Trfico vesicular FORMACIN y FUSIN de VESCULAS Las clulas eucariotas se caracterizan por el reparto ordenado y dirigido de molculas entre

diferentes compartimentos celulares mediado por vesculas, que actan como vehculos. Esto supone una gran ventaja puesto que se puede seleccionar de manera especfica qu molculas deben ir a cada compartimento, las cuales son en s mismas responsables de las funciones de tales compartimentos. Por ejemplo, las enzimas hidrolticas cidas deben ir a los lisosomas, pero no a los endosomas tempranos. Las vesculas son pequeos compartimentos membranosos que viajan entre compartimentos celulares. Sirven para transportar molculas solubles disueltas en el medio acuoso del interior de la vescula y molculas de membrana formando parte de la propia membrana de la vescula como son lpidos, canales o receptores. Las vesculas se forman en el compartimento fuente y se cargan con aquellas molculas que deben ser transportadas. Una vez liberadas al citosol son dirigidas hacia el orgnulo diana, al cual reconocen, y al que finalmente se fusionan. Entonces, las molculas transportadas formarn parte del orgnulo y sern las responsables de su funcin. Sin embargo, otras molculas slo estarn de paso en ese compartimento y sern empaquetadas de nuevo en otras vesculas para dirigirse a otro compartimento celular. Es lo que ocurre con algunas protenas que viajan desde el retculo endoplasmtico, pasan por el aparato de Golgi, donde son empaquetadas hacia otros compartimentos Todos estos pasos requieren la participacin de una serie de herramientas moleculares:

Pasos que se siguen en el transporte de molculas mediado por vesculas.

a) Un complejo molecular parareconocer y atrapar las molculas que se han transportar. Protenas adicionales deben formar la vescula a partir de las membranas del orgnulo fuente. Hay que tener en cuenta que el proceso de formacin de una vescula es tremendamente complejo puesto que su membrana tiene que formar un pliegue y separarse de la membrana del orgnulo fuente. b) Elementos del citoesqueleto paratransportar las vesculas desde el orgnulo fuente hasta el diana. c) Un complejo molecular para permitir a la vescula reconozcer y fusionarse con el orgnulo diana. Vamos a tratar por separado cada uno de estos procesos. Hay que tener en cuenta que en un mismo orgnulo se pueden producir tanto salida como llegada de vesculas como es el caso de la membrana plasmtica, donde endocitosis y exocitosis se dan de forma simultnea. Formacin de vesculas La formacin de una vescula en un compartimento fuente es un proceso complejo. Participan numerosas molculas: las que delimitan el sitio de formacin de la vescula, las que seleccionan a las molculas que tienen que ser transportadas, las que participan

en la formacin y escisin de la propia vescula, las que permiten posteriormente deshacerse de las protenas de recubrimiento, etctera. En levaduras se estima que ms de 65 protenas diferentes intervienen en el proceso formacin de una vescula.

El proceso de formacin vesicular supone una serie de pasos antes de que sus molculas formen parte de la vescula (modificado de Weinberg y Drubin 2012)

La formacin de una vescula es un proceso ordenado de reclutamiento de molculas. Aquellas denominadas recubiertas, como las recubiertas por clatrina, COPI y COPII, son los procesos mejor conocidos. La formacin de una vescula recubierta se inicia mediante el reclutamiento de protenas Arf/Sar a la membrana del orgnulo fuente. Sin embargo, no se sabe cmo se inicia el proceso, ni cmo se selecciona el lugar de la membrana donde tendr lugar. Las protenas Arf/sar son pequeas molculas que se activan e inactivan mediante la hidrlisis del GTP. Cuando las molculas Arf/sar son activadas en la membrana del orgnulo fuente se encargan de reclutar a otras protenas como las protena adaptadoras, las cuales seleccionan a las protenas que debern incorporarse en la vescula y que se denominan cargas. Las protenas adaptadoras son capaces de reconocer secuencias sealen los dominios citoslicos de las protenas transmembrana que a su vez reconocern a las protenas del lmen del orgnulo fuente que deben ser transportadas. Por ejemplo, en las vesculas de exocitosis constitutiva deben viajar protenas hacia la matriz extracelular, as como receptores transmembrana que deben quedar en la membrana plasmtica. Este conjunto inicial de protenas se asocian formando agregados en la membrana. Cuando estos alcanzan una concentracin crtica se dispara el reclutamiento de otras protenas que formarn la parte interna de la cubierta de la vescula. A este momento se le llama punto de transicin, y una vez alcanzado la vescula se formar. Si no se pasa el punto de transicin las molculas que forman los agregados iniciales pueden volver a segragarse en la membrana. Tras la agregacin de las protenas de la cubierta interna se asocian protenas de la cubierta externa. Entre las protenas de la cubierta externa estn aquellas que permiten entrelazar todas el entramado existente, servir de centros de nucleacin de actina o permitir desnudar a la vescula de estas cubiertas tras la escisin. Cuando las protenas de la cubierta externa llegan es cuando la curvatura de la membrana empieza a ser visible. Curvar la membrana de una vescula y escindirla del compartimento fuente es un proceso coordinado que requiere energa y la participacin de varias protenas. Por ejemplo, hay protenas que se insertan en una monocapa de la membrana gracias a unas secuencias de aminocidos denominadas BAR que son capaces de generar curvatura en diferentes momentos de la formacin de la vescula. La polimerizacin de filamentos de actinay la accin de la miosina son tambin necesarios para generar fuerzas motoras que

ayudan en la protusin y posteriormente en la escin de la vescula. La escisin o la independencia fsica de la vescula respecto al compartimento fuente requiere de curvatura, fuerza motora, pero tambin de otras protenas, denominadasdinaminas, que estrangulan la comunicacin membranosa entre el compartimento diana y la vescula. Tras la escisin todas las protenas que envuelven a la vescula son liberadas y devueltas al citosol para realizar un nuevo ciclo con la formacin de una nueva vescula. Viaje Tras la separacin del compartimento fuente la vescula es dirigida hacia el compartimento diana. Este viaje est mediado por protenas motoras y elementos del citoesqueleto, tanto filamentos de actina como microtbulos. Se han descubierto que los filamentos de actina forman uno haces, denominados cables de actina, que tienen uno de sus extremos en las proximidades de los lugares de endocitosis y el otro orientado hacia el interior de la clula, y que parecen ser importantes para el trasiego de vesculas de endocitosis. Fusin de vesculas El mecanismo de fusin de una vescula con su compartimento diana es complejo. Ha de ser selectivo puesto que la clula ha de asegurarse de que una vescula slo se fusiona con aquel compartimento para el que las molculas que transporta han sido destinadas. Pero adems, abrir y fusionar membranas supone saltar una barrera termodinmica importante. Esto se hace en pasos sucesivos.

El proceso de fusin vesicular supone una serie de pasos antes de que sus molculas formen parte del compartimento diana. (Modificado de Weinberg y Drubin 2012 ).

El primer paso es un reconocimiento inicial (en ingls: "tethering"). Es como si se pescara a la vescula desde el compartimento diana. Esta "caa" est formada por unos complejos proteicos asociados a las membranas del compartimentos diana. Hay distintos tipos, como COG, CORVET, Dsl1, exocysto, GARP/VFT, HOPS/Class C VPS, TRAPPI y TRAPPII, que se distribuyen de forma selectiva en distintos compartimentos. En este reconocimiento tambin participan las protenas Rab que se encuentran asociadas a las vesculas y que son de distinto tipo dependiendo del compartiemento o dominio del compartiemento fuente donde se hayan formado. Este reconocimiento inicial es esencial para la especificidad de la fusin entre las vescula y el compartimento fuente. Posteriormente sigue la fusin de las membranas de la vescula y del compartimento fuente. Para ello han de participar las protenas transmembrana SNARE. Hay dos tipos: v-SNARE y t-SNARE. Las v-SNARE se incorporan en la vescula durante su formacin en el compartimento fuente y las t-SNARE se encuentran en las membranas del compartimento diana. La interaccin entre v-SNARE y t-SNARE provoca un acercamiento de las membranas de la vescula y del compartimento diana, liberando adems la energa necesaria para la fusin de ambas membranas. Sin embargo, otras protenas parecen cooperar con las protenas SNARE para

provocar la fusin de ambas membranas, que es un proceso termodinmicamente desfavorecido. Antes se pensaba que las protenas SNARE eran necesarias para el reconocimiento entre vescula y compartimento pero reconocimiento inicial y fusin de membranas son procesos independientes. Hay que tener en cuenta que la fusin entre membranas celulares no siempre involucra a una vescula y a un compartimento diana. Se producen fusiones entre compartimentos semejantes como ocurre con los endosomas, las mitocondrias o incluso entre vesculas. Se cree que todos estos casos se siguen mecanismos parecidos con implicacin de molculas similares.

Importacin y exportacin de molculas al ncleo El transporte ncleo / citoplasmtico es realizado mediante una familia de transportadores-receptores que interaccionan tanto con la carga a transportar como con el complejo nuclear de poro. Una clase esta constituida por las importinas y exportinas. Se conocen (por el momento) unas nueve importinas y cinco exportinas, cada una de las cuales reconoce una seal de transporte diferente. El transporte mediado por importinas y exportinas depende de una seal en la molcula a ser transportada. Ejemplos de esta son la seal de localizacin nuclear o NLS (del ingls: nuclear localization signal) que es encontrada en numerosas protenas dentro del ncleo seal de exportacin nuclear o NES (del ingls: nuclear export signal ), mediadoras de la salida del ncleo Esta forma de transporte se lleva a cabo cuando molculas mas grandes que el poro deben entrar al ncleo. El poro se puede dilatar ( hasta 26 nm) cuando recibe la seal apropiada. ( la seal est en una secuencia de los pptidos y estas son secuencias ricas en lisina, arginina y prolina). La pequea molcula Ran-GTP es la que impone la direccionalidad al transporte. Se encuentra presente en grandes concentraciones solo en el ncleo donde disocia el complejo de importacin constituido por la carga + importina (ver la fig. Ciclo de importacin hacia el ncleo) y estabiliza en complejo de exportacin (ver la fig. Ciclo de exportacin desde el ncleo). La transformacin cclica de la Ran es regulada por dos pequeas protenas, y genera un gradiente Ran-GTP/ Ran GDP a ambos lados de la envoltura nuclear que es mantenido por : el factor de intercambio de guanina (RCC1), localizado en el ncleo, que convierte el Ran-GDP en Ran-GTP (ver la fig. Ciclo de exportacin desde el ncleo). la Ran-Gap ( GTPasa) de localizacin citoplasmtica, que convierte el Ran-GTP en Ran- GDP (ver la fig. Ciclo de exportacin desde el ncleo). Se considera que este gradiente motoriza el movimiento de molculas de transporte de carga a travs del del complejo nuclear de poro . La Ran regula el transporte en razn de que se puede unir selectivamente a diferentes factores de transporte ("shuttle") los cuales a su vez vehiculizan las macromolculas.
El retculo endoplasmtico es un complejo sistema de membranas dispuestas en forma de sacos aplanados y tbulos que estn interconectados entre s compartiendo el mismo espacio interno. Sus membranas se continan con las de la envuelta nuclear y se pueden extender hasta las proximidades de la membrana plasmtica, llegando a representar ms de la mitad de las membranas de una clula. Debido a que los cidos grasos que las componen suelen ser ms cortos son ms delgadas que las dems. El retculo organiza sus membranas en regiones o dominios que realizan diferentes funciones. Los dos dominios ms fciles de distinguir son el retculo endoplasmtico rugoso, con sus membranas formando tbulos ms o menos rectos, a veces cisternas aplanadas, y con numerosos

ribosomas asociados, y el retculo endoplasmtico liso, sin ribosomas asociados y con membranas organizadas formando tbulos muy curvados e irregulares. La membrana externa de la envuelta nuclear se puede considerar como parte del retculo endoplasmtico puesto que es una continuacin fsica de l y se pueden observar ribosomas asociados a ella realizando la traduccin. El retculo endoplasmtico rugoso y el liso suelen ocupar espacios celulares diferentes como ocurre en los hepatocitos, en las neuronas y en las clulas que sintetizan esteroides. Sin embargo, en algunas regiones del retculo no existe una segregacin clara entre ambos dominios y se aprecian reas de membrana con ribosomas mezcladas con otras sin ribosomas. La disposicin espacial del retculo endoplasmtico en las clulas animales depende de sus interacciones con los microtbulos, mientras que en las vegetales son los filamentos de actina los responsables.

El retculo endoplasmtico se extiende por toda la clula, llegando hasta las proximidades de la membrana plasmtica. Existe una continuidad entre el retculo endoplasmtico rugoso y el liso. El rugoso forma cisternas a las que se adhieren ribosomas, mientras que el liso forma un entramado de tbulos.

Retculo endoplasmtico rugoso

El dominio rugoso del retculo endoplasmtico se caracteriza por organizarse en una trama de tbulos alargados o sacos aplanados y apilados, ms o menos regulares en su forma, con numerosos ribosomas asociados a sus membranas. La cantidad de ribosomas asociados a sus membranas condiciona la forma de este orgnulo, de tal manera que cuando el nmero de ribosomas asociados aumenta los tbulos se expanden adoptando la forma de cisternas aplanadas. Esta morfologa es claramente visible en imgenes tomadas con el microscopio electrnico de las clulas secretoras de protenas, las cuales tienen el retculo endoplasmtico muy desarrollado.

Imagen tomada con el microscopio electrnico de transmisin de una neurona. Se observan las cisternas de retculo endoplasmttico rugoso que se

extienden desde la envuelta nuclear hasta las proximidades de la membrana plasmtica. Los ribosomas aparecen como bolitas negras asociadas a sus membranas. Obsrvese que tambin hay ribosomas asociados la membrana externa de la envuelta nuclear.

La principal misin del retculo endoplasmtico rugoso es la sntesis de protenas que irn destinadas a diferentes lugares: el exterior celular, el interior de otros orgnulos que participan en la ruta vesicular, como los lisosomas, o que formarn parte integral de las membranas, tanto plasmtica como de otros orgnulos de la ruta vesicular. Adems, el retculo endoplasmtico rugoso tiene que sintetizar protenas para s mismo, denominadas protenas residentes. Las protenas integrales de la membrana plasmtica se sintetizan en el retculo endoplasmtico. Hay que tener en cuenta que las protenas sintetizadas en el retculo que van destinadas a orgnulos concretos de la ruta vesicular deben tener unas secuencias de aminoidos o modificaciones especficas (actuarn como seales) para que cuando lleguen a la zona de reparto del aparato de Golgi sean reconocidas y dirigidas a sus compartimentos diana correspondientes. Cualquier protena que se secrete o que forme parte de los orgnulos o compartimentos de la ruta vesicular empieza su proceso de sntesis en el citosol pero terminar en el interior de una cisterna del retculo o formando parte de sus membranas. El proceso comienza con la unin de los ARNm, localizados en el citosol, unindose en primer lugar a una subunidad pequea ribosomal y posteriormente a una subunidad grande ribosomal para comenzar la traduccin. Lo primero que se traduce de estos ARNm es una secuencia inicial de nucletidos a partir de la cual se sintetiza una cadena de unos 70 aminocidos denominada pptido seal. Una molcula conocida como SRP (sequence recognizing particule), que es una mezcla de 7 ARNs y 6 polipptidos, reconoce al pptido seal y enlentece el proceso de traduccin. El complejo formado por ribosoma, ARNm, pptido seal ms SRP difunde por el citosol hasta chocar con las membranas del retculo endoplasmtico, a las cuales se une gracias a la existencia de un receptor de membrana que reconoce al SRP. Todo el complejo anterior interacciona con un translocador, que es una protena integral que forma un canal por el cual penetra la cadena polipeptdica naciente hacia el interior de la cisterna del retculo endoplasmtico. El pptido seal queda unido altranslocador mientras que el resto de la cadena que se va traduciendo y liberando hacia el interior. Una peptidasa presente en el retculo escinde el pptido seal del resto de la cadena de aminocidos, quedando sta libre en el interior. Una vez completada la sntesis, la cadena de aminocidos adopta su conformacin tridimensional y el ribosoma se libera de la membrana. Si la protena que se est sintetizando es una protena integral de membrana no ser liberada al interior del retculo. En estos casos las protenas nacientes tienen cadenas de aminocidos hidrfobos que cuando se traducen facilitan su insercin directamente entre los cidos grasos de la membrana gracias a la accin del translocador. El proceso es muy complejo y diverso para los diferentes tipos de protenas integrales puesto que en un receptor con siete cruces de membrana tienen que alternarse secuencias que han de insertarse en la membrana con otras que quedan bien en el lado citoslico o bien en el interior de la cisterna del retculo endoplasmtico. Slo en raras ocasiones el retculo importa protenas que se sintetizan completamente en el citosol gracias a ciertos transportadores presentes en su membrana. Las protenas que se sintetizan en los ribosomas adosados a la membrana del retculo endoplasmtico son modificadas conforme van siendo sintetizadas. a) Hay una glucosilacin (N-glucosilacin) de los aminocidos asparragina. stos recibirn un complejo de 14 azcares en su radical, que son transferidos desde un lpido embebido en la membrana denominado dolicol fosfato, perdindose algunos de estos azcares en procesos posteriores. b) Se da hidroxilacin slo en algunas protenas, sobre todo en aquellas que van a formar parte de la matriz extracelular. Aqu se hidroxilan los aminocidos prolina y lisina, dando hidroxiprolina e hidroxilisina, que formarn parte del colgeno. c) Algunas protenas asociadas a la membrana plasmtica estn unidas covalentemente a lpidos de la membrana, esta unin tambin se produce en este compartimento. En el retculo endoplasmtico se produce un control de la calidad de las protenas sintetizadas, de modo que aquellas que tienen defectos son sacadas al citosol y eliminadas. Existen unas protenas denominadaschaperonas que juegan un papel esencial en el plegamiento y maduracin de las protenas recin sintetizadas. Son tambin ellas las encargadas de detectar errores y marcar las protenas defectuosas para su degradacin. Otras protenas con dominios tipo lectina, reconocen determinados azcares y comprueban la adicin correcta de glcidos.

Formacin y fusin de vesculas.

Como dijimos, las protenas que se sintetizan en el retculo endoplasmtico terminan en varios posibles destinos: en el exterior celular mediante un proceso de secrecin, el interior o en la membrana de alguno de los compartimentos de la ruta vesicular como el

aparato de Golgi, los endosomas o los lisosomas. Sin embargo, algunas tienen su funcin en el propio retculo endoplasmtico, son las denominadas protenas residentes. Hemos nombrado algunas como las chaperonas, ciertas glusosidasas, el receptor para el SRP, el propio translocados, etctera. Para ser retenidas en el retculo deben poseer una secuencia de cuatro aminocidos concrfetos localizados en el extremo carboxilo (-COOH). Retculo endoplasmtico liso Es un entramado de tbulos membranosos interconectados entre s y que se continan con las cisternas del retculo endoplasmtico rugoso. No tienen ribosomas asociados a sus membranas, de ah el nombre de liso, por tanto la mayora de las protenas que contiene son sintetizadas en el retculo endoplasmtico rugoso. Es abundante en aquellas clulas implicadas en el metabolismo de grasas, detoxificacin y almacn de calcio. El retculo endoplasmtico liso est involucrado en una serie de importantes procesos celulares de los que se pueden destacar: Sntesis lipdica Las membranas del retculo endoplasmtico liso producen la mayora de los lpidos requeridos para la elaboracin de las nuevas membranas de la clula, incluyendo glicerofosfolpidos y colesterol. Gran parte de la sntesis de los esfingolpidos se lleva a cabo en el aparato de Golgi, pero su estructura bsica, la ceramida, se sintetiza tambin en el retculo. En realidad, en las membranas del retculo no se realizan todos los pasos de la sntesis de los lpidos de las membranas. Los cidos grasos se sintetizan en el citosol y son insertados posteriormente en las membranas del retculo endoplasmtico liso donde son transformados en glicerofosfolpidos. Esta sntesis la realizan protenas de membrana que tienen sus centros activos orientados hacia el citosol y por tanto los lpidos estarn inicialmente en la hemicapa citoslica de la membrana. Como el cambio pasivo de los lpidos entre hemicapas, o movimiento "flipflop", es difcil por el ambiente hidrfobo de las cadenas de cidos grasos de la membrana, para que algunos de ellos lleguen a la hemicapa interna desde la externa se requiere la existencia de transportadores de lpidos denominados "flipasas". Estos transportadores son inespecficos, es decir, transportan cualquier tipo de lpido entre las dos hemicapas y el transporte es independiente de ATP. Se propone entonces que la sntesis de lpidos en el retculo endoplasmtico no crea asimetra de membrana, sino que sta se producir en otros orgnulos de la ruta vesicular. Por ejemplo, los azcares que formarn los glucolpidos se ensamblan en el interior del aparato de Golgi, y no sern expuestos al citosol, creando por tanto asimetra. Adems, en el aparato de Golgi, as como en otros orgnulos como los endosomas, s existen transportadores especficos de lpidos que crean asimetra. Por tanto, en cuestin de lpidos, la localizacin asimtrica de stos en las membranas no depende del retculo endoplasmtico.

Esquema de los caminos propuestos para el transporte de lpidos desde el retculo endoplasmtico hasta otras membranas celulares: en vesculas y mediante transportadores.

El colesterol es otro importante componente de las membranas, sobre todo de la plasmtica, que se sintetiza mayoritariamente en el retculo endoplasmtico liso. Desde aqu es transportado por la va vesicular o por transportadores proteicos solubles. Por ejemplo, las levaduras, que poseen ergosterol en sus membranas en vez de colesterol, usan vas no vesiculares para transportar el ergosterol desde el retculo hasta la membrana plasmtica. Estos transportadores son diversos y sus movimientos son independientes de ATP.

Las mitocondrias y los peroxisomas no forman parte de la ruta vesicular por lo que sus lpidos de membrana deben ser importados. Para ello utilizan los transportadores de lpidos. Por ejemplo, para los glicerofosfolpidos existen unas protenas solubles llamadasintercambiadoras de glicerofosfolpidos que tienen la habilidad de transportarlos a travs del citosol. Los toman en la membrana del retculo endoplasmtico liso y los sueltan en las de estos orgnulos. En las clulas de los tejidos fotosintticos son los cloroplastos los encargados de sintetizar sus propios glicerofosfolpidos y glucolpidos. En el retculo endoplasmtico liso tambin se sintetizan lpidos como los triacilgliceroles que sern almacenados en el propio retculo. Este proceso es muy activo en los adipocitos, clulas que almacenan grasa, con dos funciones: reserva alimenticia y aislamiento trmico. Tambin es el principal responsable de la sntesis de la parte lipdica de las lipoprotenas, de la produccin de hormonas esteroideas y de cidos biliares. Detoxificacin Los hepatocitos, las clulas tpicas del hgado, tienen un retculo endoplasmtico liso muy desarrollado. En l se sintetizan las lipoprotenas que transportarn al colesterol y a otros lpidos al resto del organismo. En sus membranas se encuentran tambin enzimas, como la familia de protenas P450, responsables de la eliminacin de productos del metabolito potencialmente txicos, as como algunas toxinas liposolubles incorporadas durante la ingesta. La superficie de membrana del retculo se adapta a la cantidad de enzimas detoxificadoras sintetizadas, la cual depende a su vez de la cantidad de txicos presentes en el organismo. Defosforilacin de la glucosa-6 fosfato. La glucosa se suele almacenar en forma de glucgeno, fundamentalmente en el hgado. Este rgano es el principal encargado de aportar glucosa a la sangre, gracias a la regulacin llevada a cabo por las hormonas glucagn e insulina. La degradacin del glucgeno produce glucosa-6-fosfato que no puede atravesar las membranas y por tanto no puede abandonar las clulas. La glucosa 6-fosfatasa se encarga de eliminar ese residuo fosfato, permitiendo que la glucosa sea transportada al exterior celular. Reservorio intracelular de calcio Las cisternas del retculo endoplasmtico liso estn tambin especializadas en el secuestro y almacenaje de calcio procedente del citosol. Este calcio puede salir de forma masiva en respuesta a seales extra o intracelulares gracias a cascadas de segundos mensajeros. Un ejemplo destacable es el retculo sarcoplsmico (nombre que recibe el retculo endoplasmtico liso en las clulas musculares) que secuestra calcio gracias a una bomba de calcio presente en sus membranas. El secuestro y la salida de calcio desde el retculo sarcoplsmico se produce en cada ciclo de contraccin de la clula muscular.