidrofobe, acomodabile cu hidrofobicitaiea 'oin prorun zimea bistratului lipidic. se justifica 5i in acest caz prin considerente de ordin structural gi termodinami". ir"" ,i*p ins6, au fost identificate proteine transmembranare care, la nivelul domeniului transmembranar prezintil ftpliuri orientate in contrasens care se organizeazd,asemenea doagelor unuiurroiui , fn acest fel fiocare doagr (B-pliu) expune cdtre zoiele hidrofobe ale bistratului suprafa{a hidrofob, gi ascunde c6tre interiorul butoiagului componentele hidrofile din structura lanfului polipeptidic. Asemenea proteine se intalnesc, de eximplu, in membrana mitocondriali externa formand porine'
care evolufia cunoagterii

Descifrarea structurii porinelor a reprezentat un alt exemplu de schimbare de atitutine pe

se afld in ectodomeniu) gi (ii) proteine p"f JI (c6nd caprrur amino se afli in endodomeniu). Toate aceste clasificrri ne sugereaz[ marea diversitate de proteine membranare, astfel incit este clar cd prezenfa proteineloiin structura membranelor respectr caracterul eterogen al stucturdrii lor, nuanfdndu-I. in acelaqi timp existenta ecto- gi endoproteinelor (firesc entit[ti moleculare diferite, rezultat al unor fenomene diferite de biosintezd gi asambl*") ;#$" asimetria structurali a organiztrii moleculare a membranelor. Mai mult, asimetria membranelor este accentuata 9i de prezenfa proteinelor transmembranare cu ectodomeniul diferit de endodomeniu, ca gi prin caracterul asimetric al organiz[rii ranprui polipeptidic crruia ii putem asocia caracteristici vectoriale (origine, directie, senr;, .t i*-au"r similitudinea nu trebuie
transmembranare de t

Proteinele trans.mempranare se pot clasifica gi "orunitalii pe baza alior criterii. Astfel, in funcfie de numrrul de treceri ale lantului polipeptidic prin planuim"*u.*i ele se impart in (i) unipas (o singure trecere) si (ii) multipaJ(mai multe treceii). Este lesne de in(eles ci proteinele structurate cap-pliuri la nivelul domeniului transmembranar (porinet") nu pot ri pozilta capitului amino al lanfuluipolipeptidic, proteinele transmembranare se clasificd in (l) proteine transmembranare de tipul (cdnd caprtul amino

realitilii biologice

a impus_o

gtiinfifice.

u;;^:ffi;.i;"

Dr. Mirreo ltobu

- Prot inrle *embra*rr, rurs orut u stlrdrnfrito mrdiciod

in(eleasl in sensul strict algebric. Originea unei proteine poate fi convenlional atribuit6 capdtului amino-terminal, direclia nu este deloc una rectilinie, iar sensul este dinspre capltul a-inoterminal spre capitul carboxi-terminal. Vom comenta ceva mai jos efectul qi impotan(a acestor aspecte, eterogenitate $i
asimetrie, asupra funclionalit[fii membranelor.

Exemple de proteine rnetnbranare


Primele gi cele mai detaliate informatii asupra proteinelor membranare au fost obfinute din studiul membranelor eritrocitare [5]. Motivalia este simpli gi se bazeazd pe urmitoarele
aspecte:

(eritrocitele reprezint6 popula$a celulari majoritar[ din sflnge); (ii) popula$a celular[ omogen[ este uEor de asigurat (celelalte tipuri celulare reprezinti o mas[ mic[, sunt mai ugoare, sedimentdnd deasupra eritrocitelor la centrifugare, sau chiar in cdmp gravitagional, iar eliminarea lor se poate face chiar cu pierderi de eritrocite, pentru siguranla lipsei impurificArii); (iii) membranele se obfin flri dificultate printr-un simplu goc hipoton urmat de centrifugare; membranele ob[inute (numite gi fantome eritrocitare) nu sunt impurificate cu endomembrane (membrane ale organitelor celulare), inexistente in acest caz.
Proteinele membranelor astfel purificate au fost rezolvate prin electroforezil in gel de poliacrilamidl in prezenfd de dodecilsulfat de sodiu (SDS-PAGE). Avanrajele acestui tip de electroforez[ constau in faptul cI detergentul (dodecilsulfatul de sodiu, numit gi laurilsulfit de sodiu) pe de o parte elibereazdtoate proteinele (at6t pe cele periferice, cdt gi pe cele integrale) din arhitectura membranei, solubilizdndu-le [6], iar pe de alti parte se adsoarbe unitar pe lanfurile polipeptidice, conferindu-le o densitate de sarcind negative unitari. in aceste condifii migrarea proteinelor se face numai in func{ie de greutatea lor moleculari.
Rezultatele unei asemenea aborddri pentru descrierea proteinelor membranei eritrocitare infh$gaz[ sub forma unui spectru de benzi proteice distribuite intre 20 gi 250 kDa, care inifial au primit denumiri sub formd de cifre (banda 1, banda 2, etc.), nuanfAndu-se cu, spre "r"rnplr, banda4.1, banda 4.2, acolo unde benzile apireau ca dublete. Ulterior, unele dintre proteine au primit denumiri specifice. in momentul de fati organizarea Ei funcf,onarea membranei erihocitare poate discutati pe baza informaliilor disponibile referitoare la proteinele ei. Comentariile asupra proteinelor membranei eritrocitare ne vor ajuta si in,telegem mai aprofundat organizarea acestor macromolecule in arhitectura biomembranelor, care este in strdns[ legaturl cu funclionalitatea lor. vom incepe cu o protein[, de fapt o glicoproteind, numiti glicoforind. prezenti din abunden(i in membrana eritrocitului, care migreazdatipic (se dispune electroforetic undeva pe la 90kDa, degi masa ei moleculard este de numai -30kDa). Exist[ mai multe izoformi de glicoforinl identificate pini in prezent: A, B, C, D gi E. Izoforma glicoforini A este cea mai bine cunoscuti protein[ a membranei eritrocitare, sub aspectul structurii biochimice. Are 131 aminoacizi, cunosc6ndu-i-se,integral secventa; este proteini transmembra'nari unipas, tip I (capatul amino in ectodomeniu)f ectodomeniul este maie qi poarti, din cdte gtim in momentul de faf.f, 16 lanfuri glucidice care practic dubleaz[ gabaritul acestei molecule (explicalie pentru migrarea electroforetici atipici, densitatea de sarcind negativ[ pe unitatea de masi este mai mici decdt ?n mod normal, detergentul SDS adsorbindu-se unitar numai pe lanful polipeptidic, nu qi pe structurile glucidice); endodomeniul este mic, purtAnd capltul carboxil al lantului polipeptiOic; domeniul transmembranar este structurat in s-helix qi contine 23 de aminoacizi, care sunt identifica$. Paradoxul este ci, degi structural glicoforina gi-a dezvlluit repede secretele, funcfia nu i se cunoaSte inci exact, degi izoforma glicoforind C are o func(ie structurall Ul Qezi mai jos la citoscheletul asociat membranei), iar izoforma glicoforinl A prin interactiunea cu proteina banda 3 mutanti ii poate restabili func$a [8]. Ciudefenia este cu atet mai mare cu c6t exista eritrocite
se

(i) materialul biologic este ugor de ob{inut in cantitate suficientl

fi

(Ena) din a cdror membranr glicoforina lipsegte, fafi ca funcfionalitatea s6 le fie afectat[. Populatiile cu asemenea defecte de exprimare a glicoforinei sunt in zonele cu iar exprimarea deficitari in glicoforinE A refrezinti un mecanism de malarie endemica, adaptare, parazitul Plamodiurn falciparum invaddnd eritrocitele gizdn p/rn tegarea la o structure gir.iai"e purtat[ de rceasti proteind transmembranard [9]. O situalie diametral opusl o reprezinti proteina banda 3, cunoscut[ qi ca AEl (de la nurnele in englezd, ,,A,nion Exchanger 1") [8], despre care informafia asupra detaliilor structurale a evoluat mai anevoios, dar a cirei funclie fost repede gi clar stabijit* care structureazi canalul anionic de schimb intre _a "rt" frot"ina bicarbonit (Hio:-) 9i clorurr (cl-). ilanda 3 este prokini hansmembranar[, are 911 aminoacizi in lanful polipeptidic ai o masj nroteculare
structurarea endodomeniului, asigurdnd interactiuni cu alte proteine membranare. Domeniul transmembranar, care sffuctuteazd canalul de schimb anionic, are 12-14 treceri in a-helix prin bistr*ul lipidic

-100kDa Partea N-terminald

proteinei laminoacizii' l-359)

intri in

de

(-50kDa din masa moleculari). La endodomeniul mare format in principal din capdtul Ntennilal se adaugE capltul C-terminal scurt (format din 33 aminoacLi; uriui toi,pr" citosol. A$adar endodomeniul con{ine -400 din aminoacizii care formeazi proteina, adic[ -40kDa gi poartii atflt cap[tul N-terminal (proteind transmembranara de tip II), c6t gi caprtul c-terminal. -t Ectodomeniul, mic, poartd o mici incrrcdturr glucidicd (se pari c[ doar lang cu o structuri extrem de eterogen[ I10]) qi reprezintd bucle dintre por,tiunile transmembran*r.'i" p"rtiunea Cterminall banda 3 leagl anhidraza carbonici.Il, important[ pentru func{ia transportorului prin furnizarea anionului bicarbonat tl11. Au fost identificate forme mutante pentru proteina banda 3 care induc o serie de patologii specifice eritorocitelor [8], iar glicoforina A pare a fi de ajutor aces'tor forme mutante in restabilirea funcflei de transport. Cea de-a treia proteind pe care o amintim esti spectrina, care,impreuni cu celelalte dou[ I*otiP mai sus, teprezintd'peste 60?o (procente de mas[) din proteinele membranei eritrocitare. Spectina este o proteind perifericd situat6 pe fa{a interni u *"ri-rbruo"i (aqadar o endoproteini) qi reprezinti componenta de bazd' a ceea ce numim citoschelet asociat 'sau membranei, simplu citoschelet membranar, ori citoscheletul membranei. Citoscheletul membranei este o re{ea de endoproteine cu ochiuri gi noduri, solidar6 membranei prin ataqarea la endodomeniul unor proteine transmembranare. Grosimea acestei ultrastructuri membranare este de 5-lOnm. Ciioscheletul membranei este solidar gi cu citoscheletul citosolic, refea de proteine organizatd sub formd de filamente sau microtubuli la nivelul citoplasmei (vezi acolo, in cursul de "Matrice citoplasmatici"), fiind responsabil de menginerea gi/sau modificarea formei celulelor, ca 6i de geometria membranei (de exemplu: forma biconcavr a eritrocitului, structurarea speciahlirilor-de membrand cum ar fi microvili, stereocili, cili, fl ageli). spuneam c[ spectrina este componenta de bazd, a citoscheletului asociat membranei. Ea este un heterodimer format dintr-o subunitate a (a-spectrind, 280kDa) gi o subuni tate p Sspectind, ?/l6tDa). Ambele subunitd$ sunt formate predominant din multipt" unia6 ,"petitive de 106 aminoacizi: 22pentu o-spectini qi-l7.pentru p-spectrini tl2l. cele doui subunitafl cu geornetrie fibrilari se risucesc u$or una in jurul atieia intr-o structur{. elicoidali, formand basionaqe flexibile cu lungimea de -l00nm. ddsucirea in fiecare bastonag av6nd la capete gruparea amino-terminali a "r* subunitef g.d; carboxiunei "on,ru-r"nr't""irp*"rJU, 9i terminali a celeilalte. Capitul conlindnd gruparea amino-terminala a subunitfl1ii o gi gruparea carboxi+erminalr a subunit[,tii B este numit-capul bastonagului, iar celilalt cap6t Lte coada acestuia' Bastonagele au capacitatea de a interac{iona cite dtui, cap la cap, formdnd tetrameri lungi de -200nm. Aceqti tetrameri formeazd laturile refelei iiembranar. capetele tetramerilor ce reprezintd cozile bastonaEelor de spectrinr au"itor.t "t"tolui capacitatea de a se asocia, de regulr cdte 5 sau 6, prin interacfiuni cu filamente scr.t" d" actina, formand nodurile refelei. Agadar actina este o altd proteinr ce participe la structurarea citoscheletului membranei, asigur6nd solidarizarea componentelor acestuia la nivelul ,oauritor.-in il;;;;;omerici actina este o proteini globulard cu masa de -43kD gi un diametru de -5nm. La nivelul

Dr. Mircea l*abu

Protein"le membranare. curc oentru studentiitn rnedicind

fodrin\.

transmembranar[) gi din mici filamente de actini care leagi cozile titramerilor de speitrinf la nivelul nodurilor re{elei, unde, prin intermedierea benzii 4.1, refeaua se atagazi suplimentar la endodomeniul benzii 3, sau al glicoforinei (o altd proteini transmembranar[). Interacliunile afine dintre elementele citoscheletului asociat membranei sunt intr-o dinamici permanenti, astfel inc6t aceast[ struchre nu este rigid[, ci intr-o continud modelare care si satisfacE nevoile celulei. Citoscheletul asociat membranei nu este doar o caracteristici a membranei eritrocitare. El se glsegte in toate celulele gi este structurat aseminitor, chiar daci unele dintre componente au fost denumite diferit (spre exemplu echivalenta spectrinei in celulele nervoase este numiti

laturile ochiurilor relelei, unde prin intermediul ankirinei se leagd de banda

Tot in noduri se localizeazd o alti proteind periferici, banda 4.1, cu masa de -g0kD gi conforma(ie globulard (diametrul -6nm). Banda 4.1 interacfioneazd, dinamic, pe de o parte cu spectrina gi actina in nodurile refelei citoscheletale gi, pe de alti parte, c-u endodomeniul glicoforinei C, contribuind la ata$area citoscheletului pe versantul intern al membranei tgl. Rezulti de aici un rol structural pentru o izoformi a paradoxalei glicoforine. Atagarea citoscheletului asociat la membranl este insi datorati in principal unei alte proteine globulare, ankirina (masa moleculard -2l0kD, diametrul -9nm). en]arina se leagi at6t la subunitatea B a spectrinei, la cea de-a 15 unitate repetitivd (in treimea dinspre cap a heterodimerului) cdt gi la endodomeniul benzii 3, asigurdnd ancorarea la membrana la nivilul lanrilor ochiurilor citoscheletului membranar. Pe scurt, citoscheletul membranei este format din tetrameri de spectrin[ ce organizeazd

asigura asocierea cozilor tetramerilor de spectrind in nodurilor re,telei.

citoscheletului membranar formeazilfragmente mici, filamentare de 8-12 monomeri cu rolul de a

tlll

(proteinl

Din cele discutate p6n[ aici reztiltd ci proteinele contribuie la caracteristicile structurale conferite de bistratul lipidic membranelor, nuanl6ndu-le. Astfel proteinele sporesc eterogenitatea compoziSei membranelor ca gi asimetria structurali a acesteia.
Totu$i, in ciuda complexitlfii interacfiunilor pe care proteinele membranare le stabilesc intre ele, cu lipidele membranare, sau (dupd cum vefi ionstata in numeroase ocazii in parcurgerea cursurilor de biologie celulari) cu structuri intracelulare, ori din afara celulelor, ele
sunt mobile, migcflndu-se in planul membranei.

Mobilitatea proteinelor membranare consti

translafie. Migcarea de rotafie a proteinelor membranare in jurul propriei axe, denumitit li difuzie rotu$onald, este de cel pufin 1000 de ori mai lenti decdf a fipidel,or. Este lesne de inteles acest lucru gflndindu-ne la diferenfele de gabarit intre lipide qi proteine. Migcarea de translatie, denumitd gi difuzie laterald, este pi ea mult mai lent6 decat a lipideloa fiind in medie de lpm/s. l,entoarea difuziei laterale a proteinelor nu trebuie infeleasl numai prin diferenfele de m[rime intre acestea gi lipide, dar gi prin interacfiunile pe care proteinele le stabilesc in mod dinamic intre ele, sau iu alte structuri diniuntrul sau dinafara celulei. Astfel aceiagi proteini, in aceleagi condirii de fluiditate a bistratului lipidic, se poate migca mai repede sau mai incet in funclie de situa$rei funcfionali de moment (interaclioneqz6 sau nutu alte componente membranare, celulare, sau extracelulare). Pe de altd parte, migrarea laterali a proteinelor membranare poate limitati, din considerente impuse de nevoile funcfionale ale celulelor, numai la anumite domenii ale membranei. De celulele polarizate ale epiteliilor unistratificate igi creazd iqi pistreazi o compozifie proteite "*".pfr, 9i diferiti la nivelul membranei apicale, fa{i de cea de la nivelul membranei latero-bazale; asta deoarece cele doui domenii diferite ale membranei celulare au funcli diferite (vezi gi la rolul joncfiunilor

in

miscdri de rotayie gi miscdri

de

fi

membranare).

Dovezile experimentale asupra translaliei laterale a proteinelor in planul membranei au venit din observa$i colaterale, nu neapirat din experimente imaginate gi cinduse special pentru

aceasta.

Prime dovezi au fost aduse in 1970, cdnd se urmirea obtinerea de celule hibride intre om gi goarece (aqa-numifii heterocarioni). Pentru a se monitoriia fuziunea."rri"r"r-ij obfnerea heterocarionilor, cele doui tipuri de celule au fost marcate cu anticorpi specifici, ce purtau fluorescenfe de culori diferite. in celula hibride s-a observat.[ fluor"r""rt"i"i"itirr localizate separat' s-au amestecat dupd 40 de minute, distribuindu-se uniform i; membrana heterocarionului. Aceastd observa,tie a fost explicati prin proteinelor membranare de a difuza in planul membranelor clrora le apar,tin. "upu.irut"u Alte dovezi au venit din observafiiG asupra fenomenelor de',patching I capping,,pe care le-am putea denumi in romaneqte pdraie (macilare) I calotare.In ce constau aceste observatii. Limfocitele a cdror suprafafd era marcatd inifial uniforn cu anticorpi pori"ronJi n;;;fii: prezentau in timp aglomer[ri in pete a fluorescenfei, iar in cele oin urma il";."*dse aduna in inftgime polar, sub forma unei tichii (calote sgl.g) Explicafia acestei realit[{i experimentale nu putea fi datd decdt acceptand c[ proteinele, distribuite inilial uniform l, pili;"mbranei, pot difuza lateral liber, iar ambivalen{a gi caracterul policlonat al anticorpilor totosili, prin legiri incricigate, contribuiau Ia unirea partenerilor de reac{ie in complex" din c" in ce'mai mari, sf6rqind prin formarea unui complex singular. - tl tr9ilea tip de experimente, de aceastd dati destinare studiului difuziei laterale a moleculelor individuale de rodopsind (cromoproteind cu fluorescenfi intrinseci) din membranele discurilor celulelor cu bastonage din retini, sunt cele care studiazi refacerea fluorescenfei dupd foto-stingere denumit[ prescurtat FRAP (de la ,,Fluorescence Recovery Afier Phonbleachizg"). Aceste experimente au permis gi estimarea coeficien,tilor de difuzie, aEadar aprecierea cantitative a migcirii proteinelor membranare. Ele se pot realiza gi pentru proteine care nu sunt fluorescente de.la sine, dupl ce acestea au fost marcate cu fluoio&omi. pe scurt, aceste experimente constau in stingerea fluorescenfei unei zone micronice din membrani, prin actiunea unui fascicul de lumind intens qi puternic iocalizat(de obicei raz6laser) qi in ,r-ariru refacerii fluorescenlei in acea zoni datorit[ difuziei moleculLlor fluorescente din ceielatte zone, neafectate (nestinse) ale membranei. tn acest fel se pot misura coeficienli de difuzie pentru proteine din orice tip de celul6.

Rolul p rote in e lo r rn e mb ranar e Ca qi in cazul lipidelor membranare, proteinele au at6t rol structural, c6t gi rol metabolic.
CASETi. Inreenzele oi

roL

Acegti heterodimeri diferi{i au specificitdfi diverse, atdt sub de interacfiune din matricea extracelulard pe. care il leagr, cat gi sub aspectui ^p""trip*r"*rului aceqtia. Alrfel rnriialr,rii.fd de spus, chiar dac[ specificitatea.integrinelorett" u, porrretru degenerat (mai multe proteine de matrice pot lega de aceeaEi integrin[ gi mai muite integrine se [ot tega u.""ugi protein6 de matrice), afinitatea acestor interacliuni este diferitd. Daci rolul structuraial integrinelor este relativ bine caracterizat, rolul metabolic al lor (procesele de semnalizare pe care le Jeclangaza; o"purt" a" a fi cu claritate elucidat, degi nu este contestat de nimeni "*t" in comunitatea gtiin1ifictr. Integrinele sunt implicate in controlul unor procese celulare ca diferentie."u, celulara programat6, motilitatea' Toate aceste procese sunt importante atdt orguril*u normalr a fesuturilor gi organelor, cat 9i in patologii dintre cele mai diverse. in u""rt]" urp""t" de biologie normald sau patologie celularr, integrinele coopereazd cel pu$n cu receptorii ru iu"torl de cregtere. crile de semnalizare ce sunt inifiate de integrine se intersecteazi cu cele iniliate de receptorii Ia factori de cre$tere, nuanlind intr-o plaji- largi capacitdfile celulelor de a raspunde factorilor externi gi asigurdnd o multitudine de posibilitili de adaptare.

fizicol chimice ale structurilor macromoleculare din mediul Existr, identificate in momentul de fa15, 18 subunitifi o gi 8 subunitrti "*t*""iu"lur. B, care, prin diverse combina{ii, structureazx (dupd informaliile de care dispunem in acest mement) 24 de tipuri distincte de integrine.

**r9:r:ryP,!!:"ur: subunitate.- o' sau B - fiinJ proieine unipas de tipur r), cu ror in aderarea celulelor la matricea extracelulari gi in transmit..", d" informaliitegate oe caracteristicile

t,

*o*t*

Dr. Mircea Leabu

- Proteinele

membranare. curs pentru studenliitn medicind

O buni exemplificare asupra rolului structural al proteinelor membranare il constutuie comentariul aferent citoscheletului asociat membranei (vezi mai sus). Se poate adeuga rolul unor proteine Eansmembranare numite caderine gi integrine (vezi Caseta) in stabilirea joncfiunilor dintre celule, la nivelul {esuturilor, cat $i dintre acestea gi matricea extracelular[ (proteine gi/sau glicoproteine ce structureazi diverse componente tisulare intre celule). Rolul acestora este de a menfine celulele intr-o ordonare coerenti in structurarea fesuturilor, dar gi de a permite acestora si schimbe informafii pentru o integrare eficientd. Asta inseamni ci nu se poate face o delimitare

infre cele dou[ tipuri de funcfii (lucru valabil qi pentru lipide dealtfel). Acelea$i entiteti
moleculare pot avea atdt rol structural cdt gi metabolic (vezi mai sus, ca exemplu, proteina banda 3 din membrana eritrocitarl). Aga stau lucrurile gi pentru integrine, care au atAt un important rol structural (ataqarea celulelor la substrat), cit qi rol in culegerea de informaSi legate de ambianfa

care celulele se g[sesc qi de a declanEa procese celulare menite si rispund[ specific la condifiile de mediu. Detalii asupra rolurilor metabolice ale proteinelor membranare veli afla la cursurile de transport membranar gi semnalizare celulari. Aici vom aminti, doar in linii generale, ci rolurile mekbolice ale proteinelor membranare se manifesti in ceea ce privegte schimburile de informa{ii gi substanf[ dintre celule, sau dintre acestea gi mediu. Astfel proteinele membranare pot fi receptori (penm hormoni, factori de cregtere, citokine, chemokine), transportori prin membrand (canale ionice, pompe ionice, conexoni), saa transportori cu membrand (clatrind, caveolinl: proteine ce structureazd inveliquri ale unor microdomenii din membrani pentru a permite invaginarea acestora gi detaqarea sub formi de vezicule pentru a realiza precese denumite endocitozi; alte proteine asigurd fuzionarea unor vezicule cu membrana celular[, facilitdnd fenomenul de secrefie prin exocitozd', vezi amlnunte la transportul membranar).

in

Proteinele membranare mai pot funcliona ca enzime (metaloproteinaze pentru componente de matrice extracelulari, fosfolipaze, kinaze, fosfataze), ca proteine implicate in semnalizare (proteine platforml, sau scheli, proteine G). Detalii asupra micanismeloiprin care aceste proteine membranare iSi rcalizeaz6 funcfiile vef, gisi qi trebuie folosite in discutia despre aceasti^componenti moleculard a membranei pe parcursul tuturor prelegerilor despre celuli. In toate aceste func(ii asimetria structurdrii membranei este deosebit de importante. Astfel, receptorii, dar gi proteinele de adeziune (aderinele qi integrinele) prin asimetria lor structural[ permit interacfiunea prin ectodomenii cu liganzii specifici, iar prin endodomenii asigurd transmiterea informa,tiei cltre interiorul celulei qi declangarea unor procese celulare care se constituie in rdspuns celular la semnalizirile receptate. De remarcat cd in transducfia semnalelor (la receptori, sau integrine) un rol important revine domeniului transmembranar, care, prin capacitatea de a suferi rearanjiri conformagionale, asigurd transmiterea informa$ei purtate de ligand qi transmise, dinafara celulei in citoplasmd, prin interactiunea cu receptorul. Informa{ia, ajunsi la nivelul endodomeniului receptorului, este preluatd, prelucratd gi, de regull, amplificatl de participanfii la diversele procese de semnalizare. De men$onat aici cI efectele asupra conformaliei domeniilor transmembranare sunt dependente gi de aspectele legate de
parametrul fluiditate a membranei. In rezumat, proteinelc membranare sporesc eterogenitatea qi asimetria compozi{ionald ale membranelor gi moduleazi proprieti{ile fluide ale acestora, adici accentueazl, gi modeleazl caracteristicile induse de bistratul lipidic. Altfel spus, proteinele membranare coopereazd cu lipidele at0t in structurarea membranei cAt gi in perfectarea funclionaliti{ii acesteia, prin rolul lor metabolic, cel care asiguri integrarea celulei cu mediul. in exercitarea roluriloi metabolice proteinele membranare pot antrena at6t lipidele membranare, cdt qi componente citosolice, sau extracelulare.

Refemnp

1.

2.

Steck TL. ( 1974) The organization of proteins in the human red blood cell membrane . A review. J Cell Biol.62: l-19. Schultz AM, Henderson LE, Oroszlan S. (1988) Fatty acilation of proteins. Annu Rev Cell Biol.4:6ll-74.

3. 4. 5. 6. 7.

Rodriguez-Boulan E, Powell SK. (1992) Polarity of epithelial and neuronal cells. Annu Rev Cell Biol. g:

395427.

Takakuwa Z (2001) Regulation of red cell membrane protein interactions: implications for red cell function. Curr Opin Hematol. E: 80-84. 8. williamson RC, Toye AM. (2008) Glycophorin A: band 3 aid. Blood cells Mol Dis.4l:35-43. 9. Orlandi PA, Klotz FW, Haynes ID. (1992) A malaria invasion receptor, the l75-kilodalton erythrocyte binding antigen of Plasmodium^falcip_arum recognizes the terminal H"uia"1apnu2-3)Galseqriences of glycophorin A..I Cell Biol.116: 901-909. Drickamer LK. (197s) orientation of the band 3 polypeptide from human erythrocyte membranes. Identification of NH2-terminal sequence and site of iarUonyarate attachment. J Biol Chem. 253: 7?127248. 11. Vince Jw' Reithmeier RA. (1998) Carbonic anhydrase II binds to the carboxyl terminus

Spiro RG. (2002) Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. G ly c ob io to gy. 1.2: 43R-5 6R. Marchesi VT, Furthmazr H, Tomita M. (1976) The red cell membrane . Annu Rev Biochem.45:667-gg. Helenius A, Simons K. ( I 975) Solubilization of membranes by detergents. Biochim Biophys Acta. 415: 2979.

t2.

of human band 3, the erythrocyte CI-/HCO3- exchanger. J Biol Chem. Zil3: 2g430_2g437. Kennedy SP, Warren SL, Forget BG, Morrow JS. (1991) Ankyrin binds to the l5th repetitive unit of erythroid and nonerythroid beta-specrrin. J Ceil Biol. llst 267-Z7i .

CoMP0NENTA GLUCIDTcA

a.

MEMBRANEI

bidimensio-nal.

in afarn de fipide 9i proteine, in structurarea membranelor se intalnesc glucide. in ceea ce urmeaz[ vom folosi termenul de componenti glucidici a membranelor ai gi nu de glucide membranare, pentru- a !, ptin exprimare, mai aproape de realitatea biologici. Motivafia acestei pleferinfe este datd de faptul c[, in membranele celulare (ca gi in endomern'brane) glucidele nu se grsesc ca entitifi individuale, ci sunt grefate pe un purtrtoi lipidic sau prote(?a structuri in principal oligozaharidice, dar qi polizaharioice. gte sunt dispuse intotdeauna pL iupextern[ a membranelor celulare, formind ceea ce denumim glicocalix. tnci de tu in."plt, in baza afirmafiei anterioare $i^rememordnd faptul ci pe fa{a in-ternd a membranelor se afli citoscheletul putem putcta-faPt{ ca prezen,ta acestor dour structuri sporegte asimetria membranelor. 3to"i3', In cele ce urmeazi, abord6nd aspecte generale referitoare la prezenfa, glucidelor in organizarea membranelor, vom addnci argumentarea nu numai pentru caracterul asimetric al structuririi acestora, dar gi pentru eterogenitatea lor, respectiv pentru comportamentul fluid manifestat

D efini{ia

organizlrii acestei structurale a membranelor qi a rolului ei. "ompon"rt" In structura glicocalixului nu. participl toate monozaharidele existente in naturd. Numai Sapte intri in alcituirea lan.turilor oligozaharidice ale glicolipideior gi glicoproteinelor.
in{elegerea

ta lsprl celulele epiteliilor unistratificate intre polul apical qi cel latero -bazal). Sunt insa raportari de grosimi ale glicocalixului ce pot ajunge pand ia 20{i qi chiar 2000n* f if. ii care o aplicrm in in{elegerea grosimii glicocalixului este cd atesta are grosime o cu at6t mai mare, cu c6t celulele sunt mai putin implicate in interacliuni cu alte celule, sau cu substrate din matricea exhacelulari' Aplicdnd aceast[ reguld vom intui cd glicocalixul cel mai gros il preziitecelulele sanguine' Pe de alti garte,_ll celulele epiteliilor moiostratificate, polul apical are un glicocalix mai abundent, fa[[ de polul latero-bazal. La celulele epiteliilor in monostrat definim dou6 domenii membranarel: domeniul apical, situat la polui celulelor orientat cdtre cavita$le pe -situat care aceste epitelii le crptugesc (pol apical), respectiv domeniul latero-bazai, catre spafile dintre membranele a dour celule invecinate ale epiteliului gi crtre membrana baz,ali, element al matricei extracelulare prin care.aceste_ epitelii se atasazd de structurile tisulare (pol latero-bazal)' Mai mult, acolo unde mediul din cavitatea .iptugite de celulele epiteliale monostratificate este puternic agresiv (de exemplu in stomac, ruu in intestin) gticocatixut este ingroqat de secre.tii glicoproteice de tip muc]nic (vezi mai-los prin ." 'rJteizeazd, gJicbproteinele de tip mucinic, numite *uir"urt mucine, din mucusul diferitelor structurir In cele ce urmeaz[ vom discuta aspectele cu caracter general legate de otganizarca glicocalixului, intrucat complexitatea gi diveisitatea structurale a tanluritor iigozatrariaice de la nivelul acestui invelig glucidic al celulelor face abordarea detaliilor ineRciente"qiiJlurrin"* in raport cu scopul nostru: cunoa;terea organizdrii membranei la nivel molecular, pentru a ln{elege funcfionarea ei ca un- sistem integrat. Aceastr modalitate de tratare nu va afecta cu nimic

structurile oligozaharidice), sau pe proteine (ictoproteine, respectiv ectodomeniile proteinelor transmembranare). Din punct de vedere al structurii biochimice globale, trei sunt componentele membranare ce participi la structurarea glicocalixului prin pe4iie glucidice din structura tor: glicolipiaeh, glicoproteinele qi proteoglicanii. Toate ceie t de componente sunt denumite generic "i "ut"g;rii 20 gi glicoconjugate. Grosimea glicocalixului este, in medi-e, intre 50nm, variind de la un tip de celuli la altul, dar gi pentru aceeagi celuld de la un domeniu..,ribr** la altul exemptu

gli c o c alixulu i Glicocalixul reprezinti inveligul glucidic al celulelor, constituit din structuri oligozaharidice, sau polizaharidice inserate pe lipide ale foigei exteme a bistratului (doar

'.fiilr"

"**

Acestea

membran6.

I Atragem atenfia a nu se face confuzie intre nofiunea de domeniu membranar gi cea de microdomeniu de

Dr. Mircea l*abu

Componenta elucidicd a membranei celulare. curs oentru stulentii tn medicind

o anumiti semnificalie: glucoza (Glc), galactoza (Gal), manoza (Man), fucoza (Fuc), N-acetil-glucozamina (GlcNAc), N-acetil-galactozamina (GaWAc) qi acizii sialici (SA). Spunemacizi sialici (laplural) qi nu folosim singularul deoarece nereferim la o clasE de glucide ce deriv[ din structura debazd, a acidului neuraminic, un glucid cu 9 atomi de carbon in molecul[, cel din pozifia 1 afldndu-se intr-o grupare carboxil (de unde qi numele de acid). De la acidul neuraminic deriv[ primii reprezentanti a doufl serii: acidul N-acetilneuraminic (NANA), cel mai rispdndit qi acidul N-glicolil-neuraminic. Dar diversitatea acizilor sialici nu se opre$te aici, deoarece reprezentanfii debazd, pot fi O-acetila{i la hidroxilii de la carbonii 4,7,8 gi/sau 9. Jinf;nd cont c[ pot fi mono-, di-, sau chiar tri-acetilafl ne facem o idee mai exacti asupra diversitdlii entit[filor moleculare incluse sub numele de clasl acizi sialici. Aceastd diversitate enormi de tipuri de acizi sialici se constituie, iatil, ca o primi argumentare a eterogeniti$i structurilor glucidice ale glicocalixului. in afari de aceste gapte monozaharide, in proteoglicani intdlnim gi xiloza (monozaharidul prin care se poate lega structura glucidici de o serini din partea proteicd), ca gi acizi uronici (acid glucuronic Ai acid iduronic). Dintre monozaharidele men{ionate numai Fuc este din seria L, toate celelalte apar,tindnd seriei D. Prin enumerarea monozaharidelor ce participl la structurarea lanfurilor oligo- sau polizaharidice ce organizeazl glicocalixul ne accentudm ideea de eterogenitate structurali a acestuia. Dar lucrurile nu se opresc doar la acest nivel. Pentru substan,tierea caracterului eterogen al structurlrii membranelor (indus de lipide, amplificat de proteine gi de structurile glucidice) trebuie si subliniem ci ingiruirea glucidelor in lanfurile oligozaharidice nu este aceeagi, diferind intre glicolipide 9i glicoproteine, diferind intre divesele glico-lipide, diferind intre diversele glicoproteine. Mai mult legarea monozaharidelor intre ele se poate face in mai multe moduri, inruc6t existi mai multe gruplri hidroxil disponibile. E drept cd nu toate din aceste posibilitafi sunt utilizate de celule. Diversitatea de posibilitd{i teoretice este limitatd de tipurile de glicoziltransferaze pe care o anumitii celull le are in reticulul endoplasmic ai in ibmplexul Golgi, organitele unde structurile glucidice din glicolipide, glicoproteine, sau proteoglicani sunt biosin-tetizate. Glicoziltransferazele sunt enzime cu stereospecificitate foarte ridicati, astfel incdt legarea pas cu pas a glucidelor unul de altul in structurile oligozaharidice, din glicolipide gi glicoproteine, nu este intdmplltoare. intre glicolipide, glicoproteine gi proteoglicani existl insemnate diferenfe structurale la nivelul componentei glucidice. Glicolipidele, care constituie lATo dintu.e lipidele membranare, con{in un singur Ianf oligozaharidic, de reguld neramificat. Lanfurile glucidice din glicolipide con$n, in general, mai pufine monozaharide (rar peste 13-15). Pentru a avea o imagine corecti a organizErii spatiale a lan{urilor, vom menfiona ci acestea nu au traiect liniar ci sunt "contorsionate", tocmai datorite orient[rii gruplrilor hidroxil utilizate la lungirea oligomerului glucidic (rezultat al stereospecificitafii glicoziltransferazelor). Glicoproteinele confin uzual mai multe lanquri oligozaharidice grefate pe lanful polipeptidic. Inserarea se poate face la azotul amidic al unei asparagine aflate intotdeaunaiutio secvenf6 consens (vezi la "Reticulul endoplasmic"), sau la hidroxilul dintr-o serini, ori dintr-o treoninl. In primul caz structurile glucidice se numesc N-glicozidice, in cel de-al doilea O-glicozidice. Structurile O-glicozidice (legate la serini sau treonin[) sunt abundente in glicoproteinele de tip mucinic. De aceea aceste tipuri de oligozaharide din proteine sunt denumite gi structuri mucinice. Structurile N-glicozidice con,tin Man, cele O-glicozidice nu. Lan{urile oligozaharidice ale glicoproteinelor sunt ramificate. Ramificarea se face dupi principiul dihotomic (adicfl din fiecare punct de ramificare pleaci numai dou[ ramuri). De regulfl, din cdte se cunoa$te pdni in prezent, existd unul sau doud puncte de ramificare, astfel incdt fiecare structuri oligozaharidicd din glicoproteine poate fi biantenari sau triantenar[. Structurile oligozaharidice ale glicoproteinelor conlin un numlr semnificativ mai mare de monozaharide, in comparafle cu cele ale glicolipidelor.
sunt, intr-o ordine lipsitd de

Dn Mircea l*abu

Comoonenta elucidied. a ,nembranei celulare. curs oentra stadentiitn medicind

Privind succesiunea monozaharidelor in lan,turile oligozaharidice din glicolipide gi glicoproteine, se pot face urmitoarele afirmalii cu caracter de reguli: (i) glucoza, atunci cand se afli, nu se glsegte niciodati in pozi(ie terminald a lanfului; (ii) acizii sialici, atunci cdnd se afl[ (gi de regull se afli), se glsesc intotdeauna in pozitia terminali a lanfului. Regula nu este incllcat[ nici atunci cdnd o moleculd de acid sialic se afli subterminal. Aceasta inseamn[ c6 lanfurile se pot termina cu acizi sialici legafi unul de altul. Un aspect cu semnifica{ie biologic6 (vezi mai jos la ,,Rolul glicocalixului") ce trebuie punctat aici este faptul cd, de regul6 structurile glucidice din glicolipide qi glicoproteine se termini cu elemente purtdtoare de sarcinE negativ6.
Degi proteoglicanii sunt mai slab reprezentali la nivelul membranelor celulare, ceea ce a determinat gi eviden{ierea mai tdrzie a prezenqei lor in glicocalix, contribufia acestora la structurarea glicocalixului nu poate fi neglijatd, din cel pu{in doui motive. in primul rdnd inclrcltura lor glucidic[ dep[gegte cu mult componenta proteic6 (90-95Vo de masd glucide, 5l0% maxim proteini in structura proteoglicanilor) gi, in al doilea r0nd, structurile glucidice sunt cele mai lungi dintre toate cele intdlnite la nivelul glicocalixului. Lan{urile polizaharidice ale

proteoglicanilor poartd denumirea de glicozaminoglicani. Glicozaminoglicanii sunt structuri polizaharidice neramificate, formate din unitifi dizaharidice repetitive alcituite dintr-un zahar, sau aminozahar gi un acid uronic (acid glucuronic sau iduronic). Exceplia de la aceastd descriere de principiu a compoziliei moleculare o prezinti keratan-sulfa{ii in care unitllile dizaharidice repetitive conlin Gal (un zahar) gi GlcNAc (derivat de aminozahar). De subliniat gi in acest context, puternica incircituri negativd a proteoglicanilor provenitd at0t de la acizii uronici confinu{i cdt gi de la sulfatdrile pe care le pot conline zaharurile sau amino zaharurile prezente in moleculele glicozaminoglicanilor. Aceastd puternicd inclrclturl negativi se r[sfringe asupra
caracteristicilor fi zice ale s uprafe(ei celu lare.

Metodologia de studia a glicocalixului


Prezen(a glicocalixului la suprafafa celulelor a fost evidenfiat[ la microscopul electronic prin metode de citochimie ultrastructurall at6t nespecifice (adic5 metode care evidenflazi sEuctura, fbri a aduce indicii referitoare la compozifia lui biochimicd), cAt gi specifice (metode
care permit descrierea, cel pulin par1ial6, a biochimiei structurii).

Ca exemplu de metodi nespecificl amintim folosirea rogului de ruteniu. Acest compus interaclioneazi cu sarcinile negative de la nivelul glicocalixului impregndndu-i grosimea cu nucleii grei ai ruteniului qi conferind structurii electrono-opacitate. Putem caracteriza prin aceasti metod[ glicocalixul sub aspectul grosimii sale gi a densiti{ii lanfurilor glucidice care il formeazi. Ca metodd specifici prezentem citochimia ultrastructurall cu lectine 12,31. Lectinele sunt proteine, sau glicoproteine ce leagi specific structuri glucidice, au cel puf,n dou[ situri de legare identice gi nu sunt de origine imunl (adici nu sunt anticorpi impotriva unor epitopi ce confin glucide). Lectinele mai sunt cunoscute gi sub denumirea de aglutinine deoa.ece, mulgrmit[ capacitirii lor de a interacfiona cu structurile glucidice, cit gi datorit[ faptului c6 prezintfl cel pulin doud situri identice de legare, pot aglutina celulele sanguine. Irctinefu au fost ini(ial identificate gi extrase din plante; ulterior activirlfi de tip-lectinic iu fost eviden{iate gi in organismele animale, fiind implicate intr-o multitudine de procese celulare (vezi cdteva exemplifi clri, mai j os, la "Rolul glicocalix-ului"). In citochima ultrastructural[ lectinele pot fi folosite sub formd nativl, sau cuplate cu trasori electrono-opaci (feritinl, peroxidazX de hrean, hempeptizi, aur coloidal). Folosirea in fromi nativi a lectinelor implici utilizarea unor metode in doi paEi, numite metode in sandwich. La primul pas, suprafala celulelor este incubati cu lectina aflatd in exces in solu,tia folositi. Excesul este apoi indepirtat, iar lectinele rlmase, atagate specific de componente glucidice ale membranei (prin unul din siturile de legare), sunt vizualizate prin legarea de glicoproteine corespunzdtoane cuplate cu trasori electrono-opaci. Tehnicile in doi pagi pentru citochimia ultrastrcuturali cu lectine exploateaz[ existenla celor doul situri de legareale uneltei de investigare. Glicoproteinele marcate cu trasorul electrono-opac se fixeazi pe siturile de

Dr. Mircea l*abu

Comoonenta eluci.dicd. a membranei celulare. curs oentru studenliiin medicind

interacsune ale lectinelor rimase disponibile dupd legarea cu unul din situri la componentele glicocalixului. Avantajul acestor metode este ce lectinele sunt folosite cu capacitd{ile de legare (afrnitatea gi specificitatea) nealterate. Afinitatea gi specificitatea acestor unelte de studiu pot fi afectate in cazul folosirii unor conjugate lectin[-trasor electrono-opac, datoriti reacliilor chimice petrecute in timpul cupldrii, sau posibilelor impiedicdri sterice care pot aplrea in conjugat. A fost folositi o mare gaml de lectine pentru caracteizarea par.tialn a gficocalixului diverselor tipuri de celule. Amintesc aici pe cele mai des utilizate, cu glucidul determinant al specificitiiSi lor. Concanavalina A (ConA), o lectinl din Concanavalia ensiformis, care leagl o-Man din miezul trimanozidic al structurilor N-glicozidice, sau o-Glc aflatd in pozilie terminala. Rezulti ci la nivelul glicocalixului ConA nu se leagi de Glc aceasta nefiind situati in pozilie terminal6. Irctina I din Ulex europaeus (tlEA I), care recunoagte o-Fuc aflat[ in pozifie terminali a lantului oligozaharidic. l.ectina din Dolichos biflorus (DBA) interacfioneazd cu structuri ce conqin a-GalNAc legati de o alt[ GaWAc. O ahn lectin[ ce leagl o-GaWAc, insi inseratl pe o Gal este cea din Helix pomatia
G{PA). Pentru p-Gal sunt folosite lectina din arahide (PNA) gilsau lectina I din Ricinus communis (RCA D. SpecificitElile celor dou[ lectine sunt insl diferite. PNA se leag[ exclusiv de Gal aflata in pozilie terminald, in timp ce RCA I poate recunoafte gi Gal aflat[ in pozifie subterminal6, daci acidul sialic terminal este inserat la hidroxilul de la carbonul Ease al acesteia. Mai mult ambianla in care galactoza terminalS se aflI in cadrul secvenfei glucidice este diferiti. Agadar specificitn{ile celor doui lectine sunt nuantate. Au fost folosite doui lectine gi pentru evidenfierea citochimic6 a acizilor sialici. Acestea

sunt lectina

din germeni de grdu (WGA) qi lectina din Limulus polyphemus (LPA). Prima

recunoa$te acidul N-acetil-neuraminic-4-O-acetilat, dar gi B-GlcNAc. Cea de a doua se leagi de acizi sialici atdt din categoria celor N-acetilaf;, c0t gi din categoria celor N-glicolilafi. Nuanfirile din specificitilile acestor lectine sunt bine cunoscute sub aspectul secvenfelor

glicocalixului, dar qi in ceea ce privegte caracterizarea pa(iald a structurilor oligozahariai"", u secven{elor acestora. Cu c0t spectrul lectinelor folosite este mai larg, cu at6t imaginea asupra glicocalixului este mai detaliat[. tn plus combinarea acestor metode cu folosirea **J-, ,uu endoglicozidazelor, pentru degradarea specifici secven{iali, sau globall a lan{urilor glucidice, completeazl fericit caracterizarea citochimic[ a glicocalixului. Trebuie ins[ menfionat cI informa{iile complete asupra structurilor glucidice ale glicocalixului le aduc tot metodele biochimice prin care putem segrega intrJ glicolipide, glicoproteine gi proteoglicani, putem izola gi caracteiza entitetile moleculare. Speranla inieea ce priveqte rezolvarea problemei caracterizdrii glicocalixului Ei in general a biologiei glucidelor celulare o reprezintl biologia moleculari prin capacitatea de a identifica gi modela bagajul enzimatic celular implicat. Pentru a integra informaSile structurale prezentate mai sus, cu scopul de a intelege organizarea spafialn a glicocalixului putem rezuma ci acest invelip celular trebuie perceput ca o lizietd', ca un llstirig din ce in ce mai des pe misurd ce pitrundem de la exteriorul structurii cltre bishatul lipidic. El se carcatenzeazd,prin eterogenitate compozi-tional[ gi de organizare, sporind asimetria membranelor, deoarece este prezent numai pe versantul extern. Aceasta organizare a sugerat gi primele idei asupra funcSilor glicocalixului.

in care trebuie si se afle glucidul determinant al specificitn{ii. Utilizarea lor aduce astfel informafli nu numai asupra prezenfei qi abunden,tei tipurilor de glucide din compozifia

Rolul glicocalixulai
Prin asemlnare cu rolul protector al partii glucidice din glicoproteine impotriva acfiunii proteazeloq se poate afirma ci glicocalixul protejaze structura membranei celulare impotriva agresiunilor fizico-(bio)chimice. Lucrul acesta nu este departe de realita-tea biologicl. Modul in

de recunoagtere.

care el este structurat, conferi membranei rezistenld mecanici, con-trol6nd accesul citre strtaturile profunde ale sale, deci citre bistratul lipidic pi citre componentele proteice ale acesteia. Rolul acesta este cu atit mai important cu c0t accesibilitatea factorilor ugr"Jiri aste mai mare. Aceasta este o motivatie pentru care celulele sanguine, sau polii apidti ai celulelor epiteliale dispuse in.monostrat au glicocalixul abundent. Mai mult, in *u,rrit" situafii in care agresiunile pot fi mai accentuate, membranele sunt protejate de secrelii glicoproteice abundente (de exemplu in mucoasele gastrice gi intestinale). Dar glicocalixul nu este, nici pe departe, important numai penffu acest aspect. Prin componentele acide din structura lor (acizii sialici, acizii uronici, grup6rile sulfat), oligo-/poli-zaharidice ale glicocalixului participl Ia sarcina negativ6'a suprafefei lTSt" celulare. lnclrcltura negatiYd a suprafefei celulare, o caracteristicl general valabili tuturor celulelor, face ca interacliunile dinte acestea si nu se poatd rcaliza decdt sub control celular, in zone (microdomenii) ale membranelor inalt specializite in realizarea acestei functii. t" ;;rt, zone se formeazd ceea ce numim joncliuni celulare (vezi acolo), structuri specializate ale membranelor cu organizlri gi funclii diverse. Stabilirea jonc,tiunilor celulari are la bazd, fenomene de recunoaptere celulari in gare sunt implicut" ji componente glucidice ale membranelor. Participarea structurilor glucidice (de regul[ prin glucidul ierminal) ii fenomenele de recunoagtere celularl reprezinti o explicalie pentru in pozifie "*" glu.ora nu se ga;"$" structurile terminali; glucoza este glucidul aflat liber in umorile organismelor gi ar glucidice ale glicocalixului in interac(iunile pe care ar trebui s[ le stabileasc[ "ornpJti6ona procese fn diferitete Agadar, componentele structurale

ale structurilor glucidice ale suprafefei celulare. De exemplu,-eritrocitele de mamifer dupr desialilare a structurilor din glicocalix sunt eliminate din circulafie la nivelul ficatului gi splinei t+i. pi"ra"r.* sialic din pozilia terminali a structurilor glucidice din glicocalix reprezinte semnal de fe-acid imbrtranire a acestor celule. De asemenea plachet6le sanguine desialilate i$i micaoreazd timpul oe v11F in circulafie.$i determinr sporirea tromboci-topliezei [5]. Eliminarea din circula{ie a celulelor cu structurile glucidice desialilate implic[ receptori cu activitate lectinicd indreptat6 imporiva galactozei ajunsd in pozifie terminald, receptori de pe suprafa,ta celulelor din organele "cur[fltoare. Fenomenele de recunoaqtere celulard sunt implicate gi in procese biologice in care interacfiunile dintre celulele participante sunt temporare gi tranzitorii. Lxemplincemjrin (i) ceea ce se intimpli la extravazarea leucocitelor in zonele de inflamare tisular[ ii f;;f pri" ir"plicarea structurilor glucidice in procesul de fertilizare. (i) Extravazarea celulelor sanguine are loc printr-un proces al cdrui efect este trecerea lor printre celulele endoteliale, din fluxul sanguin in lesuturi, fenomen denumit diapedezi. Diapedeza se produce sub acliunea unei yarieiag de stimuli, care depind de gi difere nltazil procesele biologice ce duc la extravazarea diferiteior tipuri de celule sanguine JO-'a1. Recrutarea leucocitelor aflate margiPl in fluxul sanguin din vasele de s6nge ale zonelor inflamatorii, implicd structurile glucidice ale glicocalixuiui acestora. Procesele inflamatorii duc la eliberarea de stimuli care aclioneazd asupra unor receptori din membranele celulelor endoteliale,

permanent sau de lungi durati al existen,tei lor trebuie astfel in,teles in sensul celulele prezintd asemenea structuri neces are organizlrii fesuturilor. Existi fenomene fiziologice care se desf[qoard pe baza unor modificIri

membranelor) sunt implicate in fenomene de recunoagtere celulari, cu rol in offiizarea de fesuturi gi organe, atAt prin interacliuni ale celulelor ?ntre ele, cdt qi prin aderaref acestora la substrate extracelulare (la componente ale matricei extracelulare). Se formeazi astfel structuri cu caracter permanent, sau cu existenf6 de lungr duratd. [n ciuda caracterului lor permanent sau de Iungi durat6, aceste structuri nu trebuie intelese ca rigide gi imuabile. Ele sunt i'nt -o po*unenta dinamici, rispunz6nd nevoilor celulei in ceea ce priveqte amploarea lor, capacitatea de a se forma qi desface in diferite zone ale membraneloi celulare, sau capacitatea de a implica in momente diferite componente moleculare diferite, pentru a-Ei nuanla

ale glicocalixului (componentele glucidice

ale

funclia. Caracterul

ci

intotdeauna

Dn Mircea l*abu

Comoonenta elucidicd a membranei celulare. curs oentru studentii tn medicind

conduc6nd la expunerea pe suprafafa luminali a acestora (in ariile inflamate) a unor glicoproteine cu actrivitate lectinicI, denumite P-selectine. P-selectinele (care fac parte din familia selelctinelor) nu se alld permanent la suprafa{a endoteliului, ele fiind stocate in membrana unor structuri veziculare din interiorul celulelor endoteliale. Expunerea tranzitorie a P-selectinelor la suprafafa membranelor apicale ale celulelor endoteliale se face numai ca rezultat al stimulilor elibera{i in procesele inflamatorii. P-selectinele au parteneri de actiune expugi permanent pe suprafafa limfocitelor qi anume structuri glucidice din glicocalixul acestora, numite antigene sialilate Lewis-x. Interactiunile dintre P-selectine qi leucocite, care au loc in zonele inflamatorii, sunt de joasl afinitate, fEcindu-se qi desftcf,ndu-se, asigurind dinamica unui process de rostogolire a leucocitelor pe suprafafa endoteliului gi incetinindu-le deplasarea. Simultan cu expunerea P-selectinelor la suprafafa endoteliului, celulele endoteliale, activate de stimulii elibera{i in procesele inflamatorii, exociteazd factorul de activare plachetari (PAF), un compus de naturi fosfolipidicd2. Cele ce urmeazl descriu fenomenele ce se petrec in cazul particular al exftavazirii limfocitelor T. Prin legarea de receptorii de pe suprafa{a limfocitelor, PAF activeazd prin mecanisme de semnalizare dependente de RhoGTP-aze (vezi la semnalizarea celularfl) integrina aLpL.Integrinele sunt compugi glicoproteici transmembranari cu rol ?n adeziunea celulari, au afinitate ridicati qi sunt structura{i ca heterodimeri oB. Au specificitate pentru proteine ale matricei extracelulare, sau pentru proteine transmembranare expuse pe suprafafa unor celule partenere. Integrina uL$2 activatl se leag[ la molecule de adeziune celularl (CAM) din superfamilia imunoglobulinelor ICAM-I gi ICAM-2, expuse constitutiv la suprafafa celulelor endo-teliale. Interacliunile integrin[ aL$ZfiCANIduc la ata$area ferm6 a limfocitelor la supra-fafa endoteliului gi la oprirea lor din migcarea in care fluxul sanguin le antreneazl. Totodat[ are loc etalarea gi migrarea lor pe suprafa{a celulelor endoteliale pdnfl in zonele joncfionale dintre acestea. Ajunse aici limfocitele se insinuiazl printre dou[ celule endoteliale pirlsind lumenul vasului qi trecdnd in tesut pentru a-gi indeplini menirea in zona tisular[ inflamatii. Fenomene similare se petrec $i la extra-vazarea monocitelor. in acest caz integrina implicatl este oMp2. (ii) Berilizarea este procesul prin care spermatozoidul fuzioneazil ca ovociful t9-111. Pentru realizarea acestui proces, spermatozoizii trebuie sd ajung[ in tractul reproducator feminin, unde suferi un fenomen de capacitare, ce dweazd 5-6 ore la om. Capacitarea const[ in modificlri ale compozifiei lipidice Ei glicoproteice a suprafefei capului spermatozoidului, ca gi in cre$terea metabolismului qi motilit[1ii celulare a acestuia. Mecanismele acestor transformeri structurale qi funcfionale nu sunt cunoscute inci in detaliu. Ele sunt declan$ate de pltrunderea anionului bicarbonat prin membrana spermatozoidului qi activarea unei adenilat ciclaze. Spermatozoidul astfel capacitat poate traversa straful celulelor foliculare ce inconjoarl ovocitul, pentru a ajunge la zona pelucida, un inveliq glicoproteic al ovocitului, format din trei glicoproteine denumite ZPl, ZPZ Si ZP3. Ajuns aici, el se leagi de structuri O-glicozidice ale ZP3,prjin componente ale membranei zonei acrozomale. Zona pelucida acfioneazd, ca o barierl ce confer[ specificitate de specie fertiliz[rii, astfel incdt aceasta nu se poate rcalizaintre celule ale unor specii diferite. Acest lucru a fost--evidenflat prin faptul ci eliminarea zonei pehi:ida a ovocitului permite fertllizarea elementelor apa4in6nd unor specii diferite. Zigofii hibrizi astfel obf;nufi nu sunt insi viabili, nu se dezvolt[. Interacf,unea descrisl mai sus intre spermatozoid qi ZP3, declangazi ceea ce se numeEte reacfie acrozomali. Aceasta consti in eliberarea prin exocitozi a conSnutului vacuolei acrozomale, ca urmare a unui complex proces de semnalizare, indns de legarea spermatozoidului la zorw pelucida Ei care are ca effect cregterea concentra{iei Ca" in citosolul spermatozoidului. Enzimele eliberate ca urrnare a reacfiei acrozomale (proteaze qi hialuronidaze) degradeazdlocal zona pelucida permilAnd spermatozoidului si o penetreze ca si ajungi la membrana ovocitului de care se leagl gi cu care fuzioneazi. Fuziunea arelabazd,
2PAF
rezulttr din derivafi alchilafi ai fosfatidilcolinei (alcool gras in loc de acid gras la hidroxilul I al glicerinei), dupi acfiunea fosfolipazei A2 gi acetilarea hidroxilului 2 astfel eliberat din legatura estericd ini[iali. Altfel spus pAF
este 1 -alchil-2-acetil-3-fosfocolino-glicerol.

Dn Mircea l*abu

Componenta elucidicd a membranei celulare. curs pentru studentii tn medicind

reaqtia corticall a ovocitului, care impiedici polispermia, adicd fuziunea mai mulior spermatozoizi cu ovocitul. Aceasta conferd protec{ia secundar6 (de lungl durat[) impotriva polispermiei. O blocare primarl (de scurt[ duratl) a polispermiei are loc pe baza depolarizirii rapide a membranei ovocitului in momentul fuziunii cu spermatozoidul. Reaclia cortica6 conste in activarea, in momentul fuziunii ovocit-spermatozoid, a unei cii de semnalizare prin fosfoinozitide (fosfatidilinozitoli) care are ca efect cre$terea concentraliei Ca2* in citosolul ovocitului gi exocitarea confinutului enzimatic al granulelor corticale ale acestuia. Enzimele eliberate prin reacfia corticali modifici biochimic structura zonei pelucida, prin clivarea Zy2 Si degradarea componentei glucidice aZP3. Aceste modificdri asiguri rezistenfa zonei pelucida ia legarea altor spermatozoizi. Agadar doui dintre evenimentele esen$ale ale procesului de fertilizare (reaclia acrozomali a spermatozo-idului qi reacfia corticall a ovocitului) implic6 participarea directi a unor structuri glucidice. Pe fenomene de recunoaqtere celulard care implicd structurile glucidice ale glicocalixului wbazeazd, gi compatibilitn{ih de grup sanguin ale sistemului ABO. Purtitoarele antigenelor de grup sanguin sunt glicolipide gi glicoproteine aflate in membranele celulelor sanguine, cu sfructuri oligozaharidice cu porfiuni terminale identice. Lanfurile glucidice responsabile de
compatibilitnfile de grup sanguin au urmdtoarele structuri: Grupa Grupa

activitatea unei proteine de fuziune din membrana spermatozoidului expus[ ca urmare a modificirilor induse de reactia acrozomali. Fertilizarea se sfdrgegte cu ciea ce se nume$te

O: A: B:

Fucal---+2GalBl--+4GlcNAc-+...
Fucal---+2GalF1--+4GlcNAc---+...

1(ol--*3; Gall/Ac
Grupa Fucol---+2Galpl---+{Qls/y4g---'...

t(ol-+31
Gal

Grupa AB poarti in amestec ambele antigene ale grupelor A gi B. Binein(eles ci la una dintre grupe este dependentl de tipul de glicoziltransferaze disponibile, ca urmare a exprimirii genelor corespunzltoare. Compatibilitdsle de grup sanguin se bazeazd pe prezenlain s6nge a anticorpilor anti-antigene de grup. Indivizii din grupa A con$n in plasma lor antiticorpi anti-B care vor aglutina celulele din grupele B gi AB. Indivizii din.grupa B confin anticorpi anti-A, care aglutineazi celulele din grupele A gi AB. Indivizii din grupi A-B nu confin nici un fel de anticorpi qi sunt primitori universali, deoarece nu pot aglutina celulele indiferent cdrui grup ar apar,tine. tn sfdrqit, indivizii din grupa O, neavend -ri"i ,t u"turile glucidice specifice grupei A, nici pe cele specifice grupei B sunt donatori universali, celulele lor sanguine nefiind aglutinate indiferent de anticorpii anti-antigene prezenfi. Structufle glucidice sunt necesare, dar nu neapdrat suficiente funcfionlrii receptorilor din membranele celulare. Cea mai mare parte dintre receptorii suprafefelor celulare, evi-dentiati pin[ in prezent, sunt glicoproteine. Pentru unii dintre ei eliminarea componentei glucidice nu afecteazd' esenfial capacitatea de legare a liganzilor, pentru alfii da. penru cei cire igi pierd afirytatea fafi de liganzi, nu se poate, afirma cu certitudine c[ structura glucidici este implicati in formarea locului de legare. Mai degrabi se specul eazd cd ar fi vorba de modific6ri conforma(ionale induse de pierderea componentei glucidice, modific[ri ce ar avea ca efect distrugerea geomeffiei sitului de legare. Componentele glucidice ale suprafe,tei celulare reprezint[ interes deosebit pentru infelegerea atdt a fiziologiei cat gi a patologiei celulare. De exemplu, acizii sialici terminali din glicocalixul limfocitelor T sunt implicaf in aproape toate fenomenele ce tin de destinul gi func$ile celulei. Supraviefuirea celular[ inso{iti de fenomenele de maturare, diferen-f;ere,
apartenenta

Dn Mircea l*abu

Comoonenta slacidicd a men branei celul.are. curs oentra stuilentiitn medicind

motilitate qi moartea celularl sunt dependente de acizii sialici gi de interacfiunile acestora cu proteine cu activitili lectinice indreptate c[tre aceste glucide terminale [2]. Modificdri in glicozilarea suprafeqei celulare inso{esc diferite patologii, cum ar fi cazul celulelor canceroase, cu implicafii asupra progresiei tumorale gi metastazflrii [13]. Implicarea glicocalixului in fiziologia gi patologia celulari a flcut ca acesta si fie considerat Sntii terapeuticl in tratamentele multor boli [1, 14, 157. In concluzie se poate spune despre componenta glucidicd a membranelor ci nuanleazd, uneori intr-o manierl de mare subtilitate, funcgionarea acestei structuri care separi, dar gi unegte
celula cu mediul.

CONSIDERATII FINALE ASUPRA ORGANIZANTT MOLECULARE A MBMBRANELOR CELULARE


Organizarea membranelor celulare (ca gi a endomembranelor) are la bazl un bistrat lipidic eterogen, asimetric qi cu proprietifi fluide manifestate bidimensional. Acestuia se adaugi proteine care ii conferd caracterul unui mosaic (proteine plutind pe, sau cufundate in marea lipidicl ce formeazd bistratul). Modelul mozaicului fluid pentru organizarea biomembranelor a fost completat prin evidenferea gi descrierea unor structuri adiacente: citoscheletul asociat membranei (structuri aflati pe fa,ta intern[ a membranelor) qi glicocalixul (structurd expusd pe fa{a externe a

membranelor, alcltuiti din lanfuri oligo-/poli-zaharidice din compozi$a glicolipidelor, glicoproteinelor gi proteoglicanilor din membrani). Atdt proteinele cit gi componenta glucidicd a membranelor nu diminueazfl ci accentueaz[ qi nuanfeazl caracterul eterogen, asimetric Ai de fluid bidimensional al structurdrii membranelor
celulare.

Tot in completarea modelului mosaic fluid sub aspect structural, dar qi funcfional au fost definite no{iunile de domenii gi/sau microdomenii de membrand. Acestea sunt regiuni mai

extinse (domeniile) sau mai reduse (microdomeniile) din suprafala membranelor a ciror compozilie este diferitl de a altor zone. Compoziliile diferite ale domeniilor de membran[ (apical versus latero-bazal) sunt riguros controlate gi pdstrate de celuld. Compozilia gi existenfa microdomeniilor (caveole, plute lipidice, structuri cu invelig de clatrinl gi altele pe care le veF intfllni pe mlsuri ce vom avansa in cunoaqterea celulei) au o dinamici mai accentuat[, r[spunzAnd nevoilor in continul schimbare ale celulelor, nevoi impuse de considerente interne ale celulei, sau de stimuli externi la care celulele trebuie si rdspundi. Componentele membranelor fie ele lipide, proteine, structuri glucidice au at6t roluri structurale c6t gi metabolice. Aceasti dualitate a rolurilor este valabil[ atdt pentru clasele de componente biochimice ale membranelor, cdt qi pentru entitif moleculare (aceeagi moleculi poate indeplini at0t func(ii structurale cflt gi metabolice). In ciuda acestei organiz6ri moleculare complexe (puternic eterogen[ gi asimetric[), sau mai degrabi tocrnai'datoritd ei, biomembranele aclioneazd ca sisteme integrate. Detalii asupra funcfiondrii biomembranelor ca sisteme integrate se vor prezenta, in primul rdnd, la capitolele ,,Transp,ortul membranar" gi ,,Semnalizarca celularl". Vef afla insi aspecte legate de acest comportament al membranelor ca sisteme integrate gi in alte capitole, cu precddere in cele care prezinti organitele celulare delimitate de endomembrane.

Bibliografu specificd 1. Becker BF, Chappell D, Bruegger

D, Annecke T, Jacob M. (2010) Therapeutic strategies targeting the endothelial glycocalyx: acutedeficits, butgreat potential. Cardiovasc Res.87: 300-310.
L,eabu M, Ghinea N, Muresan V, Colceag J, Hasu M, Simionescu N. (1987) Cell surface chemistry of arterial endothelium and blood monocytes in the normolipidemic rabbit. I Submbrosc Cytol. 19;193-208.

2.

Ghinea N, kabu M, Hasu M, Muresan v, Colceag J, simionescu N. (19g7) prelesional events in atherogenesis. Changes induced by hypercholesteroiemia in the cell surface chemistry of urteriat endothelium and blood monocytes, in rabbit. J subnicrosc Cytol. rg:209-227.
4.
5.

AminoffD, Bell wc, vorderBruegge wG. (1978) cell surface carbohydrate recognition and the viability of erythrocytes in circulation. prog Clin Biol Res.23: 569_5g l. Karpatkin S, Shulman s. (1980) Asialo platelets enhance thrombopoiesi s. Trans Assoc Am physicians. g3: 2M-2s0.
Hynes Ro, Iander AD. (1992) contact and adhesive specificities in the associations, migrations, and targeting ofcells and axons. Cell. 68 303-322. Ebnet K, Vestweber D. (1999) Molecular mechanisms that control leukocyte extravasation: the selectins and the chemokines. Histochem Cell Biol. ll2: l-23.
y-an B-uul

7' 8' 9'


l0'
11'

Vasc

JD, Hordijk PL. Biol.?A:824-833.

Qa\q

Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb

E&.

wassarman PM, Jovine L, Litscher ES. (2001) A profile of fertilization in mammals. Nat cell Biot.3: E59-

Wassarman PM, Jovine L, Qi H, Williams Z, Darie C, Litscher ES. (2005) Recent aspects of mammalian fertilization research. M o I C e I I Endo c rirc l. 234; 95_ 103.

Wassarman PM, Litscher Es. (2008) Mammalian fertilization: the egg's

Dev Biol.52:665-676.

multifunctional zona pellucida. Int

12' Bi S' Baum LG. (2009) Sialic acids in T cell


1599-1610.

developmenr and function. Biochim Biophys Acta. l1X):


eenng.

13' Dafik L, d'Alarcao M, Kumar K. (2010) Modulation of cellular adhesion by glycoengin


Chem.53:-4n7-4284.

J Med

14' Drake-Holland AJ, Noble MI. (2009) The important new drug target in cardiovascular medicine - the vascular glycocalyx. c,rdiovasc Hemntor Disord Drug Targets.i: t r's-rz:. 15' Du J, Yarema KJ. (2010) carbohydrate engineered cells for regenerative medicine. Adv Drug Deliv Rev. 62:671482.

Bibliografie generali
1' M0LECULAR BIOLoGY oF THE CELL, autori: B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J'D' watson, Garland Publishing Inc., New York & London, lsas i"iiti.i il-a), t994(edilia a III-a), Garland Science, New York,2002 (editia a IV-a); aurori: B. Alberts, A.'Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P.Walter, Garland Science, New york, 200g (edi{ia a V-a).
2' M0LECULAR CELL BIOLOGY, autori: H.
J. Damell, W.H. Freeman and Company, New

!o!1t_h: york, 2000 (editia a'IV_a). '

A. Berk, S.L. Zipursky, p. Marsudaira, D. Battimore,