JOS ANTNIO MEDEIROS MACEDO

DESENVOLVIMENTO DE ESTRATGIAS PARA A CONSERVAO DE ILEX PERADO SSP. AZORICA TUTIN: MULTIPLICAO POR VIA VEGETATIVA E ECOFISIOLOGIA DA GERMINAO DAS SEMENTES.

UNIVERSIDADE DOS AORES

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PONTA DELGADA 2000

JOS ANTNIO MEDEIROS MACEDO

DESENVOLVIMENTO DE ESTRATGIAS PARA A CONSERVAO DE ILEX PERADO SSP. AZORICA TUTIN: MULTIPLICAO POR VIA VEGETATIVA E ECOFISIOLOGIA DA GERMINAO DAS SEMENTES.

ESTGIO DE LICENCIATURA EM BIOLOGIA, RAMO DE BIOLOGIA AMBIENTAL E EVOLUO ORIENTADORA: DRA. MNICA MOURA

UNIVERSIDADE DOS AORES

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PONTA DELGADA 2000

Ponta Delgada, Novembro de 2000

Jos Antnio Medeiros Macedo

A meus Pais

AGRADECIMENTOS
Dra. Mnica Maria Tavares de Moura pelos ensinamentos, apoio, conselhos e sugestes prestados durante a realizao deste trabalho, bem como pela formao profissional proporcionada ao longo do estgio. Ao Professor Doutor Jos Norberto Brando de Oliveira pelo apoio e colaborao proporcionados para a realizao deste estgio. Professora Doutora Maria Joo Bornes Pereira e Engenheira Graciete Belo Maciel pelos conhecimentos transmitidos. Ao Tcnico Superior responsvel pela Microscopia Electrnica do Departamento de Biologia, Dr. Jorge Medeiros, pela colaborao dispensada na realizao das fotografias. s tcnicas de laboratrio, D. Natlia Cabral e D. Cristina Arajo, pela colaborao e auxlio prestados. A todos os colegas, docentes e funcionrios da Universidade, que de uma forma ou de outra, contriburam para a realizao deste trabalho. Direco Regional dos Recursos Florestais, na pessoa do Engenheiro Manuel Loureiro, pela ateno e colaborao dispensadas, bem como aos Engenheiros Mrio Fagundo e Anabela Isidoro do Servio Florestal do Nordeste pelo apoio e colaborao prestados durante a realizao deste trabalho, extensivos a todos os funcionrios desta Direco Regional que, directa ou indirectamente, colaboraram para a realizao deste estgio. Ao Engenheiro Mrio vila Gomes, do Jardim Botnico do Faial, pelos conhecimentos e colaborao prestados relativamente a este taxon.

Ao Dr. Joo Paulo Constncia, do Museu Carlos Machado, Ponta Delgada, pela ateno e colaborao prestadas durante a pesquisa bibliogrfica. Professora Doutora Susyn Andrews, do Royal Botanic Gardens of Kew, Inglaterra, pela ateno dispensada no envio de bibliografia relativa propagao neste gnero.

NDICE

I. INTRODUO .................................................................................................. 1 II. DISTRIBUIO GEOGRFICA, SISTEMTICA E FILOGENIA ................ 15 II. 1 Distribuio geogrfica .......................................................... 15 II. 2 Sistemtica e filogenia .......................................................... 20 III. MORFOLOGIA .............................................................................................. 31 III. 1 Morfologia do caule ............................................................... 31 III. 2 Morfologia foliar ................................................................... 31 III. 3 Morfologia floral ................................................................... 33 III. 4 Carpomorfologia ................................................................... 35 IV. ECOLOGIA .................................................................................................... 39 IV. 1 Breve caracterizao edafo climtica dos Aores ........ 39 IV. 2 Distribuio, habitat e status para a Ilha de So Miguel 42 IV. 3 Fenologia ................................................................................. 47 IV. 4 Fitossociologia ........................................................................ 48 IV. 4. 1 Florestas Naturais ..................................................... 48 IV. 4. 2 Comunidades de matos ........................................... 54 IV. 4. 3 Brifitos e lquenes associados .............................. 57 V. MULTIPLICAO IN VITRO ........................................................................ 68 V. 1 Fundamentao bibliogrfica ............................................... 68 V. 2 Material e mtodos ................................................................. 68 V. 2. 1 Origem e tipo do material vegetal .......................... 68 V. 2. 2 Equipamento e material laboratoriais ................... 69 V. 2. 3 Colheita do material vegetal .................................... 70 V. 2. 4 Limpeza do material vegetal .................................... 71 V. 2. 5 Desinfeco do material vegetal ............................. 71 V. 2. 6 Lavagem do material de laboratrio ...................... 73

V. 2. 7 Esterilizao do material de laboratrio ............... 73 V. 2. 8 Esterilizao da gua destilada ............................... 73 V. 2. 9 Esterilizao dos meios de cultura ........................ 73 V. 2. 10 Composio dos meios de cultura ....................... 74 V. 2. 10. 1 Meios bsicos ............................................... 74 V. 2. 10. 2 Meios suplementados ................................ 75 V. 2. 11 Preparao dos meios de cultura ........................ 78 V.2.11.1 Elaborao das solues-me de macronutrientes, micronutrientes, quelato de ferro e vitaminas ......................................... 78 V. 2. 11. 2 Elaborao das solues-me dos reguladores de crescimento ..................... 78 V. 2. 11. 3 Elaborao dos meios de cultura ........... 79 V. 2. 12 Tcnicas de dissecao ........................................... 79 V. 2. 13 Colheita e anlise de dados ................................... 81 V. 3 Resultados e discusso .......................................................... 83 V. 3. 1 Micropropagao ........................................................ 83 Influncia da desinfeco na contaminao ......................... 83 Influncia da desinfeco na necrose ..................................... 88 Influncia Influncia dos dos meios meios de de cultura/reguladores cultura/reguladores de de crescimento na necrose .............................................................. 90 crescimento e da poca do ano no desenvolvimento de tecido caloso ................................................................................ 94 Influncia dos meios de cultura/reguladores de crescimento e da poca do ano na diferenciao ................ 97 V. 3. 2 Cultura de meristemas ............................................. 99 VI. MULTIPLICAO POR ESTACARIA CLSSICA ................................... 101 VI. 1 Fundamentao bibliogrfica ........................................... 101 VI. 2 Material e mtodos ............................................................. 102 VI. 2. 1 Origem e tipo do material vegetal ...................... 102 VI. 2. 2 Colheita do material vegetal ................................ 102

VI. 2. 3 Preparao das concentraes hormonais ....... 102 VI. 2. 4 Montagem dos ensaios ......................................... 103 VI. 2. 5 Colheita e anlise dos dados ............................... 104 VI. 3 Resultados e discusso ...................................................... 105 VII. MULTIPLICAO POR SEMENTES ....................................................... 110 VII. 1 Fundamentao bibliogrfica .......................................... 110 VII. 2 Material e mtodos ............................................................ 111 VII. 2. 1 Origem do material vegetal ................................ 111 VII. 2. 2 Colheita dos frutos ............................................... 111 VII. 2. 3 Extraco e armazenamento dos caroos ....... 111 VII. 2. 4 Desinfeco do material vegetal ........................ 112 VII. 2. 5 Tratamentos (quebra de dormncia) ................ 112 VII. 2. 5. 1 Escarificao ............................................. 112 VII. 2. 5. 2 Estratificao ............................................ 112 VII. 2. 5. 3 Lixiviao ................................................... 112 VII. 2. 5. 4 Embebio ................................................. 113 VII. 2. 5. 5 Aplicao de nitrato de potssio .......... 113 VII. 2. 5. 6 Adio de reguladores de crescimento 113 VII. 2. 6 Montagem dos ensaios ........................................ 113 VII. 2. 6. 1 Ensaios de germinao ........................... 113 VII. 2. 6. 2 Sementeiras ............................................... 116 VII. 2. 7 Colheita e anlise de dados ................................ 117 VII. 3 Resultados e discusso .................................................... 118 VIII. CONCLUSES ......................................................................................... 121 IX. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 123

X. ANEXOS ....................................................................................................... 143

I. INTRODUO

A crescente aco humana sobre os ecossistemas tem conduzido a alteraes ao nvel da biodiversidade com consequncias por vezes irreversveis. Neste contexto, o estabelecimento de medidas de preservao e conservao assume um estatuto de relevo, como garante da recuperao e revitalizao dos ecossistemas.

O isolamento das ilhas aliado ausncia de mamferos herbvoros e ocorrncia nos de condies climticas Deste favorveis as permitiu a sobrevivncia de muitas espcies com caractersticas primitivas j inexistentes continentes. modo, floras insulares, vulnerveis aco humana, revestem-se de grande significado cientfico, nomeadamente para os estudos florsticos e evolutivos (Melville, 1979).

Contudo, o coberto natural primitivo aoriano tem sido sujeito a uma constante degradao, quer por transformao de reas florestais em pastagens, quer por invaso de espcies exticas (Costa et al., 1993) utilizadas originalmente como sebes (e. g. Pittosporum undulatum) (Oliveira, 1985) ou cultivadas como ornamentais (e. g. Gunnera chilensis, Hedychium gardneranum) (Costa et al., 1993).

O nmero de plantas vasculares nos Aores cifra-se em cerca de 1011 espcies (Hansen, 1988 in Sjgren, 1990), apresentando este arquiplago, segundo Sjgren (1994), uma vegetao cada vez mais rara no espao europeu, a qual encerra endemismos vasculares e criptogmicos com uma especial incidncia na floresta de nvens EricaJuniperus-Laurus. Os Aores possuem cerca de 300 espcies vasculares indgenas, sendo a percentagem dos taxa vasculares endmicos na ordem dos 27% (W. W. F. & I. U. C. N., 1994). 1

A necessidade da preservao do coberto natural aoriano conduziu criao do Jardim Botnico do Faial (Gomes, 1994) e de vrias reas protegidas (Pereira et al., 1998c), apesar da existncia destas ltimas no significar necessariamente uma efectiva conservao das comunidades vegetais naturais, uma vez que no existe um conhecimento suficiente acerca da rea mnima necessria para a manuteno da dinmica e da biodiversidade destas comunidades (Bramwell, 1991 in Pereira et al., 1998c), para alm das carncias de pessoal, de condies materiais e de conhecimentos relativos gesto dessas mesmas reas protegidas (Pereira et al., 1998c).

Dentro da mesma linha conservacionista, o Departamento de Biologia da Universidade dos Aores tem efectuado estudos aos nveis do status, da fenologia, da ecofisiologia da germinao e da cultura in vitro de taxa endmicos (Pereira et al., 1998c). Para a implementao desta ltima linha de investigao foi criada, em 1992, uma unidade de micropropagao com o objectivo de delinear metodologias de multiplicao in vitro, possibilitando a reintroduo destes taxa em reas protegidas (proteco in situ), bem como em jardins, zonas de lazer e bermas de estradas (proteco ex situ), no mbito de um plano de conservao autoecolgico (Moura & Pereira, 1994; Moura, 1998), tendo sido publicados vrios trabalhos nesta e noutras reas da multiplicao vegetal (e. g. Macedo, 1998; Maciel & Caixinhas, 1993, 1994, 1998; Maciel, 1994a, 1994b; Maciel et al., 1994, 1998; Moura, 1995, 1998; Toste, 1995; Pereira et al., 1996; Loura & Pereira, 1998; Maciel & Moura, 1998; Moura et al., 1998; Pereira et al., 1998a, 1998b; Toste & Moura, 1998; Pereira, 1999). Para uma efectiva conservao in e ex situ, e adicionalmente pesquisa das metodologias mais adequadas para a multiplicao dos respectivos taxa, sero tambm necessrios estudos a vrios nveis sobre as espcies em causa, designadamente ecolgicos, evolutivos, taxonmicos ou mesmo geogrficos.

A degradao das florestas de altitude na Ilha de So Miguel tem colocado em perigo de extino o prilo, Pyrrhula murina, uma ave endmica aoriana restrita a uma pequena rea de vegetao primitiva desta ilha (Costa et al., 1993), que se alimenta de vrios taxa endmicos aorianos, designadamente de Viburnum tinus L. ssp. subcordatum (Trel.) P. Silva, Prunus lusitanica ssp. azorica (Mouillef) Franco, Vaccinium cylindraceum Sm., Rubus hochstetterorum Seub. e Ilex perado ssp. azorica Tutin (Ramos, 1995 in Pereira et al., 1998c) e que nidifica de Junho a Agosto, quando a disponibilidade de alimento elevada (Ramos, 1994). Neste sentido, a Direco Regional dos Recursos Florestais e o Departamento de Biologia da Universidade dos Aores estabeleceram um projecto conjunto: Projecto LIFE II Estudo e Conservao do Patrimnio Natural dos Aores: Subprojecto A Conservao do Prilo, com a finalidade de proceder ao controlo das plantas exticas, reintroduo dos taxa utilizados como fonte alimentar por parte desta ave e instalao temporria de estaes artificiais de alimentao (Ramos, in press). O taxon Ilex perado ssp. azorica Tutin, de nome vulgar Azevinho, pertence famlia Aquifoliaceae e ao gnero Ilex, que engloba 30 espcies caducas e mais de 780 espcies perenes distribudas mundialmente pelas zonas temperadas, sub-tropicais e tropicais (Galle, 1997), sendo utilizado em marcenaria (Morelet, 1860) e na alimentao do gado (Frutuoso, 1978; Santos, 1989; Dias, 1996) e ocorrendo em todas as ilhas dos Aores, excepo da Ilha Graciosa (Furtado, 1984; Sjgren, 1984; Dias, 1989; Hansen & Sunding, 1993). Todavia, apresenta uma classificao sistemtica e uma filogenia no definidas. A sua seleco para o presente trabalho deveu-se ao seu status e ao seu potencial interesse econmico como planta ornamental, para alm do j citado interesse na conservao de Pyrrhula murina. Embora o seu status seja frequente para a Ilha Terceira (Dias, 1989, 1996), este taxon encontra-se num estado de algum risco, dada a degradao dos

seus bitopos decorrentes da invaso de plantas exticas e da aco antrpica, nomeadamente nas Ilhas de So Miguel e do Faial, alis como parece ocorrer, segundo Andrews (1984b), com todo o Complexo Ilex perado das Ilhas do Atlntico Norte, pelo que sugerida a atribuio de um status pouco frequente, designadamente para as duas ilhas referenciadas. O taxon Ilex perado ssp. azorica Tutin uma rvore ou arbusto de zonas hiper-hmidas altas (Gomes, 1994), que ocorre preferencialmente acima dos 500 metros de altitude, embora a sua distribuio abrangesse outrora zonas mais baixas como o evidenciam dados fsseis e experimentais (Dias, 1996). Segundo Sjgren (1984), ocorre em locais expostos e muito abrigados, ravinas, correntes de lava ou crateras, apresentando, frequentemente, o tronco revestido por musgos. A bibliografia consultada para a realizao deste trabalho incidiu, maioritariamente, sobre o respectivo gnero dada a elevada escassez de trabalhos publicados especificamente sobre o taxon. Este estudo comportou ensaios de cultura in vitro, nomeadamente com microestacas uninodais e meristemas, ensaios de estacaria clssica, bem como o estudo da ecofisiologia da germinao e regeu-se pelos seguintes objectivos: 1) Contribuir para a conservao de um taxon endmico da flora dos Aores e consequentemente da vegetao natural aoriana; 2) aumentar degradadas; 3) pesquisar as melhores tcnicas de colheita de material vegetal, sua desinfeco, meios de cultura bsicos, complementos hormonais e aclimatao das plantas produzidas; os efectivos populacionais do taxon, possibilitando a sua reintroduo em reas de vegetao

4) 5)

determinar as condies que permitam quebrar a dormncia apresentada pelas suas sementes; concluir qual (quais) a (s) metodologia (s) mais eficientes para a multiplicao do taxon.

Complementarmente, procedeu-se a uma pesquisa bibliogrfica acerca de outros aspectos da biologia deste taxon e/ou do respectivo gnero de modo a contribuir para uma efectiva conservao do mesmo. A cultura de tecidos, uma das tecnologias utilizadas neste trabalho, remonta a 1902, aquando das experincias pioneiras levadas a cabo por Gottlieb Haberlandt, atravs da cultura de clulas vegetais isoladas (Kyte, 1987; Giles & Songstad, 1990; Read, 1992; Kitto, 1997), provavelmente com o objectivo de estudar a totipotncia e explorar a morfognese (Read, 1992). Estudos efectuados mais tarde demonstrariam que seria possvel a proliferao de clulas em cultura bem como a sua diferenciao (Gautheret, 1939, Nobcourt, 1939, White, 1939 in Thorpe, 1990). Posteriormente, o conceito de propagao de clones via cultura de tecidos (micropropagao) foi apresentado comunidade cientfica por Morel em 1960 (Kitto, 1997). Morel (1960, 1963 in Debergh et al., 1990) descobriu que a cultura de meristemas podia ser utilizada como meio de propagao de Cymbidium, ocorrendo a partir da um aumento significativo no nmero de espcies micropropagadas. Em 1962, Murashige e Skoog referiam-se ao meio MS como meio de cultura para a planta do tabaco, hoje amplamente utilizado para a cultura in vitro de vrias espcies (Gamborg & Shyluk, 1981; Kyte, 1987; Hartmann et al., 1990; Gamborg, 1991). Os instrumentos necessrios a uma efectiva micropropagao, a partir dos designadamente a aplicao de reguladores de crescimento e o desenvolvimento de meios, tornaram-se disponveis ltimos anos da dcada de cinquenta (Read, 1992; Kitto, 1997). Todavia, seria durante as dcadas de setenta e de oitenta que a micropropagao comercial se instalaria (Read, 1992; Kitto, 1997), inicialmente para as

espcies pertencentes ao gnero Ficus e famlia Araceae (Debergh et al., 1990). A cultura in vitro de plantas superiores, caracterizada por ocorrer em micro escala, sob condies fsicas, nutricionais e hormonais optimizadas (Pierik, 1994), definese como a cultura assptica de uma ampla variedade de material vegetal, sendo utilizada na propagao, mas tambm noutros domnios como a modificao genotpica ou a produo de biomassa e de produtos bioqumicos, entre outros (Hartmann et al., 1990). Esta tcnica de cultura difere dos mtodos tradicionais de propagao pela separao dos componentes biolgicos do sistema e pelo elevado grau de controlo que possvel obter em cada aspecto dos processos de regenerao e de desenvolvimento, em que cada etapa da sequncia pode ser manipulada (ou programada) pela seleco do material e controlo do ambiente in vitro (incluindo os aspectos patognicos) com vista a maximizar a produo em termos de nmero, tamanho e qualidade (Hartmann et al., 1990). A cultura in vitro baseiase, em primeiro lugar, no princpio da totipotncia, isto , o potencial gentico que toda a clula viva possui para reproduzir um organismo integral; um segundo princpio diz respeito regulao hormonal tornada possvel pela descoberta das auxinas e citocininas, cuja interaco foi revelada por Skoog e Miller utilizando plantas de tabaco (Hartmann et al., 1990). Os mtodos clssicos de propagao vegetativa ex vitro no conduzem, frequentemente, a uma multiplicao efectiva, dado que estes, por vezes, se tornam demasiado lentos, difceis, caros ou mesmo completamente impossveis de realizar, o que conduziu a uma maior utilizao da micropropagao, a qual corresponde, segundo Debergh & Read (1991), multiplicao conforme de um gentipo seleccionado, por

via da utilizao da cultura in vitro. De facto, a aplicao mais importante da cultura in vitro a micropropagao (Pierik, 1994), que permite a multiplicao de plantas superiores (Hussey, 1986 in Debergh et al., 1990; Pierik, 1994) livres de doenas ou de plantas cuja propagao ex vitro se torna invivel (Pierik, 1994). A cultura de microestacas uninodais constitui a tcnica mais importante para a micropropagao de plantas (Hartmann et al., 1990), sendo o mtodo mais simples e seguro e resultando na produo de rebentos e na regenerao radicular destes (Pierik, 1994). Este sistema, cuja taxa de propagao est altamente dependente do nmero de folhas formadas in vitro, caracterizase por ser um mtodo seguro, uma vez que a integridade dos meristemas e das gemas no perturbada (Pierik, 1994), permitindo deste modo a preservao do patrimnio gentico dos taxa endmicos. A cultura de meristemas tem sido extensivamente utilizada durante as duas ltimas dcadas na propagao vegetal, em que na realidade o meristema e os tecidos subjacentes so utilizados (Kartha, 1981). Constitui uma tcnica que permite uma propagao rpida das plantas em causa, embora a sua aplicao mais importante resida no facto de permitir a produo de plantas livres de patologias, nomeadamente as de origem viral (Kartha, 1981). O sucesso da micropropagao depende da optimizao de muitas variveis como o gentipo, os efeitos dos agentes patognicos, a idade da plantame, a seleco dos explantados, os efeitos das hormonas e do meio de cultura ou os factores ambientais (Hartmann et al., 1990). Os agentes contaminantes incluem, entre outros microrganismos, fungos e bactrias, sendo necessrio a esterilizao de todo o material e meios de cultura utilizados, bem como a eliminao dos contaminantes presentes no stock de plantas utilizado com fonte de explantados

(Biondi & Thorpe, 1981; Hartmann et al., 1990; Kyte, 1987), incluindo um controlo sobre as populaes de caros e de insectos (Debergh & Maene, 1984a; Hartmann et al., 1990), uma vez que inibem o desenvolvimento das plantasme e interferem com a fisiologia e bioqumica do sistema atravs da libertao de produtos metablicos (Biondi & Thorpe, 1981). A contaminao provocada por fungos geralmente atribuda presena exgena de esporos na plantame ou a fungos endgenos (Debergh & Maene, 1984a). A contaminao bacteriana frequente ocorrer na cultura de tecidos, tendo j muitos autores procedido ao isolamento de bactrias patognicas ou saprfitas, as quais em muitos casos no se revelam prejudiciais s prprias plantas, sendo mesmo toleradas por estas (Debergh & Maene, 1984a). Geralmente, os agentes contaminantes esto presentes somente superfcie das plantas, embora possam estar alojados noutros locais das mesmas, designadamente nos espaos entre as escamas das gemas, apesar das estruturas internas como os locais de crescimento das gemas e o interior das sementes e frutos, que tendem a estar relativamente livres de agentes patognicos, possam ser invadidas pelos miclios, nomeadamente se a atmosfera apresentar-se demasiado hmida

(Hartmann et al., 1990). O sucesso na micropropagao de plantas lenhosas depende, em grande parte, da idade da plantame, uma vez que as plantas jovens so, invariavelmente, mais favorveis s tcnicas de micropropagao (Hartmann et al., 1990), sendo a escolha apropriada dos explantados um elemento chave na micropropagao, requerendo a aplicao desta tcnica a uma nova espcie uma anlise sistemtica do potencial dos explantados (Hartmann et al., 1990). Murashige (1974 in Read, 1992) refere a importncia de uma seleco adequada dos explantados, tendo em ateno o gentipo, o orgo seleccionado, as idades fisiolgica e

cronolgica, a estao do ano, o estado de desenvolvimento bem como o estado geral dos mesmos. Um meio basal, que consiste em componentes essenciais (sais inorgnicos, fonte de carbono e de energia, vitaminas e hormonas vegetais) e opcionais (compostos nitrogenados orgnicos, cidos orgnicos e substncias complexas, entre outros) (Gamborg & Shyluk, 1981; Kyte, 1987; Gamborg, 1991) deve ser escolhido ou estabelecido atravs de uma anlise sistemtica, sendo, provavelmente, o meio Murashige & Skoog (MS) (Murashige & Skoog, 1962) o mais utilizado (Gamborg & Shyluk, 1981; Hartmann et al., 1990; Gamborg, 1991) especialmente para a morfognese, cultura de meristemas e regenerao de plantas (Gamborg & Shyluk, 1981). Diversos factores tm sido referidos como influenciadores da diferenciao organognica in vitro e/ou dos modelos de morfognese ex vitro, designadamente reguladores de crescimento como as auxinas ou as citocininas, entre outros, que podem apenas ser detectados se induzirem respostas ao nvel da morfognese (Tran Thanh Van & Trinh, 1990). As auxinas promovem a expanso e o alongamento celulares (Kyte, 1987), assim como a formao de razes, sendo frequentemente utilizadas em combinao com as citocininas (Kyte, 1987; Hartmann et al., 1990; Gamborg, 1991). As citocininas, derivadas da adenina, possuem um papel essencial na diferenciao e regenerao vegetais (Gamborg, 1991), uma vez que promovem a formao de rebentos e a diviso celular, influenciam o transporte da auxina, afectam a abcisso foliar e auxiliam no controlo da germinao (Kyte, 1987). Estas hormonas so utilizadas frequentemente na fase de iniciao devido ao seu baixo custo econmico e sua capacidade de quebra de dormncia das gemas, embora concentraes demasiado elevadas desta hormona possam reflectir-se em plantas fisiologicamente aberrantes, com

dificuldades

de

induzirem

formao

de

razes,

entre

outras

anormalidades (Debergh & Maene, 1984b). As variaes genticas em plantas ou clulas regeneradas in vitro foram reconhecidas nos ensaios de Lutz efectuados com a planta do tabaco e de Heinz e Mee com a cana de acar (Semal & Lepoivre, 1990). Quando estas variaes ocorrem nas plantas regeneradas in vitro, frequentemente como resultado de uma instabilidade gentica, o termo variao somaclonal empregue (Pierik, 1994). Este foi proposto por Larkin & Scowcroft (1981 in Semal & Lepoivre, 1990) para toda a variao gentica detectada nas plantas com origem em quaisquer tipos de culturas. Muitos factores determinam a possibilidade e a frequncia da mutao durante a cultura in vitro, nomeadamente o mtodo de micropropagao utilizado, o tipo de tecido seleccionado (Pierik, 1994), ou a composio do meio de cultura, incluindo a natureza e as concentraes relativas de auxinas e citocininas (Shepard, 1981, Sree Ramulu et al., 1983b in Semal & Lepoivre, 1990). A variao somaclonal, dependente da variao natural obtida numa populao de clulas, pode reflectir diferenas genticas celulares pr-existentes (Debergh et al., 1990; Thorpe, 1990) ou uma variabilidade gentica induzida pela prpria cultura in vitro, podendo manifestar-se atravs de alteraes aos nveis da pigmentao, da produo de sementes, do vigor e tamanho da planta, das morfologias floral e foliar e da tolerncia e resistncia a doenas (Thorpe, 1990). A validade da micropropagao para as plantas lenhosas irrefutvel (Debergh, 1988), representando as tcnicas de cultura in vitro um meio vlido atravs do qual possvel o aumento do efectivo populacional de espcies ameaadas (Iriondo & Perez, 1989; Moreira da Silva & Debergh, 1998; Russell-Pinto et al., 1998), uma vez que a partir

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de uma pequena quantidade inicial de material vegetal possvel a obteno de um elevado nmero de indivduos (Kyte, 1987; Iriondo & Perez, 1989; Moreira da Silva & Debergh, 1998; Russell-Pinto et al., 1998), permitindo, concomitantemente, a manuteno dos gentipos e a ultrapassagem dos problemas derivados da fertilidade, da fraca produo seminal e da reduzida capacidade de germinao (Bramwell, 1990). A propagao por estacaria envolve o corte de uma parte de um caule, raz ou folha, que induzida a formar razes e novos rebentos por intermdio de uma manipulao qumica, mecnica e/ou ambiental (Hartmann et al., 1990). Esta tcnica corresponde ao meio mais importante de propagao para as espcies ornamentais e apresenta numerosas vantagens para as espcies que podem ser facilmente propagadas por este mtodo: podem ser produzidas novas plantas num pequeno espao a partir de um stock de plantas mais reduzido; para alm de ser rpido e simples, no necessitando de tcnicas especiais como a micropropagao, apresenta um custo econmico reduzido; possvel obter uma grande uniformidade devido ausncia de variao, em que a planta original , em geral, exactamente reproduzida sem alterao gentica (Hartmann et al., 1990). Porm, apresenta desvantagens, designadamente um aumento da susceptibilidade a doenas e a pragas, uma vez que as plantas clonadas perdem a diversidade gentica caracterstica da maioria das plantas propagadas por via seminal (Hartmann et al., 1990), para alm de requererem uma muito maior quantidade de material vegetal para uma efectiva aplicao, o que no caso dos endemismos poder por vezes revelar-se prejudicial manuteno de algumas populaes mais reduzidas. Muitas plantas podem ser propagadas atravs de diferentes tipos de estacas com resultados satisfatrios, dependendo o tipo preferido

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das circunstncias individuais, sendo importante, na seleco do material vegetal, a escolha de plantas livres de doenas, moderadamente vigorosas e de identidade conhecida, evitando-se as danificadas pelo gelo, aridez, pragas ou em estado de florao ou de frutificao; com o objectivo de promover o enrazamento das estacas e de aumentar a uniformidade deste ltimo realizado um tratamento com reguladores de crescimento, nomeadamente com auxinas (Hartmann et al., 1990). A germinao, isto , a passagem de uma semente inerte a uma planta jovem (Maciel, 1994a), corresponde a um processo complexo, no qual se observam transformaes morfolgicas, fisiolgicas e bioqumicas desencadeadas na sua maioria quando dispem de condies convenientes de temperatura, arejamento, humidade e, em determinados casos, de iluminao (Caixinhas, 1980 in Maciel, 1994a). O conceito de germinao no tem sido consensual entre os vrios autores, assumindo definies diversas consoante o mbito da investigao. Assim, morfologicamente, significa a transformao de um embrio numa plntula; fisiologicamente, corresponde reaquisio do metabolismo e do crescimento que estavam inibidos ou suspensos, desencadeando-se a transcrio do genoma; bioquimicamente, ser a diferenciao sequencial das vias sintticas e oxidativas (Jann & Amen, 1977). Contudo, actualmente, todos concordam que a germinao termina quando a radcula eclode dos invlucros seminais ou tratandose de um embrio isolado, desde que a radcula se comea a alongar, isto , a definio proposta por Evenari (1957 in Cme, 1982, Maciel, 1994a). Durante o seu ciclo de vida, as plantas esto expostas a perodos de stress causados por extremos trmicos, seca ou outros factores ambientais, tendo ocorrido o desenvolvimento de mecanismos de proteco contra esses mesmos perodos desfavorveis, designadamente a dormncia, a qual simplesmente definida, corresponde incapacidade

12

de uma semente vivel, de uma planta inteira ou de um meristema (gema ou pice) de crescerem (Dennis, Jr., 1994). No entanto, segundo Lang (1987 in Maciel, 1994b), a mesma corresponder a uma suspenso temporria visvel do crescimento de qualquer estrutura da planta contendo um meristema. Quando uma semente separada da planta invariavelmente possui dormncia primria, o que no s evita uma germinao imediata, mas tambm regula o tempo, as condies e o local onde se ir processar a germinao, ocorrendo assim diferentes tipos de dormncia primria como meio de auxiliarem a sobrevivncia das espcies, programando a germinao para pocas favorveis (Hartmann et al., 1990). De facto, quer as sementes quer as gemas exibem dormncia, a qual apresenta quer num caso quer noutro muitas caractersticas em comum, tais como: necessidade de um ptimo trmico para a quebra de dormncia (Vegis, 1964, Powell, 1987 in Dennis, Jr., 1997); tempos de exposio a temperaturas baixas (refrigerao) similares para um dado gentipo; potencial de crescimento reduzido quando a refrigerao interrompida por temperaturas elevadas; e a possibilidade de estmulo ou inibio da germinao/quebra de dormncia das gemas por reguladores de crescimento (Vegis, 1964, Powell, 1987 in Dennis, Jr., 1997), levando a que vrios autores tenham proposto mecanismos comuns controladores para estes dois fenmenos (Vegis, 1964, Wareing et al., 1964, Powell, 1987 in Dennis, Jr., 1997). Todavia, determinados investigadores notam diferenas significativas entre as sementes e as gemas, advogando que os seus estados de dormncia no podero ser comparados to facilmente, referindo-se ao facto de uma semente, ao contrrio de uma gema, representar uma planta integral (Crabb, 1994 in Dennis, Jr., 1997). A propagao por sementes implica uma gesto cuidadosa das condies de germinao, dependendo o seu sucesso de vrios aspectos, designadamente da utilizao de sementes com as

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caractersticas genticas apropriadas, da boa qualidade das sementes, da metodologia utilizada para a quebra de dormncia e das condies ambientais que devem ser adequadas germinao (Hartmann et al., 1990). Por definio, uma semente que dormente possui um potencial de germinao, mas ter de ser exposta a determinados tratamentos para que tal ocorra mais rapidamente (Dennis, Jr., 1994), tais como a escarificao, a estratificao, a lixiviao e determinados tratamentos laboratoriais com reguladores de crescimento, sendo por vezes utilizadas combinaes destes procedimentos, nomeadamente para plantas lenhosas (Hartmann et al., 1990).

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II. DISTRIBUIO GEOGRFICA, SISTEMTICA E FILOGENIA

II. 1 Distribuio geogrfica As Aquifoliaceae encontravam-se amplamente distribudas,

embora com uma maior diversidade na Laursia (Figura 1) (Raven & Axelrod, 1974), composta pela Amrica do Norte e pela Eursia e que ter correspondido parte norte de um super continente, a Pangeia (que existiu, de acordo com Alfred Wegener, h mais de 200 milhes de anos) e cuja separao da Gondwanalndia ocorreu h 180 milhes de anos (Wyllie, 1988).

Figura 1 Laursia: posicionamento geogrfico (Wyllie, 1988).

O gnero Ilex, conhecido a partir do plen maastrichtiano (Figura 2, Tabela I) (Muller, 1970 in Raven & Axelrod, 1974), corresponde a um gnero bastante antigo, que apareceu provavelmente no incio do

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Cretcico Superior (Martin, 1977; Pielou, 1992) (Figura 2 e Tabela I) em locais geograficamente distintos. Possuiu um carcter cosmopolita ao longo da Histria, durante a qual ocorreram restries sua distribuio, nomeadamente provocadas pelas alteraes climticas, como por exemplo na Austrlia, onde a aridez constituiu um factor limitante sua distribuio (Martin, 1977).

106 ANOS

ERA

PERODO

POCA

ESTADO

IDADE (M. A.)

Holocnico Quaternrio Plistocnico

2.5

C E N O Z I C O

Neognico

Pliocnico Miocnico

12

25

Paleognico Tercirio

Oligocnico
38

Eocnico

Superior 54 Inferior

Paleocnico

65
Maastrichtiano Campaniano 70 80 85 90 100

Superior
M E S O Z I C O

Santoniano Coniaciano Turoniano

Cretcico
Cenomaniano 110 Albiano Aptiano Barremiano Hauteriviano Valanginiano Riazaniano 122 125

Inferior

Jurssico Fig.225Escala de tempo geolgico (Tschuddy & Scott, 1969, Raven & Axelrod, 1974 in Jones, Jr. & 2Trissico

135

Figura 2 Escala de tempo geolgico (Tschuddy & Scott, 1969, Raven & Axelrod, 1974 in Jones, Jr. & Luchsinger, 1987).

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Tabela I - Registo de eventos geolgicos, climticos e botnicos (Jones, Jr. & Luchsinger, 1987). 106 ANOS 2.5 POCA OU PERODO Plistocnico EVENTOS GEOLGICOS, CLIMTICOS E BOTNICOS Regenerao dos Andes, Montanhas Rochosas e dos Himalaias. Sucessivas glaciaes e aquecimentos. Desenvolvimento das floras modernas. 12 Pliocnico Clima semelhante ao actual

25

Miocnico

Surgimento dos Himalaias. Arrefecimento inicial acompanhado por um arrefecimento final.

38

Oligocnico

Continentes do sul e do norte amplamente separados; surgimento dos Alpes. Aquecimento climtico acompanhado por um arrefecimento posterior. Aproximao s famlias de angiosprmicas modernas.

54

Eocnico

Aumento da temperatura. Aparecimento das inflorescncias e flores adaptadas ao vento e polinizao pelos insectos.

65

Paleocnico

As Montanhas Rochosas e os Andes completam o seu surgimento. Clima mais temperado e variado.

110

Cretcico Superior

Grande parte do continente americano encontra-se coberto pelos mares. Final do arrefecimento climtico. As angiosprmicas tornam-se dominantes.

135

Cretcico Inferior

Clima quente e hmido. Aparecimento documentado das primeiras angiosprmicas (plen monossulcado com 125 milhes de anos).

180

Jurssico

Formao do Oceano Atlntico como resultado da deriva dos continentes. Possvel aparecimento das primeiras angiosprmicas.

A sua origem sudeste asitica postulada por vrios autores e baseia-se na elevada concentrao de espcies primitivas que a ocorrem (Martin, 1977). Os quatro registos fsseis do Cretcico, localizados na exURSS, no sudeste da Austrlia, no noroeste do Bornu e na Califrnia, cujas estratigrafia e datao no se apresentam suficientemente

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precisas, indicam que o gnero uma das angiosprmicas mais antigas e provavelmente apresentava uma distribuio mundial no Cretcico, tendo a disperso das sementes pelas aves e a germinao lenta das mesmas contribudo para a sua distribuio cosmopolita (Martin, 1977). Todavia, segundo Cunoud et al. (2000), as hipteses

fitogeogrficas discutidas por autores como Martin (1977) sobre a diversificao do gnero Ilex, baseiam-se principalmente na classificao de Loesener, a qual ser posteriormente referida, designadamente para o taxon em questo. No Tercirio Inferior, as massas continentais volta do Plo Norte estiveram cobertas pela geoflora terciria, que inclua todas as plantas tpicas das florestas actuais da sia oriental, da Europa ocidental e do leste e parte do oeste da Amrica do Norte (Lve & Lve, 1967). Tratavase de uma flora, que tendo ocorrido nas costas norte da Laursia e na regio que se estende desde o Japo ao Alaska, incluindo a Berngia, compreendeu vrios tipos de florestas, os quais reflectiam diferentes condies climticas impostas pela sua localizao relativamente s costas ou s montanhas (Lve & Lve, 1967). Durante o Tercirio, o clima tornou-se gradualmente mais frio, tendo a vegetao migrado para sul (Lve & Lve, 1967; Sunding, 1979) em direco ao Ttis, actual Mediterrneo, e posteriormente ainda mais para sul, abrangendo o norte de frica (Sunding, 1979). O clima apresentou-se tambm mais seco e as grandes reas desertas do norte de frica e da sia ocidental formaram-se, provocando a diviso da distribuio contnua de muitos taxa, tendo muitas espcies desaparecido totalmente ou encontrado a possibilidade de uma existncia contnua em locais mais favorveis como as ilhas da Macaronsia, o sul e leste de frica ou a sia (Sunding, 1979).

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A origem deste taxon est intimamente associada origem global da vegetao natural dos Aores ou mesmo da Macaronsia. Esta flora, nomeadamente os endemismos, tem vindo a ser frequentemente interpretada como uma relquia desta flora terciria (e. g. Lve & Lve, 1967; Dansereau, 1968; Bramwell, 1972, 1976; Sunding, 1979). Esta sobreviveu inaltervel nas ilhas durante largos perodos de tempo devido possivelmente a uma competio relativamente reduzida em reas com uma diversidade florstica baixa, a reduzidas taxas de imigrao de novas espcies e ao facto das ilhas terem constitudo um verdadeiro tampo climtico durante o Plistocnico graas aco das massas ocenicas circundantes (Cronk, 1992). A origem provvel deste taxon nas famlias das florestas tropicais africanas, constituindo-se como um elemento da flora tetianoterciria europeia, a qual migrou para a Amrica do Norte, servindo a Macaronsia de ligao entre estes dois continentes durante e aps as glaciaes (Dias, 1989), evidenciada por vrios factos: Determinadas espcies ou as suas respectivas formas primitivas, como o Ilex, ocorreram em depsitos fsseis do Pliocnico e do Miocnico no continente europeu, concertantes com um clima quente e hmido e actualmente presentes nos Aores (Teixeira & Pais, 1976 in Dias, 1989); Tendo por base as reconstrues das correntes que colocam a Amrica oriental e a Europa ocidental em latitudes mais quentes e apresentando um clima seco sazonal, taxa como o Ilex podero ter migrado, no atravessando portanto o Atlntico durante encontrar um perodo flora compreendido entre o Cretcico Superior e o Eocnico Inferior, sendo surpreendente uma mediterrnea nos Aores (e. g. Ilex, Myrica, Erica) e que vrios gneros, incluindo o Ilex, ocorram nas reas sub-hmidas do

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Mxico

possuam

representantes

no

perodo

Neognico

californiano e no Mediterrneo (Raven & Axelrod, 1974); Segundo Sunding (1979), a flora subtropical hmida existente at ao Tercirio Superior (Miocnico e Pliocnico) estava distribuda na Europa e parcialmente no norte de frica. Esta flora foi alvo de vrios estudos por parte de alguns autores (e. g. Schenck, 1907, Depape, 1922), tendo sido encontrados fsseis vegetais, que aparentam ser familiares com a flora das Canrias ou da Madeira, em determinadas localidades de Espanha, Itlia, Frana, ustria e Hungria (Sunding, 1979); Na anlise fssil de depsitos do Miocnico e do Pliocnico, na regio mediterrnica ocidental, foi detectada a presena da espcie Ilex canariensis no Vale do Rdano (Saporta, 1862-1874, Depape, 1922 in Bramwell, 1972, 1976). Este gnero assume-se como um paleoendemismo ou endemismo antigo, o qual integra espcies de gneros monotpicos ou seces taxonomicamente isoladas, com ausncia de correspondncia com taxa no endmicos, podendo apresentar diplidia ou poliplidia ao nvel citolgico (Dias, 1989). De um modo geral, as aves frugvoras so tidas como responsveis pela disperso do Ilex (Guppy, 1917), tendo sido encontrados excrementos de aves contendo caroos deste taxon, designadamente nas Lombadas, Ilha de So Miguel (Van Der Kloet, comunicao pessoal). II. 2 Sistemtica e filogenia Quer a sistemtica, quer a filogenia do gnero Ilex apresentam algumas indefinies, sendo o nmero total de espcies ainda incerto. Isto decorre provavelmente da ausncia de boas coleces, do carcter

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diico do gnero Ilex e de possveis erros na identificao e na nomenclatura (Giberti, 1990 in Del Pero Martnez et al., 1997). O taxon em estudo pertence famlia Aquifoliaceae, a qual engloba dois gneros: Nemopanthus e Ilex (Cunoud et al., 2000), possuindo este ltimo 30 espcies de folha caduca e mais de 780 espcies de folha persistente, as quais ocorrem nas zonas temperadas, temperadas quentes, subtropicais e tropicais (Galle, 1997), estando ausentes das reas ridas e rcticas (Martin, 1977). A famlia Aquifoliaceae foi instituda por Bartling (1830 in Galle, 1997) a partir do nome Aquifolium, o nome clssico e pr-lineano do azevinho. O gnero Aquifolium foi proposto por Miller (1734 in Galle, 1997), o qual corresponde ao sinnimo de Ilex Linnaeus. Posteriormente, De Candolle (1813 in Galle, 1997) institui o nome da famlia em francs, sendo, todavia, Bartling (1830 in Galle, 1997) o primeiro a publicar o nome Aquifoliaceae no seu correcto formato em latim. Loesener (1942 in Martin, 1977) dividiu a famlia Aquifoliaceae em dois grupos, Iliceae e Phellineae, reconhecendo no primeiro dois gneros: Ilex e Nemopanthus. Linnaeus (1735 in Galle, 1997) instituiu o gnero Ilex, o qual foi repetido em vrios trabalhos posteriores, incluindo o Species Plantarum de 1753, ponto de partida para a nomenclatura botnica actual. Em 1768, Banks e Solander colheram duas espcies de Ilex na Madeira, durante a primeira viagem do Capito Cook volta do mundo. Ambas foram descritas por Solander (MS. in Banksian Herbarium in Tutin, 1933), tendo sido um dos espcimes objecto de uma publicao por parte de Aiton (1789), sob o nome de Ilex perado. Contudo, Lamarck (1801 in Tutin, 1933) atribuiu o nome de Ilex maderensis a Ilex perado, enquanto que Meerbeck (1798 in Tutin, 1933)

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descreveu-o como Ilex crassifolia. O Ilex perado seria tambm registado a partir de material recolhido nos Aores por Seubert (1844), como adiante ser referido com maior detalhe. Loesener (1901 in Tutin, 1933) classificou o taxon em questo como Ilex Perado Ait., descrevendo quatro variedades para a Pennsula Ibrica e arquiplagos das Canrias, Madeira e Aores, entre as quais a variedade azorica, relativa a este ltimo arquiplago, e cuja fundamentao cientfica ser alvo de exposio e explorao mais aturadas no captulo III, respeitante morfologia. Segundo Galle (1997), o taxon Ilex perado ssp. azorica Tutin integra-se no subgnero Aquifolium Gray 1848, Seco Aquifolium Gray 1848, Srie Aquifoliodes (Loesener) S.-y. Hu 1949, classificao esta, que abrange tambm outros taxa da mesma espcie (Ilex perado ssp. iberica (Loesener) S. Andrews 1985, Ilex perado var. lopezlillo (Kunkel) S. Andrews 1985 e Ilex perado ssp. platyphylla (Webb & Berthelot) Tutin 1933) bem como pertencentes a outras espcies (e. g. Ilex aquifolium Linnaeus 1753, Ilex cornuta Lindley & Paxton 1850, Ilex integra Thunberg ex Murray 1787). Contudo, segundo Hitchcock & Green (1929 in Andrews, 1984a), a espcie Ilex perado Ait., assim como a espcie Ilex aquifolium L. pertencem ao subgnero Ilex, seco Ilex. Embora com um carcter estritamente descritivo da vegetao dos Aores, o historiador Gaspar Frutuoso foi o primeiro a retratar a flora aoriana. Referindo-se a esta planta da famlia das Aquifoliceas, numa descrio da Ilha de So Jorge, afirma: (...) tudo um lombo e espinhao de alta serra de montes e vales (...) em que h muitas alagoas de gua (...). O mato de toda a sorte de rvores silvestres, como so cedros, faias, louros, ginjas, pau branco, azevinhos, folhados, urzes, tamujos e queirs (...) (Frutuoso, 1978).

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O historiador, numa aluso que faz Ilha das Flores, descreve mais uma vez a ocorrncia deste taxon, agora no grupo ocidental do arquiplago: (...) A comedia dos gados musgo em toda a parte que h mato, e em outras que o no h, que chamam escalvados, h muito e comprido braceo, que come o gado de toda a sorte, e rama de azevinho, pau branco, sanguinho, tamujo e muitos queirs (...) (Frutuoso, 1978). Ainda nas ilhas ocidentais, e referindose ao Corvo, Frutuoso (1978) adianta que: (...) muita madeira de cedro, pau branco, louros, tamujos e azevinhos, antre o qual se criam muitos pssaros, afora os que vm do mar (...) . Nos ltimos trs sculos os Aores seriam alvo de exploraes e estudos botnicos a partir dos quais emergiram vrios trabalhos publicados sobre a sua flora. Muitas dessas exploraes resultaram na recolha de material, actualmente conservado em alguns herbrios europeus. A listagem que se segue, obtida atravs da recolha bibliogrfica efectuada para o presente trabalho, refere-se a alguns desses exemplares colhidos em vrias ilhas do arquiplago.
EXS:

So Miguel: s. l. (Welw., 1847: LISU), Mata da Achadinha (Soares, V-1941: LISI), Pico do Carvo (Carr., VI-1895: COI), Sete Cidades (Carr., VIII-1900: COI) in Palhinha (1966); Casal (Sjn 65: U), Furnas (Car 91: COI), Terra Nostra (Franco 60: LISI), Serra da Tronqueira (Cy 54: LISI), Pico do Miradouro-Serra de gua de Pau-Vila Franca do Campo (Cy 58: LISI), Achada das Furnas (Rego 25: LISI), Nordeste-Pedreira E Rib. dos Coimbos (Franco 60: LISI), Ponte Ch dos Chiqueiros-Santo Antnio Nordestinho (Franco 60: LISI), Povoao-Terra Nostra (idem), gua de Pau (Car 1891: AZ) in Sjgren (1973); T. C. Hunt 45 (K!, BM!, P!), Gonalves 4034 p. p. (BM!), 14/2/1981 (K!), P. Allorge s. n. (P!), F. D. Godman s. n. (K!), Trelease 182 (K!), H. Drouet s. n. (BM!), Carreiro 378 (AZ!), Furnas, Julho 1891, ? (AZ!), gua de Pau, Julho 1891, ? (AZ!), Andrews 508-514, 518, 525, 526A, 527 (K!) in Andrews (1984a).

Terceira: Terra Brava, Face do Boi, 1964 (P. Silva 127, LISE), Santa Brbara, 1964 (P. Silva 186, LISE), Caldeira Guilherme Moniz, 1965 (Sjgren, U), Angra, Raminho 1984 (B. Gonalves 7149), Santa Brbara, 1973 (B. Gonalves, 5229), Lagoa do Negro, 1980 (EDias 243, AZU), Serreta, Pico da

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Serreta, 1986 (EDias 604, AZU), Serreta, Pico da Serreta, caminho para a costa, 1986 (EDias 612, AZU) in Dias (1996); Terra Brava, Face do Boi (Ds 64: LISE), Santa Brbara (Ds 64: LISE) in Sjgren (1973).

Pico: Cabeo do Afonso, (Sjn 65: U), Cabeo do Redondo (Go 64: LISI), Cabeo da Escaleira, Piedade (Go 61 LISI), Canada da Serra (Pa, So 37: LISU), Mistrio de Santa Luzia (Ds 64: LISE), Mistrio da Prainha do Norte (Ds 64: LISE) in Sjgren (1973); Cancela da Serra, Panascos e Travessa (P. & S., V-1937: LISU) in Palhinha (1966); W. M. A. Brooke 11342 (BM!), Gonalves 1704 (BM!), B. de Paiva s. n. (K!) in Andrews (1984a).

Faial: Caldeira (Sjn 65: U), Cabeo do Fogo, Capelo (Go 62: LISI, LISFA) in Sjgren (1973); Nuttall s. n. (PH!), B. C. Gonalves 4597 (BM!) in Andrews (1984a).

Flores: Rocha dos Bordes (Go 63: LISI) in Sjgren (1973).

AZ: MUSEU CARLOS MACHADO, PONTA DELGADA, AORES AZU: DEPARTAMENTO DE CINCIAS AGRRIAS, UNIVERSIDADE DOS AORES, ANGRA DO HEROSMO BM: BRITISH MUSEUM, INGLATERRA COI: INSTITUTO BOTNICO DR. JLIO HENRIQUES, COIMBRA K : ROYAL BOTANIC GARDEN OF KEW, INGLATERRA LISE : ESTAO AGRONMICA NACIONAL, OEIRAS LISFA: ESTAO DE BIOLOGIA FLORESTAL, LISBOA LISI : INSTITUTO SUPERIOR DE AGRONOMIA, LISBOA LISU : INSTITUTO BOTNICO, FACULDADE DE CINCIAS, LISBOA P : MUSEUM NATIONAL DHISTOIRE NATURELLE PH: ACADEMY OF NATURAL SCIENCES U : UNIVERSIDADE DE UPPSALA, SUCIA

Watson (1843), numa descrio da flora da Ilha do Faial, refere-se ao taxon como Ilex perado. Posteriormente, Watson (1844) refere novamente a presena desta planta, designadamente nas Ilhas das Flores e do Faial, a qual considerada novamente como Ilex perado Ait. Seubert (1844) regista a ocorrncia deste taxon nos Aores, considerando-o como Ilex perado Ait., num trabalho que constituiria a primeira flora dos Aores.

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Watson (1847) referir-se- mais uma vez a este taxon, continuando a consider-lo como Ilex perado Ait. embora estabelea a possibilidade de ocorrerem duas espcies nos Aores: uma com folhas inteiras, mais obtusas e largas; a outra com folhas mais ovais, espinhosas ou muito serradas nas margens. Todavia, Watson refere que no possvel realizar tal diagnstico com base nestas diferenas, salvo se acompanhadas por outros caracteres, para alm do facto dos frutos e das flores serem desconhecidos. Watson adianta ainda que Lemann uniu o taxon das Ilhas Canrias, Ilex platyphylla (Webb), ao taxon aoriano, considerando provavelmente um s taxon para os dois arquiplagos. Tambm Drout (1858), num relatrio acerca da sua viagem de explorao cientfica aos Aores, refere a presena de Ilex perado neste arquiplago, assim como Morelet (1860) no seu trabalho sobre a histria natural dos Aores. Posteriormente, Drout (1861) retrata novamente este facto, referindo a presena de Ilex perado nos locais mais elevados da maioria das ilhas. Mais tarde, Drout (1866) referir-se-ia de novo ao taxon Ilex perado Ait., pormenorizando o carcter espinhoso das suas folhas. Godman (1870) regista tambm a ocorrncia de Ilex perado Ait. em algumas ilhas dos Aores, na Madeira e duvidosamente nas Canrias, acrescentando que no se trata de Ilex canariensis, podendo corresponder a um estado mais pequeno de Ilex macrophylla Webb., sem referir mais detalhes. Considera que a partir desta sua lista de plantas encontradas tambm na Madeira e/ou nas Canrias sobressai o facto de ocorrer uma afinidade exclusiva e parcial entre a flora aoriana e a das outras ilhas atlnticas vizinhas, embora estas ltimas apresentem um carcter mais africano. O taxon referido como Ilex perado Ait. por Trelease (1897), na obra Botanical Observations on the Azores, que inclui estampas de vrias plantas, nomeadamente do azevinho (Figura 3) e que constituiu o mais

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importante trabalho florstico durante cerca de sessenta anos, sendo, ainda hoje, um marco significativo (Dias, 1989). Loesener (1901 in Tutin, 1933, Krssmann, 1977) classifica o taxon Ilex perado dos Aores como Ilex perado var. azorica, baseando-se, segundo Krssmann (1977), no facto das folhas apresentarem uma menor dimenso, com 2.5-6 cm de comprimento, e serem elpticas a arredondadas ou ovais, inteiras ou com alguns dentes anteriores.

Figura 3 - Ilex perado Ait. (Trelease, 1897).

O taxon considerado uma vez mais como Ilex perado Ait. (Guppy, 1914, 1917). Este autor refere ainda que nas Ilhas Canrias

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ocorre um azevinho intimamente relacionado ou mesmo idntico ao Ilex aoriano (Ilex perado), embora no o tenha afirmado categoricamente (Guppy, 1917). Apesar de Gandoger (1918 in Andrews, 1984a) ter elevado este taxon categoria de espcie, propondo a classificao Ilex azorica, Tutin (1933) consider-lo-ia, posteriormente, como sub-espcie endmica dos Aores (Ilex perado ssp. azorica), justificando esta atribuio pelo facto da anlise morfolgica das flores e dos frutos de um nmero considervel de exemplares demonstrar a existncia de diferenas constantes entre as plantas dos vrios arquiplagos. Contudo, no apresenta quaisquer referncias a Gandoger (1918), referindo ainda que atendendo s diferenas ligeiras e ao facto das plantas de diferentes locais serem aparentemente afins, prope a descrio ao nvel da subespcie: Ilex perado ssp. perado para a Madeira, Ilex perado ssp. platyphilla para as Canrias e Ilex perado ssp. azorica para os Aores como acima j havia sido referido. Tutin (1933) apresenta naturalmente as caractersticas morfolgicas detalhadas que justificam tal alterao sistemtica, as quais sero devidamente apresentadas e exploradas no Captulo III Morfologia. Palhinha et al. (1946) adoptam a classificao de Loesener, considerando variedade azorica e no sub-espcie. Contudo, Palhinha (1950) considera o taxon como Ilex perado Sol. e reconhece-o como um elemento autctone no endmico, sem definir o conceito de autctone. Posteriormente, Palhinha (1966) admite a classificao Ilex perado Ait., embora referindo a classificao de Tutin (1933) e considerando o taxon como um endemismo arico-madeirense. A existncia em jardins de uma outra espcie deste gnero, Ilex paraguariensis, afirmada por Palhinha (1966). Segundo Galle (1997), trata-se de uma espcie originria do Estado de Minas Gerais, Brasil. A confirmar-se uma possvel expanso desta espcie para o exterior, tal

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poderia representar um risco de alterao do patrimnio genotpico e fenotpico do taxon aoriano, dada a faculdade de hibridao no seio do gnero Ilex (Galle, 1997). Todavia, Palhinha (1966) no refere a extenso do cultivo desta espcie nem o local e/ou ilhas onde tal ocorre. Porm, aparentemente nunca se encontrou nenhum outro taxon cujas caractersticas morfolgicas, primeira vista, evidenciassem a presena de Ilex paraguariensis. Na obra Flora Europaea editada por Tutin et al. (1968) e em Franco (1971), este ltimo uma traduo livre da primeira, a descrio para Ilex perado Ait. aplicada a Ilex perado ssp. azorica. Apesar de aparentemente poder constituir uma contradio entre a classificao de Tutin (1933) e a de Tutin et al. (1968), cr-se que tal possa corresponder a uma aplicao da caracterizao geral da espcie Ilex perado ao Ilex perado ssp. azorica dos Aores, cujas caractersticas especficas no so referidas em Tutin et al. (1968). Tais caractersticas seriam remetidas para uma consulta mais detalhada sobre este taxon em Tutin (1933), uma vez que este ltimo artigo encontra-se citado quer em Tutin et al. (1968), quer naturalmente em Franco (1971). No captulo III, respeitante morfologia, as caractersticas atribudas ao taxon nestes artigos supra citados sero alvo de uma discusso mais aturada. Silva & Lopes (1972), para o gnero Ilex, citam Franco (1971), indicando a sua ocorrncia no Continente, Madeira e Aores, enquanto que Silva & Silva (1974) classificam o taxon como Ilex perado Ait., embora admitam uma nova classificao (Ilex perado fo. umbrosa) para exemplares colhidos no Mistrio de Santa Luzia, Ilha do Pico, com base em diferenas encontradas nas dimenses das folhas. A designao Ilex perado ssp. azorica novamente aceite, desta vez por Eriksson et al. (1974 in Andrews, 1984a), numa lista de plantas vasculares da Macaronsia.

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Krssmann (1977) cita Loesener (1901) relativamente a este taxon, adoptando a sua classificao, enquanto que Kunkel (1977 in Andrews, 1984a) classifica o taxon como Ilex perado ssp. azorica (Tabela II), isto , a mesma classificao proposta por Tutin (1933). Num trabalho mais recente e tendo por base a morfologia apresentada pelo taxon, Andrews (1984a) prope a manuteno quer da classificao de Tutin (1933), quer da classificao de Kunkel (1977) (Tabela II). Todavia, as caractersticas morfolgicas apresentadas por Andrews (1984a) que explicam a manuteno da taxonomia sero integradas e discutidas no captulo respeitante morfologia. Mais uma vez, o patrimnio gentico deste taxon poder ser alvo de profundas modificaes, dada a existncia de quatro exemplares de Ilex x. Koehniana (aquifolium x latifolia) num jardim das Furnas, na Ilha de So Miguel, referida por Andrews (1984b).
Tabela II: Resumo das classificaes propostas para o Ilex perado dos Aores (Andrews, 1984a). Loesener (1901) Ilex perado var. azorica Tutin (1933) Ilex perado ssp. azorica Kunkel (1977) Ilex perado ssp. azorica Andrews (1984a) Ilex perado ssp. azorica

Embora sem um carcter sistemtico e/ou filogentico, foram tambm publicados vrios trabalhos que consideram o taxon em causa como Ilex perado ssp. azorica (e. g. Sjgren, 1973, 1979, 1984; Haggar, 1988; Dias, 1989; Hansen & Sunding, 1993; Dias, 1996), i. e., um endemismo aoriano, o que associado ao proposto por taxonomistas, como Tutin (1933) e Andrews (1984a), reflecte uma aceitao generalizada desta classificao. Mais recentemente, Cunoud et al. (2000), num trabalho efectuado sobre a filogenia e biogeografia deste gnero com base em dados moleculares (amplificao e sequenciao de atpB-rbcL spacer e de rbcL,

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a partir de DNA extrado de folhas secas em slica e em alguns casos de exemplares de herbrio), embora no tendo recorrido a amostras do taxon em questo, referem que a famlia Aquiofoliaceae est organizada em quatro grupos distintos, sendo a hierarquia dos mesmos matria de discusso e incluindo a espcie Ilex perado no grupo euroasitico. Ainda de acordo com estes, verifica-se uma maior proximidade em relao aos grupos asiticonorte americano (Ilex crenata) e americano (Ilex brasiliensis). Atendendo a que a sistemtica e a filogenia deste taxon nem sempre se revelaram consensuais, devero ser realizados estudos comparativos, quer ao nvel morfolgico, quer ao nvel molecular, entre populaes das diversas ilhas do arquiplago, bem como entre estas e populaes de outros taxa do gnero Ilex exteriores ao arquiplago. Contudo, tais estudos no se integram nos objectivos deste trabalho, tendo este captulo versado somente o resumo das vrias tendncias sistemticas e filogenticas existentes na bibliografia disponvel em relao ao Ilex perado ssp. azorica.

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III. MORFOLOGIA
Atendendo a que o estudo da morfologia no se encontra englobado no contedo do plano de estgio, as dimenses que so expostas no foram alvo de uma confirmao, correspondendo, portanto, a uma transcrio das dimenses apresentadas pelos vrios autores. III. 1 Morfologia do caule De um modo geral, as espcies de Ilex apresentam um caule que, quanto sua consistncia, lenhoso (Baas, 1973). Segundo este autor, que recorreu a material proveniente das Ilhas Canrias, a madeira da espcie Ilex perado Ait. apresenta poros semi-circulares, anis de crescimento distintos, vasos em nmero de 89-123/mm2 com uma percentagem de vasos solitrios de 14 a 28% e cujos dimetros e comprimentos respectivos variam entre 21-39-44-63 e 310-690-8801240 m, fibrotraquedos de dimenses entre 650-1130-1520-1810 m, raios em nmero de 3-4+7-10/mm e cristais ausentes. Relativamente ao taxon em questo, este varia desde arbustos a pequenas rvores (Tutin et al., 1968; Franco, 1971), embora tivessem sido observados vrios exemplares arbreos com um porte considervel, nomeadamente em Santo Antnio (Nordeste), na Ilha de So Miguel. Esta planta, na Classificao Fisionmica de Raunkjaer, uma microfanerfita (Tutin et al., 1968; Franco, 1971), isto , apresentando gemas de renovo de ordinrio entre 2 a 8 m (Vasconcellos et al., 1969). III. 2 Morfologia foliar A famlia Aquifoliaceae apresenta folhas alternas, simples, frequentemente persistentes, com estpulas rudimentares, muito pequenas ou mesmo ausentes (Tutin et al., 1968; Franco, 1971; Mendes, 31

1973), possuindo a espcie Ilex perado folhas inteiras ou dentculos inclinados para o pice, 1.11.8 vezes to compridas como largas, com 57 pares de nervuras (Tutin et al., 1968; Franco, 1971). As folhas de Ilex perado ssp. azorica apresentam-se muito grossas e coriceas, com um comprimento e largura de 2.6-4.2 e 2.5-3.2 cm, respectivamente (Tutin, 1933), caracterizando-se ainda por serem largas, achatadas, ovadas ou oblongas (Tutin, 1933; Andrews, 1984a; Loesener, 1901 in Krssmann, 1997; Galle, 1997) e arredondadas nas extremidades (Tutin, 1933; Andrews, 1984a; Galle, 1997), com margens por vezes espinhosas ou com muito poucos espinhos (Seubert, 1844; Tutin, 1933), sendo mais frequente a ausncia destes, os quais, quando presentes, possuem dimenses entre 0.5 e 1.8 mm (Andrews, 1984a). As folhas apresentam ainda uma nervao pouco proeminente (Tutin, 1933), pecolos geralmente glabros com dimenses de 0.30.9 (-1.4) cm e limbo com 3-6.6 (-9.5) 2.5-5 (-8.1) cm (Andrews, 1984a). Verificou-se que as margens das folhas dos indivduos jovens apresentavam um carcter muito mais espinhoso (Figura 4-A), o qual vai diminuindo com a idade da planta (Figura 4-B). Esta caracterstica registada tambm por Tutin et al. (1968) e por Franco (1971), referindo a ocorrncia de um carcter remotamente serrilhadoespinhoso no estado juvenil com folhas inteiras na idade adulta.

A
Figura 4 - A. Planta jovem. B. Planta adulta em frutificao.

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III. 3 Morfologia floral Na famlia Aquifoliaceae, as flores so hermafroditas ou

unissexuais por aborto, actinomrficas, dispostas em cimeiras axilares (Tutin et al., 1968; Franco, 1971), apresentando as spalas concrescentes e as ptalas livres ou levemente concrescentes na base, sendo os estames ismeros s ptalas (Tutin et al., 1968; Franco, 1971). Ainda de acordo com estes autores, apresentam um gineceu spero, sincrpico, possuindo dois. As inflorescncias das espcies de Ilex spp., nativas ou exticas, so produzidas a partir dos novos tecidos em crescimento (e. g. Ilex cassine, Ilex chinensis, Ilex glabra, Ilex opaca, Ilex paraguariensis) ou de grupos sobre rebentos da estao de crescimento anterior (e. g. Ilex perado, Ilex aquifolium, Ilex cornuta, Ilex latifolia, Ilex integra, Ilex vomitoria, Ilex fargesii) (Milbocker, 1969). A morfologia floral deste taxon, assim como da maioria das espcies do gnero Ilex, caracteriza-se por uma diferenciao sexual resultante do seu carcter diico (Hu, 1949 in Milbocker, 1969; Tutin et al., 1968; Franco, 1971). Todavia, as flores exibem vestgios de gineceu e de estames (Tutin et al., 1968; Franco, 1971), nomeadamente pela presena de um gineceu no funcional e pela ocorrncia de estamindios (ausentes ou em nmero varivel). Este taxon apresenta ainda flores 4-meras (Figura 5) com um clice gomiloso, sendo o ovrio 4-locular e o estigma 4-lobado e sssil. Segundo Tutin et al. (1968) e Franco (1971), a corola apresenta-se rosada, embora tenha sido verificada, no presente estudo, uma variao de cor entre o branco e o rosado. cada lculo um vulo anatrpico ou fracamente campilotrpico, embora, raramente, o nmero de vulos possa ser de

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Segundo Andrews (1984a), as flores possuem um clice e uma corola com 0.8-1.5 e 2.54.3 mm de comprimento, respectivamente. Os estamindios, o ovrio, o estigma e os pistilos apresentam dimenses respectivas de 1.1-1.9, 1.5-2.5, 0.5-2.5 1.1-2.5 e 0.5-1.1 mm (Andrews, 1984a). Os estames (Figura 5) ocorrem em nmero de quatro, embora, de acordo com Andrews (1984a), em nmero de 4(-5), os quais apresentam dimenses respectivas de (0.9-)1.5-2(-3) e de 0.8-1.1 mm para o filete e a antera. Observou-se ainda a presena de clios nas margens da corola e do clice (Tutin, 1933), bem como nas brcteas, que ocorriam nas flores axilares masculinas e femininas.

Figura 5 Flor masculina (10x).

O plen deste taxon caracterizado por ser tricolpado, estando os gros ornamentados por gemas (Figura 6), semelhana do referido para outras espcies por Martin (1977). O termo tricolpado refere-se presena de trs sulcos germinais transversais num mesmo gro de plen, possuindo cada um destes um poro equatorial (Kremp, 1968 in Kincaid, 1976). Segundo Kincaid (1976), esta adaptao aumenta a probabilidade de um sulco germinal contactar com a superfcie do estigma, possibilitando a existncia de trs vias possveis para a emergncia do tubo polnico.

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Figura 6 Gros de plen de Ilex perado ssp. azorica.

Ainda de acordo com este autor, a produo de gros de plen tetracolpados viveis, entre outros tipos, apresenta uma frequncia reduzida, para alm do facto de no possuirem capacidade adaptativa, uma vez que resultam de uma segregao cromossmica desigual durante a meiose. III. 4 Carpomorfologia Os frutos, como em todo o gnero Ilex, so nuculnios esfricos ocasionalmente oblongos (Figura 7), apresentando as dimenses de (7-) 8-9 (-11) 7-10 mm e contendo (3-) 4 caroos (Figura 8) de dimenses 6.5-7.5 3.4 mm (Andrews, 1984a).

Figura 7 - A. Ramo com frutos (nuculnios). B. Nuculnios.

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Figura 8 Caroos.

A partir de um estudo efectuado com um carcter meramente indicativo, e cujos universos que serviram de base ao clculo das respectivas mdias percentuais foram manifestamente diferentes e desiguais entre si, foram obtidos dados que revelaram a ocorrncia de 2 e de 5 caroos por fruto, com valores percentuais mximos respectivos de 22% e de 9% nas populaes do Monte Escuro e do Sanguinal, na Ilha de So Miguel (Tabela III). Contudo, as maiores percentagens corresponderam a frutos contendo 3 ou 4 caroos (Tabelas III, IV e V) e cujos valores percentuais mais elevados foram de 61% na populao da Ribeira do Cabo, na Ilha do Faial (Tabela IV) e de 92% na populao da Vereda, na Ilha das Flores (Tabela V), respectivamente. Os valores obtidos neste estudo permitiram ainda uma anlise estatstica de varincia das mdias relativas a cada uma das possibilidades (2, 3, 4 e 5 caroos/fruto) para as Ilhas de So Miguel e do Faial, porquanto o volume de dados recolhidos para a Ilha das Flores foi insuficiente para um tratamento estatstico. Este foi realizado atravs do programa SPSS 10.0 para Windows instalado num computador PC Pentium II. Foi efectuada uma anlise de varincia (ANOVA), com um critrio de classificao, constante no Anexo 1. A comparao das percentagens obtidas foi realizada atravs do teste de Tukey, cujo nvel

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de significncia foi de 5%. Nas Tabelas III e IV, a comparao das vrias mdias foi efectuada atravs de letras minsculas, sendo que as rotuladas com a mesma letra no diferiram significativamente entre si.
Tabela III Nmero de caroos por fruto relativo Ilha de So Miguel (STA Santo Antnio, Nordeste; SGN Sanguinal; MTE Monte Escuro).

Indivduo/ Populao A/STA A/SGN B/SGN C/SGN A/MTE B/MTE Mdia (%)

2 caroos/fruto (%) 3 5 4 9 22 __ 7b

3 caroos/fruto (%) 49 53 47 50 45 34 46 a

4 caroos/fruto (%) 48 41 47 32 52 66 48 a

5 caroos/fruto (%) __ 2 2 9 0.4 __ 2b

Tabela IV Nmero de caroos por fruto relativo Ilha do Faial (RCB Ribeira do Cabo; LBG Lombega; CLD Caldeira).

Indivduo/ Populao A/RCB B/RCB C/RCB D/RCB A/LBG A/CLD Mdia (%)

2 caroos/fruto (%) 6 __ __ 2 2 5 3b

3 caroos/fruto (%) 51 28 51 61 47 34 45 a

4 caroos/fruto (%) 43 71 48 37 50 67 53 a

5 caroos/fruto (%) __ __ __ 0.2 0.7 __ 0.15 b

Tabela V Nmero de caroos por fruto relativo Ilha das Flores (VRD - Vereda).

Indivduo/ Populao A/VRD A/Mdia (%)

2 caroos/fruto (%) __ __ __

3 caroos/fruto (%) 8 20 14

4 caroos/fruto (%) 92 80 86

5 caroos/fruto (%) __ __ __

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Verificou-se que os valores so significativamente diferentes entre 2 caroos/fruto e 3 e 4 caroos/fruto assim como entre 5 caroos/fruto e 3 e 4 caroos/fruto, quer para a mesma ilha, quer entre as duas ilhas (Tabelas III e IV). H ainda a registar o facto de, numa mesma ilha e entre as duas ilhas, os valores para 2 e 5 caroos/fruto no serem significativamente diferentes entre si, ocorrendo o mesmo entre 3 e 4 caroos/fruto (Tabelas III e IV). Isto indicia, com as devidas ressalvas para o carcter

vincadamente indicativo desta anlise, que normalmente ocorrem 3 ou 4 caroos em cada fruto nas duas ilhas, sendo que a ocorrncia de 2 e de 5 caroos corresponde, quer na ilha de So Miguel, quer na ilha do Faial, a alteraes possivelmente espordicas no nmero de caroos em cada fruto. Contudo, futuramente seria interessante um estudo morfolgico mais aprofundado com vista a um melhor conhecimento deste taxon.

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IV. ECOLOGIA

IV. 1 Breve caracterizao edafo-climtica dos Aores O Arquiplago dos Aores situa-se entre 36 55 e 39 43 de latitude N e 25 e 17 de longitude W, no extremo norte da Macaronsia, sendo constitudo por nove ilhas, distribudas por trs grupos: Santa Maria e So Miguel (Grupo Oriental), Terceira, Graciosa, So Jorge, Pico e Faial (Grupo Central), Flores e Corvo (Grupo Ocidental), as quais na sua totalidade abrangem uma rea de cerca de 2350 km, localizando-se a nordeste de Santa Maria os ilhus das Formigas (Ferreira, 1955; Madruga, 1986). Em geral, os solos evoluram a partir de materiais piroclsticos de natureza traqutica, principalmente cinzas e pedra-pomes (Oliveira, 1989), embora em alguns casos o material originrio do solo deva ser considerado de natureza mista, uma vez que apresenta camadas alternadas pouco espessas de pedra-pomes e bagacina ou mesmo mistura de piroclastos traquticos com material proveniente de rochas baslticas (Ricardo et al., 1977 in Oliveira, 1989). Na sua maioria, os solos dos Aores so do tipo andossolos, os quais correspondem a solos geralmente modernos, que evoluem sob condies de clima atlntico temperado hmido, gerados a partir de elementos piroclsticos em que predominam os constituintes vitrosos (Madruga, 1986), sendo agrupados, de acordo com Pinheiro (1990 in Dias, 1996), em trs tipos principais: -Andossolos Tpicos, os quais ocorrem at aos 500-600 metros de altitude e correspondem a solos profundos, em geral estratificados como resultado de acumulaes peridicas; -Andossolos Ferruginosos, com distribuio acima dos 500 metros de altitude e formados como consequncia da menor evapotranspirao

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e elevada pluviosidade em conjugao com drenagens deficientes, sendo os mesmos preferidos pelas turfeiras, as quais constituem um elemento integrante da paisagem aoriana, nomeadamente da Ilha Terceira (Mendes & Dias, 1998) e que desempenham um papel de relevo nos ecossistemas de montanha (Dias, 1996) bem como no sistema hidrolgico das ilhas (Dias, 1996; Mendes & Dias, 1998); -Solos Pardos, os quais se apresentam distribudos pelas zonas de menor altitude at aos 100-150 metros de altitude, estando a sua gnese associada zonalidade climtica. De acordo com Dias (1996), os solos mais evoludos apresentamse sob explorao agrria, localizando-se as reas de vegetao natural maioritariamente em solos do tipo incipientes ou orgnicos. Sobre os solos incipientes ocorrem cobertos imaturos, dependendo principalmente a sua escala de evoluo da natureza do substrato; nos orgnicos, onde frequentemente existe uma acumulao de materiais nas concavidades do manto rochoso, o estrato muscilar aparenta uma maior importncia no processo evolutivo destes solos (Dias, 1996). Segundo Pinheiro (1998), a vegetao assume um papel de relevo no controlo da eroso, por fora da conjugao do efeito de atenuao do impacto da chuva no solo com um incremento da taxa de infiltrao e reduo do escorrimento superficial, bem como na coeso do solo por via do desenvolvimento radicular. Uma correcta seleco das espcies garante uma operao de revestimento do solo mais eficaz, devendo ser dada prioridade, sempre que possvel, s espcies nativas, as quais apresentam um comportamento vegetativo conhecido (Pinheiro, 1998). O arquiplago apresenta um clima nitidamente ocenico com pequenas variaes trmicas e elevados teores de precipitao e de humidade do ar (Dias, 1989; Madruga, 1986; Narciso, 1942) e localiza-se na zona subtropical de anticiclones do Hemisfrio Norte, sendo o anticiclone dos Aores o factor dominante das condies meteorolgicas

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(Ferreira, 1955). Dependem da posio, intensidade, desenvolvimento e orientao deste ltimo a natureza e as caractersticas das massas de ar, bem como a trajectria das depresses e a orientao dos sistemas frontais que se deslocam no Atlntico Norte (Ferreira, 1955). No litoral, a temperatura mdia anual de cerca de 17,5 C (Agostinho, 1942), sendo a distribuio desta condicionada pelos factores fisiogrficos, principalmente pela altitude (Tabela VI), exposio, proximidade do mar e revestimento do solo (Madruga, 1986).
Tabela VI Valores mdios anuais de temperatura para vrias estaes localizadas a diferentes altitudes (Bettencourt, 1979 in Madruga, 1986). ESTAO / ILHA PERODO ALTITUDE (m) Santa Cruz / Flores Horta / Faial Ponta Delgada / So Miguel Nordeste / So Miguel 1931 - 1960 1931 - 1960 1931 - 1960 1955 - 1969 39 60 35 140 TEMPERATURA MDIA ANUAL (C) 17,8 17,6 17,4 16,3

A pluviosidade aumenta de leste para oeste (Agostinho, 1942; Sjgren, 1973), apresentando a Ilha das Flores a precipitao mdia anual mais elevada (Tabela VII). Como consequncia do relevo montanhoso das ilhas, a pluviosidade aumenta do litoral para o interior, bem como com a altitude (Tabela VII) (Agostinho, 1942; Sjgren, 1973).
Tabela VII Valores mdios anuais de precipitao a diferentes altitudes (Bettencourt, 1979 in Madruga, 1986). ESTAO / ILHA PERODO ALTITUDE (m) Santa Cruz / Flores Ponta Delgada / Flores Horta / Faial Cedros / Faial Ponta Delgada / So Miguel Nordeste / So Miguel 1931 1960 1935 1960 1931 1960 1935 1960 1931 1960 1955 1969 39 150 60 240 35 140 PRECIPITAO MDIA ANUAL (mm) 1429,9 1641,4 1026,9 1486,4 958,5 1632,7

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A humidade do ar, nos Aores, apresenta-se constantemente elevada, sendo de primordial importncia para a vegetao aoriana, nomeadamente para a vegetao brio-epfila, a qual exige valores permanentes acima dos 80% (Sjgren, 1978). Os ventos alsios, quentes e hmidos (Cunha & Sobrinho, 1940), so predominantes no arquiplago, os quais, de acordo com Ferreira (1980 in Dias, 1989), demonstram, pela velocidade e intensidade que atingem, uma aco ecolgica sobre a vegetao. IV. 2 Distribuio, habitat e status para a Ilha de So Miguel O Ilex perado ssp. azorica est registado para todas as ilhas dos Aores, excepo da Graciosa (Furtado, 1984; Sjgren, 1979, 1984; Dias, 1989, 1996; Hansen & Sunding, 1993). Em So Miguel, foram identificados exemplares em praticamente todas as unidades morfolgicopaisagsticas (Macio Vulcnico do Fogo; Achada das Furnas; zona montanhosa de leste, onde se insere o ponto mais alto da ilha, o Pico da Vara (1105 m); Macio Vulcnico das Sete Cidades; regio dos picos), com uma frequncia crescente no sentido oesteleste da ilha. Porm, nas vrias sadas de campo efectuadas, tal no se revelou fcil, uma vez que muitas das espcies introduzidas (e. g. Pittosporum undulatum, Hedychium gardneranum, Gunnera tinctoria) apresentam-se como um perigo para este taxon, bem como para toda a restante vegetao indgena, dada a sua elevada agressividade e competitividade (Oliveira, 1989). Aliado a isto, ocorreu durante vrias dcadas a prtica do arranque de leiva (camada superficial pedolgica com vegetao enrazada) para a cultura do anans, tornando o solo vulnervel a graves problemas de eroso e no permitindo a regenerao da vegetao natural, bem como o arroteamento de reas incultas, as quais deveriam continuar a constituir reservas botnicas (Oliveira, 1989).

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Nas sadas de campo realizadas constatou-se que a flora indgena do Macio das Sete Cidades, outrora dominada por Erica, Laurus e Calluna (Drout, 1866), apresenta-se profundamente alterada, alis como foi constatado por outros autores (e. g. Sjgren, 1973; Ormonde, 1978; Andrews, 1984b), o que, num futuro prximo, poder colocar em perigo a manuteno de um efectivo populacional deste taxon nesta rea. No obstante tal, ocorrem alguns indivduos isolados de Ilex perado ssp. azorica no seio da vegetao extica e de algumas espcies nativas como a Calluna vulgaris (Figura 9) (e. g. ravinas das Cumeeiras e da Ribeira do Ferreiro).

Figura 9 Ilex perado ssp. azorica, Ribeira do Ferreiro, Sete Cidades, Ilha de So Miguel.

introduo

de

plantas

exticas

por

proprietrios

fez

desaparecer praticamente toda a vegetao endmica, a qual, por ter um desenvolvimento mais lento que as essncias introduzidas, acabou por desaparecer (Ormonde, 1978), estando as encostas desta caldeira, a maior e mais antiga dos Aores, praticamente revestidas por conteira (Hedychium gardneranum), podendo tornar invivel a regenerao das comunidades naturais (Sjgren, 1973). Na zona central da ilha foi possvel a identificao de vrios indivduos nas Lombadas, Macio do Fogo, Monte Escuro e Sanguinal, com uma frequncia ligeiramente mais elevada neste ltimo (Figura 10).

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Figura 10 Ilex perado ssp. azorica, Estrada da Lagoa do Fogo, Ilha de So Miguel.

No Monte Escuro, uma regio pecuria cujo empobrecimento em exemplares endmicos se deveu intensa explorao pecuria e extraco de leiva e de lenha (Plano de Aproveitamento da Propriedade do Monte Escuro), os indivduos encontravam-se a dividir as exploraes pecurias, um facto que observvel um pouco por toda a ilha, constituindo vestgios provveis dos cobertos naturais precedentes s arroteias (Figura 11).

Figura 11 Ilex perado ssp. azorica num limite de uma explorao pecuria, Ilha de So Miguel.

Nas Lombadas e Macio do Fogo, nomeadamente nas suas vertentes abruptas mas tambm em locais hmidos e abrigados (Figura 12), os indivduos apresentavam-se misturados com vrias espcies 44

introduzidas (e. g. Hedychium gardneranum, Pittosporum undulatum, Cryptomeria japonica, Clethra arborea) assim como com outros endemismos (e. g. Viburnum tinus ssp. subcordatum, Vaccinium cylindraceum). A zona da Lagoa do Fogo, apesar de bastante depauperada, ainda rica em exemplares endmicos, ocorrendo este taxon em ribeiras, fendas e grutas (Ormonde, 1978). Andrews (1984a) refere a ocorrncia deste taxon na zona da Lagoa do Congro a um nvel de 400 m de altitude.

Figura 12 Ilex perado ssp. azorica: indivduos jovens em habitat abrigado e hmido, Caminho das Lombadas, Ilha de So Miguel.

Na regio oriental foram observados vrios exemplares deste taxon, nomeadamente na Tronqueira, Pico Bartolomeu e Santo Antnio. Na Tronqueira foi ainda possvel observar a ocorrncia de vrios exemplares deste taxon circundados por Clethra arborea, um endemismo madeirense que apresenta, nos Aores, uma distribuio biogeogrfica muito restrita, limitando-se apenas a So Miguel (Silva et al., 2000). Esta, como semelhana de todas as outras infestantes, representa um manifesto perigo para o azevinho; no Pico Bartolomeu foram observados indivduos isolados nas bermas das estradas assim 45

como nas suas vertentes abruptas, alguns dos quais apresentando um porte arbreo; em Santo Antnio, foi registada a presena de vrios indivduos, na sua maioria adultos e com um porte considervel, atingindo 7 a 8 metros de altura (Figura 13. A). Foi ainda possvel registar a ocorrncia de rebentos ladres com origem no desenvolvimento das gemas dormentes de troncos antigos (Figura 13. B). Este taxon ocorre igualmente no Pico da Vara, a maior rea de floresta original existente nos Aores e extremamente rica em endemismos (Le Grand et al., 1982). Todavia, as comunidades vegetais endmicas presentes nesta rea natural tm vindo a ser alvo de profundas alteraes e como tal j no se encontram num grau de preservao como o referido por Le Grand et al. (1982).

Figura 13 - A. Indivduos adultos, Santo Antnio, Nordeste, Ilha de So Miguel. B. Rebentos ladres, Santo Antnio, Nordeste, Ilha de So Miguel.

Por todas estas razes expostas, o status frequente, atribudo por Dias (1989, 1996) ao Ilex perado ssp. azorica, para a Ilha Terceira, no corresponder realidade observada na Ilha de So Miguel. Assim, para 46

esta ltima, propor-se-ia a atribuio de um status pouco frequente. Paralelamente, este taxon parece demonstrar um certo carcter de vulnerabilidade, tendo em conta a invaso de infestantes, como j anteriormente foi referido. Carece, como semelhana de outros taxa endmicos, de conservao e proteco eficazes. IV. 3 Fenologia A fenologia deste taxon no se apresenta bem definida, porquanto possvel observar vrios estados fenolgicos simultneos para uma mesma populao e poca do ano. Guppy (1917) refere ter encontrado na Ilha do Pico, durante o ms de Maro, uma mesma rvore em florao e frutificao simultneas. Ainda de acordo com Guppy (1917), a poca de florao depende da altitude, ocorrendo, nos nveis mais baixos, geralmente em Abril e Maio, mas nos nveis mais elevados em Junho e Julho, o que foi verificado, excepo do ms de Julho, durante o qual as plantas j se encontravam em plena frutificao mesmo a altitudes mais elevadas. Esta indefinio fenolgica poder estar relacionada com a ausncia de uma verdadeira diferenciao climtica entre as vrias estaes do ano. No mbito de um estudo ecolgico desta planta, seria interessante proceder-se a uma pesquisa da sua fenologia, constituindo mais um contributo para a sua efectiva conservao. Todavia, poder-se- estabelecer, de um modo geral, um ciclo fenolgico para este taxon com base no estado fenolgico dominante em cada um dos meses do ano, embora num contexto meramente indicativo:

JANEIRO:

Frutificao. frutificao/ Incio da florao.

FEVEREIRO: Incio da reactivao das gemas vegetativas/Final da MARO: Florao.

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ABRIL: MAIO: JUNHO: JULHO: AGOSTO: OUTUBRO:

Florao. Florao. Final da florao/Incio da frutificao. Frutificao. Frutificao. Frutificao (Maturao).

SETEMBRO: Frutificao/Incio da maturao dos frutos. NOVEMBRO: Frutificao (Maturao). DEZEMBRO: Frutificao (Maturao). IV. 4 Fitossociologia IV. 4. 1 Florestas Naturais O Ilex perado ssp. azorica um taxon caracterstico das florestas espontneas arborescentes, apresentando um carcter dominante nas formaes mesfilas mais expostas (Dias, 1996). Dias (1996) estabelece, para as Florestas Naturais, vrias

formaes, onde se inclui este taxon (Floresta Lauriflia, Floresta de Ilex e Zimbral), sendo mesmo uma espcie caracterstica em algumas destas. As Florestas Lauriflias, cujos limites de altitude localizam-se entre os 440 (imposto pela utilizao intensiva da terra para pastagens) e os 640 m, desenvolvem-se nas condies mais msicas das ilhas dos Aores, isto , a mdia altitude e em locais abrigados, uma vez que a perenidade e o tamanho das suas folhas so vulnerveis aos ventos fortes e s tempestades (Dias, 1996). Estas florestas apresentam-se dominadas por espcies arbreas, de folhas perenes e grandes, glabras ou subglabras e coriceas, constituindo as Lauraceae a famlia caracterstica desta flora (Dias, 1996). Em outros arquiplagos da Macaronsia, as Laurceas esto bem representadas, embora nos Aores, por via do forte efeito da insularidade, a sua presena esteja confinada

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apenas a uma espcie, o Laurus azorica. Associadas a esta espcie encontram-se outras que compartilham as mesmas caractersticas corolgicas e ecofisiolgicas (e. g. Frangula azorica) (Dias, 1996). Nos Aores, esto interligados com esta flora elementos mais atlnticos ou mesmo euro-siberianos como o Ilex perado ssp. azorica (Dias, 1996). A Floresta Lauriflia subdivide-se por sua vez em trs tipos de formaes: 1) Floresta Msica Lauriflia; 2) Floresta Hmida Lauriflia; 3) Floresta Hiper-hmida Lauriflia (Dias, 1996). 1) Floresta Msica Lauriflia (altitude mdia: 559 m): Esta formao muito rara, constituindo as manchas existentes enclaves de uma floresta que outrora ocupou uma rea muito mais vasta, apresentando o Ilex perado ssp. azorica uma cobertura mdia1 de 6 no estrato arbreo, na Ilha do Pico (Tabela VIII) (Dias, 1996). 2) Floresta Hmida Lauriflia (altitude mdia: 522 m): As suas manchas so tambm muito raras e diferencia-se essencialmente do tipo anterior por estar relacionada com uma maior humidade atmosfrica, que se reflecte nas composies florstica, estrutural e dinmica. O Ilex perado ssp. azorica uma das espcies mais caractersticas, apresentando uma cobertura mdia de 7 num estrato tambm arbreo, na Ilha do Pico (Tabela VIII) (Dias, 1996). 3) Floresta Hiper-Hmida Lauriflia (altitude mdia: 588 m): semelhana da ltima formao, desenvolve-se em zonas de nevoeiro e de ventos hmidos, apresentando, no entanto, o substrato impermeabilizado, o que o torna permanentemente encharcado. Aqui o taxon, constituindo tambm uma das espcies

Os valores respeitantes cobertura mdia foram calculados a partir da mdia aritmtica da avaliao de cobertura efectuada no campo por Dias (1996). Escala Clssica de Braun-Blanquet (Shimwell, 1971): 1 1 a 2 indivduos; 2 - < 1%; 3 1 a 4%; 4 4 a 10%; 5 11 a 25%; 6 26 a 33%; 7 34 a 50%; 8 51 a 75%; 9 76 a 90%; 10 91 a 100%.

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mais caractersticas do estrato arbreo, apresenta uma cobertura mdia de 6, 1 e 5 para as Ilhas Terceira, Faial e So Miguel, respectivamente (Tabela VIII). Regista-se uma elevada frequncia de brio-epfilos, perfeitamente desenvolvidos no Ilex perado ssp. azorica, o qual privilegia a reproduo vegetativa (Dias, 1996). As Florestas de Ilex (altitude mdia: 818 m) (Figura 14) constituem uma tipologia florestal endmica aoriana que se desenvolve em largas extenses nas zonas montanhosas, algo abrigadas e sobre um substrato de lavas cidas (Dias, 1996).

Estrato Arbreo: Ilex perado ssp. azorica, Vaccinium cylindraceum, Juniperus brevifolia, Laurus azorica, Erica azorica. Estrato Arbustivo: Myrsine africana, Euphorbia stygiana, Hypericum foliosum, Arceuthobium azoricum. Estrato Trepador: Rubia agostinhoi, Hedera canariensis, Smilax divaricata. Estrato Herbceo Alto: Dryopteris aemula, Culcita macrocarpa, Dryopteris azorica, Dryopteris crispifolia, Blechnum spicant, Pteridium aquilinum. Estrato Herbceo Baixo: Luzula purpureo-splendens, Lysimachia azorica,

Selaginella kraussiana, Sibthorpia europaea, Carex vulcani, Cardamine caldeirarum, Huperzia selago ssp. selago, Leontodon rigens, Tolpis azorica, Trichomanes speciosum. Estrato Epfito: Elaphoglossum senicylindraceum, Hymenophyllum tunbrigense, Epfilos, Brio-epfitos. Estrato Epigeico: Brio-epliticos, Sphagnum spp., Brio-epgeicos.

Figura 14 Florestas de Ilex:: estratificao e composio da flora, incluindo a indicao das espcies mais caractersticas (sublinhado) (Dias, 1996); para aceder aos conceitos de epfito, epfilo, eplitico e epigeico, consultar a seco IV. 4. 3.

Ocorrem em condies de extrema humidade atmosfrica (700900 m de altitude), i. e., sob condies de nevoeiro e de encharcamento permanentes, pelo que podero ser designadas por florestas das nvens (Dias, 1996). Contudo, e segundo o mesmo autor, o 50

arroteamento para pastagens estivais bem como a utilizao do azevinho para a alimentao do gado, como j havia sido referido anteriormente, colocam em perigo esta comunidade vegetal. O Ilex perado ssp. azorica, que apresenta uma cobertura mdia de 8 para as Ilhas do Pico e Terceira (Tabela VIII), a principal espcie caracterstica, a avaliar pelos valores de cobertura, embora ocorram outras duas espcies caractersticas do estrato arbreo, nomeadamente o Vaccinium cylindraceum e o Juniperus brevifolia (Figura 14). O Zimbral uma formao ainda frequente em algumas ilhas, ocorrendo em condies extremas de encharcamento e exposio, sendo identificadas duas formaes (Dias, 1996): 1) Bosque de Cedro (altitude mdia: 780 m): Apresenta uma densa cobertura de Juniperus brevifolia, espcie dominante, e como tal no permitindo o desenvolvimento de turfeira de Sphagnum spp. Est quase permanentemente sujeito a ventos intensos e a nevoeiros. O Ilex perado ssp. azorica surge no estrato arbreo com uma cobertura mdia de 4, 2, 5 e 2, respectivamente para as Ilhas das Flores, Faial, Pico e Terceira (Tabela VIII). Segundo Gabriel (1994 in Dias, 1991), em condies mais amenas, o Ilex perado ssp. azorica pode formar um estrato intermdio. 2) Bosque de Cedro com Turfeira (altitude mdia: 774 m): Corresponde a uma comunidade de transio para a Turfeira Florestada de Cedro, apresentando uma densidade menor de Juniperus brevifolia do que a formao anterior e permitindo o desenvolvimento de um tapete de Sphagnum spp. O Ilex perado ssp. azorica apresenta uma cobertura mdia de 3 (Tabela VIII) no estrato arbreo, na Ilha Terceira.

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Tabela VIII Cobertura mdia para Ilex perado ssp. azorica nas diversas formaes de florestas naturais dos Aores. ILHA FORMAO Flores Faial Pico Terceira So Miguel

Floresta Msica Lauriflia

Floresta Hmida Lauriflia

Floresta Hiper-Hmida Lauriflia

Florestas de Ilex

Zimbral: Bosque de Cedro

Zimbral: Bosque de Cedro com Turfeira

Da observao qualitativa dos dados constantes em Dias (1996), constata-se que este taxon ocorre associado a outros taxa do estrato arbreo como Laurus azorica, Vaccinium cylindraceum, Erica azorica, Juniperus brevifolia ou Frangula azorica. Para alm de Dias (1996), outros autores publicaram tambm alguns estudos efectuados sobre a vegetao natural dos Aores como

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Marler & Boatman (1952), Tutin (1953, 1964), Sjgren (1973) ou Haggar (1988). Ao descreverem a vegetao da Ilha do Pico, Marler & Boatman (1952) referem a presena deste taxon na comunidade Persea azoricaMyrica faya (Persea azorica-Myrica faya woodland), afirmando mesmo que aparece pela primeira vez nesta comunidade e apresentando valores de frequncia de 2 e 25% a 600 e 750 m de altitude, respectivamente. Dominam a Persea azorica (frequncias respectivas de 45 e 46 % a 600 e 750 m) e a Myrica faya (frequncias respectivas de 32 e 38% a 600 e 750 m). A salientar ainda o facto de, a 900 m de altitude, no ocorrerem registos para Ilex perado ssp. azorica, apesar de uma das espcies dominantes, Myrica faya, apresentar uma frequncia de 46%, no obstante a Persea azorica ter reduzido a sua frequncia para 9%. Tutin (1953, 1964), ao descrever a Floresta de Louro na Ilha do Pico (comunidade Perseo-Myricetum), refere a ocorrncia de Ilex perado ssp. azorica como uma espcie frequente do estrato arbreo (codominado por Persea azorica e Myrica faya) e como espcie menos dominante do estrato arbustivo (dominado por Myrsine africana), pormenorizando o facto de este ser cortado frequentemente. Ainda de acordo com Tutin (1953, 1964), este tipo de floresta praticamente constitudo por rvores folhosas persistentes. Tambm subjacente a uma anlise qualitativa, verifica-se que Tutin (1953, 1964) e Marler & Boatman (1952) apresentam como espcies associadas ao Ilex perado ssp. azorica, a Persea azorica, a Myrica faya ou a Myrsine africana, o que poder dever-se limitao dos estudos montanha do Pico, com caractersticas especficas, como adiante tambm se ver para as comunidades de matos. Numa perspectiva fitossociolgica, Sjgren (1973) cria alianas e associaes endmicas para os Aores, nomeadamente a aliana

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Juniperion brevifolii, a qual designada a partir de uma das espcies diferenciais do estrato arbustivo (Juniperus brevifolia), embora a Erica azorica parea ser a espcie mais frequente e dominante. Segundo Sjgren (1973), esta aliana a comunidade mais homognea do arquiplago sob o ponto de vista biogeogrfico, contendo o maior nmero de espcies endmicas aorianas e macaronsicas, sendo o Ilex perado ssp. azorica uma espcie diferencial de Juniperion brevifolii, geralmente associada a espcies como Frangula azorica, Hedera helix ssp., Ranunculus cortusifolius, Agrostis castellana, Erica azorica, Euphorbia stygiana, Viburnum tinus, Laurus azorica, Vaccinium cylindraceum, Myrsine africana var., Rubus hochstetterorum, Culcita macrocarpa ou Luzula purpureo-splendens e correspondendo a um elemento frequente de um estrato arbreo-arbustivo, juntamente com outros taxa como Erica azorica, Hypericum foliosum, tinus ssp. Juniperus brevifolia, 1978). Segundo Haggar (1988), o Ilex perado ssp. azorica, semelhana do Vaccinium cylindraceum, apresenta-se como uma espcie dominante ou como um elemento significativo da vegetao das florestas de baixa (600 m), mdia (750-800 m) e elevada (1250 m) altitude da Ilha do Pico. Ainda de acordo com o mesmo autor, existiam vastas populaes jovens. IV. 4. 2 Comunidades de matos Dias (1996) estabelece para as comunidades de matos vrias formaes, onde se inclui este taxon: Matos de Aluvies, Matos Encharcados, Matos ColonizadoresSucesses Primrias e Matos Colonizadores-Sucesses Secundrias . Frangula azorica, Viburnum subcordatum,

Vaccinium cylindraceum, Laurus azorica ou Myrsine africana (Sjgren,

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Os Matos de Aluvies localizam-se na base de colinas ou escarpas sobre depsitos de vertente finos e evoludos, com alguma perturbao, embora no apresentando uma grande diferenciao florstica (Dias, 1996). O Ilex perado ssp. azorica, que ocorre nesta formao a uma altitude mdia de 550 m, um taxon caracterstico deste tipo de matos, com uma cobertura mdia de 1, para a Ilha das Flores (Tabela IX) (Dias, 1996). O Ilex perado ssp. azorica constitui tambm um elemento dos Matos Encharcados, ocorrendo a uma altitude mdia de 677 m, com uma cobertura mdia de 2 para a Ilha Terceira, isto relativamente ao Mato de Rapa (nome comum para a Calluna vulgaris em algumas ilhas do Grupo Central do arquiplago) Encharcado (Tabela IX) (Dias, 1996). Os Matos Encharcados, na sua vertente arborescente, ocorrem em encostas de montanhas abrigadas, com uma elevada entrada de gua, quer por escorrncia, quer por interseco de nevoeiros, constituindo uma das derivaes ecolgicas das Turfeiras de Encosta Florestadas, enquanto que os Matos de Rapa Encharcados correspondem expresso madura dos matos de Calluna vulgaris (Callunetum, heathlands) nos Aores, sendo frequente nas Ilhas Terceira e So Miguel (Dias, 1996). Os Matos ColonizadoresSucesses Primrias correspondem a comunidades de matos sucessionais primrios, sendo os mais frequentes os campos de lavas recentes (Dias, 1996). O taxon em estudo ocorre neste tipo de comunidade, a uma altitude mdia de 662 m, com uma cobertura mdia de 2 para as Ilhas do Pico e Terceira (Tabela IX) (Dias, 1996). Relativamente aos Matos ColonizadoresSucesses Secundrias, onde, a par de formaes de origem natural, como por exemplo as deslocaes de terras, existem vastas reas de origem antrpica, o taxon em questo apresenta valores mdios de cobertura de 2, para as Ilhas

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Terceira e So Miguel, a uma altitude mdia de 578 m (Tabela IX) (Dias, 1996).
Tabela IX Cobertura mdia para Ilex perado ssp. azorica em algumas formaes de matos dos Aores. ILHA Flores Terceira Pico So Miguel

FORMAO

Matos de Aluvies

Matos Encharcados

Matos Colonizadores Sucesses Primrias

Matos Colonizadores Sucesses Secundrias

Tutin (1953, 1964), ao descrever os matos aorianos, refere a existncia da comunidade Ericetum azoricae, que atinge os 1500 m de altitude, apesar de desaparecerem quase todas as espcies subsidirias das camadas arbreas e arbustivas ao atingirem-se os 900 m de altitude. Esta apresenta um estrato arbreo onde o Ilex perado ssp. azorica ocorre com o status menos frequente e onde so registadas espcies como a Erica azorica (espcie dominante), o Juniperus brevifolia ou a Persea azorica, sendo a Myrica faya rara. Na comunidade de mato Erica azorica-Juniperus brevifolia (Erica azorica-Juniperus brevifolia scrub), dominada por estas duas espcies, a 1100 m de altitude, o nmero de rvores de Ilex perado ssp. azorica

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de apenas 1, embora a ocorrncia de plntulas seja de 5 em 7 quadrats (71%), enquanto que no mato Juniperus brevifolia (Juniperus brevifolia scrub), dominado por esta espcie, o taxon em estudo apresenta uma frequncia de 2 em 5 quadrats (40%) (Marler & Boatman, 1952). A partir de uma anlise qualitativa dos estudos efectuados por Dias (1996) sobre as comunidades de matos, observa-se que o taxon em causa aparece associado Euphorbia a espcies stygiana, vasculares Laurus como Rubus Culcita hochstetterorum, azorica,

macrocarpa, Rubia agostinhoi, Calluna vulgaris ou Myrsine africana e a brifitos como Sphagnum spp. ou Thuidium tamariscinum. Tendo por base as descries da vegetao apresentadas quer por Tutin (1953, 1964) quer por Marler & Boatman (1952), observa-se, qualitativamente, uma associao entre o Ilex perado ssp. azorica e outros taxa como a Erica azorica, o Juniperus brevifolia ou a Persea azorica. Esta diferena registada ao nvel da flora poder dever-se restrio dos estudos de Tutin (1953, 1964) e de Marler & Boatman (1952) Ilha do Pico, cuja montanha apresenta uma zonao de altitude com caractersticas peculiares, ou ausncia de formaes naturais nitidamente arbreas por fora da limitao geogrfica dos estudos da vegetao implementados por estes (Dias, 1996). A partir do exposto para o Ilex perado ssp. azorica poderemos facilmente concluir que este taxon abrange vrios tipos de comunidades desempenhando um papel ecolgico importante no seio das mesmas. A sua conservao permitir no s a sua preservao enquanto espcie individual, mas tambm a preservao e conservao dos ecossistemas naturais aorianos. IV. 4. 3 Brifitos e lquenes associados Os brifitos e lquenes so pioneiros na colonizao de substratos onde no pode subsistir qualquer outro tipo de forma de vida vegetal,

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contribuindo decisivamente para tal a ausncia de razes, a capacidade de poderem tolerar extensos perodos de secura e de obterem nutrientes da gua das chuvas e a sua capacidade de se propagarem vegetativamente (Oliveira, 1992). A maioria dos tipos florestais so importantes para os brifitos, sendo determinadas espcies sensveis s perturbaes ambientais, o que tem possibilitado a monitorizao das alteraes da poluio atmosfrica (e. g. Srgio et al., 1993 in Gabriel, 1994). As florestas naturais aorianas proporcionam vrios locais de colonizao, nomeadamente o solo, o substrato rochoso, a manta morta, os troncos apodrecidos e os troncos e folhas de rvores e arbustos (Gabriel, 1994). Os brifitos desempenham um papel importante nas

comunidades vegetais dos Aores atendendo a que: 1. Apresentam uma elevada riqueza especfica (Dias, 1996), bem como uma considervel diversidade ao nvel das briocomunidades (Sjgren, 1978); 2. Demonstram uma importncia estrutural significativa, nomeadamente ao nvel das turfeiras (Dias, 1986 in Dias, 1996; Mendes & Dias, 1998), escarpas e taludes (Dias, 1986 in Dias, 1996); 3. Apresentam um valor bio-indicador sintaxonmico

importante (Forbes, 1994 in Dias, 1996), assumindo uma relao indubitvel com as formaes vegetais do arquiplago (Sjgren, 1978; Gabriel, 1994). A maioria dos brifitos apresenta preferncia pelo tipo de substrato, utilizando Sjgren (1975 in Sjgren, 1997) uma classificao para os brifitos, quanto preferncia em relao ao tipo de substrato:

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Epfilos: espcies que crescem sobre folhas de rvores ou arbustos, nas frondes ou caules dos fetos e outras plantas vasculares ou mesmo sobre grandes brifitos. Epfitos: espcies que crescem sobre os caules de rvores ou arbustos. Epixlicos: espcies que preferem como substrato caules, ramos ou bocados de cortex de rvores presentes no cho ou sobre uma camada humfera. Epilticos: aqueles que crescem sobre superfcies de pedras ou rochas sem ou quase sem acumulao de solo ou camada de hmus. Epigeicos: aqueles que preferem como substrato um solo mineral de material mais ou menos grosseiro e sobre uma camada de hmus num grau de decomposio avanado.

As

hepticas

encontram-se

geralmente

bem

representadas,

constituindo os nveis mais ou menos constantes de humidade, insolao, temperatura e abrigo factores favorecedores da riqueza especfica assim como os elevados nveis de precipitao e de humidade atmosfrica (Gabriel, 1994). O Ilex perado ssp. azorica apontado como um dos forfitos (plantas-suporte) preferenciais para os brifitos (Figura 15) (Gabriel, 1994; Sjgren, 1997), sendo vrias as espcies associadas a este taxon: Allorgea berthelotiana: Musgo epfito (Pico) (Sjgren, 1978). Aphanolejeunea microscopica:

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Heptica epfila (S. Miguel, Terceira, Pico, S. Jorge), epfita (Terceira, Pico) e epixlica (Faial) (Sjgren, 1978). Aphanolejeunea teotonii : Heptica epfila (Terceira) (Gabriel, 1994). Bazzania azorica: Heptica epfita (Pico) (Sjgren, 1978). Cephalozia bicuspidata: Heptica epixlica (Pico) (Sjgren, 1978). Cololejeunea azorica: Heptica epfila (Pico, S. Jorge) (Sjgren, 1978). Endmica da Macaronsia (Sjgren, 1997). Cololejeunea minutissima: Heptica epfila (Pico, S. Jorge, Faial) e epfita (Terceira, Pico) (Sjgren, 1978). Colura calyptrifolia: Heptica epfila (S. Miguel, Terceira, Pico, S. Jorge, Faial) e epfita (Terceira, Pico) (Sjgren, 1978). Cyclodictyon laete-virens: Musgo epixlico (Pico) (Sjgren, 1978). Drepanolejeunea hamatifolia: Heptica epfila (S. Miguel, Terceira, Pico, S. Jorge e Faial), epfita (Terceira e Pico) e epixlica (Faial) (Sjgren, 1978). Echinodium prolixum: Musgo epfito (Pico) (Sjgren, 1978).

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Frullania microphyla: Heptica epfila (S. Miguel, Terceira, Pico, S. Jorge) e epfita (S. Jorge) (Sjgren, 1978). Frullania tamarisci: Heptica epfila (S. Miguel, Terceira, Pico, S. Jorge), epfita (Pico) e epixlica (Faial) (Sjgren, 1978). Frullania teneriffae: Heptica epfila (S. Miguel, Terceira, Pico, S. Jorge, Faial), epfita (Terceira, Pico, Faial) e epixlica (Faial) (Sjgren, 1978). Harpalejeunea ovata: Heptica epfila (S. Miguel) e epixlica (Faial) (Sjgren, 1978). Hypnum cupressiforme: Musgo epfilo (Terceira) (Sjgren, 1978). Hypnum cupressiforme ssp. resupinatum: Musgo epfito (S. Jorge) (Sjgren, 1978). Hypnum uncinulatum: Musgo epfilo (S. Miguel, Pico, S. Jorge), epfito (Pico) e epixlico (Faial) (Sjgren, 1978). Isopterygium elegans: Musgo epfilo (Pico, Faial) e epfito (Faial) (Sjgren, 1978). Lejeunea flava: Heptica epixlica (Pico) (Sjgren, 1978). Lejeunea lamacerina:

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Heptica epfila (Terceira, Pico, S. Jorge, Faial), epfita (Pico, S. Jorge, Faial) e epixlico (Pico, Faial) (Sjgren, 1978). Lejeunea patens: Heptica epfila (Terceira) (Sjgren, 1978). Lepidozia cupressina: Heptica epfita (Pico) e epixlica (Pico) (Sjgren, 1978). Lophocolea fragrans: Heptica epfita (Pico) (Sjgren, 1978). Marchesinia mackaii: Heptica epfila (Pico), epfita (S. Jorge) e epixlica (Pico) (Sjgren, 1978). Metzgeria furcata: Heptica epfila (S. Miguel, Terceira, Pico, Faial), epfita (Pico, Faial) e epixlica (Pico, Faial) (Sjgren, 1978). Metzgeria leptoneura: Heptica epfita (Pico) (Sjgren, 1978). Neckera intermedia: Musgo epfilo (Pico) (Sjgren, 1978). Oxyrrhynchium praelongum var. stokesii: Musgo epfilo e epixlico (Pico) (Sjgren, 1978). Oxyrrhynchium pumilum: Musgo epixlico (Pico) (Sjgren, 1978). Plagiochila corniculata:

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Heptica epfita (Pico) (Sjgren, 1978). Plagiochila spinulosa: Heptica epfila (Pico) e epfita (Pico ) (Sjgren, 1978). Radula aquilegia: Heptica epfila (S. Miguel, Terceira, Pico, S. Jorge, Faial), epfita (Pico, Faial) e epixlica (Faial) (Sjgren, 1978). Radula carringtonii: Heptica epfila (Sjgren, 1997). Radula complanata: Heptica epfila (Pico) (Sjgren, 1978). Radula holtii: Heptica epfita (Pico) e epixlica (Faial) (Sjgren, 1978). Radula wichurae: Heptica epfila (Pico) (Sjgren, 1978). Riccardia latifrons: Heptica epixlica (Pico) (Sjgren, 1978). Saccogyna viticulosa: Heptica epixlica (Pico) (Sjgren, 1978). Telaranea nematodes: Heptica epfita (Pico) (Sjgren, 1978). Tetrastichium fontanum: Musgo epixlico (Pico) (Sjgren, 1978).

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Thuidium tamariscinum: Musgo epfito-epixlico (Pico) e epixlico (Pico) (Sjgren, 1978).

Figura 15 Ilex perado ssp. azorica: associao com brifitos.

As florestas antigas suportam comunidades de lquenes em perigo de extino (Rose, 1988, Smith, 1993 in Purvis et al., 1995), cujo estudo poder constituir um instrumento para a seleco das reas prioritrias a conservar (Rose, 1976 in Purvis et al., 1995). As florestas de nvens correspondem a um dos tipos mais ameaados (Hamilton et al., 1993 in Purvis et al., 1995), diferindo consideravelmente ao nvel da humidade (Purvis et al., 1995). No arquiplago, estas florestas, segundo Hamilton et al. (1993 in Purvis et al., 1995) apresentam, frequentemente, um coberto de nuvens acompanhado por uma precipitao orogrfica.

64

Os lquenes, que se desenvolvem sobre uma vasta variedade de substratos, incluindo as folhas e o ritidoma das plantas, o solo e as rochas, apresentam uma importante aco ecolgica como pioneiros da colonizao de habitats rochosos pelo facto do crescimento de um lquene sobre uma arriba ou um penedo acompanhado pela decomposio da parte rochosa imediatamente subjacente garantir o estabelecimento posterior de brifitos e mais tarde das plantas vasculares e tambm devido ao facto dos seus restos mortais e das partculas rochosas formarem um substrato propcio ao desenvolvimento vegetal (Smith, 1987). O Ilex perado por ssp. azorica apresenta-se como frequentemente um forfito

colonizado

lquenes,

constituindo-se

interessante (Purvis, comunicao pessoal): Arthopyrenia antecellans: Faial (Purvis & James, 1993). Arthopyrenia carneobrunneola: Faial (Purvis & James, 1993), Terceira (Purvis et al., 1998). Arthopyrenia sp. 2: Terceira (Purvis et al., 1998). Byssoloma subdiscordans: Faial (Purvis & James, 1993 ; Purvis et al., 1995). Degelia plumbea: Terceira (Purvis et al., 1998). Graphis scripta: Flores, Terceira (Purvis et al., 1998). Graphis triticea: Terceira (Purvis et al., 1998). Lecanora chlarotera agg.: Terceira (Purvis et al., 1998).

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Lepraria lobificans: Terceira (Purvis et al., 1998). Lepraria umbricola: Terceira (Purvis et al., 1998). Lepraria sp. 1: Terceira (Purvis et al., 1998). Lepraria sp. 2: Terceira (Purvis et al., 1998) Lobaria scrobiculata: Pico (Purvis et al., 1995). Leptogium brebissonii: Terceira (Purvis et al., 1998). Leptogium burgessii: Pico (Purvis et al., 1995), Terceira (Purvis et al., 1998). Leptogium cyanescens: Pico (Purvis et al., 1995). Melaspilea ? diplaciospora: Flores (Purvis et al., 1998). Melaspilea spp.: Faial (Purvis & James, 1993; Purvis et al., 1995). Nephroma helveticum: Terceira (Purvis et al., 1998). Opegrapha sp.: Terceira (Purvis et al., 1998). Peltigera dissecta: Pico (Purvis et al., 1995). Parmentaria chilensis: Flores (Purvis et al., 1998), Faial (Purvis & James, 1993), Terceira (Purvis et al., 1998). Parmotrema chinense: Terceira (Purvis et al., 1998). Peltigera melanorrhiza: Pico (Purvis et al., 1995).

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Pertusaria maximilliana: Terceira (Purvis et al., 1998). Pertusaria sp. 1: Terceira (Purvis et al., 1998). Pertusaria sp. 3: Terceira (Purvis et al., 1998). Pseudocyphellaria intricata: Pico (Purvis et al., 1995). Pseudocyphellaria lacerata: Pico (Purvis et al., 1995). Pyrenula dermatodes: Flores (Purvis et al., 1998), Faial (Purvis & James, 1993), Terceira (Purvis et al., 1998). Pyrenula harrisii: Faial (Purvis & James, 1993), Terceira (Purvis et al., 1998). Pyrenula macrospora: Faial (Purvis & James, 1993). Pyrenula sp. 1: Terceira (Purvis et al., 1998). Pyrenula sp. 2: Terceira (Purvis et al., 1998). Sticta canariensis: Pico (Purvis et al., 1995). Tapellaria epiphylla: Faial (Purvis & James, 1993; Purvis et al., 1995). Thelotrema lepadinum: Faial (Purvis & James, 1993).

67

V. MULTIPLICAO IN VITRO

V. 1 Fundamentao bibliogrfica No obstante a escassa disponibilidade de bibliografia relativa cultura in vitro de Ilex, foram delineados alguns dos ensaios de acordo com Morte et al. (1991). Este autor refere a induo da abertura de gemas axilares em explantados num meio MS, cuja fonte de carbono utilizada foi a sacarose na concentrao de 30 g/l, tendo sido obtidos os melhores resultados para a concentrao de 1 mg/l de BAP (6benzilaminopurina), com a produo de duas gemas axilares por explantado inicial e rebentos com cerca de 1.4 cm. Pereira (1999) refere a utilizao do meio de cultura Z-2 (Zimmerman & Broome, 1980 in Brissete et al., 1990), suplementado com 2-ip, na micropropagao de Vaccinium cylindraceum Smith. Este meio foi aplicado na cultura in vitro de Ilex perado ssp. azorica devido ao facto do Vaccinium cylindraceum constituir um taxon lenhoso endmico dos Aores, semelhana do Ilex perado ssp. azorica, e disponibilidade deste meio j preparado em laboratrio. V. 2 Material e mtodos V. 2. 1 Origem e tipo do material vegetal Foram utilizadas, como material vegetal, microestacas uninodais provenientes de plantas-me jovens colhidas na Ilha de So Miguel: Caminho das Lombadas (689 m), Estrada da Lagoa do Fogo (851 m), Monte Escuro (800 m), Sanguinal (480 m), Caminho do Pico Bartolomeu (887 m) e Santo Antnio, Nordeste (258 m).

68

V. 2. 2 Equipamento e material laboratoriais Autoclave vertical semiautomtico AJC Uniclave 88: usado na esterilizao da gua destilada, dos meios de cultura e do papel Kraft. Balana digital: aplicada na pesagem dos diversos produtos implicados quer na elaborao dos meios de cultura quer na desinfeco. Cmara de crescimento: foi utilizada como cmara de crescimento uma cmara frigorfica modificada por via da aplicao de um aparelho climatizador e de um termstato e sondas que permitiram o controlo da temperatura. Cmara de fluxo laminar horizontal: utilizada na realizao de tarefas que exigiam um ambiente estril como a repicagem e inoculao do material vegetal. Destilador: foi usado na obteno da gua destilada para a preparao dos meios de cultura bem como para a desinfeco do material vegetal. Distribuidor regulvel Dispensette: foi aplicado na distribuio dos meios de cultura pelos vrios tubos de ensaio. Esterilizador elctrico Steri 350: utilizado para a esterilizao do material de dissecao aquando da sua utilizao dentro da cmara de fluxo laminar. Estufas MEMMERT: foram usadas na secagem do material de laboratrio depois de lavado bem como na esterilizao do material de repicagem.

69

Forno microondas Moulinex FM 3835: a sua utilizao permitiu a fuso dos meios de cultura previamente elaborados. METTLER KERN:

Balanas

elctricas

digitais

PJ

6000

utilizadas na pesagem dos diversos produtos envolvidos quer na preparao dos meios quer na desinfeco do material vegetal. Mquina de lavar loia comercial Ariston LS 1032: usada na lavagem de todo o material de laboratrio. Material de dissecao: foram utilizadas pinas em ao inox e bisturis n 4 munidos de lminas descartveis n 20 e n 22 para o corte e inoculao do material vegetal. Recipientes de cultura: nos vrios ensaios efectuados foram utilizados tubos de ensaio Pyrex de dimenses 125x25 mm na cultura de microestacas uninodais e tubos de menores dimenses para a cultura de meristemas tendo sido os primeiros tapados com Kaputs e os segundos com rolhas de algodo numa primeira fase e aps as inoculaes com rolhas de borracha. Termoagitador electromagntico: usado na preparao dos meios de cultura assim como na dissoluo de produtos qumicos em gua destilada na fase de desinfeco. V. 2. 3 Colheita do material vegetal O material utilizado nos ensaios preliminares foi colhido durante os meses de Maro e Abril, enquanto que, para os ensaios propriamente ditos, o mesmo foi colhido durante os meses de Julho, Outubro, Novembro e Dezembro.

70

O material vegetal foi seleccionado de acordo com o aspecto geral e a idade do mesmo, tendo sido dada prioridade a plantas aparentemente ss e jovens. Para tal, o corte dos caules foi efectuado com uma tesoura de poda devidamente desinfectada com lcool a 96%. A zona de corte foi devidamente borrifada com lcool a 96%, sendo o material inserido em frascos de vidro com gua e algumas gotas de hipoclorito de sdio (lixvia) e transportado numa mala trmica (onde a temperatura baixa era mantida pela presena de acumuladores) at ao laboratrio. V. 2. 4 Limpeza do material vegetal Aps uma primeira inspeco ao material recolhido, mormente quanto a eventuais presenas de insectos e/ou aracndeos, este foi seccionado em fragmentos de 45 cm, tendo sido retiradas as respectivas folhas ( excepo da fase 1 da modalidade de desinfeco B). Seguidamente, foi sujeito a uma lavagem contnua em gua corrente durante cerca de 3 horas num recipiente tapado com gaze. V. 2. 5 Desinfeco do material vegetal Micropropagao De acordo com os dados obtidos, para a contaminao e necrose, nos ensaios preliminares onde foram testadas quatro modalidades de desinfeco (Macedo, 1998; Maciel et al., 1998), foi escolhida a modalidade A (Tabela X) para o primeiro grupo de ensaios. Face aos resultados obtidos nestes, que continuavam a evidenciar elevadas taxas de contaminao, semelhana dos obtidos em Macedo (1998) e em Maciel et al. (1998), a modalidade B (Tabela X) foi aplicada ao segundo grupo de ensaios. Esta ltima modalidade consistiu em duas fases distintas:

71

1. Fase B1: Procedeu-se a uma primeira desinfeco das plantas com Benlate aps terem sido lavadas durante trs horas em gua corrente, no se tendo efectuado o corte dos seus caules e folhas, aps o que foram guardadas no frigorfico durante 48 horas. 2. Fase B2: Procedeu-se desinfeco propriamente dita, com o seccionamento dos caules e folhas.

Tabela X Modalidades de desinfeco aplicadas na micropropagao (modalidades A e B) e na cultura de meristemas (modalidade B) de Ilex perado ssp. azorica.

Mod. Lixvia Tempo (%) A B (B1) B (B2) 30 30 30 (min) 30 -

Tween 20 (%) 0.01 -

Tempo (min) 30 -

HgCl2 (%) 0.3 -

Tempo Benlate Tempo (min) 5 (%) 1.2 1.2 (min) 15 15

0.01

30

0.3

1.2

15

Cultura de meristemas A partir de ensaios preliminares efectuados com meristemas e dos valores de contaminao obtidos, quer nos ensaios preliminares quer no primeiro grupo de ensaios para a micropropagao, aplicou-se a modalidade de desinfeco B (Tabela X) nos ensaios com meristemas.

72

V. 2. 6 Lavagem do material de laboratrio Todo o material de laboratrio foi lavado numa mquina de lavar loua comercial com detergente tambm comercial, na dosagem mnima indicada pelo fabricante. Aps a lavagem, o material foi sujeito a trs passagens sucessivas por gua destilada, sendo colocado a secar numa estufa. V. 2. 7 Esterilizao do material de laboratrio A esterilizao do papel Kraft, utilizado na repicagem do material vegetal bem como dos copos de precipitao utilizados na desinfeco, foi efectuada com o auxlio do autoclave a 121 C durante 20 minutos. Relativamente ao material de dissecao, este foi esterilizado numa estufa elctrica a 180 C durante uma hora e, posteriormente, no interior da cmara de fluxo laminar atravs de um esterilizador Steri 350.

V. 2. 8 Esterilizao da gua destilada A gua destilada foi tambm esterilizada com o auxlio do autoclave, a 121 C, durante 90 minutos, sendo guardada no interior da cmara de fluxo laminar, havendo o cuidado de esta permanecer fechada. V. 2. 9 Esterilizao dos meios de cultura Estes foram autoclavados, a 121 C, durante 20 minutos, sendo, posteriormente, transferidos para a cmara de crescimento, no sentido de evitar possveis contaminaes por parte de agentes como fungos e/ou bactrias.

73

V. 2. 10 Composio dos meios de cultura V. 2. 10. 1 Meios bsicos De acordo com Morte et al. (1991), foi seleccionado o meio MS (Murashige & Skoog) como meio bsico de cultura, utilizado na micropropagao do azevinho europeu (Ilex aquifolium), cuja composio a constante na Tabela XI.
Tabela XI Composio do meio bsico de Murashige & Skoog (1962). MEIO MS COMPONENTES (mg/l) Macronutrientes KNO3 NH4NO3 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O KH2PO4 Micronutrientes MnSO4.4H20 H3BO3 CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O CoCl2.6H2O ZnSO4.7H2O KI 22.3 6.2 0.025 0.25 0.025 8.6 0.83 1900 1650 370 440 170 Soluo de Ferro FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O Vitaminas Tiamina.HCl cido nicotnico Piridoxina.HCl Inositol Aminocidos Glicina Hidratos de Carbono Sacarose Agar 30000 7000 0.1 0.5 0.5 100 Skoog (1944) 2 27.85 37.25

Foi ainda escolhido o meio de cultura Z-2 (Zimmerman & Broome, 1980 in Brissete et al., 1990) utilizado na micropropagao do taxon endmico aoriano Vaccinium cylindraceum por Pereira (1999), cuja composio a indicada na Tabela XII.

74

Tabela XII Composio do meio bsico de Zimmerman & Broome (1980 in George et al., 1987). MEIO Z 2 COMPONENTES (g/l) Macronutrientes KNO3 NH4NO3 (NH4)2 SO4 MgSO4.7H2O Ca(NO3)2.4H2O KH2PO4 Micronutrientes MnSO4.4H20 CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O CoCl2.6H2O ZnSO4.7H2O KI 202 160 198 370 708 408 Button & Botha (1975) 1690 2.5 250 2.5 8600 830 Soluo de Ferro FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O Vitaminas Tiamina.HCl Inositol Hidratos de Carbono Sacarose Agar 20 g 10 g Linsmaier & Skoog 55700 74500 Linsmaier & Skoog 400 100 mg

V. 2. 10. 2 Meios suplementados Reguladores de crescimento Na fase de iniciao das culturas e atendendo bibliografia disponvel (Morte et al., 1991) e aos resultados obtidos nos ensaios preliminares (Macedo, 1998; Maciel et al., 1998), realizaram-se dois grupos de ensaios recorrendo a meios (MS e Z-2) suplementados com vrias hormonas como BAP (6-benzilaminopurina), ANA (cido naftalenoactico) e 2-ip (6-,-dimetilalilamino purina). Neste primeiro grupo realizaram-se ensaios de micropropagao recorrendo a um meio de cultura MS suplementado com todas as

75

combinaes factoriais possveis entre as concentraes de 0.0, 0.5, 1.0 e 2.0 mg/l de ANA e de BAP (Tabela XIII).
Tabela XIII Meio de cultura e reguladores de crescimento utilizados no primeiro grupo de ensaios de micropropagao de Ilex perado ssp. azorica (LBD Lombadas; MTE Monte Escuro; ELF Estrada da Lagoa do Fogo; SGN Sanguinal; CPB Caminho do Pico Bartolomeu; STA Santo Antnio, Nordeste). Meio de Populao Cultura Reguladores de Crescimento (mg/l) LBD MS 0.0 ANA, 0.0 BAP LBD MS 0.5 ANA, 0.0 BAP LBD MS 1.0 ANA, 0.0 BAP LBD/MTE MS 2.0 ANA, 0.0 BAP LBD MS 0.0 ANA, 0.5 BAP ELF MS 0.0 ANA, 1.0 BAP ELF MS 0.0 ANA, 2.0 BAP SGN MS 0.5 ANA, 0.5 BAP STA MS STA MS STA MS CPB MS CPB MS CPB MS SGN MS SGN MS Populao Meio de Cultura Reguladores de Crescimento (mg/l) 0.5 ANA, 1.0 BAP 0.5 ANA, 2.0 BAP 1.0 ANA, 0.5 BAP 1.0 ANA, 1.0 BAP 1.0 ANA, 2.0 BAP 2.0 ANA, 0.5 BAP 2.0 ANA, 1.0 BAP 2.0 ANA, 2.0 BAP

Atendendo aos resultados obtidos nestes ensaios assim como taxa de diferenciao foliar de 16% obtida nos ensaios preliminares para um meio Z-2 suplementado com 15 mg/l de 2-ip, realizou-se um segundo grupo de ensaios que envolveram, quer ensaios de micropropagao, quer cultura de meristemas.

76

Assim, para os primeiros foram testados dois meios de cultura, MS e Z-2, ambos suplementados com 2-ip (Tabela XIV).
Tabela XIV Meios de cultura e reguladores de crescimento utilizados no segundo grupo de ensaios de micropropagao de Ilex perado ssp. azorica (CPB Caminho do Pico Bartolomeu; MTE Monte Escuro; LBD Lombadas; SGN Sanguinal). Populao Meio de cultura Reguladores de crescimento (mg/l) CPB CPB MTE/LBD MTE/LBD SGN SGN MS MS MS Z-2 Z-2 Z-2 5.0 2-ip 15.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip

Relativamente cultura de meristemas foi utilizado um meio MS suplementado com vrias concentraes hormonais, bem como um meio Z-2 complementado por 2-ip, de acordo com a Tabela XV.
Tabela XV Meios de cultura e reguladores de crescimento utilizados na cultura de meristemas de Ilex perado ssp. azorica (CPB Caminho do Pico Bartolomeu; MTE Monte Escuro; LBD Lombadas; SGN Sanguinal; STA Santo Antnio, Nordeste). Populao Meio de cultura Reguladores de crescimento (mg/l) LBD LBD SGN SGN SGN MTE CPB CPB CPB CPB STA STA MS MS MS MS MS MS MS MS MS Z-2 Z-2 Z-2 _ 0.0 ANA, 0.5 BAP 0.0 ANA, 1.0 BAP 0.0 ANA, 2.0 BAP 0.5 ANA, 1.0 BAP 1.0 ANA, 0.5 BAP 2.0 ANA, 1.0 BAP 5.0 2-ip 15.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip

77

V. 2. 11 Preparao dos meios de cultura V. 2. 11. 1 Elaborao das soluesme de macronutrientes, micronutrientes, quelato de ferro e vitaminas Na elaborao dos meios MS e Z-2, a preparao das solues-me concentradas regeu-se pelas concentraes respectivas indicadas nas Tabelas XI e XII. Na elaborao do meio MS, as soluesme para os

macronutrientes e micronutrientes foram preparadas nas concentraes 100x, excepo da soluo-me de micronutrientes KNO3, a qual foi preparada numa concentrao 50x. A soluome de quelato de ferro foi elaborada numa concentrao 200x e incubada durante 24 horas a 60C, enquanto que a mesma relativa s vitaminas foi preparada numa concentrao 1000x. Relativamente ao meio Z-2, as soluesme para os

macronutrientes foram preparadas numa concentrao 10x, enquanto que as mesmas para os micronutrientes foram elaboradas numa concentrao 1000x. Por seu turno, as soluesme de quelato ferro e de vitaminas foram ambas preparadas numa concentrao 100x. Todas estas solues foram posteriormente mantidas no frio a 5C, aproximadamente. V. 2. 11. 2 Elaborao das soluesme dos reguladores de crescimento Primeiramente, procedeu-se dissoluo das auxinas e das citocininas, respectivamente em lcool a 96% e em NaOH ou HCl a 1 M, aps o que se procedeu preparao das soluesme para as mesmas na razo de 10 mg:100 ml de gua destilada. 78

Estas soluesme, aps a sua preparao, foram tambm mantidas no frio. V. 2. 11. 3 Elaborao dos meios de cultura Na elaborao dos meios de cultura todos os elementos

adicionados respeitaram as concentraes constantes nas Tabelas XI e XII. A adio dos reguladores de crescimento fez-se por ltimo, aps o que se procedeu ao acerto do pH (5.8 e 4.8, respectivamente para os meios MS e Z-2, considerando um erro de 0.01) com o auxlio de NaOH ou de HCl 1 M. A solidificao dos mesmos foi realizada com Bacto Agar Difco, tendo o cozimento decorrido num Erlenmeyer apoiado num

termoagitador electromagntico. Os meios produzidos foram distribudos por tubos de ensaio, recebendo cada unidade de cultura 10 ou 5 ml, conforme se tratasse de ensaios de micropropagao ou de cultura de meristemas. V. 2. 12 Tcnicas de dissecao Micropropagao Todos os procedimentos experimentais foram realizados no interior da cmara de fluxo laminar, tendo sido efectuados os cortes dos explantados (microestacas uninodais) sobre papel Kraft esterilizado e com o auxlio de pinas e bisturis tambm esterilizados, sendo retiradas as extremidades necrticas (Figura 16).

79

Figura 16 Procedimento experimental na dissecao do material vegetal.

Os explantados foram inseridos no meio de cultura com o auxlio de pinas, havendo o cuidado de evitar o contacto dos mesmos com os bordos e paredes dos respectivos tubos e de modo a que a gema axilar ficasse acima do meio de cultura (Figura 17).

Figura 17 Explantado em meio de cultura

Cada um dos tubos foi tapado com Kaputs, sendo os mesmos distribudos por suportes, os quais foram colocados numa cmara de crescimento a 21C ( 1C) e com um fotoperodo de 16 horas de luz. A iluminao foi fornecida por lmpadas fluorescentes Sylvania Standard

80

F58W

154

T8

Daylight,

cujo

fluxo

luminoso

correspondeu

aproximadamente 4000 lm. Cultura de meristemas semelhana dos ensaios anteriores, todos os procedimentos experimentais foram realizados no interior da cmara de fluxo laminar. Com o auxlio de pinas e bisturis previamente esterilizados, retiraramse as vrias escamas constituintes das gemas axilares de modo a proceder-se abertura das mesmas, com o mximo cuidado para no danificar os tecidos meristemticos subjacentes, os quais foram posteriormente removidos e inseridos no meio de cultura com o auxlio de bisturis e pinas e tendo em conta as mesmas precaues dos ensaios anteriores. V. 2. 13 Colheita e anlise de dados Para cada ensaio de micropropagao foram realizadas trs repeties com 30 elementos cada, enquanto que para os ensaios com meristemas foram realizadas trs repeties de 12 elementos cada. Apenas durante a fase de iniciao das culturas foram colhidos dados quarta semana, uma vez que a contaminao e necrose impossibilitaram o desenvolvimento vegetativo dos explantados. Foram considerados os seguintes parmetros: Contaminao: 1) n. de explantados visualmente contaminados Necrose: 2) n. de explantados necrticos Diferenciao: 3) n. de explantados com gemas abertas sem diferenciao foliar

81

Viabilidade (desenvolvimento de tecido caloso e/ou outras anomalias): 4) n. de explantados com tecido caloso e/ou outras anomalias

Os

dados

colhidos

foram

sujeitos

uma

quantificao,

considerando os seguintes universos para cada um dos respectivos parmetros: Contaminao: n. total de explantados Necrose: n. de explantados sem contaminao visvel Diferenciao: Tecido caloso n. e de outras explantados anomalias: sobreviventes n. de sem contaminao visvel explantados sobreviventes sem contaminao visvel Assim, foram aplicadas as seguintes frmulas para o clculo das respectivas taxas de contaminao, necrose, diferenciao e de tecido caloso: Contaminao = n. de explantados contaminados/N Necrose = n. de explantados necrticos/N n. explantados

contaminados Diferenciao = n. de explantados com gemas abertas sem rebentos e/ou folhas diferenciados/N (n. de explantados contaminados + n. de explantados necrticos) Tecido Caloso = n. de explantados com desenvolvimento de tecido caloso/N (n. de explantados contaminados + n. de explantados necrticos)

82

N = n. de explantados em cada modalidade de micropropagao. No clculo das taxas de contaminao, necrose, tecido caloso e de diferenciao, os valores de N considerados foram de 30 e de 12, respectivamente para os ensaios de micropropagao e de cultura de meristemas. Foi realizado um tratamento estatstico atravs do programa SPSS 10.0 para Windows, instalado num computador PC Pentium II. Foi efectuada uma anlise de varincia (ANOVA), com um critrio de classificao, tendo sido feita a comparao das mdias atravs do Teste de Tukey, cujo nvel de significncia foi de 5%, sendo que as mdias assinaladas com a mesma letra no diferiram significativamente entre si. Quando os dados em estudo assim o justificavam, foi realizado um Teste T.

V. 3 Resultados e discusso V. 3. 1 Micropropagao Influncia da desinfeco na contaminao No incio do estudo da multiplicao deste taxon foram realizados ensaios preliminares, cujos melhores resultados relativos desinfeco foram obtidos para a modalidade constituda por uma exposio durante 30 minutos a hipoclorito de sdio (lixvia) na concentrao de 30%, seguida por uma exposio a HgCl2 (0.3%) durante 5 minutos e a Benlate (0.06%) durante 15 minutos, com um meio de MS, e com uma taxa de contaminao de 25%, aps quatro semanas em cultura. Todavia, foi observada uma taxa mdia de contaminao de 37% para uma modalidade de desinfeco que compreendeu uma primeira 83

desinfeco com a aplicao de lcool etlico (70%) durante 1 minuto, de lixvia (30%) + T-20 (0.01%) durante 30 minutos, de HgCl2 (0.3%) durante 5 minutos e de Benlate (0.06%) durante 15 minutos e uma desinfeco propriamente dita aps 24 horas e que constou na exposio a lcool, lixvia + T-20 e a HgCl2, nas mesmas concentraes e tempos de imerso da primeira desinfeco, com um meio Z-2 suplementado com 2 ml/l de anticontaminante PPM, revelando uma boa performance. De acordo com Pereira (1999), o PPM (0.4%) foi utilizado na desinfeco de explantados de Vaccinium cylindraceum Smith, com uma taxa de contaminao de 60.1%, aps quatro semanas em cultura, tendo sido mais eficaz a associao de uma soluo de benomyl ao processo de desinfeco com bicloreto de mercrio do que a associao da soluo desinfectante PPM. Ainda de acordo com esta autora, os melhores resultados obtidos com a soluo de benomyl tero uma explicao muito provvel na especificidade da natureza anti-fngica e na elevada concentrao com que foi utilizado o benomyl (12%), referindo que seria interessante a experimentao de PPM como soluo de desinfeco numa concentrao superior usada (0.4%). Todavia, no foi possvel a utilizao deste anticontaminante nos ensaios posteriores com Ilex perado ssp. azorica face ao seu elevado custo econmico. Seria interessante uma nova aplicao deste produto em ensaios a realizar com este taxon, uma vez que permitiu uma diminuio substancial da contaminao nos ensaios preliminares. A partir de um Teste T realizado, verificou-se que as duas modalidades de desinfeco apresentavam valores percentuais significativamente diferentes entre si (Tabela XVI e Anexo 2).

84

Tabela XVI Contaminao total mdia obtida nas modalidades de desinfeco A e B.

Modalidade de desinfeco Modalidade A Modalidade B

Contaminao total mdia (%) 88 a 72 b

A evoluo do nmero absoluto de explantados contaminados, para as modalidades de desinfeco A e B, ao longo de quatro semanas em cultura, poder ser observada nas Figuras 18 e 19. Os resultados expostos revelaram nitidamente a ocorrncia de uma elevada contaminao aps a primeira semana, demonstrando a ocorrncia de um elevado ndice de contaminao num perodo de tempo relativamente curto. Para alm disso, as taxas de sobrevivncia para todos os ensaios realizados revelaram-se nulas a partir da quarta/quinta semana em cultura. Estes factos constituram os principais obstculos ao sucesso da micropropagao deste taxon, com uma consequente ocorrncia de universos de explantados muito reduzidos.

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

88

N de explantados contaminados

1 semana 1 semana 2

1 semana 3

0 semana 4

Figura 18 Nmero absoluto de explantados contaminados, para a modalidade de desinfeco A, ao longo das quatro semanas em cultura.

85

60 60 50 40 30 20 10 0 semana 1 semana 2 semana 3 semana 4

N de explantados contaminados

Figura 19 Nmero absoluto de explantados contaminados, para a modalidade de desinfeco B, ao longo das quatro semanas em cultura.

A anlise da desinfeco do material vegetal vital para a compreenso da micropropagao bem como de todo o processo de cultura in vitro. O sucesso destas tcnicas na propagao vegetal depende de uma excluso rigorosa dos agentes contaminantes, um aspecto fulcral de toda a tecnologia de cultura in vitro (Biondi & Thorpe, 1981). Apesar dos ensaios de micropropagao terem apresentado elevadas taxas de contaminao, os melhores resultados observados (59%) para este parmetro foram obtidos com a aplicao da modalidade de desinfeco B a um ensaio com um meio de cultura MS suplementado com 5.0 mg/l de 2-ip, o qual decorreu nos meses de Outubro e de Novembro. A contaminao, maioritariamente provocada por fungos, pode terse originado a partir de microrganismos presentes superfcie das plantas ou ter sido uma consequncia das tcnicas laboratoriais, embora durante o crescimento e desenvolvimento das plantas muitos microrganismos, incluindo os patognicos facultativos ou obrigatrios, possam penetrar no interior destas, colonizando os tecidos e permitindo

86

s plantas o desenvolvimento de floras endgenas constitudas por diversas espcies (Cassells, 1991). Entre os principais microrganismos associados com a superfcie vegetal encontram-se os fungos, as bactrias ou mesmo as leveduras (Bov, 1988 in Cassells, 1991), os quais nutrem-se a partir da planta e, como tal, as reas onde ocorre uma maior abundncia de alimento (e. g. nectrios, cortes) parecem suportar maiores populaes (Preece, 1988 in Cassells, 1991). No que respeita aos procedimentos laboratoriais, estes foram cumpridos com o mximo de rigor possvel, muito embora as condies para a cultura in vitro no fossem as ideais. Relativamente contaminao por agentes endgenos, muitos dos microrganismos que possam estar presentes intercelularmente nos tecidos vegetais sero capazes de crescer no meio de cultura, embora alguns possam ser inibidos pela elevada concentrao de sacarose ou de sais e pelo pH (Cassells et al., 1988 in Cassells, 1991). Os fungos endgenos ocorrem virtualmente em todas as espcies vegetais intra ou intercelularmente sem provocarem sinais aparentes de danificao dos tecidos (Bills, 1996, Sinclair, 1996 in Saikkonen et al., 1998). So considerados mutualistas vegetais, recebendo os nutrientes e a proteco das plantas hospedeiras, enquanto que estas beneficiam de uma maior capacidade competitiva e de uma maior proteco contra os herbvoros, agentes patognicos e stress provocado por factores abiticos (Saikkonen et al., 1998). A sua eliminao nem sempre se torna fcil, pois alguns dos estudos realizados com cultura de caules e de folhas previamente esterilizados revelaram uma elevada diversidade de fungos existentes sob a cutcula ou mesmo no interior dos tecidos de muitas plantas ss (e. g.

87

Luginbhl & Miller, 1980 in Carroll, 1988; Carroll, 1991). Adicionalmente, os elevados valores de precipitao e de humidade relativa do ar registados nos Aores aliados ao facto das plantas-me no terem sido sujeitas a quaisquer tipos de tratamentos fitossanitrios prvios tambm podero ter contribudo de um modo decisivo para as taxas de contaminao obtidas. No tratamento estatstico efectuado, a existncia de valores significativamente diferentes entre as duas modalidades de desinfeco ensaiadas poder estar correlacionada com a aplicao da primeira desinfeco com Benlate (1.2%), durante 15 minutos, na modalidade B. Influncia da desinfeco na necrose Nos ensaios preliminares os melhores resultados observados para a necrose (18%) foram obtidos numa modalidade de desinfeco que compreendeu a aplicao de hipoclorito de sdio (30%) + T-20 (0.01%) durante 30 minutos, de HgCl2 (0.3%) durante 5 minutos e de Benlate (0.06%) durante 15 minutos, num meio Z-2 suplementado com 15 mg/l de 2-ip, da que se tenha optado por retirar o lcool das desinfeces posteriores (Macedo, 1998). A partir da comparao das mdias de necrose total para cada uma das modalidades de desinfeco, recorrendo a um Teste T, verificou-se que estas no diferiam significativamente entre si (Tabela XVII e Anexo 3), embora a modalidade B exibisse uma taxa de necrose mais elevada. Assiste-se a uma ausncia de necrose durante as primeiras 2 a 3 semanas em cultura, como se poder observar nas Figuras 20 e 21. Este facto poder significar, numa primeira leitura, que a desinfeco empregue no fomentou decisivamente a necrose dos explantados, podendo esta ter outras origens tais como os meios de cultura e/ou os reguladores de crescimento empregues. 88

Tabela XVII Necrose total mdia obtida nas modalidades de desinfeco A e B.

Modalidade de desinfeco Modalidade A Modalidade B

Necrose total mdia (%) 36 53

2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 semana 1 semana 2 semana 3 semana 4 0 0 0 N de explantados necrticos

Figura 20 Nmero absoluto de explantados necrticos para a modalidade de desinfeco A ao longo das quatro semanas em cultura.

14 12 10 8

13

N de explantados necrticos 6 4 2 2 0 0 semana 1 semana 2 semana 3 semana 4 0

Figura 21 Nmero absoluto de explantados necrticos para a modalidade de desinfeco B ao longo das quatro semanas em cultura.

89

A inexistncia de valores significativamente diferentes tambm poder estar relacionada com o facto do universo de explantados sobreviventes ser demasiado pequeno.

Influncia dos meios de cultura/reguladores de crescimento na necrose Foi efectuado um tratamento estatstico s taxas de necrose obtidas, atravs de uma anlise de varincia ANOVA e de um Teste Tukey, em funo do efeito do meio de cultura e dos reguladores de crescimento sobre a necrose. No foram verificadas diferenas significativas entre as mdias comparadas (Tabela XVIII), embora com uma significncia de 0,017, como se poder observar atravs dos valores presentes no Anexo 4. A anlise estatstica influncia dos dois meios bsicos de cultura na necrose, foi realizada atravs de um Teste T, o qual revelou a inexistncia de diferenas significativas entre os meios MS e Z2 (Tabela XIX e Anexo 5). Interpretando os resultados obtidos, verifica-se que ambos os meios provocaram necrose, sendo, por isso, conveniente a experimentao de outras formulaes. A composio do meio e/ou os reguladores de crescimento podero ter contribudo em grande parte para a ocorrncia de necrose por via de vrios factores, nomeadamente pela oxidao dos compostos fenlicos, por possveis alteraes ao nvel da composio qumica dos meios de cultura ou pela aplicao de concentraes insuficientes ou demasiado elevadas de reguladores de crescimento.

90

O facto da anlise estatstica ao efeito isolado de cada um dos meios bsicos de cultura na necrose ter revelado a inexistncia de diferenas significativas poder novamente tambm estar relacionado com a ocorrncia de universos reduzidos.
Tabela XVIII Necrose total mdia obtida em cada uma das modalidades de cultura ensaiadas.

Meio de Cultura

Reguladores de Crescimento (mg/l)

Necrose (%) Modalidade A

Meio de Cultura

Reguladores de Crescimento (mg/l)

Necrose (%) Modalidade B

MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS

0.0 ANA, 0.0 BAP 0.5 ANA, 0.0 BAP 1.0 ANA, 0.0 BAP 2.0 ANA, 0.0 BAP 0.0 ANA, 0.5 BAP 0.0 ANA, 1.0 BAP 0.0 ANA, 2.0 BAP 0.5 ANA, 0.5 BAP 0.5 ANA, 1.0 BAP 0.5 ANA, 2.0 BAP 1.0 ANA, 0.5 BAP 1.0 ANA, 1.0 BAP 1.0 ANA, 2.0 BAP 2.0 ANA, 0.5 BAP 2.0 ANA, 1.0 BAP 2.0 ANA, 2.0 BAP

36 36 27 33 44 29 13 20 25 87 28 50 0 11 89 33

MS MS MS Z-2 Z-2 Z-2 __ __ __ __ __ __ __ __ __ __

0.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip 0.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip __ __ __ __ __ __ __ __ __ __

90 14 53 84 29 76 __ __ __ __ __ __ __ __ __ __

Tabela XIX Influncia dos meios bsicos de cultura MS e Z-2 na necrose.

Meio de cultura MS Z-2

Necrose total mdia (%) 90 84

Os fenis constituem um grupo de compostos que afectam significativamente o crescimento e o desenvolvimento das plantas (Kefeli 91

& Kutcek, 1977; Kefeli, 1978, Sembdner & Gross, 1986 in Sebanek et al., 1991) com possveis interferncias no metabolismo das auxinas, afectando os processos fisiolgicos (Kefeli & Kutcek, 1977 in Sebanek et al., 1991). Segundo Debergh & Read (1991), quando os tecidos vegetais so expostos a situaes de stress, tais como cortes ou isolamento de um explantado da planta-me, o metabolismo dos compostos fenlicos estimulado. Deste modo, os tecidos dos explantados de plantas lenhosas, particularmente das Angiosprmicas, segregam frequentemente pigmentos acastanhado-negros, compostos principalmente por polifenis oxidados e taninos (Thorpe et al., 1991), tendo sido verificado o escurecimento do meio de cultura. Os compostos fenlicos libertados no meio de cultura oxidam-se (Aug, 1989), inibindo deste modo o crescimento dos rebentos e conduzindo morte dos tecidos, produzindo os explantados provenientes de plantas-me mais velhas uma maior quantidade destes compostos (Chalupa, 1987 in Thorpe et al., 1991). A adio de anti-oxidantes constitui uma soluo para a

ultrapassagem dos problemas decorrentes deste fenmeno (Berthouly, 1989 in Dublin et al., 1991), sendo a remoo dos compostos fenlicos feita, por exemplo, atravs da adsoro com carvo activado (George & Sherrington, 1984 in Debergh & Read, 1991). Os explantados em cultura produzem tambm substncias volteis que se podem acumular nos tubos de ensaio, influenciando o crescimento e a morfognese, e que incluem, entre outras, o dixido de carbono, o etileno ou o etanol (Thomas & Murashige, 1979 in Thorpe et al., 1991). Contudo, estas situaes nefastas para os tecidos em cultura no foram contabilizadas no presente estudo. A ocorrncia de outras possveis alteraes no contabilizadas ao nvel da composio qumica dos meios com perda de alguns

92

componentes e formao de produtos txicos, resultantes de alguns procedimentos na preparao dos meios de cultura, dos quais se salientam a autoclavagem ou a exposio luz, podero tambm ter contribudo para a necrose dos tecidos vegetais (Dalton et al., 1983, Skirvin et al., 1986, Elmore et al., 1990, Williams et al., 1990 in Williams, 1992). George & Sherrington (1984 in Barros & Pasqual, 1992) registaram variaes de pH promovidas pela autoclavagem que evidenciaram uma acidificao do meio MS, a qual foi tambm referida por Skirvin et al. (1986 in Barros & Pasqual, 1992). As variaes de pH aps a autoclavagem so devidas s reaces qumicas ocorridas durante o processo de esterilizao do meio de cultura, as quais podem modificarse em funo do pH ajustado inicialmente e da temperatura de autoclavagem (Bohagel, 1971 in Barros & Pasqual, 1992). A qualidade da gua, nutrientes minerais e tipo de autoclave usados na preparao dos meios, assim como o tempo gasto na autoclavagem influenciam na variao do pH (Barros & Pasqual, 1992). McCown & Sellmer (1987 in Debergh, 1988) referem que uma elevada concentrao inica possui um efeito inibidor no crescimento de muitos taxa lenhosos, adiantando ainda que uma deficincia em clcio nos tecidos, por via de uma elevada humidade no interior das unidades de cultura, poder conduzir necrose dos tecidos. A adio de concentraes insuficientes ou demasiado elevadas de reguladores de crescimento que possam ter provocado, quer a incapacidade de desenvolvimento vegetativo, quer a necrose precoce dos tecidos, poder constituir tambm uma causa provvel para a morte dos explantados, uma vez que, de acordo com Skoog & Miller (1957 in Evans et al., 1981), as concentraes de reguladores de crescimento presentes nos meios de cultura so crticas em relao ao controlo do crescimento e da morfognese.

93

Porm, segundo Tran Thanh Van & Trinh (1990), existem vrios factores a ter em conta no que respeita ao ratio auxina/citocinina utilizado nas culturas in vitro tais como o grau de sensibilidade das clulas vegetais aos reguladores de crescimento, o estado fisiolgico da planta-me, o nvel endgeno de molculas activas dos reguladores de crescimento presentes, o tipo de auxina ou citocinina utilizado ou mesmo a actividade das auxinas/citocininas oxidases. Influncia dos meios de cultura/reguladores de crescimento e da poca do ano no desenvolvimento de tecido caloso Foi efectuada uma anlise de varincia ANOVA e um Teste de Tukey, em funo da influncia dos meios de cultura e dos reguladores de crescimento no desenvolvimento de tecido caloso, que revelaram a inexistncia de diferenas significativas entre as mdias comparadas, embora com uma significncia de 0.005 (Tabela XX e Anexo 6). Na anlise influncia dos meios bsicos de cultura no desenvolvimento de tecido caloso, e recorrendo a um Teste T, foram comparadas as mdias relativas aos meios MS e Z-2 no suplementados com reguladores de crescimento, sendo registada a ausncia de diferenas significativas entre estas (Tabela XXI e Anexo 7). As composies em sais de meios de cultura, como o MS, de acordo com Gamborg & Shyluk (1980), so propcias formao de tecido caloso. Para alm destes sais, so adicionados o inositol, a sacarose, as Bvitaminas e os reguladores de crescimento, sendo estes ltimos responsveis pela induo da diviso das clulas e consequentemente pela formao deste tipo de tecido. Geralmente, uma concentrao elevada de auxinas e uma concentrao baixa de citocininas no meio promovem uma proliferao abundante de clulas com formao de tecido caloso (Evans et al., 1981).

94

Tabela XX Influncia dos meios de cultura/reguladores de crescimento no desenvolvimento de tecido caloso.

Meio de Cultura MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS Z-2 Z-2 Z-2

Reguladores de Crescimento (mg/l) 0.0 ANA, 0.0 BAP 0.5 ANA, 0.0 BAP 1.0 ANA, 0.0 BAP 2.0 ANA, 0.0 BAP 0.0 ANA, 0.5 BAP 0.0 ANA, 1.0 BAP 0.0 ANA, 2.0 BAP 0.5 ANA, 0.5 BAP 0.5 ANA, 1.0 BAP 0.5 ANA, 2.0 BAP 1.0 ANA, 0.5 BAP 1.0 ANA, 1.0 BAP 1.0 ANA, 2.0 BAP 2.0 ANA, 0.5 BAP 2.0 ANA, 1.0 BAP 2.0 ANA, 2.0 BAP 0.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip 0.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip

Tecido Caloso (%) 67 96 100 33 50 100 67 33 100 33 17 33 0 100 33 0 67 16 0 50 50 0

Tabela XXI Influncia dos meios bsicos de cultura MS e Z-2 no desenvolvimento de tecido caloso.

Meio de Cultura MS Z-2

Tecido Caloso (%) 67 50

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Os valores respeitantes influncia da poca do ano no desenvolvimento de tecido caloso foram comparados atravs de um Teste T, tendo sido observada a ocorrncia de valores significativamente diferentes entre as mdias correspondentes a cada uma das pocas do ano (Tabela XXII, Anexo 8).

Tabela XXII Influncia da poca do ano sobre o desenvolvimento de tecido caloso.

poca do ano Julho Outubro/Novembro

Tecido Caloso (%) 100 a 16 b

No decurso da Primavera ocorre um aumento de produo de hormonas, como as auxinas, as citocininas e as giberelinas, o qual acompanhado por um crescimento dos orgos vegetais, diminuindo o fluxo destas substncias no Vero (Aug, 1989). De acordo com Gamborg & Shyluk (1981), uma auxina e por vezes uma citocinina promovem a formao de tecido caloso durante a cultura in vitro. Por conseguinte, no primeiro grupo de ensaios, realizados durante o ms de Julho, a formao de tecido caloso foi promovida, provavelmente, quer pelos reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura, quer pelas hormonas endgenas dos explantados que nesta altura do ano ainda ocorriam em concentraes relativamente elevadas comparativamente com os meses de Outubro e de Novembro. Isto parece indiciar que o aparecimento de taxas de tecido caloso mais elevadas no primeiro grupo de ensaios est relacionado mais com a poca do ano do que propriamente com os meios de cultura e os reguladores de crescimento utilizados.

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Influncia dos meios de cultura/reguladores de crescimento e da poca do ano na diferenciao As taxas de diferenciao observadas (Tabela XXIII) referem-se apenas abertura de gemas sem diferenciao foliar. Posteriormente, estes explantados viriam a ficar contaminados ou necrticos aps a quarta/quinta semana em cultura. Todavia, e atendendo ao reduzido volume de dados obtidos para este parmetro, optou-se pela no realizao de quaisquer tipos de anlise estatstica.
Tabela XXIII Taxas de diferenciao obtidas aps quatro semanas em cultura. poca do Ano Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Julho Outubro/Novembro Outubro/Novembro Outubro/Novembro Outubro/Novembro Outubro/Novembro Outubro/Novembro Meio de Cultura MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS MS Z-2 Z-2 Z-2 Reguladores de crescimento (mg/l) 0.0 ANA, 0.0 BAP 0.5 ANA, 0.0 BAP 1.0 ANA, 0.0 BAP 2.0 ANA, 0.0 BAP 0.0 ANA, 0.5 BAP 0.0 ANA, 1.0 BAP 0.0 ANA, 2.0 BAP 0.5 ANA, 0.5 BAP 0.5 ANA, 1.0 BAP 0.5 ANA, 2.0 BAP 1.0 ANA, 0.5 BAP 1.0 ANA, 1.0 BAP 1.0 ANA, 2.0 BAP 2.0 ANA, 0.5 BAP 2.0 ANA, 1.0 BAP 2.0 ANA, 2.0 BAP 0.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip 0.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip Diferenciao (%) 0 0 0 0 0 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 33 10 0 0 28 0

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Ao nvel deste parmetro, apenas foram registados resultados para a abertura de gemas sem formao de rebentos, tendo sido obtidos os melhores resultados, com uma taxa de diferenciao de 33%, para um meio de cultura MS simples e com uma modalidade de desinfeco B (Tabela XXIII). Porm, e devido elevada contaminao que impossibilitou a viabilidade dos explantados no meio de cultura e a resposta morfognica dos mesmos em relao a cada um dos meios nutritivos suplementados ou no, a anlise da diferenciao ocorrida, nomeadamente ao nvel da influncia dos meios de cultura e dos reguladores de crescimento, tornou-se impraticvel. No entanto, atravs da Tabela XXIII, constatou-se que a

diferenciao atingiu percentagens superiores no segundo grupo de ensaios realizados. Isto poder dever-se ao facto de no primeiro grupo as taxas de contaminao registadas terem sido superiores em relao s do segundo, o que limitou naturalmente uma anlise mais aprofundada deste parmetro. Em suma, a elevada contaminao das culturas foi o principal obstculo ao sucesso da micropropagao cujas metodologias de desinfeco aplicadas revelaram-se infrutferas. Contudo, seria til a continuao da pesquisa das metodologias mais adequadas para a micropropagao deste taxon, mormente no que se refere s tcnicas de desinfeco do material vegetal. Assim, a existncia de um local onde pudesse ser efectuada a multiplicao prvia dos vrios taxa a propagar e os respectivos tratamentos espacial das fitossanitrios, vrias reas bem como a na compartimentao envolvidas

micropropagao, constituem algumas das sugestes para a soluo substancial da contaminao.

98

V. 3. 2 Cultura de meristemas Os ensaios preliminares de cultura de meristemas efectuados com um meio MS simples e com a aplicao da modalidade de desinfeco A (Tabela X) revelaram, ao fim de quatro semanas, taxas de contaminao e de necrose de 45 e 100%, respectivamente. Posteriormente, e atendendo aos resultados obtidos nos ensaios efectuados, quer nos preliminares, quer nos referentes ao primeiro grupo de ensaios de micropropagao, foram realizados ensaios de cultura de meristemas, com a aplicao da modalidade de desinfeco B (Tabela X), e cujos resultados respectivos para a contaminao, necrose, tecido caloso e diferenciao so os constantes na Tabela XXIV. O volume reduzido de explantados envolvidos em cada um dos ensaios no permitiu, contudo, uma anlise de varincia aos dados obtidos. A principal obstruo encontrada na cultura de meristemas residiu na necrose, a qual se generalizou a partir da quinta semana. Tal poder ter derivado de vrias causas, as quais foram j exploradas na seco respeitante micropropagao e que so igualmente extensivas cultura de meristemas. Constituiu uma tcnica que, no obstante o seu insucesso por via da necrose generalizada, apresentou taxas de contaminao mais reduzidas, indiciando ser uma variante da cultura in vitro a considerar e a merecer uma pesquisa mais intensa, porquanto contornou em grande parte o problema da contaminao. Segundo Aug & BocconGibod (1989), existe uma concentrao crescente de agentes patognicos das partes mais jovens para as mais velhas, supondo-se que o prprio meristema constitua um tecido inclume aos agentes contaminantes. Contudo, ainda no existem explicaes plausveis para este facto, supondo-se que as clulas em diviso possuam uma certa imunidade ou que ocorra uma competio

99

pelos

nutrientes

entre

os

tecidos

meristemticos

os

agentes

patognicos (Aug & Boccon Gibod, 1989).

Tabela XXIV Taxas de contaminao, necrose, tecido caloso e diferenciao aps quatro semanas em cultura, para a cultura de meristemas, com a aplicao da modalidade de desinfeco B. Meio de cultura Reguladores de Crescimento (mg/l) MS MS MS MS MS MS MS MS MS Z-2 Z-2 Z-2
0.0 ANA, 0.0 BAP 0.0 ANA, 0.5 BAP 0.0 ANA, 1.0 BAP 0.0 ANA, 2.0 BAP 0.5 ANA, 1.0 BAP 1.0 ANA, 0.5 BAP 2.0 ANA, 1.0 BAP 5.0 2-ip 15.0 2-ip 0.0 2-ip 5.0 2-ip 15.0 2-ip

Contaminao (%)

Necrose (%)

Tecido Caloso (%)

Diferenciao (%)

25 31 47 61 64 53 67 39 72 56 75 72

23 19 0 6 0 0 0 0 51 20 15 33

0 0 6 17 7 0 0 0 0 19 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 17

Face insuficincia dos dados obtidos, que impossibilitou uma explorao mais aturada desta tcnica de cultura in vitro, seria conveniente, no futuro, crescimento, de modo proceder-se a fomentar a experimentao diferenciao de novas tecidos modalidades, abrangendo novos meios de cultura e reguladores de dos meristemticos.

100

VI. MULTIPLICAO POR ESTACARIA CLSSICA

VI. 1 Fundamentao bibliogrfica Os ensaios foram delineados de acordo com a bibliografia disponvel sobre a propagao por estacaria do gnero Ilex, embora tenham sido introduzidas algumas alteraes, nomeadamente quanto s concentraes hormonais, respeitando o comportamento especfico da prpria planta demonstrado nos ensaios preliminares. Hartmann et al. (1990) sugerem a utilizao de substratos de turfa e perlite na proporo de 1:1, bem como de casca de pinheiro, turfa e perlite nas propores de 3:2:2 e com a aplicao do regulador de crescimento IBA nas concentraes de 10000, 3000 e 2500 ppm para Ilex opaca, Ilex vomitoria e Ilex cornuta, respectivamente. Galle (1997) aconselha a utilizao de estacas, com cerca de 1520 cm de comprimento, removidas das suas folhas em cerca de metade ou 1/3, com um corte na zona basal das mesmas. Sugere ainda a utilizao de 10003000 ppm de IBA, em soluo ou em talco, bem como de alguns produtos comerciais de enrazamento: Hormex (concentraes de 0.8, 1.6 e 3.0 % de IBA), Hormodin (concentrao de 0.8% de IBA) e Woods Compound (1.03% de IBA + 0.51% de NAA + 78.46 % de etanol + 20% de dimetilformamida). O perodo de enrazamento das estacas de Ilex varia, de acordo com Galle (1997), entre 6 a 8 semanas. Dehgan et al. (1988) referem a realizao de ensaios de propagao vegetativa clssica de cinco espcies nativas da Florida (Ilex cassine, Ilex glabra, Ilex myrtifolia, Ilex opaca e Ilex sp.), cujos melhores resultados foram obtidos com a concentrao de 2500 ppm de IBA, com taxas de enrazamento mdias respectivas de 97.3 e 100.0% para Ilex cassine e Ilex glabra, e no ensaio controlo e nas concentraes de 2500 e

101

5000 ppm de IBA , com taxas mdias de enrazamento de 89.3, 92.0 e 84.0 % para Ilex myrtifolia, Ilex opaca e Ilex sp., respectivamente. VI. 2 Material e mtodos VI. 2. 1 Origem e tipo do material vegetal Nos ensaios de estacaria clssica realizados, foram utilizadas, como material vegetal, estacas com cerca de 12 cm de comprimento provenientes de vrios locais da Ilha de So Miguel: Tnel-Sete Cidades (300 m), Ribeira do Ferreiro-Sete Cidades (562 m), Lombadas (689 m), Estrada da Lagoa do Fogo (851 m), Monte Escuro (800 m), Sanguinal (480 m), Santo Antnio-Nordeste (258 m) e Pico Bartolomeu (887 m). VI. 2. 2 Colheita do material vegetal O material vegetal foi seleccionado tendo em ateno o aspecto geral e a idade do mesmo, sendo dada prioridade s plantas ss semiherbceas. Os cortes foram efectuados com uma tesoura de poda previamente desinfectada com lcool a 96%. As zonas de corte foram tambm devidamente desinfectadas com lcool a 96%, aps o que foram transportadas em malas trmicas cujo fundo encontrava-se preenchido por gua com algumas gotas de lixvia. VI. 2. 3 Preparao das concentraes hormonais Nos ensaios de estacaria clssica, foi escolhido o regulador de crescimento IBA (cido 3indolbutrico) como hormona de enrazamento, de acordo com a bibliografia consultada. As vrias concentraes de IBA foram preparadas atravs da sua mistura com um elemento inerte (talco), nas respectivas propores, e para um total de 100 mg para cada uma das concentraes respectivas.

102

VI. 2. 4 Montagem dos ensaios Os primeiros ensaios preliminares comportaram dois grupos de ensaios: 1. Durante o ms de Outubro procedeu-se ao estudo da capacidade de diferenciao e de enrazamento, temperatura ambiente, em gua. Para tal, foram colocadas 30 estacas, com cerca de 10 cm de comprimento e s quais foram retiradas todas as folhas, em frascos de vidro tendo como substrato gua renovada de 48 em 48 horas, sendo seccionadas as extremidades necrticas tambm de 48 em 48 horas. No ms de Janeiro foram colocadas em tubos de ensaio com gua e transferidas para uma sala, temperatura ambiente e sem controlo da humidade, havendo o cuidado da renovao regular da gua. 2. No ms de Outubro foram ainda realizados ensaios de estacaria clssica em dois tipos de substrato (Sphagnum sp. e turfa + perlite numa proporo de 1:1), tendo sido aplicado s estacas o regulador de crescimento IBA na concentrao de 0.1%. Para tal, aps as estacas terem sido abundantemente enxaguadas em gua corrente, foram retiradas as folhas deixando apenas as duas ou trs terminais. Em seguida, foram seccionadas com o auxlio de uma tesoura de poda previamente esterilizada, de modo a obterem-se estacas com cerca de 12 cm de comprimento. Posteriormente, foram aplicadas as respectivas concentraes de IBA na parte basal de cada uma das estacas aps estas terem sido previamente humedecidas, aps o que foram plantadas nos respectivos substratos. Posteriormente, foram realizados ensaios definitivos, durante os meses de Novembro e de Dezembro, em substratos de Sphagnum sp. e de turfa + perlite na proporo de 1:1, com aplicao de IBA nas concentraes de 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0%, tendo sido repetidos todos os

103

procedimentos experimentais referidos anteriormente para as tcnicas de estacaria clssica. Foram ainda efectuados, no ms de Dezembro, ensaios em terra na Reserva Florestal da Pedreira, no Nordeste, em colaborao com o Servio Florestal do Nordeste, Ilha de So Miguel, tendo sido aplicado IBA nas concentraes de 0.5, 1.0 e 1.5 %. VI. 2. 5 Colheita e anlise dos dados Na avaliao da diferenciao das gemas e da capacidade de enrazamento foram colhidos dados mensais, ponderando os seguintes parmetros: Contaminao: 1) N. de gemas ou estacas visualmente contaminadas Necrose: 2) N. de gemas ou estacas necrticas Diferenciao: 3) N. de gemas abertas sem formao de rebentos 4) N. de gemas com diferenciao foliar ou n. de estacas enrazadas Os dados colhidos foram sujeitos a uma quantificao,

considerando os seguintes universos para cada um dos respectivos parmetros: Contaminao: n. total de gemas ou estacas Necrose: n. de gemas ou estacas sem contaminao visvel Diferenciao: n. de gemas ou estacas sobreviventes sem contaminao visvel Assim, foram aplicadas as seguintes frmulas para o clculo das respectivas taxas de contaminao, necrose e diferenciao:

104

Contaminao = n. de gemas ou estacas contaminadas/N Necrose = n. de gemas ou estacas necrticas/N n. gemas ou estacas contaminadas Diferenciao sem formao de rebentos = n. de gemas abertas sem formao de rebentos/N (n. de gemas contaminadas + n. de gemas necrticas) Diferenciao foliar = n. de gemas abertas com formao de rebentos/N (n. de gemas contaminadas + n. de gemas necrticas) Enrazamento = n. de estacas enrazadas/N (n. de estacas contaminadas + n. de estacas necrticas) N = 300 (n. total de gemas no primeiro grupo de ensaios preliminares); N = 30 (n. estacas por cada modalidade). VI. 3 Resultados e discusso Nos ensaios preliminares efectuados, os melhores resultados obtidos foram registados num substrato de Sphagnum sp., com uma concentrao de 0.1% de IBA, tendo sido atingida uma percentagem de enrazamento de 3% (Maciel et al., 1998). Ainda nos ensaios preliminares foi obtida uma taxa de diferenciao (gemas abertas sem diferenciao de rebentos) de 40%, embora as estacas depois de transferidas tenham apresentado um estado necrtico generalizado. Relativamente aos ensaios de estacaria definitivos efectuados em dois tipos distintos de substratos, Sphagnum sp. e turfa + perlite (1:1), e com a aplicao de vrias concentraes de IBA, os resultados obtidos so os constantes na Tabela XXV.

105

Os dados obtidos foram sujeitos a uma anlise de varincia ANOVA com um critrio de classificao, tendo sido realizada a comparao mltipla das mdias atravs do Teste de Tukey, ao nvel de significncia de 5%. As mdias assinaladas com a mesma letra no diferiram significativamente entre si.
Tabela XXV Taxas de contaminao, necrose e enrazamento para estacas de Ilex perado ssp. azorica, em substratos de Sphagnum sp. e de turfa + perlite (1:1), aps 1 ms.

Substrato

IBA (%)

Contaminao (%) 0a

Necrose (%) 92 a

Enrazamento (%) 0

Sphagnum sp.

0.0

Sphagnum sp.

0.5

8b

79 b

33

Sphagnum sp.

1.0

0a

93 a

Sphagnum sp.

1.5

0a

94 a

Sphagnum sp.

2.0

1 ab

92 a

17

Turfa + Perlite (1:1) Turfa + Perlite (1:1) Turfa + Perlite (1:1) Turfa + Perlite (1:1) Turfa + Perlite (1:1)

0.0

0a

99 a

0.5

0a

92 a

1.0

0a

100 a

1.5

0a

97 a

2.0

0a

100 a

Relativamente ao primeiro grupo de ensaios, a anlise de varincia efectuada permitiu concluir que, ao nvel da contaminao, ocorreram valores significativamente diferentes, em que apenas a modalidade 106

correspondente a um substrato de Sphagnum sp. com a aplicao de 0.5% de IBA se revelou significativamente diferente de todas as restantes, excepo da Sphagnum (2.0% IBA) (Tabela XXV e Anexo 9). No que respeita necrose, a anlise de varincia efectuada permitiu concluir que a modalidade correspondente a um substrato de Sphagnum, com aplicao de 0.5% de IBA se revelou significativamente diferente de todas as outras (Tabela XXV e Anexo 10), no se verificando o mesmo em relao s taxas de enrazamento (Tabela XXV e Anexo 11). Nos ensaios efectuados num substrato de terra, e tambm com a aplicao de vrias concentraes de IBA, foram obtidos os dados presentes na Tabela XXVI.
Tabela XXVI Taxas de contaminao, necrose e enrazamento para Ilex perado ssp. azorica, aps 3 meses, em substrato de terra.

Substrato

IBA (%)

Contaminao (%) 0 0 0

Necrose (%) 2 0 0

Enrazamento (%) 0a 8b 5 ab

Terra Terra Terra

0.5 1.0 1.5

A anlise de varincia realizada aos dados obtidos no segundo grupo de ensaios revelou, relativamente necrose, a inexistncia de diferenas significativas entre as vrias mdias comparadas (Tabela XXVI e Anexo 12). No que respeita aos dados observados para o enrazamento, verificou-se que a modalidade que compreendeu a aplicao de IBA na concentrao de 0.5 % mostrou-se significativamente diferente em relao ao ensaio correspondente aplicao de 1.0 % de IBA, apesar da ltima modalidade (1.5 % de IBA) no ter demonstrado a ocorrncia de diferenas significativas em relao s outras duas

107

restantes (Tabela XXVI e Anexo 13). A ocorrncia de taxas de enrazamento mais elevadas nos ltimos dois ensaios poder dever-se utilizao de maiores concentraes de IBA. A propagao por estacaria clssica correspondeu,

indubitavelmente, metodologia com maior sucesso na multiplicao deste taxon (Figura 22). As taxas de enrazamento apresentadas na Tabela XXVI so manifestamente inferiores s suas homlogas precedentes, o que poder dever-se ao facto do universo considerado no clculo das vrias taxas de enrazamento bem como de contaminao e de necrose, neste ltimo grupo de ensaios, ser substancialmente superior, uma vez que, no primeiro grupo, os universos considerados coincidiram praticamente com o nmero de estacas sobreviventes.

Figura 22 Estaca enrazada.

Sendo assim, seria conveniente uma nova experimentao das modalidades ensaiadas no primeiro grupo de ensaios em condies ambientais mais favorveis, nomeadamente numa estufa com

108

temperatura e humidade controladas, porquanto a elevada necrose registada derivou em grande parte da ausncia destas condies. Relativamente ao segundo grupo de ensaios, a limitao de tempo existente para a escrita deste trabalho no permitiu a recolha de dados mais recentes e, por conseguinte, a anlise dos dados que sero obtidos aps um ano significativa para o estudo da multiplicao por estacaria clssica deste taxon, uma vez que a necrose foi reduzida para alm de haver indcios de algum sucesso no enrazamento, a julgar pelas percentagens obtidas aps trs meses em cultura. Mais uma vez, a existncia de condies adequadas propagao vegetal vital para o sucesso desta, designadamente a existncia uma estufa, como foi j anteriormente citado.

109

VII. MULTIPLICAO POR SEMENTES

VII. 1 Fundamentao bibliogrfica Os ensaios foram delineados, na sua generalidade, de acordo com a bibliografia disponvel sobre a germinao das sementes no gnero Ilex, embora tenham sido introduzidas algumas alteraes julgadas necessrias respeitando no s as caractersticas especficas do prprio taxon, designadamente o seu comportamento demonstrado nos ensaios preliminares, bem como a prpria disponibilidade de material vegetal e laboratorial e o tempo disponvel para a realizao dos ensaios. Cuquel et al. (1994), no intuito de pesquisarem o mtodo mais eficaz para a quebra de dormncia de Ilex paraguariensis, procederam, durante seis meses, a tratamentos de estratificao em ambiente no controlado e sob condies diversas de luz, temperatura, cido giberlico e de nitrato de potssio, tendo sido os mtodos mais adequados para a quebra de dormncia das sementes os que envolveram as modalidades de alternncia de luz e temperatura (15 35 C e um fotoperodo de 8 horas) e alternncia de luz e temperatura (15 35 C e um fotoperodo de 8 horas) + nitrato de potssio e cujas taxas de germinao mdias foram de 5.2 e 4.2 %, respectivamente. Young & Young (1992) sugerem para Ilex opaca uma estratificao a 20/30 C durante 60 dias seguida por uma refrigerao a 5C durante 60 dias, bem como regimes de temperaturas alternas de 9/23 C ou de 19/33 C e um fotoperodo de 12 horas, coincidindo este com a temperatura mais elevada. Maciel et al. (1998) referem a realizao de ensaios de germinao com Ilex perado ssp. azorica sob uma temperatura constante de 15 C e uma temperatura alterna de 1020 C, ambas com um fotoperodo de 8 110

horas luz coincidente com a temperatura mais elevada do regime de alternncia trmica. Foram ainda efectuados testes de quebra de dormncia atravs de estratificao, submetendo as sementes a uma temperatura de 3 C durante 3 meses e de escarificao qumica pela aplicao de cido sulfrico puro durante diferentes perodos de imerso, aps o que as sementes foram submetidas s condies de temperatura e de luz referidas anteriormente. Em nenhum dos ensaios ocorreu germinao.

VII. 2 Material e mtodos VII. 2. 1 Origem do material vegetal Nos ensaios de germinao foram utilizados como material vegetal caroos provenientes das Ilhas de So Miguel (Monte Escuro, Sanguinal, Caminho do Pico Bartolomeu e Santo Antnio, Nordeste) e do Faial (Lombega, Ribeira do Cabo e Caldeira). Nas sementeiras efectuadas utilizaram-se frutos (nuculnios) e caroos provenientes da Ilha do Faial (Lombega, Ribeira do Cabo e Caldeira). VII. 2. 2 Colheita dos frutos Foram colhidos os frutos visivelmente maduros quer directamente das plantas-me quer os cuja abciso tinha j ocorrido. VII. 2. 3 Extraco e armazenamento dos caroos Os frutos extraram-se por esmagamento em gua. Em seguida foram colocados a secar em papel de cozinha temperatura ambiente. Posteriormente, os caroos foram armazenados por alguns dias em frascos fechados com slica.

111

VII. 2. 4 Desinfeco do material vegetal No foi efectuado qualquer tipo de desinfeco antes da realizao dos ensaios. Contudo, quando se verificava a ocorrncia de contaminao visvel os caroos foram devidamente desinfectados com soluo de Benlate a 1.2%. VII. 2. 5 Tratamentos (quebra de dormncia) Com vista quebra de dormncia das sementes e germinao das mesmas foram efectuados vrios tratamentos de carcter fsico e/ou qumico, designadamente escarificao, estratificao, lixiviao, embebio, aplicao de nitrato de potssio e adio de um regulador de crescimento bem como algumas combinaes destes tratamentos. VII. 2. 5. 1 Escarificao Escarificao qumica: foi efectuada pela aplicao de cido sulfrico puro durante seis horas consecutivas. Escarificao mecnica: realizou-se um pequeno corte lateral em cada um dos caroos com o auxlio de um alicate. VII. 2. 5. 2 Estratificao Efectuou-se uma estratificao a 25C 1C, durante 1 e 2 meses, seguida por outra a 4C 1C, em turfa, tambm durante 1 e 2 meses. VII. 2. 5. 3 Lixiviao gua corrente/embebio: durante uma semana, os caroos foram sujeitos aco de gua corrente durante 8 horas consecutivas intercalados por perodos de embebio em gua durante 16 horas.

112

VII. 2. 5. 4 Embebio Os caroos permaneceram embebidos em gua durante 48 horas. VII. 2. 5. 5 Aplicao de nitrato de potssio Foi aplicado na concentrao de 0.2% no momento da montagem dos respectivos ensaios. VII 2. 5. 6 Adio de reguladores de crescimento Com a finalidade de facilitar a germinao das sementes foi aplicado o regulador de crescimento GA3 (cido giberlico) nas concentraes de 0.1, 1.0, 15.0, 20.0, 25.0 e 30.0 mg/l. VII. 2. 6 Montagem dos ensaios VII. 2. 6. 1 Ensaios de germinao Na realizao dos ensaios foram colocados os caroos em caixas de Petri de 10 cm de dimetro sobre discos de papel de filtro Whatman n 1 embebido em gua destilada ou na soluo da substncia a testar (nitrato de potssio e cido giberlico). Dada a escassa disponibilidade de caroos, para cada modalidade ensaiada foram testados trs lotes com apenas 30 sementes cada, tendo-se optado, pelas mesmas razes invocadas, pela no incluso de ensaios controlo. Aps a montagem dos ensaios, as caixas de Petri foram devidamente fechadas com Parafilm, tendo sido colocadas posteriormente em cmaras climatizadas com controlo automtico de temperatura e cuja iluminao foi garantida por seis lmpadas fluorescentes Philips TL8W/339H.

113

Foram testados quatro regimes trmicos: temperaturas constantes de 10 C, 15 C e 20 C e temperaturas alternas de 1020 C. O fotoperodo foi de 8 horas, o qual, no caso das temperaturas alternas, coincidiu com a temperatura mais elevada. Face reduzida disponibilidade de material vegetal, nas modalidades n.s 1, 2, 3 e 4 foram apenas testadas para as temperaturas constante de 15 C e alterna de 1020 C, para a Ilha de So Miguel. Assim , foram testadas as seguintes modalidades: Modalidade 1 Faial (Lombega/Ribeira do Cabo) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C So Miguel (Sanguinal/Monte Escuro) Temperatura: 15 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: 0.1 mg/l GA3 Durao: 939 dias Modalidade 2 Faial (Lombega/Ribeira do Cabo) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C So Miguel (Sanguinal/Monte Escuro) Temperatura: 15 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: 1.0 mg/l GA3 Durao: 936 dias Modalidade 3 Faial (Lombega/Ribeira do Cabo) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C So Miguel (Sanguinal/Monte Escuro) Temperatura: 15 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Escarificao mecnica + 1.0 mg/l GA3 Durao: 528 dias

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Modalidade 4 Faial (Lombega/Ribeira do Cabo) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C So Miguel (Sanguinal/Monte Escuro) Temperatura: 15 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Lixiviao em gua corrente + embebio Durao: 926 dias Modalidade 5 So Miguel (Caminho do Pico Bartolomeu/Santo Antnio, Nordeste) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C. Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Estratificao durante 1 ms 25C + estratificao durante 1 ms a 4C + escarificao com cido sulfrico Durao: 189 dias Modalidade 6 So Miguel (Caminho do Pico Bartolomeu/Santo Antnio, Nordeste) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Estratificao durante 2 meses a 25C + estratificao durante 2 meses a 4C + escarificao com cido sulfrico Durao: 127 dias Modalidade 7 So Miguel (Caminho do Pico Bartolomeu/Santo Antnio) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Escarificao com cido sulfrico + lixiviao com nitrato de potssio Durao: 215 dias Modalidade 8 Faial (Caldeira) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C

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Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Escarificao com cido sulfrico + 15.0 mg/l GA3 Durao: 242 dias Modalidade 9 Faial (Caldeira) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Escarificao com cido sulfrico + 20.0 mg/l GA3 Durao: 241 dias Modalidade 10 Faial (Caldeira) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Escarificao com cido sulfrico + 25.0 mg/l GA3 Durao: 241 dias Modalidade 11 Faial (Caldeira) Temperatura: 10, 15, 20 e 1020 C Fotoperodo: 8 horas Tratamento: Escarificao com cido sulfrico + 30.0 mg/l GA3 Durao: 241 dias VII. 2. 6. 2 Sementeiras Foi ainda testada a quebra de dormncia das sementes bem como a capacidade germinativa das mesmas atravs da realizao de algumas sementeiras: Ensaio 1 Faial (Lombega/Ribeira do Cabo) Substrato: Turfa + terra na proporo de 1:1 Material vegetal: caroos

116

Lotes: 3 lotes de 50; 3 lotes de 100 Durao: 239 dias Ensaio 2 Faial (Caldeira) Substrato: Turfa + perlite na proporo de 1:1 Material vegetal: frutos visivelmente maduros Lotes: 1 lote de 50 Durao: 959 dias Ensaio 3 Faial (Caldeira) Substrato: Terra Material vegetal: frutos visivelmente maduros Lotes: 1 lote de 50 Durao: 959 dias Ensaio 4 Faial (Caldeira) Substrato: turfa Material vegetal: frutos visivelmente maduros Lotes: 1 lote de 50 Durao: 959 dias VII. 2. 7 Colheita e anlise de dados Todos os ensaios foram observados periodicamente com o objectivo de acompanhar o desenvolvimento dos eventuais processos germinativos.

117

VII. 3 Resultados e discusso Os resultados de todos os ensaios realizados no revelaram a ocorrncia de germinao das sementes, demonstrando-se por isso nulos, apesar de terem sido aplicados vrios tipos de tratamentos j anteriormente descritos. O insucesso destes poder estar correlacionado com vrias causas, as quais sero posteriormente expostas e exploradas. No obstante esta ausncia de germinao, o ndice de contaminao mostrou-se extremamente elevado em todos os ensaios. De acordo com Galle (1997), o Ilex spp. propaga-se por sementes no meio natural e a atest-lo esto algumas plantas jovens encontradas em Santo Antnio, Nordeste, Ilha de So Miguel (Figura 23), sob uma densa cobertura de rvores adultas de Ilex perado ssp. azorica, por vezes rodeadas de Selaginella sp.

Figura 23 Plantas jovens de Ilex perado ssp. azorica, Santo Antnio, Nordeste, Ilha de So Miguel.

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Contudo, a germinao das sementes varivel, manifestando-se relativamente cedo, como so os casos de Ilex crenata, Ilex cassine, Ilex glabra ou de Ilex vomitoria (Hartmann et al., 1990) ou podendo requerer um a dois anos (Galle, 1997) ou mesmo mais (Young & Young, 1992), como so exemplos os de Ilex aquifolium, Ilex cornuta e de Ilex decidua (Hartmann et al., 1990). Neal & Dye (1964 in Martin, 1977) referem que a germinao poder requerer oito anos. Isto parece estar relacionado com a dormncia profunda exibida por algumas espcies deste gnero causada pelo endocarpo rgido que rodeia o tegumento da semente bem como pelas caractersticas do embrio (Young & Young, 1986, 1992), o qual, segundo Hartmann et al. (1990), apresenta-se rudimentar na poca de colheita dos frutos, isto , como uma massa de tecido meristemtico no diferenciado (Cuquel et al., 1994). O facto das sementes exibirem uma dormncia profunda foi tambm j apontado por Maciel et al. (1998) como uma possvel explicao para o insucesso obtido nos ensaios de germinao de Ilex perado ssp. azorica. O facto dos caroos apresentarem um tegumento espesso e rgido leva a que este constitua uma barreira ao fornecimento de gua (Mayer, 1977) e de oxignio semente, mas tambm emergncia da prpria radcula (Mayer, 1977; ebnek et al., 1991), controlando deste modo todo o processo germinativo de Ilex perado ssp. azorica. Segundo Hu et al. (1979), a natureza rudimentar dos embries de Ilex foi descrita por autores como Ives (1923), Martin (1946) e pelo Woody-Plant Seed Manual (1948) e confirmada por Hu (1975) para onze espcies de Ilex. Uma vez que estes embries tm de completar o seu desenvolvimento sob condies ambientais favorveis antes da germinao ocorrer natural um atraso na germinao das suas sementes (Hu et al., 1979). Atendendo a que, em cultura, o crescimento dos embries excisados era drasticamente reduzido quando os mesmos

119

eram mantidos adjacentemente ao endosperma, o carcter rudimentar poder dever-se presena de determinados inibidores de crescimento presentes no endosperma e/ou na estrutura membranar ligada ao mesmo (Hu, 1977; Hu et al., 1979). Contudo, tais inibidores no foram ainda isolados e identificados (Hu et al., 1979). Um outro facto registado foi o elevado ndice de contaminao obtido, embora esta tivesse diminudo ligeiramente aps a desinfeco com Benlate. Todavia, os caroos sujeitos escarificao com cido sulfrico demonstraram uma contaminao mais precoce, o que parece indiciar a presena de fungos endgenos, semelhana da multiplicao in vitro, uma vez que as sementes constituem um veculo de propagao destes fungos (Carroll, 1988) e cuja libertao teria sido facilitada pela menor espessura do tegumento do caroo tratado com cido. Esta contaminao poder ter influenciado a prpria germinao das sementes, designadamente pela competio pelo oxignio e gua, bem como pela possibilidade de libertao de substncias txicas. Com a finalidade de se obterem no futuro resultados satisfatrios ao nvel da germinao das sementes, seria conveniente a utilizao de sementes j conservadas durante alguns anos e que possivelmente apresentariam embries j suficientemente maduros que permitissem a germinao das mesmas.

120

VIII. CONCLUSES

Face aos manifestos insucessos obtidos na multiplicao in vitro e nos ensaios de germinao, a multiplicao por estacaria clssica revelou-se at ao momento, como sendo a metodologia mais eficaz na propagao do Ilex perado ssp. azorica Tutin. Contudo, e apesar das taxas de enrazamento satisfatrias, as taxas de necrose em vrios dos ensaios de estacaria efectuados apresentaramse elevadas por fora da ausncia de condies ideais para a manuteno destes ensaios, como foi j anteriormente referido. Como tal, seria conveniente a realizao de novos ensaios ao nvel das vrias vertentes de propagao vegetal, no sentido de apurar-se com maior acuidade quais as metodologias mais eficazes na multiplicao deste taxon, ponderando todas as dificuldades, inerentes ou no prpria planta, encontradas at agora. O status para este taxon, designadamente para a Ilha de So Miguel, assim como o potencial interesse econmico como planta ornamental, justificam cabalmente a implementao de todas estas medidas sugeridas, as quais se inserem num objectivo mais vasto de conservao dos recursos naturais do arquiplago, designadamente da sua flora autctone. Por conseguinte, seria conveniente o estabelecimento e

implementao de um futuro programa de conservao deste taxon, que incluiria no s alguns dos aspectos j conhecidos acerca da sua multiplicao, mas tambm a realizao de novos ensaios com a finalidade de obter-se um maior conhecimento relativo sua propagao, uma vez que os ensaios efectuados at ao momento foram insuficientes para a definio de uma metodologia de multiplicao.

121

Complementarmente, seria tambm importante para o estudo e caracterizao da prpria planta, a implementao da pesquisa aos nveis ecolgico, sistemtico e filogentico das suas populaes.

122

IX. BIBLIOGRAFIA

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141

YOUNG, J. A. & C. G. YOUNG, 1992. Seeds of woody plants in North America. 407 p. Dioscorides Press, Portland, Oregon.

142

X. ANEXOS

143

Anexo 1: Tabela XXVII ANOVA: nmero de caroos por fruto.

Graus de liberdade Entre grupos Dentro dos grupos Total 7 40 47

Quadrado mdio 3519,299 72,832

Significncia 0,000

Anexo 2: Tabela XXVIII Teste T: Influncia da desinfeco na contaminao.

t 3,355

Graus de liberdade 4

Diferena mdia 15,3333

Significncia 0,028

Anexo 3: Tabela XXIX Teste T: Influncia da desinfeco na necrose.

t -0,864

Graus de liberdade 4

Diferena mdia -17,0000

Significncia 0,436

Anexo 4: Tabela XXX ANOVA: Influncia dos meios de cultura/reguladores de crescimento na necrose.

Graus de liberdade Entre grupos Dentro dos grupos Total 21 44 65

Quadrado mdio 2096,994 979,788

Significncia 0,017

Anexo 5: Tabela XXXI Teste T: Influncia dos meios bsicos de cultura MS e Z-2 na necrose.

t 2,271

Graus de liberdade 4

Diferena mdia 6,3333

Significncia 0,086

Anexo 6: Tabela XXXII ANOVA: Influncia dos meios de cultura/reguladores de crescimento no desenvolvimento de tecido caloso.

Graus de liberdade Entre grupos Dentro dos grupos Total 21 44 65

Quadrado mdio 3789,007 1493,894

Significncia 0,005

144

Anexo 7: Tabela XXXIII Teste T: Influncia dos meios bsicos de cultura MS e Z-2 no desenvolvimento de tecido caloso.

t 0,378

Graus de liberdade 4

Diferena mdia 16,6667

Significncia 0,725

Anexo 8: Tabela XXXIV Teste T: Influncia da poca do ano no desenvolvimento de tecido caloso.

t 24,233

Graus de liberdade 4

Diferena mdia 84,3333

Significncia 0,000

Anexo 9: Tabela XXXV ANOVA: Contaminao obtida no primeiro grupo de ensaios de estacaria clssica.

Graus de liberdade Entre grupos Dentro dos grupos Total 9 20 29

Quadrado mdio 18,967 7,600

Significncia 0,042

Anexo 10: Tabela XXXVI ANOVA: Necrose obtida no primeiro grupo de ensaios de estacaria clssica.

Graus de liberdade Entre grupos Dentro dos grupos Total 9 20 29

Quadrado mdio 116,759 10,667

Significncia 0,000

Anexo 11: Tabela XXXVII ANOVA: Enrazamento obtido no primeiro grupo de ensaios de estacaria clssica.

Graus de liberdade Entre grupos Dentro dos grupos

Total

Quadrado mdio 379,630 416,667

Significncia 0,535

9 20
29

145

Anexo 12: Tabela XXXVIII ANOVA: Necrose obtida no segundo grupo de ensaios de estacaria clssica.

Graus de liberdade Entre grupos Dentro dos grupos Total 2 6 8

Quadrado mdio 4,000 1,000

Significncia 0,079

Anexo 13: Tabela XXXIX ANOVA: Enrazamento obtido no segundo grupo de ensaios de estacaria clssica.

Graus de liberdade Entre grupos Dentro dos grupos Total 2 6 8

Quadrado mdio 49,000 5,000

Significncia 0,013

146