Sunteți pe pagina 1din 13

CAPITOLUL 13 Spectrometria de mas utilizat ca tehnic de detecie n cromatografie

13.1. Introducere Spectrometria de mas (MS) este o tehnic de investigare cu largi aplicaii n chimia analitic, cum ar fi: determinarea maselor atomice i moleculare; compoziia izotopic a elementelor; sau identificarea compuilor organici. Pe lng aceste aplicaii, ea a devenit una dintre cele mai importante tehnici de detecie n cromatografie, fiind utilizat att la identificarea analiilor care elueaz din coloana cromatografic, ct i la determinarea lor cantitativ. nceputul acestei tehnici este datorat lui Thompson (1912), cel care a nregistrat primele spectre de mas i a sugerat posibila utilizare a acestora n identificarea substanelor.[132] Curnd dup aceast dat, Aston i Dempster ntreprind primele cercetri bazate pe aceast tehnic privind compoziia izotopic a unor elemente. Primele spectre de mas pentru compui organici sunt nregistrate n anul 1930, utiliznd experimente de ionizare i fragmentare a unor hidrocarburi gazoase sub aciunea unui fascicul de electroni. Primele instrumente MS comercializate apar dup anul 1950, fiind utilizate n industria de prelucrare a petrolului. Dup anii 1960, spectrometria de mas devine cea mai important tehnic de detecie att n cromatografia de gaze, ct i n cromatografia de lichide. 13.2. Componentele unui spectrometru de mas Principalele componente ale unui spectrometru de mas, redate n figura de mai jos, sunt: camera de ionizare; separatorul (analizorul) de ioni; detectorul de ioni. In cazul cuplrii sistemul MS cu unul cromatografic interfaa dintre ele realizeaz etapa 1.
Computer Control hardware Achiziie de date, procesare i interpretare Etapa (5)

Introducerea probei Etapa (1)

Sursa de ionizare Etapa (2)

Analizorul de mas Etapa (3)

Detector de ioni Etapa (4)

Izolarea ionului (anumite specii ionice)

Izolarea ionului (fragmentarea ionului indus colizional)

Analiza ionilor rezultai

Sistem de vid

n Fig. 13.1. Schema de baz a unui spectrometru de mas.[133] 230

Anumite aplicaii pot impune dezvoltarea etapei (3) n sensul mbuntiri cantitii de informaie care poate fi extras din procesul de ionizare, i n consecin, o cretere corespunztoare a selectivitii. Secvena de operaii dintre parantezele drepte din figur alternativa de mai sus poate fi repetat de un numr de ori (n). Deoarece spectrometria de mas are ca scop caracterizarea fragmentelor moleculare ionice produse de ctre analit n condiii controlate, i c aceste fragmente ionice sunt sau ncrcate cu sarcin electric pozitiv sau cu sarcin electric negativ, maniera de lucru n condiii reale va trebui s defineasc n mod univoc semnul sarcinii ionilor analizai (+) MS sau (-). n spectrometrele moderne de mas, analiza ionilor pozitivi i negativi poate fi realizat alternativ, pe durata aceluiai proces, dar niciodat ntr-o manier simultan. Va trebui de asemenea menionat faptul c formarea, separarea i caracterizarea fragmentelor ionice trebuie realizate ntr-un mediu lipsit de interferene de orice natur, cu alte cuvinte, spectrometrul de mas va trebui s opereze n condiii de vacuum avansat (funcie de caracteristicile constructive ale analizorului de mas, nivelul vidului poate varia n intervalul 10-5 i 10-12 torri). 13.3. Spectrul de mas Spectrul de mas este reprezentarea bidimensional a abundenelor individuale ale fragmentelor moleculare ionice generate n procesul de ionizare n funcie de rapoartele mas/sarcin corespunztoare (m/z). Fragmentele ionice sunt produse n etapa de ionizare a unei probe ce poate reprezenta un compus pur sau un amestec de componeni individuali. Masa ionilor poate fi descris n urmtoarele trei moduri distincte: (1) masa medie a ionului reprezentnd suma maselor medii ale atomilor ce l formeaz; masele atomice medii sunt calculate ca i medie ponderat a maselor izotopice, prin raportarea la distribuia lor n natur; (2) masa monoizotopic a ionului, reprezint suma maselor atomice exacte corespunztoare celor mai abundeni izotopi naturali ai atomilor ce intr n compoziia ionului respectiv; (3) masa ionic nominal reprezint suma celor mai abundeni izotopi naturali ai atomilor care intr n compoziia ionului n cauz, exprimat ca numr ntreg. Masele ionice se vor exprima n Daltoni (Da). z reprezint numrul total de sarcini acumulate de fragmentul molecular ionic n cauz, exprimat n uniti elementare de sarcin (e). In Fig. 13.2 este prezentat un detaliu din spectru de mas al atrazinei (intervalul cuprins ntre 197 i 220 Da). Maniera de prezentare de tip profil spectral presupune o rezoluie dat[133], caracteristic pentru analizorul de mas utilizat, pe cnd maniera de reprezentare de tip linie spectral reprezint un mod idealizat, prin care sunt figurate intensitile doar pentru valorile ntregi ale rapoartelor m/z. Ionul cu cea mai mare abunden n spectrul de mas se va numi ionul major (este acel ion cu cea mai mare stabilitate i probabilitate de a se obine). Raportarea abundenelor individuale a tuturor celorlali ioni la abundena ionului major va conduce la msurtori de abunden relativ (RA%) n lungul axei Oy. Ionul molecular este ionul produs de ctre moleculele analitului prin ndeprtarea sau captura unuia sau mai multor electroni. Interpretarea spectrului de mas poate fi utilizat la identificarea structurii unui compus organic investigat prin aceast tehnic. Identificarea structural presupune de regul compararea unui spectru de mas experimental cu spectre MS dintr-o librrie spectral, stocat n memoria sistemului de procesare a datelor cu care este dotat
231

spectrometrul de mas.
ATRAZIN Formula molecular: C8H14ClN5 Masa medie Mw = 215.69 Masa monoizotopic Mw = 215.09377 Masa ionic nominal Mw = 215

100 90 80 70 60 50 40

Spectrul de linii
HN N HN N N Cl

Abunden ionic relativ ( R.A. %)

30 20 10 0

212

213

214

215

216

217

199

200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

218 218

219 219

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 197 198 199 200 201 202 203 204 205 220

198

Profil Spectral

Raport mas / sarcin (m/z) Fig. 13.2. Detalii ale spectrului de mas al atrazinei pe domeniul m/z [197; 220].

13.4. Sistemul de introducere a probelor n spectrometrul de mas Probele de interes pot fi aduse n zona de ionizare att n faz gazoas, ct i n faz condensat (lichid sau solid). Probele supuse analizei prin spectrometria de mas pot fi n egal msur de natur organic sau anorganic. Probele de natur organic sunt supuse analizei prin spectrometrie de mas pentru a obine informaia structural sau confirmarea acesteia, de cele mai multe ori plecnd de la cantiti extrem de reduse.
232

220

n cazul n care informaia structural reprezint scopul declarat, ionizarea simultan a mai multor specii moleculare este de dorit a fi evitat. Rezult deci necesitatea separrii compuilor individuali din amestecurile multicomponent naintea analizei lor prin spectrometrie de mas. Toate tehnicile de separare (cromatografia n strat subire, cromatografia de gaze, cromatografia de lichide, cromatografia de fluide n stare supercritic, cromatografia electrocapilar, cromatografia electrocinetic micelar tehnic de imobilizare a miceliilor i electroforeza capilar) au fost cuplate cu succes la spectrometrele de mas, n mod direct sau prin intermediul unor interfee specializate. Pentru probele de natur anorganic, informaia produs de spectrometria de mas, se refer la identificarea i determinarea calitativ a atomilor, inclusiv a ponderilor naturale izotopice asociate. n asemenea cazuri, introducerea probei nu necesit o structur/ construcie special, doar modalitile practice de ionizare sunt mult mai complexe (bombardarea cu ioni accelerai, plasm cuplat inductiv, etc). 13.5. Ionizarea n spectrometria de mas Ionizarea prin impact electronic Ionizarea prin impact electronic presupune coliziunea moleculelor analitului de interes aduse n stare gazoas cu un flux focalizat de electroni accelerai, n zona de ionizare. Energia electronilor accelerai este mai mare dect potenialul de ionizare al moleculelor de analit (n mod curent aceasta este de 70 eV). In urma acestui proces este probabil ca un electron s ciocneasc o molecul pe care o ntlnete, transfernd o parte a energiei sale moleculei i provocnd expulzarea unui electron (ionizarea moleculei). Procesul de ionizare a unei molecule de analit M conduce ntr-o prim etap la un ion molecular: M + e- M+ + 2eIonul molecular M+ se poate apoi fragmenta printr-o suit de reacii ce decurg n paralel: M+ Ai + Bi+ (i = 1,2,...) , sau n serie: M+ A + B+ B+ A + B+ B+ A + B+ Procesele de fragmentare decurg n acord cu structura chimic a moleculelor i vor fi reluate n cap. 13.8. O caracteristic important a ionilor, moleculari sau formai, este dat de stabilitatea acestora, care se va regsi n spectrul de mas nregistrat. Cele mai importante procese de ionizare a unei specii moleculare decurg din impactul unui electron cu dubletul de electroni , dubletul de electroni , sextetul de electroni ai unui sistem aromatic, sau electronii neparticipani p ai unui atom (halogeni, oxigen, azot, fosfor, sulf, etc), reprezentate astfel:
233

C C

+e

+ C.C

+ 2e

X:

+e +e

+ X. + . C Y

+ 2e + 2e

C Y

+e

+ 2e

In urma proceselor de ionizare de mai sus se formeaz ioni moleculari, cu sarcin pozitiv distribuit pe atomul sau atomii de la care a avut loc expulzarea unui electron, a cror stabilitate depinde de prezena substituenilor, dar i a energiei electronului de impact care a produs ionizarea. Din punct de vedere instrumental, att ionizarea prin impact electronic (EI electron ionization), ct i ionizarea chimic (CI chemical ionization), discutat n continuare, se pot realiza n surse de ionizare avnd construcii foarte asemntoare, aa cum se prezint n Fig. 13.3.
Gaz reactiv

Ecran i fant pentru focalizarea i accelerarea electronilor primari incideni Introducerea probei (vapori)

N
Magnet Filament de Reniu

(CI)
Valva Manometru

Electrod de redirecionare

Zon de ionizare

Ctre analizorul de mas

Vid Anod Magnet

Electroni primari(70 eV) Sistem de ecrane cu fante pentru accelerarea i focalizarea ionilor ctre analizorul de mas

Surs de ionizare

Fig. 13.3. Schema de baz a unei surse de ionizare utilizate pentru EI sau CI.[133]

234

Electronii produi prin nclzirea filamentului de reniu sunt focalizai i accelerai datorit polilor magnetului, anodului i a ecranului de focalizare / accelerare. Fascicolul de electroni intr n coliziune cu moleculele de analit (sau moleculele de gaz reactiv) n aria de ionizare. Modul de alimentare cu gaz reactiv include un robinet de control al debitului i un manometru. n acest mod, se poate controla numrul ionilor formai n interiorul sursei. Electrodul de redirecionare este utilizat pentru eliminarea anumitor electroni a cror apariie este nedorit (electrodul va fi ncrcat cu sarcin pozitiv n cazul n care se dorete eliminarea ionilor negativii formai prin ruperea moleculelor de analit i va fi negativ n cazul n care ioni care trebuie nlturai au sarcini pozitive). Sistemul de ecrane ajut la focalizarea i accelerarea ionilor formai n zona de ionizare spre analizorul de mas (ecranele sunt ncrcate cu voltaje cresctoare de semn opus ionilor care se doresc a fi analizai). ntreaga surs de ionizare este funcioneaz n vid corespunztor prin intermediul pompelor turbomoleculare sau de difuzie. In ionizarea negativ, datorit formrii ionului molecular ncrcat electric negativ i n stare energetic superioar (M-*), pot avea loc ruperi de legturi n molecula analitului cu formarea unor fragmente mai mici, ncrcate la rndul lor cu sarcin negativ, aa dup cum este sugerat n secvena urmtoare: M+e M
-

M + e- M-* M-* Ai- + Bi, i=1,2, In practic, cel mai utilizat mod de ionizare este cel cu producerea ionilor pozitivi. Ionizarea chimic Ionizarea chimic reprezint modalitatea de ionizare a moleculelor de analit ca urmare a coliziunii lor cu ali ioni produi prin impactul cu electroni ai moleculelor de gaz reactiv, introduse direct n sursa de ionizare. Existena moleculelor de gaz reactiv n exces mare n raport cu moleculele analitului de interes (10000 : 1) impune o cretere substanial a energiei electronilor primari (500 eV). Ionizarea chimic este cunoscut i sub denumirea de ionizare blnd (soft ionization), deoarece transferul energetic rezultat ntre ionii gazului reactiv i moleculele analitului nu depete 5 eV. Produii rezultai n urma ionizrii chimice prezint o stabilitate mai bun din cauza strii electronice pare (prin comparaie cu starea electronic impar care, de regul, rezult pentru ionii produi prin impact electronic). Urmtoarele substane sunt folosite n mod curent ca i gaze reactive (ionii acestora sunt menionai ntre paranteze): H2 (H3+); CH4 + + + + + + (CH5 ); C2H6 (C2H7 ); H2O (H3O ); CH3OH (CH3OH2 ); CH3CN (CH3CNH ); NH3 (NH4 ); + + CH3NH2 (CH3NH3 ); H2NCH2CH2NH2 (H2NCH2CH2NH3 ). Pentru ionizarea chimic, mod negativ, urmtoarele substane sunt utilizate ca i gaze reactive (ionii acestora sunt menionai ntre paranteze): NH3 (NH2-); N2O n amestec cu CH4; CH4 + He; H2 + He (OH; N2O sau amestecat cu N2 (O-.); NF3 (F-); CHF3 (F-); O2 (O2-.); CH2Br2 (Br-); CH2Cl2 (Cl-); CHCl3 (Cl-); CF2Cl2 (Cl-). Interaciile posibile pe durata ionizrii chimice cu ajutorul amoniacului, prin care agentul de colizionare i inducere a ionizrii devine ionul amoniu (NH4+) sunt ilustrate mai jos: :NH3 + e- NH3+ + 2e235

NH3+ + :NH3 NH4+ + :NH2 Interaciile care pot avea loc n sursa de ioni sunt exemplificate pentru cazul n care drept gaz reactiv se folosete metanul:
+ CH 4 + e - CH 4 . + 2 es ; p + + CH 4 . CH 3 + H. + + CH 4 . CH 2 . + H 2 + + CH 2 . + CH 4 C 2 H 3 + H 2 + H. + + CH 4 . + CH 4 CH 5 + CH .3 + + CH 3 + CH 4 C 2 H 5 + H 2 + + C 2 H 3 + CH 4 C3H 5 + H 2 + CH 5 + M [MH]+ + CH 4 + C 2 H 5 + M [MH]+ + C 2 H 4 + C3H 5 + M [MH]+ + C3H 4 + CH 5 + M [MCH 5 ]+ + C 2 H 5 + M [MC 2 H 5 ]+ + C3H 5 + M [MC 3H 5 ]+ + C 2 H 5 + M [M - H]+ + C 2 H 6

Avantajele modului de ionizare chimic sunt: ionizare blnd, posibiliti multiple de confirmare a masei moleculare a analitului datorit unei game extrem de variate de interacie respectiv modaliti de producere a ionilor, o aciune selectiv sau universal, depinznd de natura gazului reactiv, formarea relativ uoar a ionilor negativi, permind evaluri structurale i termochimice. Att ionizarea prin impact electronic ct i ionizarea chimic se pot realiza n surse de ionizare avnd construcii foarte asemntoare, aa cum s-a prezentat n Fig. 13.3. Ionizarea n cmp electric Prin metoda de ionizare n cmp electric, moleculele analitului n stare gazoas sunt aduse n vecintatea unei suprafee curbe (cum ar fi de pild vrfuri sau lame) supuse unui cmp electric intens (107 - 108 Vcm-1). Moleculele analitului vor fi ionizate datorit efectului de tunel cuantic al electronilor de valen ctre suprafaa metalic. Aceast modalitate trebuie s fie considerat ca o ionizare blnd, avnd drept neajuns major un randament de ionizare relativ sczut. Ionizarea din faze condensate - faza lichid Bombardarea cu atomi rapizi (FAB) Moleculele analitului de interes sunt dispersate ntr-un mediu lichid i cu volatilitate redus, la nivelul unei suprafee solide poroase i sunt supuse coliziunii (bombardrii) cu atomi sau ioni caracterizai prin energii cinetice mari (domeniul keV). Utilizarea atomilor de Xe sau a ionilor de Cs conduce la obinerea unor spectre foarte asemntoare. n zona din imediata apropiere a suprafeelor solide poroase, molecula de analit interacioneaz ntr-o manier foarte asemntoare cu ionizarea chimic, prin producerea speciilor [M+H]+ sau [M-H]-. Cel mai frecvent utilizat mediu lichid de dispersie este glicerina. FAB este aplicabil moleculelor polare cu mas molecular inferioar valorii de 20,000 Da. Dac ionii de energie mare nlocuiesc atomii, tehnica de ionizare este cunoscut i sub denumirea LSIMS (spectrometria de mas a ionilor secundari
236

generai din faz lichid). Sursa de ionizare prin coliziune cu atomi rapizi este redat n mod schematic n figura urmtoare.

Suprafa solid poroas (frit)

Tun de atomi / ioni

Introducerea probei lichide

Introducerea suportului lichid vscos

Optic pentru extracia ionilor

Vid

Ctre analizorul de mas

Fig.13.4. Schema unei surse de ionizare prin coliziune cu atomi rapizi.

Ionizarea chimic la presiune atmosferic (APCI) Un flux de lichid coninnd moleculele analitului de interes este pompat printr-un sistem de vaporizare. Jetul de vapori rezultat coninnd de asemenea picturi de lichid (aflate n continu evaporare sub influena cldurii) va fi orientat ctre zona de descrcare. Descrcarea electric generat este de tip coroan i se realizeaz ntre vrful ascuit al unui ac i un contraelectrod discoidal, meninut la un potenial de 1 4kV. Descrcarea electric ionizeaz moleculele de solvent existente n stare gazoas. O serie de coliziuni i reacii cu transfer de sarcin ntre ionii generai de solvent i moleculele de analit, conduce n final la ionizarea acestora din urm. Generarea ionilor moleculari protonai sau deprotonai [M+H]+; [M-H]- este n consecin posibil. Ionii rezultai sunt extrai ctre analizorul de mas prin intermediul unui tub capilar. Maniera de ionizare chimic la presiune atmosferic este reprezentat schematic n Fig. 13.5 (construcie ortogonal). Ionizarea chimic la presiune atmosferic se poate utiliza pentru o gam destul de larg a polaritii moleculelor de interes i tolereaz relativ bine srurile nevolatile sau tampoanele anorganice din lichidul purttor. Cu toate acestea ionizarea chimic la presiune atmosferic se folosete cu predilecie pentru compuii apolari. Maniera de ionizare nu este prea mult influenat de interaciile n soluie ale moleculelor de analit (prin intermediul fazei purttoare). Ionizarea chimic la presiune atmosferic nu se poate utiliza n cazul compuilor cu labilitate termic i doar foarte rar poate genera ioni cu sarcin multipl. Precursorul sistemului de ionizare APCI este cunoscut i sub denumirea de thermospray (TSP). Varianta thermospray nu a cunoscut niciodat o alternativ cu aplicabilitate n mod uzual la analize de serie i cu timpul a fost total nlocuit de APCI.
237

Descrcare electric de tip coroan

Flux de lichid

+
Flux de N2

+
Sistem de vaporizare (pn la 600C)

Faz gazoas Contraelectrod

Electrod ac

Capilar de extracie a ionilor formai

Ctre analizorul de mas

Curent de N2 nclzit Vid

Descrcare electric de tip coroan

Fig. 13.5. Sursa de ionizare chimic la presiune atmosferic (construcie ortogonal).

Ionizarea de tip electrospray (ESI sau AP-ESI) Un flux de lichid coninnd moleculele analitului de interes este amestecat cu azot i forat s treac printr-un tub capilar din oel inoxidabil meninut la un potenial de 3-4 kV. Se formeaz astfel un con de detenie (cunoscut sub denumirea de con Taylor) coninnd picturi de lichid suspendate n faz gazoas. n contra curent se va aplica un flux de azot nclzit, care determin micorarea continu a volumului picturilor. Acest proces are ca rezultat o cretere substanial a densitii cmpului electric pe suprafaa picturii pn n momentul n care se atinge limita Reyleigh. Ionii rezultai sunt extrai din picturi i orientai prin intermediul unui tub capilar ctre analizorul de mas. Principiul de funcionare al ESI este ilustrat n Fig. 13.6. Maniera de ionizare de tip electrospray reprezint cea mai blnd tehnic de ionizare cunoscut. Este destinat compuilor polari, chiar i n cazul unui caracter relativ nevolatil al acestora. Ionii sunt ejectai din picturile ncrcate cu sarcin sub form protonat [M+H]+ sau deprotonat [M-H]-. Randamentul de ionizare este puternic influenat de chimia n soluie a analitului situat n fluxul purttor. ESI accept cu greu sruri nevolatile i tampoane anorganice. Poate genera uor ioni cu sarcin multipl, motiv pentru care este des utilizat la caracterizarea compuilor cu mase moleculare mari. Performane analitice superioare ale manierei de ionizare prin electrospray se pot obine prin reaciile ion-ion n sursele de ionizare multipl. Aceste soluii tehnice conduc
238

la simplificarea spectrelor ESI i la urmrirea n detaliu a mecanismelor de reacie. Sursa de ionizare de tip electrospray poate fi relativ uor miniaturizat. Nanosprayul i reeaua de emitori electrospray pot ameliora n manier considerabil creterea vitezei de prelucrare a probelor. Realizarea la nivel micro a proceselor de preparare, concentrare i separare a probelor este astfel mult nlesnit. Manierele de lucru n sistem tandem APCI / AP-ESI au fost de asemenea testate, conducnd la nalt sensibilitate a determinrilor i la o vitez crescut de procesare a datelor.
Flux de lichid Flux de N2

4 kV

Contraelectrod

Dispersia picturilor ncrcate electric (con Taylor)

Capilar de extracie a ionilor formai

Ctre analizorul de mas

Pictura iniial (+ ioni predominai)

Curent de N2 nclzit Vid Limit Reyleigh

+-+ + + + -- + ++ + -+ + -

-+ -+ ++++ + + -+-++-Reducere
de volum

++ -+++

+ + + + + Explozie

Cluster solvent-ion

+
Extracia ionului

Fig. 13.6. Schema de funcionare a unei surse de ionizare de tip AP-ESI.

Ionizare multifoton (MPI) Moleculele analitului de interes sunt dispersate ntr-un flux lichid, care amestecat cu azot, genereaz efectul de separare. Att moleculele de solvent ct i cele de analit sunt vaporizate apoi ntr-un tub de cuartz i sunt aduse n zona de iradiere n faz gazoas omogen. Fotoionizarea direct a moleculelor analitului de interes este din punct de vedere statistic puin probabil, ceea ce ar conduce la randamente de ionizare reduse. Introducerea n fluxul de azot utilizat pentru sprayere a unui dopant poate avea repercursiuni importante asupra randamentului de ionizare. Moleculele dopantului sunt
239

cele care ionizeaz primele, iar mai apoi ionii respectivi interacioneaz cu moleculele analitului. Utilizarea unui laser acordabil emind n regim pulsat poate conduce la o cretere substanial a randamentului de ionizare. Vor trebui considerate cel puin dou etape distincte: 1. fotoni de tip n vor excita n mod coerent moleculele analitului de interes, aducndu-le pe un nivel electronic intermediar (proces de rezonan); 2. iradierea secvenial a acestor intermediari cu fotoni de tip m care conduce la ionizare. Prin creterea puterii (intensitii) radiaiei laser este posibil s se controleze procesul de ionizare, plecnd de la un proces blnd i ajungndu-se, dac se dorete, la o fragmentare molecular avansat. Schema unei surse de ionizare MPI este prezentat n Fig. 13.7.

Surs de fotoni Zona de iradiere Flux de N2 Flux de dopant Sistem de vaporizare Optic pentru extracia ionilor

Faz gazoas omogen Flux de lichid Tub de cuartz

Ctre analizorul de mas

Curent de N2 nclzit

Fig. 13.7. Schema de funcionare a unei surse de ionizare multifoton (MPI).

Faza solid - Ionizarea prin desorbie din matrice asistat Laser (MALDI) Proba se amestec iniial cu o matrice lichid (de exemplu acid sinapinic) aleas tocmai datorit proprietilor sale de a absorbi i a disipa energia transferat de fasciculul laser. Raportul molar analit matrice este un parametru operaional important de care analistul trebuie s in seama. Odat preparat proba se va transfera la nivelul unei suprafee solide. Caracteristicile acestei suprafee i geometria sa trebuie de asemenea s fie considerate ca influennd rezultatul analizei. Dup aplicare, att proba ct i matricea sunt convertite la o faz condensat (solid) prin evaporare sub flux de gaz sau vacuum. Astfel, apare fenomenul de cocristalizare a probei cu matricea. Variaia de dimensiune i de distribuie spaial a clusterilor sunt fenomene ce pot apare frecvent la nivelul suprafeei de depunere. Instrumentele moderne ncorporeaz un dispozitiv microscopic permind n egal msur micarea probei, pentru a se permite astfel selectarea acelor cristale care sunt ulterior supuse excitrii Laser. Selectarea zonei de impact (sweet spots) poate fi asistat cu ajutorul unei camere digitale. Fasciculul modulat de laser genereaz un volum de particule ejectate din suprafaa solid, coninnd ioni i molecule neutre aparinnd n egal msur matricei i analitului. Acest volum este n continu expansiune (cu viteze supersonice) plecnd de la suprafaa probei n unghi drept. Laserele UV sunt cele mai folosite (N2 la 337 nm sau Nd-YAG).
240

Laserele IR (CO2 sau Er-YAG) sunt utilizate pentru situaii cu totul speciale. Durata unui puls este de 1 la 10 ns i suprafaa de impact este de circa 0.01 mm2. Excitarea laser este repetat la intervale determinate de timp (frecvena este de circa o excitare pe secund - 1 Hz ). Frecvena de excitare va trebui aleas n acord cu tipul de analizor de mas utilizat. Analizorul timpului de zbor (TOF) este frecvent cuplat la sursa de ionizare MALDI. MALDI (prezentat n Fig. 13.8) reprezint o manier de ionizare blnd, avnd tendina de a produce ioni ncrcai cu o singur sarcin electric. Ambele moduri de ionizare (+) i (-) pot fi realizate, dei maniera (+) este de departe cea mai comun. Urmrirea ionilor negativi este ns des utilizat n analiza acizilor nucleici. n mod normal, MALDI nu produce fragmentare molecular. Studiile biochimice de investigare structural utiliznd MALDI vor presupune n consecin fragmentarea moleculei precursor pe cale enzimatic sau chimic, nainte de ionizarea propriu zis. Aplicaiile MALDI acoper domenii de interes extrem de variate, plecnd de la identificarea aditivilor n industria alimentar i caracterizarea compuilor macromoleculari n analiza de mediu (corelarea datelor analitice cu structura i impactul asupra mediului).
Surs laser Prob Matrice

Suprafa de depunere

Desolvarea Desorbie Transfer de protoni x Distribuie spaial Cocristalizarea probei cu matricea Camer digital H
+

Ctre analizorul de mas

Fig. 13.8. Sursa de ionizare MALDI.

Direciile principale de evoluie ale tehnicii de ionizare MALDI pot fi rezumate dup cum urmeaz: 1) cuplarea interfeelor n regim de presiune atmosferic peste caracteristicile
241

MALDI, avnd ca rezultat apariia unor noi tehnici denumite AP MALDI sau Laser Desorption (LD APCI). Aceste tehnici separ n ultim instan procesele de desorbie de cele de ionizare, eliminnd astfel impunerea legat de substratul care trebuie s nlesneasc desorbia i ionizarea n acelai timp, simplific modalitatea de preparare a probelor i mresc n mod sensibil randamentul de ionizare. 2) Tehnica MALDI fr suport matricial presupune depunerea probei ca atare pe un suport de siliciu poros confecionat din material cu rezistivitate joas (0.001 - 0.005 x cm) de tip n+. O astfel de soluie tehnic simplific n mod substanial procedura de preparare a probelor, reduce la minim zgomotul (mai ales n intervalul m/z mic) i favorizeaz astfel analiza ionilor cu mas redus. Cu toate acestea, absorbia optic, conductibilitatea termic, dimensiunile porilor i porozitatea total reprezint tot atia parametrii critici pentru suportul din siliciu. 3) cuplarea metodelor de separare n faz lichid cu sistemul MALDI MS s-a putut realiza prin electrodepunerea unui film de lichid pe o plac aflat n continu micare. Aplicarea unor pulsuri de tensiune negativ (-2 kV) cu durat scurt (circa 20 ms) mpiedic distribuia efluentului provenit din coloana cromatografic pe o suprafa pre extins. Acizii dihidroxibenzoic i respectiv -ciano-4-hidroxicinamic sunt utilizai ca matrice n astfel de cazuri. Interfeele care realizeaz depunerea continu n regim de vacuum a efluentului sunt de asemenea disponibile. 4) Dezvoltarea unor suprafee de afinitate pentru interfeele MALDI, care s permit concentrarea selectiv i ndeprtarea interferenelor n probe complexe. Astfel de suprafee pot fi modificate chimic (hidrofobice, ionice, amfionice sau cu metal imobilizat) sau biochimic (anticorp imobilizat, ADN imobilizat, enzim sau receptor imobilizai). Ionizarea cu fragmente rezultate din fisiune sau ionizarea prin desorbie din plasma Moleculele analitului de interes sunt depuse pe o suprafa de Ni (foi subire). Pulsuri cu fragmente de fisiune ale izotopului 252Cf vor fi orientate i focalizate asupra probei. ocul termic va avea ca rezultat vaporizarea ionilor mobili (H+, Na+, i H-). Ionii astfel produi vor interaciona cu moleculele de prob, imediat dup ocul termic, transformndu-le n ioni. PDI poate fi aplicat la studiul structural al moleculelor mari (pn la 50.000 Da). Depunerile pe film de nitroceluloz conduc n egal msur la formarea de ioni cu sarcin egal cu unitatea, ct i la ioni cu sarcini multiple. PDI este considerat a fi ca un precursor MALDI. Spectrometria de mas a ionilor secundari (SIMS) Un flux de ioni (monoatomici sau poliatomici, pozitivi sau negativi, provenind de la gazele inerte sau de la elemente cu accentuat caracter pozitiv / negativ) colideaz proba depus pe o suprafa metalic. Ionii secundari produi prin ejecia din suprafaa probei vor fi apoi colectai i analizai. Aceast tehnic poate opera att cu probe de natur organic ct i anorganic. n primul caz, sunt formai ioni moleculari i aduci cu sodiu. Imagistica la nivelul suprafeei (SIMS static) ct i harta tridimensional de distribuie (SIMS dinamic) a ionilor int sunt posibile. Natura ionilor primari alei poate determina pe cei secundari, care sunt transferai n analizorul de mas. Teoriile cinetic i de chemosorbie explic ejecia diferiilor ioni din prob, plecnd de la natura i proprietile ionilor primari.
242

S-ar putea să vă placă și