Ultracentrifugation

Introduction
- le comportement des macromolcules en solution, qui sont soumises au champ gravitationnel (facteur acclration g = 9.81 ms2), ne dmontre aucune vidence de sdimentation - lagitation thermique est suffisante les garder disperses de faon homogne en solution - moins quelles ne soient agrges - cest seulement lorsque les macromolcules sont assujetties des acclrations normes quelles commencent sdimenter. - Lultracentrifugeuse fut invente en 1923 par un chimiste sudois, Theodor Svedberg (prix Nobel de chimie 1926) - avec ce type de centrifugeuse, il est possible datteindre des vitesses de rotation de 80,000 rpm (rvolutions par minute) qui donnent lieu des forces dpassent 600,000 X g - Avec cette technique, Sverdberg a pu dmontrer que les protines sont des macromolcules de composition homogne et quun grand nombre de protines sont composes de sous-units.

A. Sdimentation
- la vitesse avec laquelle une particule sdimente dans une ultracentrifugeuse dpend de sa masse - la force, Fsdimentation, subie par une particule de masse m situe une distance r dun point autour duquel la particule tourne avec une vitesse angulaire (en radians s-1) est gale la force centrifuge (m2r) qui sexerce sur la particule moins la force due au dplacement de la solution par la particule (Vp2r ou force de flottaison) Fsdimentation = m2r - Vp2r o Vp est le volume de la particule en question et est la densit de la solution - Cependant, le dplacement dune particule travers une solution est oppose par une force qui reprsente la friction entre la particule et la solution F
friction

= v f

o v est la vitesse de migration de la particule et f est le coefficient de friction. - le coefficient de friction dune particule peut tre dtermin en mesurant sa vitesse de diffusion.

- Sous linfluence dune force centrifuge, une particule va acclrer jusqu ce que toutes les forces soient contrebalances, soit : m2r - Vp2r o on atteint la phase stationnaire = v f

quoi peut servir cette technique? mesurer la masse de macromolcules

- La masse molaire de particules, M, est M = mN o N reprsente la constante dAvogadro (6.02 X 1023). - Le volume dune particule, Vp, en fonction de sa masse molaire et sa densit, est:

reprsente le volume partiel spcifique de la particule qui est dfini par le

changement en volume lorsque 1g sec de particules est dissous dans une solut volume infini.

En substituant Vp et m dans les quations ci-dessus, on obtient : vf = m2r - Vp2r si on manipule lquation encore, on obtient une relation indpendante de et r, et qui est seulement dpendante des proprits de la protine en question on dfinit alors le coefficient de sdimentation, S, par : - Le coefficient de sdimentation est analogue au coefficient de mobilit lectrophortique; sa valeur est exprime en units de 10-13 sec qui sont connues sous forme de Svedbergs (S).

La relation ci-dessus indique quil sera possible de dterminer la masse dune particule, m=M/N, partir de son coefficient de sdimentation S et de son coefficient de friction f En effet, jusquaux annes 1970, la plupart des dterminations des masses molculaires ont t faites partir dune ultracentrifugeuse analytique - un instrument qui permettait la dtermination des vitesses de sdimentation

- Bien que de nouvelles techniques sont maintenant utilises pour mesurer la masse des macromolcules (par ex: chromatographie en gel de filtration, lectrophorse SDS-PAGE), lanalyse des complexes de macromolcules utilise toujours lultracentrifugation - la masse des constituants de ces complexes est souvent exprim en Svedberg (S) Par exemple: -le ribosome bactrien - les sous-units 30S et 50S sont constitus par les ARNr 5S, 16S et 23S - les deux sous-units sassemblent pour former le ribosome 70S - le ribosome eucaryote - les sous-units 40S et 60S sont constitus par les ARNr 5S, 5.8S, 18S et 23S - les deux sous-units sassemblent pour former le ribosome 80S - le protasome 26S - chez les eucaryotes, complexe multiprotique impliqu dans la dgradation des protines

B. La centrifugation prparative.
- Les centrifugeuses prparatives sont conues pour la prparation dchantillons possdant des volumes significatifs - La sdimentation peut tre faite dans une solution inerte comme le saccharose ou de chlorure de csium (CsCl) dans lesquels la concentration et donc la densit augmente du haut vers le bas du rotor - Lutilisation des gradients de densit augmente de faon significative le pouvoir de rsolution de la centrifugeuse. - Dans le cas de saccharose, ce type de gradient minimise lagitation dune solution par convection (qui peut nuire la rsolution). Il faut se rappeler que la densit de la solution doit tre moindre que celle de la macromolcule pour quil y ait de la migration. Les gradients de densit ont deux applications: 1) Ultracentrifugation zonale ou en zones. 2) Ultracentrifugation en gradient de densit lquilibre.

B.1 Lultracentrifugation en zones.

- Cette technique permet la sparation des particules selon leurs coefficients de sdimentation - Dans ce type de centrifugation, la solution de macromolcules est dpose sous forme de couche en haut dun gradient de densit prpar auparavant - Ce type de gradient minimise lagitation par chauffement de la solution, ce qui peut nuire la rsolution - On utilise le saccharose, qui est visqueux et biochimiquement inerte pour former le gradient - Puisque la vitesse de sdimentation est une fonction plus sensible la forme dune macromolcule qua sa densit, lultracentrifugation en zones spare les macromolcules de forme similaire selon leur masse - Pendant la centrifugation, chaque espce se dplace travers le gradient une vitesse largement dtermine par leur coefficient de sdimentation et donc migre comme une zone - la fin de lexprience, la rcolte des fractions se fait par linsertion dune aiguille au fond du tube de centrifugation et on collectionne le contenu du tube par un collecteur de fraction

B.2 Lultracentrifugation par densit dquilibre.

- Cette mthode de centrifugation, aussi connue sous le nom de centrifugation isopycnique, spare les macromolcules selon leur densit - Lchantillon est dissout dans une solution concentre dune substance dense qui diffuse relativement vite comme les sels CsCl et Cs2SO4, et qui est subie des hautes vitesses de rotation - Le fort champ centrifuge gnre un gradient important de sel dans lequel les composantes de lchantillon se retrouvent en zone de densits gales celle de la solution de sel; autrement dit o (1- /) = 0, donc aucune migration puisque v = 0 - la technique prfre pour sparer des macromolcules qui possdent une gamme de densits. Par exemple: - acides nucliques (plasmide vs ADN gnomique et ARN total) - ribosomes et polysomes - virus - organites subcellulaires (microsome, mitochondries, )

Ultracentrifugation en zones vs isopycnique

Rcapitulation des principes de lultracentrifugation

Utilisation des ultracentrifugeuses

- les ultracentrifugeuses cres un vacuum dans la chambre du rotor pour permettre dobtenir de trs hautes vitesses de centrifugation sans avoir la friction de lair, ce qui peut amener un chauffement des chantillons - les vitesses obtenues sont trs leves (de lordre de 80 000 100 000 rpm) - de plus, la chambre du rotor est rfrigre pour viter le rchauffement des chantillons - ces vitesses, il est essentiel de: - bien balancer le rotor pour viter tout dbalancement lors de la centrifugation - utilisez le bon rotor!

Ce qui arrive lorsque vous utilisez un rotor incompatible!