BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERALDE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA EN FARMACIA REA: BIOQUMICA - ALIMENTOS

ASIGNATURA: LABORATORIO DE BIOQUMICA II (METABLICA)

CDIGO: FARM-016 L ELABORADO POR: M.C. Ma. Bertha Alvarado Hidalgo M. C. Rosa Mara Dvila Mrquez M.C. Eustoquia Ramos Ramrez M.C. Leticia Garca Albarrn M. C. Gonzalo A. Flores Mendoza

DICIEMBRE 2008
PE: LICENCIATURA EN FARMACIA

REGLAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO Usar siempre bata y lentes de proteccin Eliminar de la zona de trabajo los artculos personales (libros, cuadernos, suter, bolsa, etc. No fumar. Fumar es peligroso porque hay materiales y vapores flamables, adems de que contamina el ambiente No ingerir bebidas ni alimentos en el laboratorio, porque hay la posibilidad de contaminar los alimentos, bebidas y manos con sustancias txicas y / o corrosivas No usar el material de laboratorio como recipientes para comer o beber Lavarse las manos peridicamente Desechar el material defectuoso (material de vidrio estrellado, tubo de hule desgatado, cables elctricos pelados, etc.) Mantener el rea de trabajo perfectamente limpia. De preferencia con una franela En caso de cualquier accidente por leve que sea avisar de inmediato a su profesor Realizar el experimento siguiendo la tcnica indicada. En caso de querer modificarla consultar a su profesor Leer perfectamente las etiquetas antes de usar cualquier reactivo. NUNCA regresar el reactivo sin usar al frasco. Si se toma una cantidad excesiva, dejar el exceso para otro estudiante o trasvasarlo a otro vacio y etiquetarlo. Cuando caliente el material de vidrio, hgalo con proteccin y lentamente, si es un tubo de ensayo NUNCA apuntar la boca del recipiente hacia uno o hacia sus compaeros NUNCA probar el sabor de un reactivo. Cuando necesite olerlo, no lo haga directamente del recipiente, abanicar con la mano los vapores hacia la narz NUNCA verter agua sobre un cido. Siempre agregar lentamente el cido sobre el agua Si se desprenden vapores durante un experimento , realizarlo bajo la campana de extraccin Verter los reactivos lquidos que ya no sirven en un contenedor que indique su profesor. Si se tira directamente al desage dejar correr agua abundante No tirar los slidos en el lavabo Los disolventes orgnicos son insolubles en el agua por lo que deben guardarse en contenedores que proporcione su profesor Al terminar cualquier prctica se debe lavar perfectamente el material con agua y jabn antes de guardarlo

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ACCIN DE LA AMILASA SOBRE EL ALMIDON (Durante la germinacin)

INTRODUCCION: La germinacin se presenta cuando las semillas realizan una serie de cambios dando como resultado el desarrollo de una plntula. Para que esto suceda, el alimento que fue almacenado en la semilla, es empleado como fuente de energa. En las semillas, el alimento de reserva es el almidn, polisacrido formado por 15 20 % de amilosa y 80 -85 % de amilopectina. Para que la energa guardada sea aprovechable interviene una enzima que degrada el almidn a carbohidratos ms simples. Esta enzima es una amilasa que hidroliza los enlaces a (1-4) tanto de la amilosa como de la amilopectina. OBJETIVO: Demostrar la actividad de la amilasa en semillas de frijol alubias durante la germinacin. MATERIAL 1 pipeta de 10 ml. 3 cajas de Petri 1 vaso de precipitado. 1 estufa de incubacin a 25 0 C MATERIAL BIOLGICO Los alumnos debern traer 10 a 12 frijoles alubias (de preferencia grandes de tamao homogneo) limpias y sin germinar. MATERIAL QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS: 1 gotero de pliego de papel manila 1 regla transparente. 3 frascos gerber de 100 ml para iniciar la germinacin REACTIVOS: Agar nutritivo adicionado con almidn. (200 mg de almidn / 100 ml de medio) Solucin reveladora: Lugol 3 alfileres navaja o bistur. Un lpiz graso. 20 g de algodn absorbente.

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DESARROLLO:

1. En cada frasco gerber se coloca algodn completamente mojado (con agua de

la llave) en el fondo. Se colocan 3 4 frijoles o alubias, bien lavados, en cada frasco distribuyndolos de la mejor manera, de modo que su ombligo (mancha central) quede orientado hacia la pared del frasco.

2. Con el papel manila envolver los frascos cerrados sin que la tapa este apretada,
escribindole a dicha envoltura los siguientes datos: materia, semestre y grupo al que pertenecen, seccin de laboratorio, nombre del responsable del equipo, contenido, y fechas en que se inicia y termina la incubacin (incluyendo hora).

3. Se incuban los frascos de 3 a 4 das en la estufa de incubacin cuidando que la

temperatura sea de 25-30 0 C

4. Para realizar la prctica deber contar con tres cajas petri numeradas. 5. El da de la prctica se eligen 8 semillas y se les elimina el embrin y la raicilla
(si las tienen) con la navaja o bistur y adems se abren a lo largo colocando hacia arriba su ombligo, obtenindose as 16 mitades. De preferencia la cascara se quita despegndola antes o despus de obtener las mitades. A 8 mitades (mitades A) se les cortaran las orillas colocndolas con la parte plana hacia abajo de modo que su forma ya no sea elptica sino rectangular.

Mitad "A"

Las otras 8 mitades (mitades B) sern sometidas a un corte muy delgado de la cara plana para eliminar los pequeos bordes naturales. A todas las mitades se les pica con el alfiler en tres partes de manera perpendicular a la cara plana.

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6. Dividir las placas de petri en cuadrantes usando un lpiz graso por la parte exterior. 7. Inmediatamente despus de los cortes, en cada placa (calculando la mitad de cada cuadrante) se colocan dos mitades A con la cara plana hacia abajo, y se presionan ligeramente para marcar el agar, se retira y a continuacin con la navaja se corta el agar para hacer un hueco sobre la forma que dej impresa la semilla (cuidando no llegar al fondo de la caja) y luego se coloca la mitad, de modo que por lo menos dos de sus costados toquen el agar. Tambin en cada placa se colocan dos mitades B con la cara plana hacia abajo y se presionan ligeramente para fijarlas cuidando de no romper el agar. 8. Una vez colocadas todas las mitades en las placas se coloca una pequea gota de agua por un costado de cada mitad para mojar las partes de contacto entre las semillas y el agar. Esta agua puede ser de la llave pero debe de estar atemperada a 25 300C. Se mojarn las semillas mximo cada 20 minutos o menos, controlando que no se sequen las zonas de contacto y acomodando las semillas A o presionando las semillas B, si es necesario Las placas se incuban a 25 30 0C segn la siguiente tabla
NMERO DE PLACA 1 2 3 TIEMPO DE INCUBACIN 30 min. 45 min. 60 min.

9. Despus de transcurrido el tiempo de incubacin, se revelan las placas con lugol, de la siguiente manera: A cada placa se agrega gota a gota el revelador (lugol) necesario para cubrir ligeramente toda la placa y se deja actuar por 2 minutos. Despus, se elimina el revelador por vertido y se enjuaga la placa con agua de la llave cuidando de que no se desprenda el agar de la placa. Se miden las zonas translcidas con la regla.

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TABLA DE RESULTADOS.
Tiempo de Revelado. Promedio de las zonas translcidas de las semillas A 30 minutos. 45 minutos. 60 minutos. B

CUESTIONARIO. 1. Cul es el fundamento de la presencia ausencia de almidn al momento de revelar? 2. Qu indican las zonas translcidas? 3. Por qu a mayor tiempo es mayor la zona translcida? 4. Hay almidn en la zona translcida ? Si no lo hay, en que se transform?

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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA

INTRODUCCIN: La enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del cido succnico es una Oxidorreductasa que cataliza la oxidacin del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD. Esta enzima se localiza en eucariotes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa.
COOH I CH2 I CH2 I COOH FAD FADH2 COOH I CH

II
Succinato deshidrogenasa

HC I COOH

FADH2 Succinato deshidrogenasa

FAD

Azul de metileno oxidado

Azul de metileno reducido

OBJETIVO: Que el alumno aprecie la actividad de le enzima Succinato Deshidrogenasa mediante una reaccin colorimtrica. MATERIAL: 2 tubos de ensaye 2 pipetas de 5ml REACTIVOS: NaOH al 10% cido succnico al 3% neutralizado con NaOH al 10% hasta pH=7.4 Bao Mara a 50C Pinzas para tubo de ensaye

Fenol al 90% Azul de metileno al 0.1% Aceite mineral Hgado de rata

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DESARROLLO: 1. Pesar 1gr. de hgado de rata recientemente sacrificada. 2. En el mortero molerlo con 3 4ml de cido succnico hasta obtener una masa. 3. Transferir en partes iguales a 2 tubos y proseguir segn la siguiente tabla.

Nmero de tubo Reactivo Fenol al 90% Azul de metileno Aceite mineral 1 2 1.0ml --2.0 gotas 2.0 gotas MEZCLAR CADA TUBO 0.5ml 0.5ml

4. Incube ambos tubos 10 minutos en el bao Mara a 50C 5. Observe los cambios CUESTIONARIO: 1. Cules son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y reducido? 2. Cul es la funcin del fenol en la reaccin? 3. En qu va metablica est involucrada la enzima succinato deshidrogenasa?.

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INFLUENCIA DE LA BILIS (SALES BILIARES ) SOBRE LA TENSIN SUPERFICIAL DEL AGUA

INTRODUCCIN: En la naturaleza existen sustancias capaces de disminuir la tensin superficial de los lquidos. Ellas se denominan sustancias tensoactivas. Tales sustancias presentan molculas con carcter dipolar, es decir, una parte de la molcula es hidrfila y la otra hidrfoba. Estas molculas entran en interaccin molecular con el disolvente por su extremo hidrfilo, mientras que el otro extremo tiende a alejarse del lquido. Como resultado, las sustancias tensoactivas se acumulan en la capa superficial de la disolucin. Su extremo hidrfobo estar dirigido hacia afuera de la fase. Todo esto conduce a la disminucin de la tensin superficial de la solucin. Las sustancias tensoactivas juegan un papel de gran importancia en la naturaleza, ayudando a mezclar mejor los lquidos que generalmente no se mezclan. Por ejemplo agua y grasa. Son sustancias tensoactivas los jabones, los cidos grasos, aminocidos, sales biliares, etc. OBJETIVO: Demostrar la capacidad que tienen las sales biliares para disminuir la tensin superficial del agua. MATERIAL: 1 vaso de precipitado 2 tubos de ensaye 2 varillas de vidrio REACTIVOS: Alcanfor Bilis Flor de azufre Agua destilada

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DESARROLLO: 1. .- PRUEBA DEL ALCANFOR. a).- En un vaso de precipitado se vierten 200 250ml de agua, cuidadosamente se ponen en ella varios pedacitos de alcanfor. Los pedacitos de alcanfor se mueven rpidamente en la superficie del agua. Esto se explica por el hecho de que los diferentes lados del pedacito de alcanfor se disuelven en el agua con diferente velocidad y por lo tanto al rededor del pedacito se crea una tensin superficial desigual, de manera que el pedacito se traslada hacia donde la tensin superficial es ms alta. b).- Introduzca la varilla en la bilis y despus en el vaso donde est el alcanfor. El movimiento de los pedacitos de alcanfor cesa ya que bilis disminuye la tensin superficial. 2. PRUEBA DE LA FLOR DE AZUFRE: a).- Coloque en dos tubos de ensaye 3 4ml de agua destilada, a uno de los tubos agregue de 6 a 8 gotas de bilis. b).- Sobre la superficie de ambos tubos coloque una pequea cantidad de flor de azufre. Observe la distribucin del azufre en ambos tubos. Cmo explica la diferencia entre ambos tubos? CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Defina tensin superficial. Qu es un agente tensoactivo? Escriba los nombres y frmulas de las sales biliares. Explique las funciones de las sales biliares.

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HIDRLISIS ENZIMTICA DE LOS LPIDOS

INTRODUCCIN: Las lipasas y las esterasas catalizan la hidrlisis de enlaces ster que se encuentran en un gran nmero de lpidos saponificables.
CH2 - O - CO - R R - OC - O - CH CH2 - O - CO - R Lipasa CH2 - OH R - OC - O - CH CH2 - OH + 2 R - COOH

Estas enzimas estn ampliamente distribuidas el la naturaleza y son especialmente importantes en el tracto gastrointestinal donde funcionan en la digestin y absorcin de grasas. Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben actuar en la interfase lpido-agua, lo cual trae como consecuencia una disminucin de la actividad enzimtica. Consecuentemente, ser necesario el empleo de los agentes emulsificantes tales como las sales biliares que producen a menudo una estimulacin marcada de la hidrlisis enzimtica de los lpidos, debido al incremento de la interfase lpido-agua. En la leche homogeneizada los glbulos de grasa estn en un estado muy finamente dividido y este material sirve como sustrato excelente para las lipasas. En este experimento se emplea como enzima una lipasa muy potente que se encuentra en el pncreas desecado. OBJETIVO: Demostrar la accin de la lipasa pancretica en presencia y ausencia de la bilis. MATERIAL: 8 matraces Erlen Meyer de 125 ml Pinza para bureta 1 pipeta de 10 ml 1 Pipeta de 1 ml REACTIVOS: Pancreatina al 1% en agua KOH 0.05 N El alumno deber traer: Leche homogeneizada Bilis. 1 pipeta de 5 ml 1 bureta de 25 ml 1 soporte universal termmetro y bao mara a 37 C

Etanol al 95% Fenolftalena

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MTODO: 1. Preparar una serie de matraces Erlen Meyer de acuerdo a la siguiente tabla: MATRAZ NMERO 2 3 4 5 5 5 5 5 1.5 0 0 30' 1.5 0 0 45' 1.5 0 1 15' 1.5 0 1 30'

REACTIVOS (ML) Leche homogeneizada Extracto neutro de pancreatina al 1% Extracto de pancreatina caliente a ebullicin por 3 minutos Bilis Tiempo de incubacin a 37C.

T1 5 0 1.5 0 45'

1 5 1.5 0 0 15'

6 5 1.5 0 1 45'

T2 5 0 1.5 1 45'

2. despus de que cada matraz ha cumplido su tiempo de incubacin, retirarlos del bao, adicionar 12.5 ml de alcohol al 95% y 3 gotas de fenolftalena y titular con una solucin de hidrxido de potasio 0.05 N. 3. Agitar el matraz durante la titulacin tan rigurosamente como sea posible, ya que la protena puede enmascarar los cidos grasos. 4. Titular cada matraz tan rpido como sea posible, contra un fondo blanco, debido a que la digestin por la lipasa contina durante la titulacin. RESULTADOS: a) Datos.- Restar del gasto de hidrxido de potasio de cada uno de los matraces el gasto de hidrxido de potasio del testigo. b) grficas
Gasto de KOH corregido 1,2,3.

Gasto de KOH corregido 4,,5,6. Tiempo de Hidrlisis Tiempo de Hidrlisis

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. Cul es la interpretacin de las grficas obtenidas? Cul es el objeto de agregar bilis en el experimento? Cmo se clasifican los lpidos? Cules son los cidos grasos ms importantes de la grasa humana? Cul es la importancia clnica de la lipasa en un diagnstico? Cul es la composicin y el funcionamiento del tejido adiposo?

DETERMINACIN DE CUERPOS CETNICOS

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INTRODUCCIN El hbito humano de consumir alimentos pocas veces al da (3 4) conduce a un proceso cclico de nutricin. En condiciones normales los combustibles empleados en los tejidos para obtener energa son: Glucosa, cidos grasos, cuerpos cetnicos y aminocidos. En caso de ayuno hay cambios que requieren de la adaptacin del organismo y esto trae como consecuencia modificaciones en los patrones metablicos y por lo tanto en las molculas utilizadas como combustibles. Durante las primeras etapas del ayuno se realizan cambios hormonales, se deja de liberar insulina y se aumenta la liberacin de glucagon, lo que ocasiona un aumento en la Glucogenlisis, estimulacin de la Liplisis, inhibicin de la sntesis de triacilglicridos, aumento de la Beta - oxidacin y produccin de cuerpos cetnicos (Cetognesis), si el ayuno es prolongado se presenta un desequilibrio entre el metabolismo de carbohidratos y el de lpidos lo que ocasiona que los niveles de cuerpos cetnicos se eleven en sangre y sean eliminados por orina donde son detectados fcilmente. OBJETIVO Demostrar la presencia de cuerpos cetnicos como consecuencia de un ayuno prolongado. MATERIAL: 2 Tubos de ensaye 1 Pipeta de 10 ml. 1 Pipeta de 2 5 ml MATERIAL BIOLGICO. La orina de animal en ayunas ser proporcionada por el bioterio Los alumnos debern traer orina de personas en ayuno de 8 horas (la primera del da), diabticas y normales. REACTIVOS: Reactivo de Imbert (Nitroprusiato de sodio al 5%) Amoniaco concentrado o Hidrxido de amonio concentrado

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DESARROLLO: 1. En un tubo de ensaye se colocan 2.5 ml de orina (Rata, perro o humana) y se agregan 10 gotas del reactivo de Imbert. Se mezcla. 2. Deslizando por las paredes del tubo se agrega 0.5 ml de Amoniaco o hidrxido de amonio para obtener una reaccin zonal. 3. Cuando la reaccin es positiva, en el punto de contacto aparece un anillo violeta cuya intensidad es proporcional a la cantidad de cuerpos cetnicos. CUESTIONARIO: 1. Qu nombre recibe la presencia de cuerpos cetnicos en sangre y orina cuando se encuentran en cantidades ms altas que las normales? 2. En qu condiciones metablicas se acumulan cuerpos cetnicos? 3. Cul es el fundamento de la prueba de Imbert?

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