Laboratorio de Microbiologa General I 1 Informe del Examen Prctico Escribir dentro de las zonas sombreadas y no modificar el formato

Nombre:

Urbina Soto Jonathan Uriel

Equipo: 6 Cepa # 35

I. Descripcin del tratamiento de la muestra1 Se eligi la cepa al azar, se observaron las caractersticas del medio lquido sin agitar el tubo, se observ que el medio (caldo) era turbio y ligeramente opaco, haba un precipitado abundante en el fondo y una ligera nata en la superficie del tubo.

Tubo cepa no. 35

Se tomaron tres azadas, una del precipitado del fondo, otra de la nata de la superficie del tubo para realizar 2 frotis para la tincin de Gram, posteriormente se agit el tubo para homogenizar el medio. Se realizo la tincin de Gram, se observaron las muestras al microscopio, primero con objetivo 10X y 40X para identificar las bacterias, despus con objetivo 100X y con aceite de inmersin se observo morfologa bacteriana para ambos frotis. Se identificaron streptobacilos Gram (-) delgados y cortos con disposicin en cadenas cortas y bacilos Gram (+) de tamao pequeo y sin disposicin alguna. Eleccin de los medios de cultivo: con base a la morfologa identificada en los frotis de tincin de Gram se sembr en agar nutritivo para poder aislar y ver la morfologa colonial de ambas bacterias, agar sal y manitol para comprobar el gnero de la bacteria Gram (+) que si es Bacillus no se encontrara crecimiento alguno, se utilizo ASC 5 % para observar algn posible tipo de hemolisis, agar SS para identificar una posible especie de ese gnero y EMB para aislar a los streptobacilos Gram (-). Todos los medios se incubaron a 37C por 24 horas.
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Realizar una descripcin de cada una de las actividades efectuadas durante el examen prctico, fundamentando cada una de las decisiones.

Laboratorio de Microbiologa General I 2 Informe del Examen Prctico Se observo la morfologa colonial de cada medio de cultivo, en agar nutritivo se diferenciaron las bacterias negativas de las positivas por su color de la colonia que fue rosa claro de las positivas que no presentaron color alguno, en agar sal y manitol no hubo crecimiento como se esperaba, en ASC 5% hubo crecimiento sin mostrar hemolisis alguna. Para el medio SS hubo crecimiento y se logro aislar colonias; por ultimo en agar EMB hubo crecimiento abundante, las colonias presentaron coloracin rosa claro con un centro negro. Dados los resultados observados en la tincin de Gram y en los medios de cultivo se eligieron las siguientes PBQ Gram (+) Gelatina nutritiva ( se utiliza para saber si es capaz de producir proteinasas (gelatinasas) CRF + lactosa (saber si es fermentador de lactosa) CRF + sacarosa (saber si es fermentador de sacarosa) RMVP (capacidad para mantener los productos cidos de la fermentacin y observar si es capaz de producir acetoina) MIO (observar si posee motilidad, produccin de indol y ornitina)

Otras PBQ Catalasa (saber si es productor de la enzima catalasa) Tincin de esporas (Schaeffer- Fulton). Identificar al gnero Bacillus productor de esporas. Gram (-) Caldo nitrato (observar si es capaz de utilizar el nitrato como aceptor final de electrones, respiracin anaerobia) CRF + lactosa (saber si es fermentador de lactosa) RMVP(capacidad para mantener los productos cidos de la fermentacin y observar si es capaz de producir acetoina) TSI (fermentacin de monosacridos y disacridos) LIA (observar si es capaz de desaminar la lisina y/o descarboxilar) Citrato de Simmons (saber si es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono) MIO (observar si tiene motilidad, produce indol y ornitina) Urea de Christensen (observar si produce ureasa)

Otras PBQ Catalasa (saber si es productor de la enzima catalasa) Todas las PBQ fueron inoculadas, para las Gram positivas se tomaron colonias aisladas del AN y para las Gram negativas se tomaron colonias aisladas de agar EMB. Se incubaron A 37 C por 24 horas.

Laboratorio de Microbiologa General I 3 Informe del Examen Prctico Posterior a las 24 horas se procedi a leer e interpretar las pruebas utilizando los reactivos propios para cada prueba que los requiriera, se tomo nota de los resultados. II. Resultados PQB Gram positivo (presuntible a Bacillus cereus) Prueba bioqumica CRF + lactosa CRF + sacarosa Gelatina nutritiva RMVP MIO Resultados + + M (+) O (-) Catalasa + *Tincin de esporas *Prueba + especial Bibliografa + + V + +

Gram negativo (presuntible a Klebsiella pneumoniae) Prueba bioqumica Resultado Agar almidn + Urea de Christensen + Caldo nitrato + O- F manitol + MIO M (+) Indol (-) Ornitina (-) RMVP TSI A/A

RF + lactosa LIA Citrato de Simmons Gelatina nutritiva Catalasa Agar almidn

+ A + +

Bibliografa + + + M (-) Indol (-) Ornitina (-) A/A : Produccin de gas Fermentacin de lactosa y glucosa + A + +

III.

ndice de Kappa

Para Bacillus cereus: 6 pruebas positivas/ 7 pruebas realizadas x 100 = 85.7 %

Laboratorio de Microbiologa General I 4 Informe del Examen Prctico Para Klebsiella pneumaniae: 9 pruebas positivas / 10 pruebas realizadas x 100 = 90 %

IV.

Discusin

En base a los resultados obtenidos en las pruebas bioqumicas realizadas al tubo con las cepas a identificar se tiene que: Para Gram (+)se realizaron una tincin especial de esporas por el mtodo de Schaeffer- Fulton, esta tincin se utiliza para la identificacin de los genero Bacillus sp y algunas especies de Clostridium sp , se utiliza verde de malaquita y safranina y se efecta por emisin de vapores para que el colorante primario pueda introducirse a la clula de la cual hasta el 15 % de la endoespora consiste en Calcio en la base, el cido dipicolinico es el responsable de la resistencia trmica de la espora, el Calcio puede ayudar a la resistencia al calor y contra algunos agentes oxidantes. En el frotis que se realizo se pudieron observar esporas de color verde. CRF + carbohidratos (lactosa, sacarosa): en esta prueba se evalu la capacidad de los m.o de degradar un carbohidrato especifico incorporado a un medio basal para producir acido y gas por medio de la fermentacin, esta es importante ya que es un proceso metablico anaerobio de oxido- reduccin donde el aceptor final de electrones no es el Oxigeno. En el caso del bacilo Gram (+) fue positiva la prueba para lactosa y sacarosa, para el m.o Gram (-) fue positiva la prueba en la cual se esperaba este resultado. Gelatina nutritiva: se basa en la produccin de enzimas gelatinasas que son de origen proteoltico por algunos microorganismos que licuan la gelatina; esta prueba dio positiva para ambas bacterias. RMVP: En esta prueba se basa en la deteccin de acetona como producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. sta es metabolizada en cido pirvico, intermediario clave en la gluclisis. A partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir muchas vas. La produccin de acetona que es uno de los ciclos para la degradacin de la glucosa en las bacterias. La formacin de acetona y butilenglicol es una va alternativa del metabolismo del cido pirvico. Las bacterias que utilizan esta va producen solo pequeas cantidades de cidos mixtos que son insuficientes en el caso de rojo de metilo La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH para determinar la concentracin de iones hidrgeno presentes cuando un organismo fermenta glucosa. Las bacterias RM positivas producen cidos estables manteniendo una alta concentracin de iones Hidrgeno hasta alcanzar cierta concentracin y entonces cesa toda actividad. La prueba dio negativa para ambas bacterias. MIO: Esta prueba es utilizada para la identificacin de enterobacterias, se fundamenta en la produccin de indol por la aportacin de triptfano por parte de la tripteina, este aminocido es el sustrato de la enzima triptofanasa, la ornitina evidencia la presencia de la enzima ornitinasa,

Laboratorio de Microbiologa General I 5 Informe del Examen Prctico tambin se evala la movilidad de los m.o; ambas bacterias dieron positivo para la motilidad y negativo para indol y la ornitina. TSI: En esta prueba el medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentracin diez veces mayor de lactosa: Las enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa estn presentes como constituyentes de las bacterias, y estas pueden obtener mayor energa por utilizacin del azcar ms simple. La bacteria Gram (-) fermento glucosa y lactosa ya que tanto el pico de flauta como el fondo se tornaron color amarillo. LIA : En el agar Hierro lisina se determino la capacidad para descarboxilar la lisina, se produce la amina cadaverina que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador a color violeta. La produccin de H2S se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de Sulfuro de Hierro. La descarboxilacin de la lisina tiene lugar en un medio acido, por lo que es necesario que la glucosa sea fermentada previamente; los m.o que no producen lisina descarboxilasa pero que sean fermentadores de glucosa producen un viraje de la totalidad del medio a color amarillo. En el caso de la bacteria Gram (-) hubo fermentacin de la glucosa lo que dio origen a un medio acido, la bacteria no posee la enzima lisina descaboxilasa por lo que el medio viro a color amarillo en su totalidad. Citrato de Simmons: Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo; provocando la alcalinizacin del medio. Estas caractersticas se dan en los siguientes gneros de enterobacterias: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. La bacteria presuntiva (Klebsiella pneumoniae) dio positiva a esta prueba. Urea de Christensen: aqu se determin la capacidad del m.o para desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por la accin de la enzima ureasa produciendo un cambio de color rojo en el medio. La hidrlisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dar dos molculas de amoniaco. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicin de los compuestos orgnicos. La bacteria Gram (-) produjo un vire a color rosa claro lo cual indica un resultado positivo y se denota con una sola cruz (+). Agar almidn : Este medio es adecuado para determinar la capacidad de un microorganismos de producir la enzima amilasa, se puede utilizar en medio de caldo, agar en placa o en pico de flauta en tubo, dependiendo del m.o a evaluar. La bacteria dio un resultado positivo ya que viro a color purpura el medio al agregarle el lugol, se observaros los halos transparentes alrededor de las colonias presentes. Caldo nitrato: Esta prueba se fundamenta en la reduccin de nitrato en nitrito y en gas nitrgeno tiene lugar generalmente en condiciones anaerobias, en las cuales un organismo obtiene Oxgeno

Laboratorio de Microbiologa General I 6 Informe del Examen Prctico a partir del nitrato. El Oxgeno sirve como un aceptor de Hidrgeno, en este caso las dos cepas dieron positivas a la reduccin de nitratos, la bacteria dio positiva a esta prueba. Catalasa: Se basa en la presencia de la enzima catalasa, es una prueba rpida pero importante ya que la mayora de los gneros son catalasa positivos y las excepciones a esta prueba pueden ser de gran ayuda para lograr su identificacin bioqumica. Adems esta enzima se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo (excepto Streptococcus sp), esto hace que no puedan descomponer el perxido de Hidrgeno. Ambas bacterias a evaluar son catalasa (+). V. Conclusin Con base a los resultados obtenidos en las tinciones, morfologa colonial y pruebas bioqumicas realizadas a la mezcla de las dos bacterias que se proporcionaron se sospecha que: La bacteria Gram (+) tiene caractersticas morfolgicas propias del gnero bacillus, ya que son bacilos alargados, cortos sin disposicin alguna, produce esporas y se comparo con la especie B. cereus por las 6 pruebas positivas que concuerdan con las de esta especie, cabe destacar que las condiciones en las que se llevo a cabo este examen prctico no fueron en su totalidad las adecuadas; los factores como el rea de trabajo, temperatura, corrientes de aire y el estado de los medios de cultivo y reactivos puede influir en los resultados variando en n nmero de pruebas. As mismo como el manejo de la muestra problema al momento de inocular, sembrar e incubar. Sin embargo el trabajo realizado durante el examen se sigui conforme a las instrucciones correspondientes y mtodos establecidos.*Algo muy importante podra ser el nmero de pruebas realizadas al microorganismo a identificar ya que existen al menos 6 pruebas ms para un bacilo Gram (+).

Bacteria Gram (-): Por sus caractersticas morfolgicas (streptobacilos en forma de cadena corta y empalizada), morfologa colonial y pruebas bioqumicas la bacteria es presuntiva para Klebsiella pneumoniae ya que es una enterobacteria capaz de crecer en al agar Salmonella Shigella, en el agar EMB Y agar nutritivo tuvo una coloracin roscea y consistencia cremosa tpica del genero Klebsiella; los resultados de las pruebas bioqumicas y del ndice de Kappa dan un porcentaje del 90 % de confiabilidad para este dictamen. Es importante mencionar que algunas pruebas (medios semislidos) estaban en mal estado y esto pudo afectar en cierto porcentaje los resultados obtenidos.

Las pruebas bioqumicas se basan en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas enzimas (catalasas, coagulasas, descarboxilasas, desaminasas, ureasas, peroxidasas, etc.) involucradas en el metabolismo bacteriano, pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que

Laboratorio de Microbiologa General I 7 Informe del Examen Prctico contienen los sustratos sobre los cuales ellas actan, junto con un sistema indicador que va a poner de manifiesto la degradacin del sustrato o la presencia de un metabolito especifico (ac. lctico, indol, ac. Succnico, etc.). Las pruebas evalan bioqumicas tambin evalan: la capacidad de reducir ciertos iones (nitrato a nitrito), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la produccin o no de hemolisinas, el requerimiento o no de algunos factores especiales (protenas sricas), la produccin o no de algunas toxinas con capacidad virulenta (toxina diftrica, toxina botulnica, etc.).

Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso infeccioso, stas deben ser identificadas hasta llegar a GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su actividad bioqumica o metablica. Del microorganismo aislado depender el tipo de tratamiento que debe ser administrado al paciente. Las enterobacterias son las responsables del 50% de todos los aislamientos clnicamente significativos, producen el 50% de los casos de septicemia, del 60 al 70% de la enteritis bacterianas, el 90% de las infecciones urinarias. Son causa importante de infeccin nocosomial.

VI.

Referencias2 Elmer W. Koneman, M.D. Diagnostico Microbiolgico. Buenos aire-Bogot-Mxico-Caracas. Editorial Panamericana 2003. Jean F. Mac. Faddin, pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Mxico, Editorial Panamericana 1993. Anexos3 Tincin de Gram.

VII.

Tincin de Gram. Bacilos Gram positivos y Bacilos Gram negativos

2

Escritas de manera correcta, no importa el estilo (Vancouver, Harvard, APA, etc.) lo importante es que se referencie de manera adecuada. 3 Agregar todas las fotografas en orden cronolgico, incluyendo pie de imagen.

Laboratorio de Microbiologa General I 8 Informe del Examen Prctico

Tincin de esporas por el mtodo de Schaeffer- Fulton. Las esporas se aprecian de color verde Medios de cultivo: crecimiento y aislamiento

Agar nutritivo. Bacterias Gram positivas (color blanco), Gram negativas (color rosa)

Agar EMB. Se observa crecimiento abundante, colonias rosas, buen aislamiento.

Laboratorio de Microbiologa General I 9 Informe del Examen Prctico

Agar Salmonella Shigella. Se observa aislamiento, colonias color rosa intenso.

Agar sal manitol. No hubo crecimiento.

Morfologa colonial. BACTERIA (+) MEDIO DE CULTIVO TAMAO AGAR NUTRITIVO Mediano SAL MANITOL EMB SALMONELLA SHIGELLA Mediana 1 mm Circular Entero Plana ASC 5 % GRAM GRAM (+) GRAM (-) GRAM (-) GRAM (-)

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Grande 2 mm

Pequeo 0.5 mm Irregular Ondulado Convexa

FORMA BORDE ELEVACIN

Circular Entero Convexa

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Circular Entero Plana

Laboratorio de Microbiologa General I 10 Informe del Examen Prctico COLOR DE LA COLONIA Blancas transparent es Translucida Opaca Pastosa --Rosa intenso Rosa transparente Rosa transparente

LUZ TRANSMITIDA LUZ REFLEJADA TEXTURA O CONSISTENCIA OTRAS CARACTERISTICAS

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Opaca Opaca Cremosa

Translucida Opaca Cremosa

Opaca Opaca cremosa

Crecimiento abundante

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Crecimiento abundante

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Pruebas bioqumicas. Gram positivo CRF + lactosa Imagen Gram negativo CRF + lactosa Imagen

CRF + sacarosa

CRF + sacarosa

Gelatina nutritiva

Gelatina nutritiva

RMVP

RMVP

Laboratorio de Microbiologa General I 11 Informe del Examen Prctico MIO MIO

Catalasa ---

Hubo burbujeo en el portaobjetos ---

Catalasa Urea de Christensen

Hubo burbujeo en el portaobjetos.

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Caldo nitrato

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O- F manitol

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TSI

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LIA

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Citrato de Simmons

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Agar almidn

Laboratorio de Microbiologa General I 12 Informe del Examen Prctico VIII. Nombre de las Cepas identificadas Bacteria Gram (+) presuntivo a Bacillus cereus Bacteria Gram (-) presuntivo a Klebsiella pneumoniae