Sunteți pe pagina 1din 13

CAPITOLUL 13 Spectrometria de masă utilizată ca tehnică de detecţie în cromatografie

13.1. Introducere

Spectrometria de masă (MS) este o tehnică de investigare cu largi aplicaţii în chimia analitică, cum ar fi: determinarea maselor atomice şi moleculare; compoziţia izotopică a elementelor; sau identificarea compuşilor organici. Pe lângă aceste aplicaţii, ea a devenit una dintre cele mai importante tehnici de detecţie în cromatografie, fiind

utilizată atât la identificarea analiţilor care eluează din coloana cromatografică, cât şi la determinarea lor cantitativă. Începutul acestei tehnici este datorat lui Thompson (1912), cel care a înregistrat primele spectre de masă şi a sugerat posibila utilizare a acestora în

identificarea substanţelor.

Curând după această dată, Aston şi Dempster întreprind

primele cercetări bazate pe această tehnică privind compoziţia izotopică a unor elemente. Primele spectre de masă pentru compuşi organici sunt înregistrate în anul 1930, utilizând experimente de ionizare şi fragmentare a unor hidrocarburi gazoase sub acţiunea unui fascicul de electroni. Primele instrumente MS comercializate apar după anul 1950, fiind utilizate în industria de prelucrare a petrolului. După anii 1960, spectrometria de masă

devine cea mai importantă tehnică de detecţie atât în cromatografia de gaze, cât şi în cromatografia de lichide.

[132]

13.2. Componentele unui spectrometru de masă

Principalele componente ale unui spectrometru de masă, redate în figura de mai jos, sunt: camera de ionizare; separatorul (analizorul) de ioni; detectorul de ioni. In cazul cuplării sistemul MS cu unul cromatografic interfaţa dintre ele realizează etapa 1.

cromatografic interfa ţ a dintre ele realizeaz ă etapa 1. Computer Control hardware Achiziţie de date,
Computer Control hardware Achiziţie de date, Introducerea Sursa de Analizorul Detector procesare şi probei
Computer
Control
hardware
Achiziţie de
date,
Introducerea
Sursa de
Analizorul
Detector
procesare şi
probei
ionizare
de masă
de ioni
interpretare
Etapa (1)
Etapa (2)
Etapa (3)
Etapa (4)
Etapa (5)
Sistem
Izolarea
Izolarea ionului
Analiza ionilor
de vid
ionului
(fragmentarea
rezultaţi
(anumite
ionului indusă
specii ionice)
colizional)
n
Fig. 13.1. Schema de bază a unui spectrometru de masă. [133]

230

Anumite aplicaţii pot impune dezvoltarea etapei (3) în sensul îmbunătăţiri cantităţii de informaţie care poate fi extrasă din procesul de ionizare, şi în consecinţă, o creştere corespunzătoare a selectivităţii. Secvenţa de operaţii dintre parantezele drepte din figură alternativa de mai sus poate fi repetată de un număr de ori (n). Deoarece spectrometria de masă are ca scop caracterizarea fragmentelor moleculare ionice produse de către analit în condiţii controlate, şi că aceste fragmente ionice sunt sau încărcate cu sarcină electrică pozitivă sau cu sarcină electrică negativă, maniera de lucru în condiţii reale va trebui să definească în mod univoc semnul sarcinii ionilor analizaţi (+) MS sau (-). În spectrometrele moderne de masă, analiza ionilor pozitivi şi negativi poate fi realizată alternativ, pe durata aceluiaşi proces, dar niciodată într-o manieră simultană. Va trebui de asemenea menţionat faptul că formarea, separarea şi caracterizarea fragmentelor ionice trebuie realizate într-un mediu lipsit de interferenţe de orice natură, cu alte cuvinte, spectrometrul de masă va trebui să opereze în condiţii de vacuum avansat (funcţie de caracteristicile constructive ale analizorului de masă, nivelul vidului poate varia în intervalul 10 -5 şi 10 -12 torri).

13.3. Spectrul de masă

Spectrul de masă este reprezentarea bidimensională a abundenţelor individuale ale fragmentelor moleculare ionice generate în procesul de ionizare în funcţie de rapoartele masă/sarcină corespunzătoare (m/z). Fragmentele ionice sunt produse în etapa de ionizare a unei probe ce poate reprezenta un compus pur sau un amestec de componenţi individuali. Masa ionilor poate fi descrisă în următoarele trei moduri distincte: (1) masa medie a ionului reprezentând suma maselor medii ale atomilor ce îl formează; masele atomice medii sunt calculate ca şi medie ponderată a maselor izotopice, prin raportarea la distribuţia lor în natură; (2) masa monoizotopică a ionului, reprezintă suma maselor atomice exacte corespunzătoare celor mai abundenţi izotopi naturali ai atomilor ce intră în compoziţia ionului respectiv; (3) masa ionică nominală reprezintă suma celor mai abundenţi izotopi naturali ai atomilor care intră în compoziţia ionului în cauză, exprimată ca număr întreg. Masele ionice se vor exprima în Daltoni (Da). z reprezintă numărul total de sarcini acumulate de fragmentul molecular ionic în cauză, exprimat în unităţi elementare de sarcină (e). In Fig. 13.2 este prezentat un detaliu din spectru de masă al atrazinei (intervalul cuprins între 197 şi 220 Da). Maniera de prezentare de tip profil spectral presupune o rezoluţie dată [133] , caracteristică pentru analizorul de masă utilizat, pe când maniera de reprezentare de tip linie spectrală reprezintă un mod idealizat, prin care sunt figurate intensităţile doar pentru valorile întregi ale rapoartelor m/z. Ionul cu cea mai mare abundenţă în spectrul de masă se va numi ionul major (este acel ion cu cea mai mare stabilitate şi probabilitate de a se obţine). Raportarea abundenţelor individuale a tuturor celorlalţi ioni la abundenţa ionului major va conduce la măsurători de abundenţă relativă (RA%) în lungul axei Oy. Ionul molecular este ionul produs de către moleculele analitului prin îndepărtarea sau captura unuia sau mai multor electroni. Interpretarea spectrului de masă poate fi utilizată la identificarea structurii unui compus organic investigat prin această tehnică. Identificarea structurală presupune de regulă compararea unui spectru de masă experimental cu spectre MS dintr-o librărie spectrală, stocată în memoria sistemului de procesare a datelor cu care este dotat

231

spectrometrul de masă.

ATRAZINĂ Formula moleculară: 100 C 8 H 14 ClN 5 Masa medie M w =
ATRAZINĂ
Formula moleculară:
100
C 8 H 14 ClN 5
Masa medie M w
= 215.69
90
Masa monoizotopică M w
Masa ionică nominală M w
= 215.09377
= 215
80
70
Spectrul de
linii
60
50
HN
40
N
N
30
HN
N
Cl
20
10
0
100
90
80
Profil Spectral
70
60
50
40
30
20
10
0
Abundenţă ionică relativă
( R.A. %)
197
198
198
199
200
199
200
201
201
202
203
202
203
204
205
204
205
206
206
207
208
207
208
209
209
210
210
211
211
212
213
212
213
214
215
214
215
216
216
217
218
217
218
219
219
220
220

Raport masă / sarcină (m/z)

Fig. 13.2. Detalii ale spectrului de masă al atrazinei pe domeniul m/z [197; 220].

13.4. Sistemul de introducere a probelor în spectrometrul de masă

Probele de interes pot fi aduse în zona de ionizare atât în fază gazoasă, cât şi în fază condensată (lichidă sau solidă). Probele supuse analizei prin spectrometria de masă pot fi în egală măsură de natură organică sau anorganică. Probele de natură organică sunt supuse analizei prin spectrometrie de masă pentru a obţine informaţia structurală sau confirmarea acesteia, de cele mai multe ori plecând de la cantităţi extrem de reduse.

232

În cazul în care informaţia structurală reprezintă scopul declarat, ionizarea simultană a mai multor specii moleculare este de dorit a fi evitată. Rezultă deci necesitatea separării compuşilor individuali din amestecurile multicomponent înaintea analizei lor prin spectrometrie de masă. Toate tehnicile de separare (cromatografia în strat subţire, cromatografia de gaze, cromatografia de lichide, cromatografia de fluide în stare supercritică, cromatografia electrocapilară, cromatografia electrocinetică micelară tehnică de imobilizare a miceliilor şi electroforeza capilară) au fost cuplate cu succes la spectrometrele de masă, în mod direct sau prin intermediul unor interfeţe specializate. Pentru probele de natură anorganică, informaţia produsă de spectrometria de masă, se referă la identificarea şi determinarea calitativă a atomilor, inclusiv a ponderilor naturale izotopice asociate. În asemenea cazuri, introducerea probei nu necesită o structură/ construcţie specială, doar modalităţile practice de ionizare sunt mult mai complexe (bombardarea cu ioni acceleraţi, plasmă cuplată inductiv, etc).

13.5. Ionizarea în spectrometria de masă

Ionizarea prin impact electronic

Ionizarea prin impact electronic presupune coliziunea moleculelor analitului de interes aduse în stare gazoasă cu un flux focalizat de electroni acceleraţi, în zona de ionizare. Energia electronilor acceleraţi este mai mare decât potenţialul de ionizare al moleculelor de analit (în mod curent aceasta este de 70 eV). In urma acestui proces este probabil ca un electron să ciocnească o moleculă pe care o întâlneşte, transferând o parte a energiei sale moleculei şi provocând expulzarea unui electron (ionizarea moleculei). Procesul de ionizare a unei molecule de analit M conduce într-o primă etapă la un ion molecular:

M + e - M + + 2e -

Ionul molecular M + se poate apoi fragmenta printr-o suită de reacţii ce decurg în paralel:

, sau în serie:

M + A i + B i + (i = 1,2,

)

M + A+ B +

B + A’+ B’ +

B’ + A’’+ B’’ +

……

Procesele de fragmentare decurg în acord cu structura chimică a moleculelor şi vor fi reluate în cap. 13.8. O caracteristică importantă a ionilor, moleculari sau formaţi, este dată de stabilitatea acestora, care se va regăsi în spectrul de masă înregistrat. Cele mai importante procese de ionizare a unei specii moleculare decurg din impactul unui electron cu dubletul de electroni σ, dubletul de electroni π, sextetul de electroni ai unui sistem aromatic, sau electronii neparticipanţi p ai unui atom (halogeni, oxigen, azot, fosfor, sulf, etc), reprezentate astfel:

233

+ . C C + e - C C + 2e - + X .
+
.
C
C
+ e -
C
C
+ 2e -
+
X .
+ 2e -
X:
+ e -
+
.
C
Y
+ e -
C
Y
+ 2e -
+ e -
+
+ 2e -

In urma proceselor de ionizare de mai sus se formează ioni moleculari, cu sarcină pozitivă distribuită pe atomul sau atomii de la care a avut loc expulzarea unui electron, a căror stabilitate depinde de prezenţa substituenţilor, dar şi a energiei electronului de impact care a produs ionizarea. Din punct de vedere instrumental, atât ionizarea prin impact electronic (EI – electron ionization), cât şi ionizarea chimică (CI – chemical ionization), discutată în continuare, se pot realiza în surse de ionizare având construcţii foarte asemănătoare, aşa cum se prezintă în Fig. 13.3.

Gaz reactiv

Ecran şi fantă pentru focalizarea şi accelerarea electronilor primari incidenţi (CI) N Magnet Valva Filament
Ecran şi fantă pentru
focalizarea şi accelerarea
electronilor primari
incidenţi
(CI)
N
Magnet
Valva
Filament
Manometru
Introducerea
de Reniu
probei (vapori)
Zonă de
ionizare
Electrod
Către
de
analizorul
redirecţionare
de masă
Electroni
primari(70 eV)
Vid
Anod
Sistem de ecrane cu
fante pentru accelerarea
şi focalizarea ionilor către
analizorul de masă
Magnet
S
Sursă de
ionizare

Fig. 13.3. Schema de bază a unei surse de ionizare utilizate pentru EI sau CI. [133]

234

Electronii produşi prin încălzirea filamentului de reniu sunt focalizaţi şi acceleraţi datorită polilor magnetului, anodului şi a ecranului de focalizare / accelerare. Fascicolul de electroni intră în coliziune cu moleculele de analit (sau moleculele de gaz reactiv) în aria de ionizare. Modul de alimentare cu gaz reactiv include un robinet de control al debitului şi un manometru. În acest mod, se poate controla numărul ionilor formaţi în interiorul sursei. Electrodul de redirecţionare este utilizat pentru eliminarea anumitor electroni a căror apariţie este nedorită (electrodul va fi încărcat cu sarcină pozitivă în cazul în care se doreşte eliminarea ionilor negativii formaţi prin ruperea moleculelor de analit şi va fi negativ în cazul în care ioni care trebuie înlăturaţi au sarcini pozitive). Sistemul de ecrane ajută la focalizarea şi accelerarea ionilor formaţi în zona de ionizare spre analizorul de masă (ecranele sunt încărcate cu voltaje crescătoare de semn opus ionilor care se doresc a fi analizaţi). Întreaga sursă de ionizare este funcţionează în vid corespunzător prin intermediul pompelor turbomoleculare sau de difuzie. In ionizarea negativă, datorită formării ionului molecular încărcat electric negativ şi în stare energetică superioară (M - *), pot avea loc ruperi de legături în molecula analitului cu formarea unor fragmente mai mici, încărcate la rândul lor cu sarcină negativă, aşa după cum este sugerat în secvenţa următoare:

M

+ e - M -

M

+ e - M - *

M - * A i - + B i , i=1,2,…

In practică, cel mai utilizat mod de ionizare este cel cu producerea ionilor pozitivi.

Ionizarea chimică

Ionizarea chimică reprezintă modalitatea de ionizare a moleculelor de analit ca urmare a coliziunii lor cu alţi ioni produşi prin impactul cu electroni ai moleculelor de gaz reactiv, introduse direct în sursa de ionizare. Existenţa moleculelor de gaz reactiv în exces mare în raport cu moleculele analitului de interes (10000 : 1) impune o creştere substanţială a energiei electronilor primari (500 eV). Ionizarea chimică este cunoscută şi sub denumirea de “ionizare blândă” („soft ionization”), deoarece transferul energetic rezultat între ionii gazului reactiv şi moleculele analitului nu depăşeşte 5 eV. Produşii rezultaţi în urma ionizării chimice prezintă o stabilitate mai bună din cauza stării electronice pare (prin comparaţie cu starea electronică impară care, de regulă, rezultă pentru ionii produşi prin impact electronic). Următoarele substanţe sunt folosite în mod curent ca şi gaze reactive (ionii acestora sunt menţionaţi între paranteze): H 2 (H 3 + ); CH 4 (CH 5 + ); C 2 H 6 (C 2 H 7 + ); H 2 O (H 3 O + ); CH 3 OH (CH 3 OH 2 + ); CH 3 CN (CH 3 CNH + ); NH 3 (NH 4 + ); CH 3 NH 2 (CH 3 NH 3 + ); H 2 NCH 2 CH 2 NH 2 (H 2 NCH 2 CH 2 NH 3 + ). Pentru ionizarea chimică, mod negativ, următoarele substanţe sunt utilizate ca şi gaze reactive (ionii acestora sunt menţionaţi între paranteze): NH 3 (NH 2 - ); N 2 O în amestec cu CH 4 ; CH 4 + He; H 2 + He (OH - ; N 2 O sau amestecat cu N 2 (O -. ); NF 3 (F - ); CHF 3 (F - ); O 2 (O 2 -. ); CH 2 Br 2 (Br - ); CH 2 Cl 2 (Cl - ); CHCl 3 (Cl - ); CF 2 Cl 2 (Cl - ). Interacţiile posibile pe durata ionizării chimice cu ajutorul amoniacului, prin care agentul de colizionare şi inducere a ionizării devine ionul amoniu (NH 4 + ) sunt ilustrate mai jos:

:NH 3 + e - → ⋅NH 3 + + 2e -

235

NH 3 + + :NH 3 ⋅→ NH 4 + + :NH 2

Interacţiile care pot avea loc în sursa de ioni sunt exemplificate pentru cazul în care drept gaz reactiv se foloseşte metanul:

CH

CH

CH

CH

+

4

+

4

+

e

.

.

4

-

p

CH

+

.

4 +

CH

CH

+

3

+

+

.

2 +

H

.

H

2

+

2

.

CH

+ →

4

C

2

H

+

3

2 e

+

-

s ;

H

2

CH

CH

C

+

4

+

3

2

H

.

+

3

+

+

+

CH

4

CH

+

5

CH

4 2

C

H

+

5

CH

4

C

3

H

+

+

CH

H

2

.

3

+

5

+

H

2

+

H

.

CH

C

C

CH

C

+

M

+

2 5

H

+

M

3 H

+

M

+

+

5

+

2 5

H

+

M

M

+

5

+

5

[MH]

[MH]

5

+

+

+

+

+

+

+

[MH]

[MCH ]

[MC H

2

5

C

C

+

3 5

+

2

5

H

H

+

+

M

M

[MC H [M - H]

3

5

+

CH

C

2

C

3

4

H

H

4

4

]

]

+

+

+

C

2

H

6

Avantajele modului de ionizare chimică sunt: ionizare blândă, posibilităţi multiple de confirmare a masei moleculare a analitului datorită unei game extrem de variate de interacţie respectiv modalităţi de producere a ionilor, o acţiune selectivă sau universală, depinzând de natura gazului reactiv, formarea relativ uşoară a ionilor negativi, permiţând evaluări structurale şi termochimice. Atât ionizarea prin impact electronic cât şi ionizarea chimică se pot realiza în surse de ionizare având construcţii foarte asemănătoare, aşa cum s-a prezentat în Fig. 13.3.

Ionizarea în câmp electric

Prin metoda de ionizare în câmp electric, moleculele analitului în stare gazoasă sunt aduse în vecinătatea unei suprafeţe curbe (cum ar fi de pildă vârfuri sau lame) supuse unui câmp electric intens (10 7 - 10 8 Vcm -1 ). Moleculele analitului vor fi ionizate datorită efectului de tunel cuantic al electronilor de valenţă către suprafaţa metalică. Această modalitate trebuie să fie considerată ca o “ionizare blândă”, având drept neajuns major un randament de ionizare relativ scăzut.

Ionizarea din faze condensate - faza lichidă Bombardarea cu atomi rapizi (FAB)

Moleculele analitului de interes sunt dispersate într-un mediu lichid şi cu volatilitate redusă, la nivelul unei suprafeţe solide poroase şi sunt supuse coliziunii (bombardării) cu atomi sau ioni caracterizaţi prin energii cinetice mari (domeniul keV). Utilizarea atomilor de Xe sau a ionilor de Cs conduce la obţinerea unor spectre foarte asemănătoare. În zona din imediata apropiere a suprafeţelor solide poroase, molecula de analit interacţionează într-o manieră foarte asemănătoare cu ionizarea chimică, prin producerea speciilor [M+H] + sau [M-H] - . Cel mai frecvent utilizat mediu lichid de dispersie este glicerina. FAB este aplicabilă moleculelor polare cu masă moleculară inferioară valorii de 20,000 Da. Dacă ionii de energie mare înlocuiesc atomii, tehnica de ionizare este cunoscută şi sub denumirea LSIMS (spectrometria de masă a ionilor secundari

236

generaţi din fază lichidă). Sursa de ionizare prin coliziune cu atomi rapizi este redată în mod schematic în figura următoare.

este redat ă în mod schematic în figura urm ă toare. Suprafaţă solidă poroasă (frită) Tun
Suprafaţă solidă poroasă (frită) Tun de atomi / ioni Introducerea probei lichide Introducerea Optică pentru
Suprafaţă solidă
poroasă (frită)
Tun de atomi /
ioni
Introducerea
probei lichide
Introducerea
Optică pentru
suportului lichid
extracţia ionilor
vâscos
Către analizorul
Vid
de masă
Fig.13.4. Schema unei surse de ionizare prin coliziune cu atomi rapizi.

Ionizarea chimică la presiune atmosferică (APCI)

Un flux de lichid conţinând moleculele analitului de interes este pompat printr-un sistem de vaporizare. Jetul de vapori rezultat conţinând de asemenea picături de lichid (aflate în continuă evaporare sub influenţa căldurii) va fi orientat către zona de descărcare. Descărcarea electrică generată este de tip coroană şi se realizează între vârful ascuţit al unui ac şi un contraelectrod discoidal, menţinut la un potenţial de 1 – 4kV. Descărcarea electrică ionizează moleculele de solvent existente în stare gazoasă. O serie de coliziuni şi reacţii cu transfer de sarcină între ionii generaţi de solvent şi moleculele de analit, conduce în final la ionizarea acestora din urmă. Generarea ionilor moleculari protonaţi sau deprotonaţi [M+H] + ; [M-H] - este în consecinţă posibilă. Ionii rezultaţi sunt extraşi către analizorul de masă prin intermediul unui tub capilar. Maniera de ionizare chimică la presiune atmosferică este reprezentată schematic în Fig. 13.5 (construcţie ortogonală). Ionizarea chimică la presiune atmosferică se poate utiliza pentru o gamă destul de largă a polarităţii moleculelor de interes şi tolerează relativ bine sărurile nevolatile sau tampoanele anorganice din lichidul purtător. Cu toate acestea ionizarea chimică la presiune atmosferică se foloseşte cu predilecţie pentru compuşii apolari. Maniera de ionizare nu este prea mult influenţată de interacţiile în soluţie ale moleculelor de analit (prin intermediul fazei purtătoare). Ionizarea chimică la presiune atmosferică nu se poate utiliza în cazul compuşilor cu labilitate termică şi doar foarte rar poate genera ioni cu sarcină multiplă. Precursorul sistemului de ionizare APCI este cunoscut şi sub denumirea de thermospray (TSP). Varianta thermospray nu a cunoscut niciodată o alternativă cu aplicabilitate în mod uzual la analize de serie şi cu timpul a fost total înlocuită de APCI.

237

Flux de lichid Descărcare electrică de tip coroană + Flux de N 2 + +
Flux de lichid
Descărcare
electrică de tip
coroană
+
Flux de N 2
+
+
+
+
Sistem de vaporizare
(până la 600 ° C)
Fază gazoasă
Contraelectrod
Capilară de extracţie a
ionilor formaţi
Electrod ac
Către
analizorul
de masă
Curent de N 2 încălzit
Vid
Descărcare electrică de tip coroană

Fig. 13.5. Sursa de ionizare chimică la presiune atmosferică (construcţie ortogonală).

Ionizarea de tip electrospray (ESI sau AP-ESI)

Un flux de lichid conţinând moleculele analitului de interes este amestecat cu azot şi forţat să treacă printr-un tub capilar din oţel inoxidabil menţinut la un potenţial de 3-4 kV. Se formează astfel un con de detenţie (cunoscut sub denumirea de con Taylor) conţinând picături de lichid suspendate în fază gazoasă. În contra curent se va aplica un flux de azot încălzit, care determină micşorarea continuă a volumului picăturilor. Acest proces are ca rezultat o creştere substanţială a densităţii câmpului electric pe suprafaţa picăturii până în momentul în care se atinge limita Reyleigh. Ionii rezultaţi sunt extraşi din picături şi orientaţi prin intermediul unui tub capilar către analizorul de masă. Principiul de funcţionare al ESI este ilustrat în Fig. 13.6. Maniera de ionizare de tip electrospray reprezintă cea mai blândă tehnică de ionizare cunoscută. Este destinată compuşilor polari, chiar şi în cazul unui caracter relativ nevolatil al acestora. Ionii sunt ejectaţi din picăturile încărcate cu sarcină sub formă protonată [M+H] + sau deprotonată [M-H] - . Randamentul de ionizare este puternic influenţat de chimia în soluţie a analitului situat în fluxul purtător. ESI acceptă cu greu săruri nevolatile şi tampoane anorganice. Poate genera uşor ioni cu sarcină multiplă, motiv pentru care este des utilizată la caracterizarea compuşilor cu mase moleculare mari.

Performanţe analitice superioare ale manierei de ionizare prin electrospray se pot obţine prin reacţiile ion-ion în sursele de ionizare multiplă. Aceste soluţii tehnice conduc

238

la simplificarea spectrelor ESI şi la urmărirea în detaliu a mecanismelor de reacţie. Sursa de ionizare de tip electrospray poate fi relativ uşor miniaturizată. Nanosprayul şi reţeaua de emitori electrospray pot ameliora în manieră considerabilă creşterea vitezei de prelucrare a probelor. Realizarea la nivel micro a proceselor de preparare, concentrare şi separare a probelor este astfel mult înlesnită. Manierele de lucru în sistem tandem APCI / AP-ESI au fost de asemenea testate, conducând la înaltă sensibilitate a determinărilor şi la o viteză crescută de procesare a datelor.

Flux de lichid Flux de N 2 Contraelectrod ∼ 4 kV Către Dispersia picăturilor analizorul
Flux de lichid
Flux de N 2
Contraelectrod
∼ 4 kV
Către
Dispersia picăturilor
analizorul
încărcate electric
Capilară de extracţie a
ionilor formaţi
de masă
(con Taylor)
Curent de N 2
încălzit
Picătura iniţială
(+ ioni predominaţi)
Vid
Limită Reyleigh
Cluster
+ -
+ - solvent-ion
- +
-
+ +
+
+
+ -
+
+
- -
-
+
-
+
-
+
- +-
+
+
+
-
++
+ - +
+
-
+
- ++ - +
+ - +
-
+
+
-
+
+ -
+ - - -
-
+
Extracţia ionului
Reducere
Explozie
de volum

Fig. 13.6. Schema de funcţionare a unei surse de ionizare de tip AP-ESI.

Ionizare multifoton (MPI)

Moleculele analitului de interes sunt dispersate într-un flux lichid, care amestecat cu azot, generează efectul de separare. Atât moleculele de solvent cât şi cele de analit sunt vaporizate apoi într-un tub de cuartz şi sunt aduse în zona de iradiere în fază gazoasă omogenă. Fotoionizarea directă a moleculelor analitului de interes este din punct de vedere statistic puţin probabilă, ceea ce ar conduce la randamente de ionizare reduse. Introducerea în fluxul de azot utilizat pentru sprayere a unui dopant poate avea repercursiuni importante asupra randamentului de ionizare. Moleculele dopantului sunt

239

cele care ionizează primele, iar mai apoi ionii respectivi interacţionează cu moleculele analitului. Utilizarea unui laser acordabil emiţând în regim pulsat poate conduce la o creştere substanţială a randamentului de ionizare. Vor trebui considerate cel puţin două etape distincte: 1. fotoni de tip n vor excita în mod coerent moleculele analitului de interes, aducându-le pe un nivel electronic intermediar (proces de rezonanţă); 2. iradierea secvenţială a acestor intermediari cu fotoni de tip m care conduce la ionizare. Prin creşterea puterii (intensităţii) radiaţiei laser este posibil să se controleze procesul de ionizare, plecând de la un proces blând şi ajungându-se, dacă se doreşte, la o fragmentare moleculară avansată. Schema unei surse de ionizare MPI este prezentată în Fig. 13.7.

Sursă de fotoni Zona de iradiere Optică pentru extracţia Flux de ionilor Flux de Sistem
Sursă de fotoni
Zona de iradiere
Optică pentru
extracţia
Flux de
ionilor
Flux de
Sistem de vaporizare
dopant
N
2
Fază gazoasă
omogenă
Către
analizorul
Flux de
de masă
lichid
Tub de cuartz
Curent de N 2 încălzit

Fig. 13.7. Schema de funcţionare a unei surse de ionizare multifoton (MPI).

Faza solidă - Ionizarea prin desorbţie din matrice asistată Laser (MALDI)

Proba se amestecă iniţial cu o matrice lichidă (de exemplu acid sinapinic) aleasă tocmai datorită proprietăţilor sale de a absorbi şi a disipa energia transferată de fasciculul laser. Raportul molar analit matrice este un parametru operaţional important de care analistul trebuie să ţină seama. Odată preparată proba se va transfera la nivelul unei suprafeţe solide. Caracteristicile acestei suprafeţe şi geometria sa trebuie de asemenea să fie considerate ca influenţând rezultatul analizei. După aplicare, atât proba cât şi matricea sunt convertite la o fază condensată (solidă) prin evaporare sub flux de gaz sau vacuum. Astfel, apare fenomenul de cocristalizare a probei cu matricea. Variaţia de dimensiune şi de distribuţie spaţială a clusterilor sunt fenomene ce pot apare frecvent la nivelul suprafeţei de depunere. Instrumentele moderne încorporează un dispozitiv microscopic permiţând în egală măsură mişcarea probei, pentru a se permite astfel selectarea acelor cristale care sunt ulterior supuse excitării Laser. Selectarea zonei de impact (“sweet spots”) poate fi asistată cu ajutorul unei camere digitale. Fasciculul modulat de laser generează un volum de particule ejectate din suprafaţa solidă, conţinând ioni şi molecule neutre aparţinând în egală măsură matricei şi analitului. Acest volum este în continuă expansiune (cu viteze supersonice) plecând de la suprafaţa probei în unghi drept. Laserele UV sunt cele mai folosite (N 2 la 337 nm sau Nd-YAG).

240

Laserele IR (CO 2 sau Er-YAG) sunt utilizate pentru situaţii cu totul speciale. Durata unui

puls este de 1 la 10 ns şi suprafaţa de impact este de circa 0.01 mm

este repetată la intervale determinate de timp (frecvenţa este de circa o excitare pe secundă - 1 Hz ). Frecvenţa de excitare va trebui aleasă în acord cu tipul de analizor de masă utilizat. Analizorul timpului de zbor (TOF) este frecvent cuplat la sursa de ionizare MALDI. MALDI (prezentată în Fig. 13.8) reprezintă o manieră de ionizare blândă, având tendinţa de a produce ioni încărcaţi cu o singură sarcină electrică. Ambele moduri de ionizare (+) şi (-) pot fi realizate, deşi maniera (+) este de departe cea mai comună. Urmărirea ionilor negativi este însă des utilizată în analiza acizilor nucleici. În mod normal, MALDI nu produce fragmentare moleculară. Studiile biochimice de investigare structurală utilizând MALDI vor presupune în consecinţă fragmentarea moleculei precursor pe cale enzimatică sau chimică, înainte de ionizarea propriu zisă. Aplicaţiile MALDI acoperă domenii de interes extrem de variate, plecând de la identificarea aditivilor în industria alimentară şi caracterizarea compuşilor macromoleculari în analiza de mediu (corelarea datelor analitice cu structura şi impactul asupra mediului).

. Excitarea laser

2

+

+ C ă t r e analizorul de mas ă

Către

analizorul

de masă

Sursă laser Probă Matrice Suprafaţă de depunere - Desolvarea Desorbţie Transfer de y protoni x
Sursă laser
Probă
Matrice
Suprafaţă de
depunere
-
Desolvarea
Desorbţie
Transfer de
y
protoni
x
H +
Distribuţie
spaţială
Cameră
Cocristalizarea probei
digitală
cu matricea
Fig. 13.8. Sursa de ionizare MALDI.

Direcţiile principale de evoluţie ale tehnicii de ionizare MALDI pot fi rezumate după cum urmează:

1) cuplarea interfeţelor în regim de presiune atmosferică peste caracteristicile

241

MALDI, având ca rezultat apariţia unor noi tehnici denumite AP – MALDI sau Laser Desorption (LD – APCI). Aceste tehnici separă în ultimă instanţă procesele de desorbţie de cele de ionizare, eliminând astfel impunerea legată de substratul care trebuie să înlesnească desorbţia şi ionizarea în acelaşi timp, simplifică modalitatea de preparare a probelor şi măresc în mod sensibil randamentul de ionizare. 2) Tehnica MALDI fără suport matricial presupune depunerea probei ca atare pe un suport de siliciu poros confecţionat din material cu rezistivitate joasă (0.001 - 0.005 Ω x cm) de tip n + . O astfel de soluţie tehnică simplifică în mod substanţial procedura de preparare a probelor, reduce la minim zgomotul (mai ales în intervalul m/z mic) şi favorizează astfel analiza ionilor cu masă redusă. Cu toate acestea, absorbţia optică, conductibilitatea termică, dimensiunile porilor şi porozitatea totală reprezintă tot atâţia parametrii critici pentru suportul din siliciu. 3) cuplarea metodelor de separare în fază lichidă cu sistemul MALDI – MS s-a putut realiza prin electrodepunerea unui film de lichid pe o placă aflată în continuă mişcare. Aplicarea unor pulsuri de tensiune negativă (-2 kV) cu durată scurtă (circa 20 ms) împiedică distribuţia efluentului provenit din coloana cromatografică pe o suprafaţă pre extinsă. Acizii dihidroxibenzoic şi respectiv α-ciano-4-hidroxicinamic sunt utilizaţi ca matrice în astfel de cazuri. Interfeţele care realizează depunerea continuă în regim de vacuum a efluentului sunt de asemenea disponibile. 4) Dezvoltarea unor suprafeţe “de afinitate” pentru interfeţele MALDI, care să permită concentrarea selectivă şi îndepărtarea interferenţelor în probe complexe. Astfel de suprafeţe pot fi modificate chimic (hidrofobice, ionice, amfionice sau cu metal imobilizat) sau biochimic (anticorp imobilizat, ADN imobilizat, enzimă sau receptor imobilizaţi).

Ionizarea cu fragmente rezultate din fisiune sau ionizarea prin desorbţie din plasma

Moleculele analitului de interes sunt depuse pe o suprafaţă de Ni (foiţă subţire).

Pulsuri cu fragmente de fisiune ale izotopului

probei. Şocul termic va avea ca rezultat vaporizarea ionilor mobili (H + , Na + , şi H - ). Ionii

astfel produşi vor interacţiona cu moleculele de probă, imediat după şocul termic, transformându-le în ioni. PDI poate fi aplicată la studiul structural al moleculelor mari (până la 50.000 Da). Depunerile pe film de nitroceluloză conduc în egală măsură la formarea de ioni cu sarcină egală cu unitatea, cât şi la ioni cu sarcini multiple. PDI este considerat a fi ca un precursor MALDI.

Cf vor fi orientate şi focalizate asupra

252

Spectrometria de masă a ionilor secundari (SIMS)

Un flux de ioni (monoatomici sau poliatomici, pozitivi sau negativi, provenind de la gazele inerte sau de la elemente cu accentuat caracter pozitiv / negativ) colidează proba depusă pe o suprafaţă metalică. Ionii secundari produşi prin ejecţia din suprafaţa probei vor fi apoi colectaţi şi analizaţi. Această tehnică poate opera atât cu probe de natură organică cât şi anorganică. În primul caz, sunt formaţi ioni moleculari şi aducţi cu sodiu. Imagistica la nivelul suprafeţei (SIMS static) cât şi harta tridimensională de distribuţie (SIMS dinamic) a ionilor ţintă sunt posibile. Natura ionilor primari aleşi poate determina pe cei secundari, care sunt transferaţi în analizorul de masă. Teoriile cinetică şi de chemosorbţie explică ejecţia diferiţilor ioni din probă, plecând de la natura şi proprietăţile ionilor primari.

242