TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

CUPRINS
Capitolul 1. Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. Caracteristicile proceselor biotehnologice Fazele unui proces biotehnologic Sinteza schemelor tehnologice de prelucrare n aval de bioreactor Criterii principale pentru o prelucrare eficient n aval de bioreactor 1 3 7 7 15 18 18 21 24 24 26 27 35 35 38 44 44 46 47 48 48 49 51 52 53 53 i

Capitolul 2. Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie 2.1. Condiionarea lichidului de fermentaie prin floculare i coagulare 2.2. Separarea prin sedimentare gravitaional 2.3. Separarea prin filtrare 2.3.1. Mecanismul filtrrii 2.3.2. Teoria filtrrii. Posibiliti de mbunatire a filtrrii 2.3.3. Alegerea i dimensionarea echipamentelor de filtrare 2.4. Separarea prin centrifugare 2.4.1. Bazele teoretice ale sedimentrii n cmp de fore centrifugal 2.4.2. Tipuri de centrifuge utilizate n procesele de bioseparare 2.4.3. Aplicaii ale separrii centrifugale n biotehnologii 2.4.3.1. Separarea drojdiilor 2.4.3.2. Separarea bacteriilor 2.4.3.3. Separarea celulelor animale 2.4.3.4. Separarea resturilor celulare 2.4.3.5. Recuperarea i splarea corpilor de incluziune 2.4.3.6. Fracionarea plasmei umane 2.5. Separarea prin microfiltrare 2.6. Centrifugare sau microfiltrare ? Capitolul 3. Dezagregarea masei celulare 3.1. Susceptibilitatea la rupere a celulelor

Cuprins 3.1.1. Celule animale 3.1.2. Celule vegetale 3.1.3. Fungii i drojdii 3.1.4. Bacterii 3.2. Metode de dezagregare a celulelor 3.2.1. Metode mecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor 3.2.1.1. Forfecarea lichidului cu ajutorul ultrasunetelor 3.2.1.2. Forfecarea lichidului prin agitare mecanic 3.2.1.3. Forfecarea lichidului prin presurizare 3.2.1.4. Forfecarea fazei solide prin mcinare 3.2.1.5. Forfecarea fazei solide prin presurizare 3.2.2. Metode nemecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor 3.2.2.1. Dezagregarea celulelor prin deshidratare 3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode fizice 3.2.2.3. Permeabilizarea celulelor prin metode chimice 3.2.2.4. Permeabilizarea celulelor prin metode enzimatice 3.3. Influena dezagregrii asupra proceselor ulterioare de separare Capitolul 4. Separarea prin extracie 4.1. Extracia fizic lichid lichid 4.1.1. Aspecte generale privind extracia lichid lichid 4.1.2. Aspecte particulare ale extraciei lichid lichid n bioprocese 4.1.2.1. Solveni de extracie 4.1.2.2. Echipamente de extracie 4.1.2.2.1. Extractoare centrifugale 4.1.2.2.2. Extractoare rotative cu agitare 4.1.2.2.3. Extractoare cu talere pulsate 4.1.2.2.4. Alte echipamente de extracie 4.1.3. Aplicaii ale extraciei lichid lichid n bioprocese 4.1.3.1. Extracia antibioticelor 4.1.3.2. Extracia alcoolilor 4.1.3.3. Extracia acizilor carboxilici 4.2. Extracia n sisteme apoase bifazice 4.2.1. Formarea sistemelor apoase bifazice 4.2.2. Mecanismul extraciei biopolimerilor 4.2.3. Proiectarea procesului de extracie n sisteme apoase bifazice 4.2.4. Aplicaii ale extraciei n sisteme apoase bifazice 4.2.5. Procesul tehnologic de extracie n sisteme apoase bifazice ii 53 54 55 55 57 58 58 59 60 63 66 67 67 67 68 69 71 73 74 74 75 76 77 78 83 84 85 86 88 90 90 92 92 95 98 100 101

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 4.2.6. Recuperarea chimicalelor i reducerea costurilor 4.2.7. Transpunerea la scar a extraciei n sisteme apoase bifazice 4.2.8. Aspecte economice ale extraciei n sisteme apoase bifazice 4.3. Extracia cu micele inverse 4.3.1. Formarea i proprietile micelelor inverse 4.3.2. Mecanismul extraciei n micele inverse 4.3.3. Factorii care influeneaz transferul biomoleculelor n micelele inverse 4.3.4. Reextracia din micele inverse 4.3.5. Procesul tehnologic de extracie cu micele inverse 4.3.6. Aplicaii ale extraciei cu micele inverse 4.3.6.1. Extracia cu micele inverse n prezena masei celulare 4.3.6.2. Izolarea i renaturarea proteinelor 4.3.6.3. Sinteza proteinelor n micele inverse 4.4. Extracia cu afroni 4.5. Extracia reactiv 4.5.1. Mecanismul extraciei reactive 4.5.2. Ageni de extracie 4.5.2.1. Derivai organofosforici 4.5.2.2. Amine cu mas molecular ridicat 4.5.2.3. Compui macrociclici 4.5.2.4. Sinergismul agenilor de extracie 4.5.3. Echipamente pentru extraci reactiv 4.5.3.1. Instalaii cu uniti distincte amestector decantor 4.5.3.2. Extractoare tip coloan fr agitare mecanic 4.5.3.3. Extractoare tip coloan cu agitare mecanic 4.5.3.4. Alte tipuri de extractoare 4.5.4. Extracia reactiv a produilor de biosintez 4.5.4.1. Extracia acizilor carboxilici 4.5.4.1.1. Extracia acizilor carboxilici cu derivai organofosforici 4.5.4.1.2. Extracia acizilor carboxilici cu amine 4.5.4.2. Extracia aminoacizilor 4.5.4.2.1. Extracia aminoacizilor cu derivai organofosforici 4.5.4.2.2. Extracia aminoacizilor cu amine 4.5.4.2.3. Extracia aminoacizilor cu eteri-coroan i calixarene 4.5.4.3. Extracia antibioticelor 4.5.4.4. Alte aplicaii ale extraciei reactive 4.5.4.4.1. Extracia acizilor organici din produse naturale 4.5.4.4.2. Extracia vitaminelor 103 104 105 107 107 113 115 117 119 121 121 122 122 125 127 128 132 134 135 137 140 141 141 142 142 143 143 143 144 145 151 152 154 156 159 162 162 164 iii

Cuprins 4.5.4.4.3. Extracia selectiv a enantiomerilor 4.6. Extracia cu membrane lichide 4.6.1. 167 175

iv

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

1. Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez

Noiunea de biotehnologie nu nseamn acelai lucru pentru toat lumea. Unii vd biotehnologia reprezentnd toate formele de cercetare biologic, fie c este vorb de fabricarea brnzei, obinerea berii sau tehnologia ADN-ului recombinat. Alii consider c biotehnologie nseamn doar tehnici biologice moderne (ADN recombinat, tehnologii de hibridizare, anticorpi monoclonali). n timp ce unii consider biotehnologia drept un nou set de unelte n ldia cu scule a biologilor, pe Wall Street biotehnologia reprezint doar o surs de noi oportuniti i de riscuri financiare. O definiie destul de ampl consider biotehnologia ca fiind orice tehnic ce utilizeaz organisme vii sau pri ale acestora pentru a elabora sau modifica produse, pentru a mbunti plante sau animale, ori pentru a dezvolta microrganisme cu utilizri specifice. O a doua definiie mai restrns definete biotehnologia drept utilizarea industrial a ADN recombinat, a fuziunii celulare i a noilor tehnici de bioprelucrare [1]. O definiie nc actual este cea adoptat n 1978 de ctre Federaia European de Biologie: utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei i ingineriei n scopul obinerii unei aplicaii tehnologice (industriale), cu ajutorul microrganismelor, culturilor de celule i a prilor componente ale acestora [2]. Cuvntul biotehnologie provine din grecescul bios, care nseamn via (din care provine i biologia = tiina vieii) i din tehnologie, care la rndul su provine tot din limba greac, technos = meteug + logos = tiin. Utilizarea microorganismelor pentru a transforma materialele de origine vegetal sau animal n produse alimentare fermentate este cunoscut nc din antichitate. De atunci biotehnologiile au evoluat i s-au diversificat, la ora actual fabricndu-se un numr enorm de produse, de la relativ ieftinii solveni organici i bio-etanol, pn la produse costisitoare ca antibiotice, proteine terapeutice, vaccinuri, hormoni, etc. Un proces biotehnologic (bioproces) necesit o abordare pluri- i interdisciplinar. Punerea la punct a unui bioproces industrial necesit o strns colaborare ntre specialiti din domeniul biochimiei, geneticii, enzimologiei, microbiologiei, ingineriei 1

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez biochimice. Aceast abordare este evident dac ne uitm la etapele de dezvoltare necesare unui proces industrial de obinere a unui produs pe baz de ADN recombinat: insulin, hormon de cretere, interferon (fig. 1.1).
1 12: GENETICA
5. Gena 1. Biochimicale 6. Portiune de cromozom 11. Multiplicarea plasmidei si inglobarea genei 9. Plasmida recombinata 3. Microorganism (ex: E. coli) 4. Plasmida 8. Plasmida sectionata 7. Gena taiata din cromozom 10. Inserare in microorganism

2. Tesut animal

12 14: MICROBIOLOGIE

12. Diviziunea celulara 13. Cultura la scara redusa 14. Bioreactor de laborator 15. Bioreactor pilot

14 18: INGINERIE DE PROCES

16. Instalatia industriala

17. Recuperarea produsului

18. Conditionare, ambalare si comercializare

Figura 1.1. Etapele de dezvoltare ale unui bioproces pentru producerea i comercializarea unui bioprodus pe baz de ADN recombinat [3] Un proces biotehnologic este un proces complex, format din mai multe procese tehnologice componente. Dintre procesele tehnologice componente nu trebuie s lipseasc procesul esenial, respectiv procesul biochimic. Aa cum ntr-un proces tehnologic din industria chimic trebuie s existe cel puin un proces chimic, proces care implic transformri de substan la nivel molecular, i n procesul biotehnologic va exista cel puin un proces biochimic, n care transformrile de substan la nivel molecular decurg la nivelul unui organism viu (microbian, vegetal sau animal) sau al unei poriuni din acesta (enzim). ntre un proces chimic i un proces biochimic nu exist deosebiri fundamentale. n ambele exist o transformare fundamental la nivel molecular (reacia chimic, respectiv reacia biochimic) nsoit de procese de transfer de mas sau de energie (fig. 2.1). Proces chimic
REACTIE CHIMICA REACTII BIOCHIMICE

Fenomene de transfer

Fenomene de transfer

Proces biochimic Figura 1.2. Asemnri ntre procesul chimic i procesul biochimic 2

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 1.1. CARACTERISTICILE PROCESELOR BIOTEHNOLOGICE Faa de alte procese tehnologice ntlnite n industriile de proces, bioprocesele prezint o serie de particulariti, cum ar fi [2 - 4]: - capaciti de producie foarte variate: de la 20 milioane t/an (etanol) pn la mai puin de 20 kg/an (insulin, interferon, anticorpi monoclonali) tab. 1.1; - produsele de biosintez se gsesc deseori ntr-o concentraie foarte sczut n masa de reacie evacuat din bioreactor (lichidul de fermentaie); - separarea produsului se realizeaz n mai multe etape, acest lucru ducnd la creterea costurilor; costul separrii poate atinge n unele cazuri 90 % din costul total al procesului biotehnologic (tab. 1.2); - lichidele de fermentaie au comportare de fluid nenewtonian; acest lucru necesit o abordare specific n proiectarea echipamentelor n care se realizeaz procese de transfer de impuls, cldur i mas; - produsele de biosintez, n special cele cu mas molecular mare, sunt labile termic i chimic, sunt sensibile la fore de forfecare i la tensiuni interfaciale ridicate; acest lucru face ca procedeele clasice de separare (distilarea, de exemplu) s nu poat fi utilizate; - n lichidele rezultate n bioprocese, alturi de produsul util exist o serie de compui secundari (impuriti) ale cror caracteristici fizice i chimice sunt similare cu ale produsului util; asemnarea proprietilor face foarte dificil separarea; - produsele de biosintez, n special cele cu mas molecular ridicat, prezint o mobilitate foarte redus. Tabelul 1.1. Produse majore obinute prin biotehnologii [5]
Produsul de fermentaie Solveni organici - etanol (fr utilizri alimentare) - aceton / butanol Biomas - culturi starter i drojdii pentru industria alimentar i agricultur - proteine monocelulare Acizi organici - acid citric - acid gluconic - acid lactic - acid itaconic Aminoacizi - acid L-glutamic - L-lisin - L-fenilalanin - L-arginin - ali aminoacizi Tipul de organism utilizat Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Bacterii lactice sau drojdie de panificaie Pseudomonas methylotrophus sau Candida utilis Aspergillus niger Aspergillus niger Lactobacillus delbrueckii Aspergillus itaconicus Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium spp. Producie mondial [kg/an] 2 x 1010 2 x 106 (butanol) 5 x 108 (0,5 1) x 108 (2 3) x 108 5 x 107 2 x 107 3 x 108 3 x 107 2 x 106 2 x 106 1 x 106

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez

Transformri microbiene - steroizi - D-sorbitol n L-sorboz (la fabricarea vitaminei C) Antibiotice - peniciline - cefalosporine - tetracicline - macrolidice (eritromicina) - polipeptidice (gramicidina) - aminoglicozidice (streptomicina) - aromatice (griseofulvina) Polizaharide extracelulare - xanthan - dextran Nucleotide - 5 guanozin monofosfat Enzime - proteaze - -amilaze - glucoamilaze - glucozizomeraz - pectinaze - renin - total alte enzime Vitamine - B12 - riboflavin Alcaloizi Ergot Pigmeni - shikonin - -caroten Vaccinuri - antidifteric - antitetanos - antipertussis (tuse convulsiv) - antipoliomielitic - antirubeolic - antihepatic B Proteine terapeutice - insulin - hormonul creterii - eritropoietin - factorul VIII-C - activatorul plasminogen de esut - interferonul 2 Anticorpi monoclonali Insecticide - spori bacterieni - spori de fungi Rhizopus arrhizus Acetobacter suboxydans Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces aureofaciens Streptomyces erythreus Bacillus brevis Streptomyces griseus Penicillium griseofulvum Xanthomonas campestris Leuconostoc mesenteroides Brevibacterium ammoniagenes Bacillus spp. Bacillus amyloliquefaciens Aspergillus niger Bacillus coagulans Aspergillus niger Mucor miehei sau drojdie recombinat Propionibacterium shermanii sau Pseudomonas denitrificans Eremothecium ashbyii Claviceps paspali Lithospermum erythrorhizon Blakeslea trispora Corynebacterium diphtheriae Clostridium tetani Bordetella pertussis virui activi atenuai crescui n rinichi de maimu sau n celulele diploide umane virui activi atenuai crescui n rinichi de pui de hamster antigen de suprafa evideniat n drojdia recombinat Escherichia coli recombinat Escherichia coli recombinat sau celule de mamifere recombinate celule de mamifere recombinate celule de mamifere recombinate celule de mamifere recombinate Escherichia coli recombinat Celule Hybridoma Bacillus thuringiensis Hirsutella thompsonii 4 x 107 (3 4) x 107 1 x 107 1 x 107 2 x 106 1 x 106

5 x 106 1 x 105 6 x 105 4 x 105 4 x 105 1 x 105 1 x 104 1 x 104 5 x 104 1 x 104 5 x 103 60 < 50

< 20

< 20

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Datele din tab. 1.1 nu sunt exhaustive: nu au fost incluse procesele de epurare a apelor uzate, de bioremediere a solurilor poluate, biolixivierea minereurilor sau procesele clasice de fabricare a unor produse alimentare tradiionale: iaurt, pine, bere, vin, oet. Tabelul 1.2. Costul separrii bioproduselor ca fraciune din costul total de producie
Sursa Celule de biomas de drojdie Produse de mare tonaj Enzime extracelulare Antibiotice Enzime/proteine intracelulare Produsul Proteine monocelulare, extract de drojdie Acid citric, lactic, malic Amilaze, proteaze Penicilin Antibiotice noi Insulin, interferon Costul separrii (% din costul total) 5 10 50 10 20 50 60 90

Produsele de biosintez se prezint n forme diverse i provin din surse variate. Ele pot fi molecule de diferite dimensiuni, de la metabolii organici cu mas molecular mic (etanol, acid citric, antibiotice), pn la peptide i proteine (insulin, anticorpi, enzime) sau molecule bazate pe nucleotide (ARN, plasmide ADN). Aceste produse pot fi metabolii ai microorganismelor, celulelor vegetale sau animale; pot reprezenta produsul unei reacii enzimatice sau al unei sinteze peptidice sau pot fi, pur i simplu, componente ale unei surse naturale: snge, lapte sau esut vegetal. Dac sursa produsului este un microorganism, acesta se poate regsi excretat n mediul de cultur, se poate acumula n citoplasma sau periplasma celulelor sau poate forma corpi de incluziune agregate mari de proteine denaturate care se gsesc n interiorul bacteriei. Concentraia produselor de biosintez poate varia pe o plaj foarte larg de valori: de la sute de g/L (etanol, acid citric) la mg/L (anticorpi recombinai) sau chiar g/L n cazul factorilor de coagulare ai sngelui. Dac n cazul produselor aflate n concentraie ridicat izolarea/purificarea nu pune probleme deosebite, putndu-se realiza prin intermediul operaiilor unitare clasice utilizate n industriile de proces (de ex. separarea i concentrarea etanolului prin distilare), n cazul produselor aflate n concentraii sczute, alturi de cantiti considerabile de impuriti, cum este cazul factorilor de snge, anticorpilor monoclonali sau proteinelor recombinate, separarea i purificarea este mult mai dificil i evident mai costisitoare. n general, ponderea costului purificrii n costurile totale de producie depinde de concentraia produsului n mediul de cultur, reprezentnd ntre 5 i 90 % din costurile totale (tab. 1.2). Ca o consecin a acestui fapt, se poate constata c exist o relaie direct ntre preul de vnzare al produselor de biosintez, pre care reflect costurile de producie, i concentraia bioprodusului n mediul de cultur (fig. 1.3). Cerinele de puritate ale produselor de biosintez sunt diferite. n funcie de destinaia acestora este stabilit nivelul maxim acceptabil de impuriti, precum i natura acestora. Produsele terapeutice de uz uman vor avea cele mai mari exigene de puritate, n timp ce enzimele industriale se situeaz la polul opus (fig. 1.4). n tab. 1.3 se prezint un exemplu de reglementare a compoziiei unei proteine terapeutice recombinate. Produsele de biosintez sunt caracterizate prin randamentul de obinere, puritate, activitate specific, noiuni definite astfel: 5

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez Randament = masa de produs separata 100 [%] (1.1) masa de produs alimentata in procesul de separare masa de produs 100 [%] (masa de produs) + (masa impuritatilor) unitati de activitate biologica UAB g masa produsului
Enzime de diagnostic/cercetare Anticorpi monoclonali Enzime terapeutice

Puritate =

(1.2) (1.3)

Activitatea specifica =
Aminoacizi Antibiotice Enzime ind.

Concentraia iniial, kg/m3

Pre de vnzare, $/kg

Figura 1.3. Relaia dintre concentraia produsului n materialul de pornire i preul de vnzare [6] Tabelul 1.3. Exemplu de reglementare a compoziiei unei proteine terapeutice recombinate
Puritate Agregate Proteine din celula gazd Acizi nucleici (majoritar ADN) Endotoxine Virui Celule i particule Substana solubil *UE = uniti de endotoxine > 99 % <1% < 1 ppm < 100 pg per doz < 5 UE* per kg mas corporal > 12 log reducere nedectabile < 1 ppm

Figura 1.4. Cerine de puritate pentru diverse enzime [7]

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 1.2. FAZELE UNUI PROCES BIOTEHNOLOGIC Un proces biotehnologic industrial, cuprinde, de regul, urmtoarele procese componente principale: selecia microorganismelor (celulelor), pregtirea mediului de cultur, procesul biochimic propriu-zis, recuperarea (capturarea) produsului urmat de separarea, purificarea i condiionarea acestuia (fig. 1.5). n funcie de poziia acestor procese fa de procesul biochimic propriu-zis, care decurge n bioreactor, ele pot fi incluse fie n prelucrarea n amonte de bioreactor (upstream processing), fie n prelucrarea n aval de acesta (downstream processing).
UPSTREAM PROCESSING DOWNSTREAM PROCESSING CAPTURAREA PRODUSULUI UTIL SEPARAREA PRODUSULUI UTIL PURIFICAREA PRODUSULUI UTIL CONDIIONAREA PRODUSULUI

Pregtirea mediului de cultur

BIOPROCES
Selecionarea microorganismelor

BIOPRODUS

AMBALARE

Figura 1.5. Fazele principale ale unui proces biotehnologic industrial Prelucrarea masei de reacie n aval de bioreactor este dictat de numeroi factori, doi dintre acetia fiind fundamentali: natura produsului de biosintez obinut i faza n care se gsete acesta n urma procesului de biosintez. n funcie de aceti factori, la care se adaug cerinele de puritate, se sintetizeaz schema tehnologic de separare care asigur obinerea produsului dorit n condiii de eficien economic (respectiv cu costuri totale minime). 1.3. SINTEZA SCHEMELOR TEHNOLOGICE DE PRELUCRARE N AVAL DE BIOREACTOR Elaborarea unei scheme de flux tehnologic pentru recuperarea i purificarea unui produs de biosintez este un proces creativ, bazat pe experiena i imaginaia inginerului de proces. Dei exist ncercri de transpunere a experienei acumulate n programe de calculator, sub forma sistemelor expert, majoritatea inginerilor cu experien se bazeaz 7

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez pe cteva reguli de bun sim tehnic, cunoscute i ca reguli euristice. Cteva dintre aceste reguli sunt enumerate n continuare [8]: 1. Iniial se ndeprteaz impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare; 2. Iniial se ndeprteaz impuritatea cel mai uor de separat; 3. Cea mai dificil i mai costisitoare separare se realizeaz la sfrit; 4. Se alege acel proces de separare care face apel la diferena maxim ntre proprietatile produsului i proprietile impuritilor; 5. Se aleg i se introduc alternativ n schema de separare procese care utilizeaz diferite fore motoare pentru realizarea separrii. n funcie de dimensiuni i de masa molecular, produsele de biosintez pot fi molecule de mici dimensiuni (solveni organici, chimicale fine, antibiotice, hormoni, aminoacizi, vitamine), molecule de dimensiuni mari (proteine, polizaharide, acizi nucleici) sau produse particulate (celule, spori, lipozomi, particule subcelulare). Tab. 1.4 prezint o clasificare a produselor de biosintez n conformitate cu acest criteriu. Tabelul 1.4. Categorii principale de produse de biosintez n funcie de mrimea acestora [7]
Exemple Masa molecular (Da) Raza tipic Zaharuri 200 600 0,5 nm Aminoacizi 60 200 0,5 nm Molecule mici Vitamine 300 600 1 2 nm Acizi organici 30 300 0,5 nm Proteine 103 106 3 10 nm Molecule mari Polizaharide 104 107 4 20 nm 2 1000 nm* Acizi nucleici 103 1010 Ribozomi 25 nm Virui 100 nm Produse particulate Bacterii 1 m Celule de drojdii 4 m Celule animale 10 m * - piese singulare de ADN genetic pot avea dimensiuni desfurate de ordinul mm, n funcie de procedeul de izolare; diametrul elicii duble a ADN este de 2,5 nm. Produsul

Produsele obinute prin biosintez pot fi excretate de ctre celule, gsindu-se n lichidul de fermentaie: acestea sunt produsele extracelulare. Aproape toate produsele cu mas molecular mic i multe produse cu mas molecular mare sunt produse extracelulare. Recuperarea i purificarea acestora este relativ simpl, datorit cantitii reduse de impuriti existente n faza lichid n care se afl aceste produse de biosintez. Dac produsul biosintetizat rmne in interiorul celulei, vorbim despre un produs intracelular. Astfel de produse sunt, de exemplu, proteinele eucariote recombinate produse de ctre microrganismele procariote. Produsele intracelulare se acumuleaz n celule fie sub form nativ, fie sub form denaturat, caz n care, de cele mai multe ori formeaz corpi de incluziune. n alte cazuri, produsul biosintezei este celula nsi. Tabelul 1.5 prezint cteva exemple de diverse tipuri de produse de biosintez. 8

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Tabelul 1.5. Clasificarea produselor de biosintez n funcie de faza n care se gsesc
Tip de produs Extracelular Intracelular Celula nsi Exemple alcooli, acizi organici aminoacizi, enzime, antibiotice proteine pe baz de ADN recombinat drojdie de panificaie, proteine monocelulare Concentraie [g/L] 100 20 10 30

Indiferent de faza n care se gsete produsul util, prima etap n prelucrarea n aval de bioreactor este separarea masei celulare de lichidul de fermentaie (se aplic regula euristic nr. 1: se ndeprteaz impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare). Acest lucru fiind stabilit, prelucrarea ulterioar va merge pe una din cele trei ci redate n fig. 1.6, n funcie de faza n care se gsete produsul biosintetizat. n majoritatea cazurilor, biosepararea se realizeaz n patru trepte. Obiectivele i operaiile unitare utilizate n fiecare treapt sunt redate n tab. 1.6.
RECUPERARE PRODUS EXTRACELULAR

Supernatant FERMENTARE SEPARARE LICHID-SOLID

PURIFICARE

RECUPERARE Celule DEZAGREGARE CELULE PRODUS CELULAR

PURIFICARE

PRODUS INTRACELULAR

RESTURI CELULARE

Figura 1.6. Schema general de prelucrare n aval de bioreactor Tabelul 1.6. Obiective i operaii unitare tipice la biosepararea n patru trepte
Treapta Separare insolubile Izolare produs Purificare primar Purificare avansat Obiective - ndeprtarea celulelor, resturilor celulare i a impuritilor insolubile - reducerea volumului de prelucrat - ndeprtarea componentelor cu proprieti diferite de ale produsului - reducerea volumului de prelucrat - ndeprtarea componentelor cu proprieti similare cu ale produsului - ndeprtarea lichidelor - trecerea produsului n form cristalin Operaii unitare tipice - filtrare - sedimentare - extracie - adsorbie - extracie - adsorbie - ultrafiltrare - precipitare - cromatografie - metode bazate pe afinitate - cristalizare fracionat - precipitare fracionat - uscare - cristalizare

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez O structur generalizat a prelucrrii n aval de bioreactor este redat n fig. 1.7. Pentru fiecare tip de produs (extracelular sau intracelular) exist mai multe alternative de prelucrare. Alegerea unei alternative de prelucrare i selectarea operaiei (operaiilor) unitare corespunztoare se face innd cont de proprietile produsului, proprietile impuritilor i de proprietile microorganismelor, celulelor sau esuturilor productoare. Sinteza procesului tehnologic de separare va consta n alegerea succesiunii operaiilor n conformitate cu cele 5 reguli euristice prezentate anterior, pe baza structurii redate n fig. 1.7. Majoritatea bioproceselor, n special n cazul obinerii produselor de mic tonaj i de valoare ridicat, sunt concepute pentru a fi conduse n regim discontinuu. Procesele continue de bioseparare sunt utilizate n cazul produselor de valoare relativ redus, fabricate n cantiti considerabile: etanol, butanol, acizi organici, etc. RECUPERAREA PRIMAR reprezint prima etap a procesului de prelucrare n aval de bioreactor, etap n care are loc o oarecare purificare i o reducere a volumului de material supus prelucrrii. Aa cum reiese din fig. 1.7, alegerea cii de urmate depinde de locul n care se gsete produsul, respectiv dac acesta este intracelular sau extracelular. n cazul produselor intracelulare, prima etap de purificare o reprezint recoltarea celulelor, respectiv ndeprtarea lichidului extracelular. Pentru realizarea acestui proces se face apel fie la centrifugare, fie la filtrarea membranar (att microct i ultrafiltrare). Centrifugarea este avantajoas n cazul microorganismelor de dimensiuni mari i cu densitate ridicat ( > 2 m, > 1,03 g/cm3), cum este cazul drojdiilor. Pentru microorganisme mai mici se pot utiliza diverse tehnici de coagulare pentru a mri dimensiunea particulelor care sedimenteaz. Filtrarea membranar este avantajoas pentru recoltarea celulelor mici i uoare. Pierderile tipice de celule prin centrifugare sunt cuprinse ntre 1 i 5%. Filtrarea membranar asigur o recuperare practic integral a celulelor, aceasta n cazul n care nu se produce dezagregarea celulelor sau sfierea membranei acestora. Dezagregarea celulelor este de regul al doilea pas n separarea produselor intracelulare. Scopul acestei operaii este de a deschide celulele gazd i de a elibera produsul intracelular. Dezagregarea bacteriilor i a drojdiilor se realizeaz fie n omogenizatoare de nalt presiune, fie n mori cu bile. Pentru capaciti mari (de civa m3/h) numai omogenizatoarele sunt eficiente economic. Pentru eliberarea produselor periplasmatice acumulate ntre membrana celular i peretele celular se utilizeaz adeseori ocul osmotic. naintea dezagregrii, concentratul de celule este deseori diluat cu un tampon litic al crui rol este de a minimiza denaturarea produsului dup eliberarea sa din celul. Pentru microorganismele greu de dezagregat sunt necesare treceri multiple prin omogenizator, la presiuni de 50 100 MPa. Trecerile multiple sunt necesare i pentru eliberarea produilor care formeaz corpi de incluziune. Suplimentar are loc fragmentarea resturilor celulare n particule foarte mici, facilitndu-se astfel separarea ulterioar a corpilor de incluziune de resturile celulare. n aceast etap are loc o oarecare degradare a produselor proteice datorit forfecrii puternice i a oxidrii. ndeprtarea resturilor celulare se realizeaz de regul prin centrifugare sau microfiltrare. Alte opiuni posibile sunt separarea n filtre rotative sub vid sau n filtre pres, filtrarea n adncime, extracia sau cromatografia de adsorbie n strat expandat (cromatografie ASE). 10

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

BIOREACTOR
Produse intracelulare
RECOLTARE CELULE

Produse extracelulare

RECUPERARE PRIMAR

Centrifugare Microfiltrare Ultrafiltrare

NDEPRTARE BIOMAS

DEZAGREGARE CELULE

Omogenizare Mcinare cu bile oc osmotic

EXTRACIA PRODUSULUI

NDEPRTARE RESTURI CELULARE Centrifugare Microfiltrare Filtre la vid Filtre pres

Soluii apoase bifazice Solveni organici Adsorbie strat expandat Adsorbie discontinu Fluide supercritice Micele inverse Distilare extractiv

Filtrare la vid Centrifugare Microfiltrare Ultrafiltrare Filtre pres Filtre lumnare Flotaie

RECUPERARE INTERMEDIAR

Corpi de incluziune
RENATURARE Dizolvare Rempturire

CONCENTRARE
Ultrafiltrare Evaporare Osmoz invers Precipitare Cristalizare Extracie Adsorbie Distilare

Se cere puritate ridicat

Se cere puritate sczut

PURIFICARE FINAL

PURIFICARE FINAL

Cromatografie Diafiltrare Electrodializ Electroforez

Pentru forma solid final

DESHIDRATARE (NDEPRTARE SOLVENT)

Atomizare Congelare Uscare n tvi

Figura 1.7. Schema-bloc generalizat a prelucrrii n aval de bioreactor [9]

11

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez Dac produsul este solubil, el este recuperat n timpul ndeprtrii resturilor celulare fie n faza uoar a unei centrifuge, fie n permeatul unui filtru. Centrifugarea asigur doar ndeprtarea resturilor celulare mari (cu un diametru Stokes de peste 0,5 m), aa c dup centrifugare este necesar o finisare a separrii prin filtrare. n caz contrar, resturile celulare mici rmase n faza lichid pot provoca probleme serioase n etapele ulterioare de prelucrare n cazul separrilor cromatografice, de ex. Pentru finisarea separrii se pot folosi diverse tipuri de filtre (n strat adnc, pres, lumnare, rotative sub vid, microfiltre membranare, etc.). Aceste filtre pot fi utilizate pentru ndeprtarea resturilor celulare i fr o centrifugare prealabil a suspensiei. Dac produsul este insolubil i formeaz corpi de incluziune, el va trebui mai nti separat de resturile celulare, apoi dizolvat i renaturat (a se vedea cazul insulinei, de ex.). Din fericire, corpii de incluziune sunt uzual de diametru mare (0,3 1,0 m) i au densitate ridicat (1,3 1,5 g/cm3), putndu-se separa uor de resturile celulare ntr-o centrifug separatoare cu talere. Corpii de incluziune se regsesc n faza grea colectat din centrifug, n timp ce resturile celulare rmn n faza uoar. Faza grea este uzual resuspendat i re-centrifugat de 2 3 ori, pentru a asigura o puritate corespunztoare corpilor de incluziune. Resuspendarea se realizeaz ntr-o soluie diluat de detergent pentru a facilita ndeprtarea altor contaminani. Se regleaz pH-ul i tria ionic a soluiei astfel nct s se reduc hidrofobicitatea resturilor celulare i s se uureze trecerea lor n faza uoar. O puritate final a produsului mai mare de 70% n aceast etap reprezint un lucru comun. Separarea produsului de resturile celulare se poate face i prin extracie i/sau adsorbie. Pentru extracia produselor cu mas molecular mic (antibiotice, de ex.) se folosesc frecvent solveni organici, iar recuperarea proteinelor se poate realiza folosind sisteme apoase bifazice (SAB). Separarea produsului de resturile celulare i concentrarea simultan a acestuia se poate realiza prin tehnici de adsorbie, putndu-se folosi diveri adsorbani: schimbtori de ioni, adsorbani de afinitate, de schimbare de faz, etc. Acest tip de purificare necesit amestecarea suspensiei cu coninut de resturi celulare cu un adsorbant ntr-un recipient cu agitare. Dup adsorbie este necesar o etap de splare care are drept scop ndeprtarea impuritilor i a resturilor celulare. Mai recent se utilizeaz cromatografia ASE pentru separarea proteinelor de resturile celulare. Suspensia este pompat ascendent prin stratul expandat. Proteina int este legat de adsorbant n timp ce resturile celulare i ali contaminani trec prin strat fr a se reine. O etap de splare ndeprteaz materialul slab reinut. Dup splare se realizeaz eluia de pe adsorbant, urmat de o purificare avansat. n cazul produselor extarcelulare, prima etap n procesul de separare o reprezint ndeprtarea biomasei, care n acest caz este impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare. Aceast etap se realizeaz utiliznd una sau mai multe dintre urmtoarele operaii unitare: filtrarea n filtre rotative la vid, centrifugarea n centrifuge cu discuri sau centrifuge decantoare, filtrarea n filtre pres, ultrafiltrarea, flotaia, etc. ntruct fiecare operaie unitar prezint avantaje i dezavantaje pentru diverse produse i microorganisme, e dificil de selectat operaia optim pentru un sistem dat. Filtrarea n filtre rotative la vid, n special cu utilizarea unui strat de adjuvant, este metoda clasic cea mai utilizat pentru ndeprtarea organismelor micelare. Aceste echipamente pot fi exploatate continuu pentru perioade lungi de timp i, n plus, debitele de filtrat prelucrate sunt mari: peste 200 L/(m2.h), pn la 1000 L/(m2.h). Dezavantajul 12

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII principal al acestor utilaje este problema depozitrii amestecului de biomas i adjuvant, acesta din urm fiind adugat ntr-o cantitate cel puin egal cu biomasa. Reglementrile severe de mediu fac costisitoare depozitarea acestor materiale. Centrifugarea n centrifuge separatoare cu talere sau n centrifuge decantoare, se utilizeaz frecvent n instalaiile de capacitate mare. Centrifugele separatoare lucreaz la turaii mai ridicate, putnd ndeprta microorganisme mai mici i mai uoare. Performanele centrifugelor decantoare pot fi mbuntite prin adaosuri de ageni de coagulare. ntruct nu necesit adaos de adjuvant, centrifugarea este mai avantajoas dect filtrarea n filtre rotative sub vid. Uzual, pasta de biomas rezultat la centrifugare conine ntre 40 i 60% v/v lichid extracelular. Pentru recuperarea produsului dizolvat, pasta este de regul splat i apoi recentrifugat. Filtrarea membranar (micro- i ultrafiltrare) permite trecerea n permeat a produsului extracelular, reinnd n concentrat biomasa i alte componente particulate. Concentrarea este uzual urmat de diafiltrare, n vederea creterii randamentului de recuperare a produsului. Filtrele cu membran sunt utilizate n special n recuperarea produilor cu mas molecular redus, cum ar fi antibioticele din miceliu. Pentru produii cu mas molecular mare, aplicaiile sunt limitate la cazurile n care cantitatea de solide este mai redus dect n cazul culturilor celulare. RECUPERAREA INTERMEDIAR, care urmeaz recuperrii primare, are drept scop concentrarea i purificarea produsului. Dac produsul este solubil, etapa de recuperare intermediar o reprezint concentrarea. n cazul produselor denaturate insolubile, etapa de recuperare intermediar const n dizolvarea i renaturarea (rempturirea) produsului, urmat ulterior de concentrare i purificare. Concentrarea produsului este o etap necesar ntruct dup separarea primar, produsul se gsete, de regul, ntr-o soluie diluat. Reducerea volumului prin concentrare este n concordan cu regulile euristice 1 i 2. Dintre posibilitile de concentrare se pot meniona ultrafiltrarea, osmoza invers, evaporarea, adsorbia, precipitarea, extracia i distilarea. Ultrafiltrarea este utilizat n mod extensiv pentru concentrarea soluiilor de proteine. Masa molecular de tiere a membranei este aleas astfel nct s fie reinut produsul, n timp ce impuritile nedorite (de regul solubile i cu mase moleculare mici) s poat trece prin membran n fluxul de permeat. n comparaie cu evaporarea, ultrafiltrarea are avantajul operrii la temperaturi sczute i posibilitatea ndeprtrii impuritilor solubile. Parametrii tipici de operare sunt o cdere de presiune transmembranar de 0,2 0,5 kPa i un debit mediu specific de 20 L/(m2.h). Osmoza invers necesit membrane cu dimensiuni ale porilor mai mici, pentru a putea face posibil concentrarea produselor cu mase molrculare mai mici: antibiotice, anumii aminoacizi, etc. Evaporarea poate fi utilizat cu condiia asigurrii condiiilor blnde de prelucrare, pentru a nu periclita produsul. Se utilizeaz evaporatoare rotative cu film subire, operate la temperaturi relativ coborte (40 50 C), sub vid. n comparaie cu ultrafiltrarea, evaporarea prezint dezavantajul lipsei oricrui fel de purificare n timpul concentrrii, avnd ns avantajul obinerii unor soluii cu o concentraie mai ridicat i pe acela al posibilitii prelucrrii comode a unor volume mari de soluie. 13

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez Precipitarea este o modalitate de concentrare i purificare frecvent utilizat pentru fraciunile proteice din snge, sau pentru acidul citric, de ex. Pentru precipitarea compusului dorit, n soluie se pot aduga sruri, solveni sau polimeri, sau se poate modifica pH-ul, tria ionic sau temperatura soluiei. De multe ori precipitarea apare ca etap urmtoare extraciei realizate prin intermediul soluiilor apoase bifazice de polimer/sare (PEG i fosfat de potasiu, de ex.). Cnd produsul se recupereaz n faza bogat n polimer precipitarea se realizeaz prin adaos suplimentar de polimer n soluie. Din punct de vedere economic se recomand recuperarea i reciclarea agenilor de precipitare. Procesul de precipitare se poate utiliza i pentru ndeprtarea impuritilor. De ex., acizii nucleici pot fi ndeprtai prin precipitare cu sulfat de mangan i streptomicin sulfat. Distilarea este utilizat n cazul concentrrii i purificrii solvenilor organici care nu se degradeaz sub influen temperaturii: etanol, acid acetic, etc. Renaturarea produsului este necesar atunci cnd acesta se gsete sub form de corpi de incluziune. Proteinele eucariote sintetizate de ctre microorganismele procariote formeaz corpi de incluziune insolubili n celula gazd. Acetia pot fi dizolvai utiliznd soluii de haotropi1 puternici, cum ar fi clorhidratul de guanidin (6 M) sau ureea, n prezena unui agent reductor ca 2-mercaptoetanol (0,5 M) sau ditiotrietol (50 mM). Proteina dizolvat este lsat apoi s-i reia conformaia original, ndeprtnd agenii haotropi prin diafiltrare sau cromatografie i dilund soluia pn la o concentraie total de protein de 20 50 mg/L. Diluia este necesar pentru minimizarea interaciunilor intermoleculare care pot aprea n timpul rempturirii i pot conduce la inactivarea produsului. Procesul de rempturire este finalizat prin adaosul de mici cantiti de glutation n form redus (2 5 mM) i oxidat (1 2 mM), urmat de incubarea timp de 5 10 ore la 35 40 C. PURIFICAREA FINAL ine cont de cerinele de puritate ale produsului obinut. De regul produsele farmaceutice (antibiotice, hormoni, etc.) necesit o puritate ridicat, n timp ce produsele industriale (enzime pentru detergeni, solveni, acizi organici, etc.) necesit o puritate relativ sczut, ce poate fi asigurat prin deshidratare sau, mai general, prin ndeprtarea solventului. Pentru produsele de nalt puritate, etapa de purificare final implic o combinaie de etape de cromatografie i de filtrare, iar dac produsul finit este necesar n form solid, aceste etape sunt urmate de o deshidratare sau ndeprtare a solventului. Cromatografia se realizeaz de regul ctre sfritul procesului global de bioseparare, n conformitate cu regula euristic nr. 3: cea mai dificil i mai costisitoare separare se realizeaz la sfrit. n cazul produselor biologice cu valoare ridicat, pn la aplicarea separrilor cromatografice s-a ndeprtat deja cea mai mare parte a impuritilor, concomitent cu reducerea de 50 100 de ori a volumului de prelucrat, ajungndu-se la un influent cu 1 5% (m/v) coninut de proteine la intrarea n unitatea de separare cromatografic. Progresele recentele ale cromatografiei ASE permit utilizarea etapei cromatografice de separare n etapa de recuperare primar, deoarece
Haotropismul (din cuvintele greceti chaos = dezordine, haos, confuzie i tropos = form) este proprietatea anumitor substane, de regul ioni (tiocianat, perclorat, guanidin), de a destructura proteinele, de a promova solubilitatea unor substane nepolare n solveni polari, n general de a modifica structura apei, proteinelor, organismelor vii, permind realizarea unor procese care altfel nu ar fi posibile. n contrast cu haotropismul este cunoscut cosmotropismul [10, 11].
1

14

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII aceast tehnic cromatografic permite captura, concentrarea i purificarea produsului direct din lichidul de fermentaie care conine celule, resturi celulare i alte particule solide. n consecin, cromatografia ASE are potenialul de a elimina etapele preliminare de separare a biomasei sau a resturilor celulare sau de concentrare a produsului. O secven de mai multe etape de separare cromatografic este necesar de regul pentru atingerea gradului de puritate cerut, iar aceste etape se aleg n conformitate cu regulile euristice 4 i 5. De ex., n concordan cu regula euristic nr. 5, o etap de separare prin schimb ionic nu trebuie s fie urmat de o alt etap de separare de acelai tip, ci de o etap de separare bazat pe o alt for motoare: cromatografie de afinitate sau de inversie a fazelor. Etapele de filtrare membranar se intercaleaz de regul ntre separrile cromatografice, n vederea modificrii tamponului sau pentru concentrarea soluiilor diluate de produs. Deshidratarea sau ndeprtarea solventului se realizeaz prin uscare. Atunci cnd produsele suport temperaturi de 50 100 C se poate utiliza uscarea prin pulverizare, uscarea n strat fluidizat sau uscarea n strat fix. Dac produsele sunt termolabile se utilizeaz uscarea prin congelare (aa-numita frreeze drying). Echipamentele necesare pentru realizarea procesului implic costuri ridicate de investiii i se recomand evitarea, pe ct posibil, a utilizrii sale. Cu titlu exemplificativ, n fig. 1.8 sunt prezentate schemele tehnologice de obinere a dou bioproduse: sinteza, separarea i purificarea unui compus extracelular, cu valoare relativ sczut i cerine de puritate obinuite acidul citric (fig. 1.8 a); sinteza, separarea i purificarea unui compus intracelular, cu valoare ridicat i cerine calitative nalte insulina (fig. 1.8 b). Se poate remarca diferena de complexitate ntre cele dou procese, precum i numrul net superior de etape de separare i purificar n cazul producerii insulinei. 1.4. CRITERII PRINCIPALE PENTRU O PRELUCRARE EFICIENT N AVAL DE BIOREACTOR Aa cum s-a artat anterior, inginerul de proces are de ales ntre diverse ci de prelucrare a masei de reacie. Pentru fiecare cale de prelucrare exist mai multe operaii unitare posibil de aplicat, iar fiecare operaie unitar se poate realiza n cteva tipuri de echipamente. Pe lng regulile euristice enunate n capitolul precedent, este util de tiut c: - dac produsul are o valoare de piaa ridicat, gradul de recuperare trebuie s fie ct mai ridicat; - echipamentele alese trebuie s aib o fiabilitate ct mai nalt; - numrul etapelor de prelucrare trebuie redus la minimum, n acest mod scznd costurile de investiii i de exploatare; - procesul ales trebuie s asigure o reducere de volum considerabil de la bulionul de fermentare iniial pn la fluidul din faza final de recuperare a produsului: o reducere cu minimum trei ordine de mrime (1000 : 1) ar fi rezonabil; 15

Capitolul 1 Etapele i caracteristicile proceselor de biosintez

Etapa de fermentare Etapa de recuperare

Etapa de izolare

a Biosinteza acidului citric

Etapa de recuperare primar Etapa de fermentare

Etapa de reacie

Etapa de purificare final

b Biosinteza insulinei Figura 1.8. Scheme tehnologice pentru obinerea produselor de biosintez ntr-o form comercializabil [8] 16

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII prelucrarea trebuie s conduca la un bulion epuizat final uor de reciclat, pentru a face posibil recuperarea nutrienilor neconsumai; prelucrarea n aval de bioreactor trebuie nceput imediat ce bulionul prsete seciunea de fermentare; orice ntarziere sau stocare necesit vase de stocare costisitoare, existnd i posibilitatea deteriorrii sau contaminrii produsului din bulion; ntrucat n majoritatea proceselor biotehnologice concentraia produsului este sczut, costul pe unitate de volum de bulion procesat n recuperarea primar va avea o pondere nsemnat n costul final de producie.

Alegerea metodei de recuperare este influenat i de alte criterii, cum ar fi: locul i starea n care se afl produsul, concentraia produsului, proprietile fizico-chimice ale produsului, aplicaiile acestuia, cerinele de minim puritate, caracteristicile fizicochimice ale impuritilor, preul de pia al produsului, etc. Tabelul 1.7. Categorii de produse de biosintez
Caracteristici Producie Valoare de pia Puritate cerut Costuri de separare Etape de separare Tehnologia de separare Exemple Produse low-tech mare (peste 1.104 kg/an) mic (sub 100 USD/kg) mic (maximum 90 95 %) mici (sub 50% din costurile totale) puine clasic, fr probleme deosebite solveni (etanol, butanol, aceton) acizi organici aminoacizi proteine monocelulare enzime industriale antibiotice Produse high-tech mic (sub 1.104 kg/an) mare (peste 1000 USD/kg) mare (uzual peste 99 %) mari (pn la 90% din costurile totale) numeroase sofisticat vitamine pigmeni enzime de diagnoz enzime terapeutice vaccinuri proteine terapeutice

Produsele obinute prin biosintez pot fi ncadrate n dou mari categorii (tab. 1.7). n prima categorie intr produsele care se obin n cantiti mari, au o valoare de pia relativ sczut i nu necesit o puritate prea ridicat: etanol, butanol, aceton, acizi organici, proteine monocelulare, enzime industriale, antibiotice. Separarea i purificarea acestor produse se poate realiza folosind o succesiune de operaii unitare clasice, cunoscute i aplicate frecvent n industriile de proces: filtrare, centrifugare, flotaie, extracie cu solveni, adsorbie, precipitare, evaporare, uscare, etc. n a doua categorie sunt incluse produsele care se obin n cantiti mult mai reduse, au o valoare de pia ridicat i necesit o purificare avansat: vitamine, pigmeni, enzime de diagnoz i terapeutice, vaccinuri, proteine terapeutice, etc. Pentru separarea i purificarea acestor produse, operaiile unitare clasice nu sunt suficiente, fcndu-se apel la o serie de tehnici noi, de cele mai multe ori concepute iniial pentru operare la scar de laborator i uletrior transpuse la scar industrial: ultracentrifugare, dezagregare mecanic, precipitare fracionat, cromatografie n strat fix, ultrafiltrare, dializ, diafiltrare, osmoz invers, liofilizare, etc.

17

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

2. Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

Fie c este vorba de recoltarea celulelor sau de ndeprtarea biomasei, dup cum produsul dorit este intra- sau extracelular (vezi fig. 1.7), acesta este primul proces de prelucrare n aval de bioreactor, al crui scop este de a reine acea faz care conine produsul util, concomitent cu reducerea considerabil a volumului de prelucrat, prin ndeprtarea celeilalte faze. Pentru separarea celulelor de lichidul de fermentaie avem la ndemn cel puin cinci tehnici de separare: sedimentarea, filtrarea, centrifugarea, ciclonarea i microfiltrarea. Suplimentar, flocularea celulelor poate fi utilizat pentru mbuntirea eficienei tuturor acestor tehnici. 2.1. CONDIIONAREA LICHIDULUI DE FERMENTAIE PRIN FLOCULARE I COAGULARE Pentru facilitarea proceselor ulterioare de separare a masei celulare de lichidul de fermentaie este util aglomerarea particulelor celulare n agregate mari, uor separabile. n absena floculrii sau coagulrii, sedimentarea gravitaional a particulelor celulare i subcelulare decurge foarte lent (tab 2.1). Tabelul 2.1. Timpul de sedimentare natural al diferitelor particule
Tipul particulei Bacterii Coloizi Diametrul particulei [m] 1 0,1 0,01 0,001 Suprafaa specific [m2/m3] 6 000 000 60 000 000 600 000 000 6 000 000 000 Durata de sedimentare 8 zile 2 ani 20 ani 200 ani

Flocularea este definit ca fiind fenomenul de agregare a particulelor solide, indus de adaosul unui polimer, n timp ce coagularea se refer la o agregare indus de 18

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII ctre fore de atracie electrostatice sau de tip van der Waals care apar ntre particule (fig. 2.1) [12]. Agregarea celulelor a fost definit drept aglomerarea acestora n scopul formrii unor asociaii multicelulare stabile i consistente, sub influena anumitor condiii fiziologice [13]. Din punctul de vedere al inginerului biotehnolog, distincia dintre E barier energetic coagulare, agregare, floculare i aglomerare, nu este ntotdeauna clar. ES Cuvinte ca: agregate, flocoane, distan aglomerate, clustere, sunt deseori utilizate drept sinonime. Ele se refer la un ansamblu de celule individuale, format din celule iniial libere sau prin absena dispersiei celulare, sub influena anumitor condiii fiziologice, sau dup adugarea anumitor ageni n energie van der Waals mediu. energie electrostatic n fig. 2.2 se prezint dou din energie rezultant mecanismele principale care produc aglomerarea celulelor. n primul caz Figura 2.1. Diagrama energetic a (fig. 2.2 a) aglomerarea se datoreaz suspensiilor coloidale formei naturale a celulelor, care prezint diveri apendici. Aceti apendici depesc bariera energetic (reprezentat punctat) care ine la distan celulele, permindu-le astfel apropierea i asociere. n al doilea caz, agentul de floculare (polimerul reprezentat prin linia curb) se ataeaz de celul (fig. 2.2 b). Dac tria ionic a soluiei este suficient de sczut, raza de repulsie (bariera energetic reprezentat punctat) se micoreaz, permind formarea punilor de polimer ntre celule (fig. 2.2 c).

Figura 2.2. Mecanisme principale de aglomerare a celulelor: a prin apendici; b, c prin puni de polimer n cazul separrii celulelor prin centrifugare, flocularea ar trebui s conduc la formarea unor flocoane cu rezisten mecanic sporit. n producerea microalgelor, metoda cea mai economic de recoltare s-a dovedit a fi flocularea chimic urmat de sedimentare, flotaie sau filtrare [14]. 19

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie Pentru aglomerare se pot utiliza particule coloidale, sruri, polimeri solubili, sau combinaii ale acestora. Eficiena aglomerrii poate fi hotrtor influenat de tria ionic a soluiei. La creterea triei ionice, eficiena aglomerrii scade dramatic. Celulele de Saccharomices cerevisiae formeaz flocoane n prezena particulelor submicronice de Al(OH)3 ncrcate pozitiv. De asemenea, pentru obinerea de flocoane din celule sau resturi celulare de S. cerevisiae i Escherichia coli se pot utiliza particule de polimer organic ncrcate pozitiv (de ex. polistiren-divinilbenzen cu grupri de amoniu cuaternar la suprafa, avnd diametrul particulelor de 0,27 m) [15]. Electroliii simpli favorizeaz coagularea particulelor prin comprimarea stratului dublu electric care nconjoar particulele coloidale. Efectul cel mai puternic l au ionii metalici cu sarcin mare (Al3+, Fe3+), a cror tendin de adsorbie este mai mare. Mai mult, prin hidroliz aceti ioni formeaz compleci polinucleari hidroxo, ncrcai pozitiv, care au capacitatea de a inversa sarcina superficial a coloizilor. Concentraia ionilor metalici trebuie s fie suficient de mare pentru a putea comprima stratul dublu electric. O supradozare poate duce ns la inversarea sarcinii particulelor coloidale i la restabilizarea lor. Polimerii solubili folosii pentru aglomerare sunt fie polimeri sintetici, fie biopolimeri de origine natural. Polimerii sintetici folosii ca floculani pot fi anionici (acrilamide i copolimeri acizi), cationici (copolimeri ai acrilamidei cu metacrilatul sau acrilatul de dimetil-aminoetil) i neionici (poliacrilamida PAA). Dintre acetia, PAA i derivaii si sunt folosii pe scar larg, datorit economicitii i eficacitii lor [16]. ntruct monomerul acrilamid are proprieti puternic neurotoxice i cangerigene, se fac eforturi pentru gsirea unor nlocuitori mai siguri, biodegradabili, cu un impact mai redus asupra sntii umane i asupra mediului nconjurtor. Astfel, s-a constatat c anumite microorganisme (Rhodococcus erythropolis) provoac flocularea celulelor de drojdii, de E. coli, de nmol activ, de Microcystis aeruginosa, etc. Procesul este efectiv la pH = 3 5, i este considerabil mbuntit prin adaos de ioni de Ca2+ [17, 18]. Polizaharidele sintetizate i excretate de Paecilomyces provoac flocularea E. coli la pH = 4 8 i trii ionice de 0,0001 0,1 M [19]. Fa de polimerii sintetici, chitosanul, un polimer natural derivat din chitin, componentul majoritar al exoscheletului crustaceelor, prezint cteva avantaje: monomerii nu sunt toxici, poate fi sterilizat termic fr degradare, este biodegradabil. La pH acid este solubil, gsindu-se sub form de lanuri liniare (datorit repulsiei dintre gruprile aminice ncrcate electric, NH3+), n timp ce la pH alcalin (peste 7,9, punctul de neutralizare) tinde s se ncolceasc i s precipite. Chitosanul poate fi folosit n flocularea E. coli, Euglena gracilis, sau n separarea selectiv a -D-galactozidazei de resturile celulare i acizii nucleici provenii prin dezintegrarea celulelor de E. coli [20]. Utilizarea adaosurilor pentru aglomerare prezint i o serie de dezavantaje, dintre care pot fi menionate: (1) cunoaterea insuficient a mecanismelor care provoac aglomerarea, ceea ce nseamn un control redus al procesului, (2) fermentaia avnd loc n arje, caracteristicile suspensiei pot varia de la o arj la alta, astfel nct comportarea la adugare de floculani poate fi nepredictibil, (3) de cele mai multe ori floculanii adaugai sunt incompatibili cu procesul de fermentare, fcndu-se astfel imposibil recircularea nutrienilor neconsumai din lichidul de fermentaie, (4) flocoanele formate sunt instabile, putnd fi degradate prin forfecare, (5) procedura este puin aplicabil deeurilor celulare, (6) apar costuri suplimentare. 20

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Flocularea poate fi controlat i de ctre factori genetici. Astfel, adugarea de amidon la o suspensie de E. coli a condus la formarea unor flocoane bacteriene, permind ulterior o separare foarte eficient a celulelor prin sedimentare. Flocularea a depins de un receptor maltoporin pentru amidon aflat la suprafaa celulei. Expresia acestui receptor maltoporin poate fi controlat genetic, astfel nct prezena sa la suprafaa celulei s fie independent de proprietile suprafeei. Agregarea amidono-dependent a celulelor este potenial aplicabil i altor microorganisme care rspund urmtoarelor cerine: (1) prezint receptori pentru amidon, (2) suprafaa celular nu este mascat de un strat de protein sau polizaharid, (3) celula nu produce enzime amilolitice extracelulare. Utilizarea amidonului n recoltarea celulelor bacteriene ofer cteva avantaje: (1) legarea de celule este rapid, (2) amidonul este netoxic, (3) spre deosebire de floculanii ncrcai electric, nu afecteaz pH-ul, iar legarea sa este efectiv n condiiile de pH n care au loc de regul procesele de fermentaie, (4) este un produs ieftin, (50 este uor separabil de bacterii, dac acest lucru este necesar [21]. 2.2. SEPARAREA PRIN SEDIMENTARE GRAVITAIONAL Sedimentarea gravitaional, ca proces de separare a celulelor de faza lichid, este aplicat n diverse procese de biosintez sau de bioseparare: (1) producerea proteinelor terapeutice sau de diagnoz din celule de mamifere, (2) atingerea unor concentraii ridicate de celule n fermentatoarele continue prin recircularea celulelor, (3) tratarea biologic a apelor uzate sau a deeurilor, (4) producerea berii, (5) studiul diverselor tipuri de celule implicate n rspunsul imunologic, (6) recoltarea celulelor obinute n micropurttori sau n culturi celulare n suspensie [22]. Utilizarea sedimentrii gravitaionale n separarea celulelor prezint o serie de aspecte particulare, i anume: - Sedimentarea ca proces de separare este o tehnic blnd. Acest lucru este important n biologia celular, cnd capacitile funcionale ale celulelor izolate nu trebuie alterate n timpul separrii. - Se preteaz foarte bine la manipularea aseptic. Echipamentele sunt uor de asamblat, curat i sterilizat. - Din punct de vedere practic, sedimentarea neajutat poate fi prea lent dac vitezele de sedimentare sunt mici. La scar industrial, durata prea mare a procesului poate periclita creterea microbian sau poate accelera degradri enzimatice nedorite. - n forma ei cea mai simpl, sedimentarea gravitaional poate fi cea mai ieftin tehnic de separare a celulelor. - Este o operaie simpl i fezabil. Spre deosebire de centrifugare, de ex., nu necesit o pregtire special a personalului de exploatare. Ca regul general, sedimentarea gravitaional poate fi utilizat pentru separare dac diametrul celulelor depete 1 m. La dimensiuni mai mici ale particulelor trebuiesc avute n vedere alte opiuni: centrifugare, ultracentrifugare, filtrare, separare membranar. 21

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie Civa factori mai importani influeneaz sedimentarea gravitaional a celulelor ntr-o faz lichid, i anume: - diferena dintre densitatea celulei (c) i densitatea mediului lichid nconjurtor (l); - densitatea fazei lichide (l); - mrimea, forma i concentraia celulelor; - viscozitatea fazei lichide (l). Legtura dintre aceti factori este dat de expresia vitezei de sedimentare n regim laminar (Re < 1), cunoscut i ca legea lui Stokes modificat: 1 ( l ) 2 v0 = c dc g (2.1) l 18

n care dc reprezint diametrul celulelor, iar g acceleraia gravitaional, ceilali termeni avnd semnificaia prezentat anterior. Pentru mrirea vitezei de sedimentare se poate actiona prin mrirea diferenei de densitate ntre celule i faza lichid, prin creterea mrimii particulelor care sedimenteaz (floculare, coagulare, agregare), sau prin micorarea viscozitii fazei lichide. n multe separri la scar industrial, viteza de sedimentare a celulelor este prea sczut, datorit faptului c celulele biologice i agregatele celulare au densiti mici. Deoarece viteza de sedimentare este direct proporional cu diferena de densitate ntre celule i faza lichid, modificarea densitii fazei lichide poate accelera separarea. Dac, de ex., avem de separat un amestec de dou tipuri de celule avnd densiti diferite (1,05 g/cm3 i 1,1 g/cm3), prin mrirea densitii fazei lichide (care se poate realiza prin adaos de ficoll, ser bovin fetal, albumin) se mrete raportul dintre vitezele relative de sedimentare ale celor dou tipuri de celule, ducnd la mbuntirea separrii (fig. 2.3). Pornind de la aceast observaie se poate utiliza un gradient de densitate n faza lichid n care are loc sedimentarea, realizndu-se aa-numita sedimentare izocinetic.
Tabelul 2.2. Distana parcurs n timp de 1 h de o particul sferic (c = 2,0 g/cm3) printr-un lichid (l = 1,0 g/cm3) la 298 K
Raza particulei [nm] 0,1 1,0 10 100 1000
Densitatea fazei lichide [g/cm3]

Raportul vitezelor de sedimentare

Distana parcurs 0,08 nm 8 nm 0,8 m 80 m 8 mm

Figura 2.3. Efectul densitii fazei lichide asupra raportului vitezelor de sedimentare

n tab. 2.2 s-a calculat distana ipotetic parcurs ntr-o or de o celul sferic cu densitatea de 2,0 g/cm3 care sedimenteaz ntr-un lichid de densitate 1,0 g/cm3. Datele
22

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

din tab. 2.3 ofer o idee asupra dimensiunilor tipice ale diverselor tipuri de celule ntlnite n practic.
Tabelul 2.3. Dimensiuni tipice ale unor celule
Tipul de celul Virui bacterieni Bacterii Celule de drojdie Globule roii umane (eritrocite) Globule albe umane (leucocite) Fungii filamentoase Celule de ficat uman Celule vegetale Protozoare (paramecium, didinium) Dimensiuni [nm] 0,08 0,1 2,5 2 10 68 8 12 10 40 30 10 100 100 200

Teoretic, viteza de sedimentare este direct proporional cu ptratul diametrului celulelor. Orice mrire a diametrului agregatelor celulare va duce la creterea considerabil a vitezei de sedimentare. Creterea real nu este cea dat de legea lui Stokes, ci mai redus: n cazul agregatelor celulare poroase de nmol activat s-a constatat o mrire a vitezei de sedimentare proporional cu d0,55 [23]. Viteza de sedimentare este invers proporional cu viscozitatea fazei lichide. ntruct viscozitatea nu variaz liniar cu concentraia, o diluare cu 25 50% poate conduce la o descretere mai mare a viscozitii, ducnd la creterea vitezei de sedimentare. Dac dimpotriv se dorete ncetinirea sedimentrii celulelor, se pot aduga n faza lichid substane care mresc viscozitatea (de ex., soluii de 4% dextran cu masa molecular medie de 500 kDa). n aplicaiile industriale, sedimentarea gravitaional se realizeaz de regul n rezervoare de sedimentare specifice. Acestea sunt prevzute cu un racord de alimentare, un racord de evacuare sau de preaplin i un racord pentru evacuarea materialului sedimentat. Exist i alte echipamente care pot fi foarte eficiente n anumite situaii. Un astfel de echipament, care utilizeaz un dispozitiv nclinat, format din plci paralele, este redat n fig. 2.4 [24]. Acest dispozitiv este utilizat pentru Evacuare faza recircularea celulelor n procesele lichid continue de de cultur a celulelor sau de fermentare. Concepia aparatului permite nu numai Dispozitiv de obinerea unor densiti ridicate sedimentare Alimentare de mas celular n fermentator, cu suspensia de celule ci i o modalitate eficient de reinere selectiv a celulelor.
Conducta de retur pentru celulele sedimentate (Dac dispozitivul este cuplat cu un bioreactor, aceast conduct alimenteaz partea superioar sau lateral a bioreactorului)

Figura 2.4. Dispozitiv nclinat pentru sedimentarea celulelor 23

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie 2.3. SEPARAREA PRIN FILTRARE

n filtrare, particulele solide sunt separate din amestecul solid-fluid, fornd fluidul s treac printr-un material sau strat filtrant care reine particulele solide. Solidele rmn pe filtru sub forma unei turte de filtrare, opunnd o rezisten suplimentar procesului ulterior de filtrare.
2.3.1. Mecanismul filtrrii

Ca operaie unitar, filtrarea este rezultatul a trei procese elementare [25]: (1) sedimentarea proces prin care particulele solide se depun pe stratul/suprafaa filtrant ca ntr-un decantor, (2) cernerea sunt reinute acele particule solide care au dimensiuni mai mari dect dimensiunile porilor stratului/suprafeei filtrante, (3) adsorbia particulele mai mici dect deschiderea porilor stratului/suprafeei filtrante sunt reinute prin fore de suprafa n interiorul porilor, provocnd colmatarea (nfundarea) filtrului. n funcie de proprietile materialului filtrant, unul dintre aceste procese elementare poate deveni determinant n filtrare, astfel nct putem vorbi despre filtrare n adncime, filtrare superficial, filtrare cu efect de sit [26].

a.

b.

c.

Figura 2.5. Tipuri de filtrare n conformitate cu mecanismul filtrrii: a filtrare n adncime; b filtrare superficial; c filtrare cu efect de sit Filtrele n adncime (fig. 2.5 a) sunt constituite din materiale fibroase, granulare sau sinterizate care produc o structur poroas aleatoare. Cnd o suspensie traverseaz filtrul, particulele solide devin captive n structura tortuoas a canalelor de curgere. Particulele sunt reinute prin adsorbie aleatoare i capturare mecanic n matricea materialului filtrant. Astfel de filtre se confecioneaz din bumbac, rayon, polipropilen, celuloz sau fibr de sticl. Filtrele superficiale (fig. 2.5 b) sunt constituite din mai multe straturi suprapuse de sticl sau microfibre polimerice. n timpul filtrrii, particulele mai mari dect spaiile din matricea filtrului sunt reinute n special la suprafaa filtrului. Particulele mai mici pot fi capturate n interiorul matricii. Particulele mari sunt reinute ca urmare a efectului de sitare, cele mici fiind reinute prin adsorbie aleatoare i capturare mecanic. Filtrele superficiale se confecioneaz din materiale polimerice, hrtie armat cu rini sau cu fibr de sticl. Filtrele sit (fig. 2.5 c) au o matrice poroas cu structur geometric regulat, n care particulele sunt reinute ca urmare a efectului de cernere. Particulele mici i 24

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

microorganismele mai mari dect dimensiunile porilor sunt reinute la suprafa. Procesul de filtrare este absolut, ntruct nici o particul mai mare dect diametrul porilor filtrului nu este lsat s treac. Astfel de filtre sunt membranele utilizate n separrile submicronice i macromoleculare din biotehnologii. Structura materialului filtrant este mai rigid, iar fabricarea acestor materiale este mai bine controlat dect n cazul altor tipuri de filtre. Fa de suprafaa filtrant faza fluid poate curge perpendicular sau tangenial. La curgerea perpendicular (fig. 2.6 b) particulele solide se depun pe suprafaa filtrant, grosimea stratului depus crete n timpul filtrrii, opunnd o rezisten din ce n ce mai mare la curgere. La un moment dat rezistena stratului de precipitate depus este att de mare nct filtrarea devine neeconomic i este necesar ndeprtarea particulelor depuse, curirea i regenerarea suprafeei filtrante. Aceast modalitate de filtrare este ntlnit n majoritatea echipamentelor clasice de filtrare i se numete filtrare fr ieire (dead-end filtration). La curgerea tangenial (fig 2.6 a) fluidul care nainteaz paralel cu suprafaa filtrant provoac forfecri care limiteaz creterea stratului de precipitat. Aceast modalitate de filtrare este ntlnit n procesele de separare prin membrane i se numete filtrare n curent ncruciat (cross flow filtration). O mic parte a fluidului alimentat traverseaz membrana, formnd aa-numitul filtrat sau permeat; restul fluidului este reinut sub form de retenat sau concentrat. Retenatul este recirculat peste membran pn cnd acesta ndeplinete condiiile cerute de concentraie [27].

Filtrat

Alimentare

Concentrat

Alimentare

Filtrat

Filtrat

Figura 2.6. Reprezentarea schematic a filtrrii: a curgere tangenial pe suprafaa filtrant (cross-flow filtration) b curgere perpendicular pe suprafaa filtrant (dead-end filtration)

Uurina filtrrii depinde de proprietile solidului i ale fluidului; separarea prin filtrare a solidelor cristaline necompresibile din lichide cu viscozitate redus este o operaie relativ simpl. Separarea prin filtrare a masei celulare de lichidele de fermentaie este n schimb o operaie dificil, att din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor, ct i din cauza comportrii nenewtoniene a lichidelor de fermentaie. Factorul determinant l reprezint ns natura masei celulare; aceasta poate avea caracter fibros, mucilaginos sau de past. Majoritatea celulelor microbiene formeaz precipitate compresibile, a cror porozitate scade pe msur ce filtrarea avanseaz. 25

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie 2.3.2. Teoria filtrrii. Posibiliti de mbuntire a filtrrii

Filtrarea este o operaie care decurge n regim dinamic, nestaionar. ntruct procesul de filtrare este influenat de un numr foarte mare de factori, o teorie a filtrrii simpl i concomitent util din punct de vedere practic nu poate fi dezvoltat. Teoriile simple existente (teoria filtrului ideal, teoria filtrrii prin stratul de precipitat, teoria filtrrii prin stratul de precipitat cu luarea n considerare a suportului), completate cu determinri experimentale, servesc la proiectarea filtrelor i la conducerea raional a filtrrii. n conformitate cu teoria filtrrii prin stratul de precipitat cu luarea n considerare a suportului [25], n cazul filtrrii la cdere de presiune constant volumul specific de filtrat poate fi determinat pe baza ecuaiei:
VS2 + 2 VS = t (2.2) n care VS [m3/m2] este volumul de filtrat V [m3] care n timpul t [s] trece printr-un m2 de suprafa filtrant, este coeficientul de rezisten al materialului filtrant [m2/s], iar este coeficientul de rezisten al precipitatului [m3/m2]. Dac rezistena materialului filtrant este mult mai mic dect rezistena stratului de precipitat, iar stratul de precipitat este incompresibil, ecuaia (2.2) devine [4]:
2 P V V = = t = t r CS A
2 S 2

(2.3)

n care V [m3] este volumul de filtrat colectat n timpul t [s], A este aria suprafeei filtrante [m2], P este diferena de presiune de pe feele filtrului [Pa], este viscozitatea fazei lichide [Pa.s], r este rezistena specific a stratului de precipitat [m/kg], iar CS este coninutul de faz solid din suspensia supus filtrrii [kg/m3]. Rezistena specific a stratului de precipitat este independent de P dac precipitatul este incompresibil. Pentru precipitate compresibile: r = r '(P )
s

(2.4)

s reprezentnd compresibilitatea precipitatului. Compresibilitatea are valoarea 0 pentru precipitate rigide, incompresibile i apropiat de 1 n cazul materialelor puternic compresibile, aa cum sunt cele rezultate la filtrarea lichidelor de fermentaie. Rezistena specific a stratului de precipitat este funcie de proprietile particulelor din strat:

2 (1 ) r= 3 p

(2.5)

unde este factorul de form al particulelor [adimensional], este suprafaa specific a particulelor [m2/m3], este porozitatea (fracia de goluri) a stratului de precipitat [m3/m3], iar p este densitatea particulelor [kg/m3]. Pentru precipitatele compresibile, att ct i sunt funcie de cderea de presiune prin strat. Viteza filtrrii este exprimat uzual prin debitul de filtrat colectat. Ecuaia (2.3) pus sub forma (2.6):
26

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

mV =

V 2 A2 P [m3/s] = t r CS V

(2.6)

ne arat c debitul de filtrat (mV) este direct proporional cu ptratul ariei suprafeei filtrante, i este invers proporional cu rezistena specific a stratului de precipitat, viscozitatea fazei lichide, volumul i concentraia suspensiei. Pe baza acestei ecuaii se pot stabili o serie de msuri care pot fi luate pentru mbuntirea procesului de filtrare al unei suspensii date [3]: - Creterea ariei suprafeei filtrante, A. Dei viteza de filtrare crete cu ptratul suprafeei filtrante, creterea lui A necesit instalarea unor echipamente mai mari, mrindu-se astfel cheltuielile de investiii. - Creterea valorii diferenei de presiune pe feele filtrului, P. Soluia este valabil numai n cazul precipitatelor necompresibile. n cazul precipitatelor compresibile sau a precipitatelor cristaline sub form de ace sau plci, creterea P va conduce la nrutirea filtrrii. Pentru precipitatele compresibile (cum sunt marea majoritate a precipitatelor obinute din suspensii de mas celular), este necesar reducerea compresibilitii precipitatului, prin adugare de adjuvani de filtrare. - Reducerea masei precipitatului, CS = mp/V. La filtrarea n filtre rotative continue, acest lucru se realizeaz prin reducerea grosimii stratului de precipitat depus pe tambur la fiecare rotaie a acestuia i prin plasarea racletei care ndeprteaz precipitatul ct mai aproape de tambur, astfel nct pe pnza filtrant s rmn un strat de reziduu solid minim. - Reducerea viscozitii fazei lichide, . Dac viscozitatea iniial a suspensiei este foarte ridicat, diluarea poate conduce la reducerea viscozitii. Nu se recomand reducerea viscozitii prin mrirea temperaturii suspensiei, deoarece majoritatea lichidelor de fermentaie nu suport temperaturi ridicate fr o degradare termic a produselor. - Reducerea rezistenei specifice a stratului de precipitat, r. Pe baza ecuaiei (2.5), mijloacele posibile de micorare a valorii lui r sunt: o Creterea porozitii, . Porozitatea scade pe msur ce are loc filtrarea celulelor. Reducerea acestui efect se poate realiza utiliznd adjuvani. o Reducerea valorii factorului de form, . n cazul suspensiilor de micelii, morfologia celulelor se poate schimba modificnd condiiile de fermentare. o Reducerea suprafeei specifice a particulelor, . Creterea dimensiunilor medii ale particulelor i minimizarea variaiilor n mrimea particulelor conduce la scderea lui . Acest efect se poate atinge prin schimbarea condiiilor de fermentare sau prin condiionarea suspensiei (adaosuri de floculani i/sau coagulani) nainte de filtrare.
2.3.3. Alegerea i dimensionarea echipamentelor de filtrare

Filtrarea lichidelor de fermentaie care conin mas celular cu caracter fibros (culturi de fungi din clasele Aspergillus i Penicillium) este o operaie relativ uoar, miceliul necolmatnd materialul filtrant i desprinzndu-se uor de pe acesta. La nivel
27

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

de operare industrial se recomand filtrele rotative cu vid (filtrele Oliver), echipamente care confer o suprafaa mare de filtrare, posibiliti de splare a miceliului pe filtru pentru recuperarea avansat a produselor utile i n plus se preteaz la automatizare [3, 4].
lichid de splare

lichid de fermentaie

biomas

Figura 2.7. Filtru celular rotativ cu vid (Oliver)

A seciune transversal; B seciune longitudinal 1 tambur rotativ; 2 celule; 3 material filtrant; 4 tuburi de legtur ntre celule i capul de distribuie; 5 arbore; 6 roat dinat de acionare; 7 cap de distribuie; 8 raclet pentru desprinderea precipitatului; 9 cuv; 10 agitator pendular; 11 racord pentru alimentarea lichidului de splare; 12 racord pentru alimentarea lichidului de fermentaie (suspensia de mas celular).

Un filtru rotativ cu vid (fig. 2.7) este alctuit dintr-un tambur rotativ (1) cu lungimea de 1 4,5 m i diametrul de 0,5 3 m, construit din 2 cilindri orizontali coaxiali. Tamburul se rotete lent (0,1 2 rpm) fiind paial imersat ntr-o cuv (9) n care este alimentat i agitat (10) lichidul de fermentaie. Cilindrul exterior este perforat i acoperit cu material filtrant (3), iar spaiul dintre cilindri este mprit, prin perei radiali, n 6 12 celule etane (2) care funcioneaz succesiv i independent ca nite filtre nuce. Celulele sunt legate, prin intermediul unui cap de distribuie (7) i a tuburilor de legtur (4), de conductele de vid sau aer comprimat. Suprafaa tamburului este mprit n mai multe zone corespunztoare operaiilor de filtrare (a d), deshidratare (e, f), splare (g), deshidratare dup splare (h j), ndeprtare a stratului de miceliu (l) i regenerare a suprafeei filtrante (m). n timpul unei rotaii a tamburului, fiecare celul trece succesiv prin toate aceste zone. Capul de distribuie asigur crearea vacuumului n zonele de filtrare (a d), splare (g) i deshidratare (e, f, h j) i insuflarea de aer comprimat n zonele de ndeprtare a miceliului de pe filtru (l) i dezobturare a porilor suprafeei filtrante (m). Tamburul (1) are un grad diferit de scufundare n lichidul de fermentaie supus filtrrii, n funcie de caracterul stratului filtrant i de necesitile de splare i uscare. n obinerea antibioticelor, de ex., se utilizeaz filtre a cror adncime de scufundare a tamburului este de pn la 50 % [28]. Dac produsul util este localizat
28

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

numai n faza lichid, splarea masei celulare dup filtrare nu este o operaie dificil. Debitul i amplasarea jeturilor de ap de splare trebuie alese astfel nct s se evite diluarea excesiv a filtratului. Miceliul de pe materialul filtrant se ndeprteaz cu ajutorul racletei (8). Dintre dezavantajele filtrului celular rotativ cu vid se pot meniona: - etanarea defectuoas a celor dou discuri ale capului de distribuie; - griparea suprafeei lefuite a discurilor prin particole de solid scpate n filtrat; - splarea insuficient a biomasei, datorit depunerii sale ntr-un stat cu grosime inegal, sau prin apariia fisurilor n stratul de biomas depus; - eliminarea nesatisfctoare a apei n faza de desecare a precipitatului de biomas; - evacuarea defectuoas a biomasei cu ajutorul racletei de desprindere. Aceste deficiene au fost eliminate prin construcia unor utilaje mai performante, cum ar fi filtrul Oliver perfecionat (fig. 2.8) [25]. Acesta utilizeaz un cap de distribuie care elimin frecrile ntre suprafeele metalice. Suprafaa i grosimea biomasei depuse pe filtru sunt uniformizate cu ajutorul unui dispozitiv cu rulori care conduc o pnz cu rol de egalizare a grosimii, stoarcere i astupare a fisurilor n stratul de precipitat. n locul pnzei se poate folosi un rulou de presare, apa din precipitat fiind ndeprtat mai bine. Desprinderea precipitatului se poate face att cu ajutorul racletei, ct i prin intermediul sforilor, lanurilor sau a unor rulouri de preluare din cauciuc.

lichid de splare

biomas

Figura 2.8. Filtru rotativ celular cu vid perfecionat a zon de filtrare; b zon de splare; c zon de desprindere a precipitatului. n medalion: desprinderea precipitatului cu ajutorul ruloului de preluare

Dimensionarea filtrelor se bazeaz pe stabilirea suprafeei necesare de filtrare, A. n cazul filtrelor aflate curent n exploatare, aceasta variaz ntre 5 i 40 m2 [4, 25].
29

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

Pentru o durat t a filtrrii impuse, cunoscndu-se fora motoare a filtrrii (P), caracteristicile suspensiei i ale precipitatului, aria filtrului n funcie de debitul de suspensie prelucrat se determin pe baza ecuaiei (2.3). Pentru precipitate compresibile, valoarea VS obinut prin calcul se corecteaz prin nmulire cu coeficienii K1 i K2:
(VS ) corectat = K1 K 2 (VS ) calculat unde : K1 = 50 ; K 2 = P CS

(2.7)

Pentru filtrele rotative continue, t reprezint durata unui ciclu de filtrare, putndu-se calcula cu relaia: 1 t= [s] (2.8) n 100 n care n reprezint turaia filtrului (s-1), iar reprezint gradul de scufundare al filtrului n mediul supus filtrrii (%). Viteza de filtrare se determin n funcie de volumul de filtrat obinut pe unitatea de suprafa de filtrare ntr-un ciclu de filtrare: (V ) (2.9) v f = S corectat [m3/(m2.s)] t Valorile vitezei de filtrare calculate n acest mod sunt apropiate de valorile experimentale prezentate n tab. 2.4 [4].
Tabelul 2.4. Viteza de filtrare a unor lichide de fermentaie [4]
Lichid de fermentaie (produs) Penicillium (peniciline G i V) Streptomyces S. kanamyceticus (kanamicina) S. fradiae (neomicina) S. lincolnensis (lincomicina) Bacillus subtilis (proteaze) Hidrolizat de drojdii CS [kg/m3] 50 28 Caracteristicile filtratului r [Pa.s] [m/kg] 10,3 3,92 3,1.1011 1,6.1014 Tipul filtrului filtru rotativ cu vid filtru rotativ cu strat adjuvant filtru pres filtru rotativ cu strat adjuvant filtru rotativ cu strat adjuvant 18,5 9,8 3,5.1012 filtru pres filtru rotativ cu strat adjuvant filtru rotativ cu strat adjuvant filtru rotativ cu strat adjuvant vf [L/(m2.h)] 238 - 256 1413 - 1848 12,5 87 130 58 380 109 - 435 304

Tabelul 2.5. Viteza de filtrare a lichidelor de fermentaie a P. Chrysogenum (P = 0,054 MPa, = 40 %)

r [m/kg] 2.1011 3.1011 5.1011 n = 1 rpm 1140 875 606 Viteza medie de filtrare, vf [L/((m2.h)] la n = 2 rpm n = 3 rpm n = 4 rpm 740 617 530 615 500 342 432 356 306 n = 5 rpm 407 390 375

30

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

n funcie de viteza de filtrare se determin turaia optim a tamburului, la diferite valori ale rezistenei precipitatului depus (r) i ale gradului de scufundare a filtrului n suspensie (). n tab. 2.5 este prezentat dependena dintre viteza de filtrare, r i pentru filtrarea lichidelor de fermentaie ale P. Chrysogenum, la biosinteza penicilinelor G i V. Pentru capaciti de producie mici se pot utiliza i filtrele pres, care acumuleaz treptat biomasa i sunt deschise periodic pentru ndeprtarea precipitatului. Aceste filtre sunt operate n regim discontinuu i de regul ndeprtarea precipitatului este operaia cea mai costisitoare i mai greoaie, necesitnd munca manual. Recent au fost introduse n practic filtrele presurizate Larox, care funcioneaz n regim pseudocontinuu i se preteaz la automatizare pe scar larg. Un astfel de filtru este alctuit din mai multe uniti de filtrare identice (fig. 2.9), amplasate pe nlime, prin care trece o band filtrant fr sfrit ghidat prin intermediul unor role de capt. Fiecare unitate de filtrare este alctuit din trei camere amplasate una peste alta. Camera superioar este separat de camera intermediar prin intermediul unei membrane elastice, n timp ce camera intermediar este separat de camera inferioar de ctre pnza filtrant.
1 6

5 7 2

4 3

Figura 2.9. Unitate de filtrare a unui filtru presurizat Larox

1 camera superioar; 2 camera intermediar; 3 camera inferioar; 4 pnza filtrant; 5 membran elastic; 6 racord de alimentare cu ap sub presiune; 7 racord de alimentare cu suspensie/ap de splare/aer comprimat; 8 racord de evacuare a filtratului.

n forma sa cea mai complet, procesul de filtrare decurge n ase etape succesive. Toate unitile de filtrare lucreaz simultan, fiecare dintre ele gsindu-se n aceeai etap a filtrrii. n prima etap, de filtrare propriu-zis, se umple camera intermediar cu suspensia supus filtrrii. Sub aciunea forei gravitaionale, faza solid se depune pe banda filtrant, iar lichidul trece prin aceasta, ptrunznd n camera inferioar, de unde este evacuat. n a doua etap, de stoarcere a precipitatului, n camera superioar se introduce ap sub presiune. Aceasta deformeaz membrana elastic provocnd stoarcerea mecanic a precipitatului aflat n camera intermediar. n a treia etap, de splare, n timp ce apa sub presiune este evacuat din camera superioar, n camera intermediar se introduce peste precipitat ap pentru splarea precipitatului. Aceasta se poate colecta mpreun cu filtratul sau separat. A patra etap const n
31

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

stoarcerea precipitatului splat, prin pompare de ap sub presiune n camera superioar, deasupra membranei elastice. Etapa a cincea o reprezint uscarea precipitatului. Pe msur ce apa sub presiune prsete camera superioar, n camera intermediar se introduce aer comprimat deasupra precipitatului. Aerul trece prin stratul depus pe filtru realiznd uscarea. A asea i ultima etap este cea de descrcare a precipitatului. Toate unitile de filtrare se deschid, iar pnza filtrant execut o micare de deplasare fiind ghidat de rolele de capt exterioare. La trecerea pnzei peste role, sub aciunea forei gravitaionale, sau prin intermediul unor raclete, precipitatul se desprinde de pe pnz i cade pe un dispozitiv colector. Pnza filtrant este splat automat. Dup ce pnza filtrant a avansat de la o unitate de filtrare la alta, unitile se nchid i se reia ciclul de filtrare. Etapele procesului de filtrare sunt redate n fig. 2.10. Principalele caracteristici ale acestor filtre sunt redate n tab. 2.6.
Tabelul 2.6. Caracteristici constructive ale filtrelor presurizate Larox [29]
Caracteristica Suprafa filtrant Capacitate maxim Presiune de operare Putere consumat: - uniti de 9,5 38 m2 - uniti de 48 144 m2 18,5 kW (5,5 15 kW pentru presare diafragme) 86 kW (diafragme acionate pneumatic) 1,6 144 m2 150 t/h substan uscat max. 1,6 MPa Valoare

Utilizarea filtrelor presurizate Larox n industria produselor de biosintez a condus la realizarea de economii importante, n special prin creterea gradului de recuperare al filtratului. S-au redus de asemenea cu pn la 50% pierderile de miceliu, iar randamentele de recuperare au crescut de la 94 la 98 %, pe fondul scderii costurilor de filtrare. Separarea masei celulare din lichidele de fermentaie ale bacteriilor, actinomicetelor, a hidrolizatelor celulare se face mult mai dificil dect n cazul biomaselor fibroase. Aceasta se explic prin caracterul mucilaginos al masei celulare care obtureaz rapid porii materialelor filtrante. n acelai timp, trebuie remarcat dezavantajul creat de nestandardizarea mediilor de cultur, manifestat prin inconstana de la o arj la alta a principalilor parametri care determin filtrabilitatea: coninutul de suspensii, viscozitatea, caracteristicile biomasei, coninutul de proteine, etc [4]. ntruct ncercrile de separare a antibioticelor cu schimbtori de ioni direct din suspensia celular, utilizarea centrifugelor sau a filtrelor pres nu au dat rezultatele scontate, s-a ajuns la concluzia c rezolvarea problemei filtrrii lichidelor de fermentaie trebuie nceput cu modificarea radical a caracteristicilor de filtrabilitate a acestora, n scopul mririi vitezei de filtrare i a pierderilor de produse utile. n scopul mririi vitezei de filtrare, lichidele de fermentaie se supun unor tratamente preliminare termice, acide sau cu ali ageni chimici, n scopul coagulrii moleculelor proteice i a agregrii biomasei, cu sau fr adugarea suplimentar a unor materiale cu rol de strat adjuvant (materiale poroase obinute din diferite roci vulcanice:
32

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

perlit, supercel, dicalit, sau din resturi ale exoscheletelor diatomitelor: kieselgur). Alegerea metodei de prelucrare preliminar este determinat de caracteristicile lichidului de fermentaie, de natura produsului biosintetizat (stabilitate chimic i termic), precum i de caracteristicile precipitatelor formate.

1. Filtrare Filtrat 2. Stoarcere Filtrat 3. Splare Filtrat 4. Stoarcere post-splare Filtrat 5. Uscare Filtrat 6. Evacuare precipitat Precipitat Ap sub presiune Aer comprimat Ap sub presiune Ap de splare Ap sub presiune Suspensie

Ap sub presiune

Precipitat

Figura 2.10. Etapele procesului de filtrare ntr-un filtru presurizat Larox 33

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

Adjuvanii de filtrare se pot aduga fie nainte de filtrarea lichidului de fermentaie, formnd un strat care previne blocarea porilor materialului filtrant de ctre masa celular fie prin amestecare direct cu lichidul de fermentaie (fig. 2.11). Aceast ultim metod se recomand doar dac produsul util este extracelular. Adaosul de adjuvani mrete costul filtrrii, cantitatea minim de adjuvant stabilindu-se experimental (fig. 2.12). Kieselgurul adsoarbe lichid, i ca urmare, dac produsul util se gsete n faza lichid, vor aprea pierderi suplimentare. Alt dezavantaj este acela c dei adjuvanii mresc viteza de filtrare, limpiditatea filtratului scade. Apar probleme suplimentare i cu depozitarea precipitatului: biomasa cu coninut de kieselgur, de ex., nu poate fi utilizatn hrana animalelor dect dup ndeprtarea adjuvantului.
Adjuvant adugat anterior filtrrii lichidului de fermentaie Precipitat format din masa celular i adjuvant

Productivitatea filtrului, L/m2

kieselgur mare

Direcia de curgere a lichidului de fermentaie

Filtrat

kieselgur mijlociu kieselgur fin fr kieselgur

Durata filtrrii, minute

Pnza filtrant Adjuvant adugat n lichidul de fermentaie

Figura 2.11. Utilizarea adjuvanilor n filtrarea lichidelor de fermentaie [3]

Figura 2.12. Efectul adaosului de kieselgur asupra productivitii filtrrii [25]

Prin coagulare, rezistena stratului depus i rezistena total (rezistena stratului + rezistena materialului filtrant care are depunerile reinute n pori) se reduc semnificativ (cu circa 2 ordine de mrime: de la 1013 1014 la 1011 1012). Reducerea rezistenelor la filtrare a permis utilizarea filtrelor continue de tipul filtrelor rotative cu vid i cu strat adjuvant, a cror vitez de filtrare este de 100 300 L/(m2.h) [4]. Un astfel de filtru este filtrul cu rennoirea suprafeei de filtrare. Acesta este un filtru Oliver prevzut cu un cuit cu avansare micrometric, care n timpul funcionrii se deplaseaz ndeprtnd biomasa depus mpreun cu stratul superficial de adjuvant. Depunerea stratului de adjuvant (dicalit de calitate medie i grosier) pe materialul filtrant (sit metalic cu ochiuri de 150 200 m sau estur sintetic) se realizeaz naintea nceperii operaiei de filtrare a biomasei. n timpul depunerii adjuvantului, viteza de filtrare se regleaz cu ajutorul vidului astfel nct n 45 60 min s se depun un strat gros de 20 100 mm. Apoi se regleaz viteza de naintare a cuitului micrometric, care s corespund unei deplasri de 0,15 0,45 mm n timpul 34

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

unei rotaii complete a tamburului. n cuva filtrului se introduce lichidul de fermentaie, n prealabil tratat chimic sau termic, i se filtreaz pna cnd pe suprafaa tamburului rmne un strat de adjuvant cu grosimea de 5 8 mm. Un ciclu de filtrare dureaz 6 24 h. Durata ciclului de filtrare se poate calcula cu relaia: hi h f t= (2.10) 60 h n n care t este durata ciclului de filtrare [h], hi i hf sunt respectiv grosimea iniial i final a stratului de adjuvant [mm], h este adncimea ptrunderii cuitului micrometric la o rotaie a tamburului [mm], iar n este turaia tamburului [rot/min]. Turaia tamburului influeneaz semnificativ procesul de filtrare. O dublare a turaiei, de la 0,5 la 1,0 rot/min conduce la dublarea aproape a vitezei de filtrare. Cea mai important cretere a vitezei de filtrare pentru biomasele bacteriene i actinomicetice se produce la turaii de 0,5 0,66 rot/min. La mrirea turaiei de la 0,66 la 1,0 rot/min, ritmul de cretere a vitezei de filtrare se diminueaz, iar consumul de adjuvant crete cu 0,1%. Nu se recomand creterea turaiei peste 1,0 rot/min ntruct stratul de biomas nu se deshidrateaz suficient, datorit micorrii duratei etapelor de uscare [4].
2.4. SEPARAREA PRIN CENTRIFUGARE

Centrifugarea este o tehnic de lucru care permite realizarea unor procese de separare (sedimentare, filtrare, spargerea emulsiilor, extracie, etc.) ntr-un cmp de fore centrifugal, procese care uneori sunt dificil sau chiar imposibil de realizat numai sub aciunea gravitaiei. Acest capitol trateaz numai procesele i aplicaiile referitoare la sedimentarea n cmp de fore centrifugal. n biotehnologii, centrifugarea are numeroase aplicaii: separarea masei celulare din lichidele de fermentaie, ndeprtarea resturilor celulare, colectarea precipitatelor, prepararea unor medii de fermentare, separarea diferitelor tipuri de celule, extracia diverilor componeni (alcaloizi, arome, uleiuri eseniale din plante, antibiotice din lichidul de fermentaie, steroizi, proteine), etc. Prima aplicaie a separrii centrifugale n industria alimentar a fost n procesul de smntnire a laptelui, iar n biotehnologie la recoltarea masei celulare n fabricarea drojdiei de panificaie.
2.4.1. Bazele teoretice ale sedimentrii n cmp de fore centrifugal

Fora centrifug, ca i gravitaia este o for masic. Dac o particul de mas m se rotete cu o vitez unghiular la o raz r fa de centrul de rotaie, asupra acesteia se manifest o fora centrifug FC = m2r orientat n direcie radial. Prin analogie cu expresia forei gravitaionale, FG = mg, acceleraia centrifugal este 2r. n centrifugele de sedimentare, 2r >> g, astfel nct forele gravitaionale se pot neglija. Raportul dintre fora centrifug i fora gravitaional: z= FC m 2 r = FG g (2.11)
35

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

denumit i factor de eficacitate, este utilizat deseori ca o msur a puterii de separare a unei centrifuge. Fora centrifug este suficient de mare pentru a contracara forele browniene de difuziune, care, n sedimentarea gravitaional, ncetinesc sau chiar mpiedic depunerea particulelor foarte fine. Deoarece eficiena separrii este n principal afectat de comportarea celor mai mici particule din sistem, iar aceste particule au de obicei numere Reynolds mici (deplasarea lor fiind n domeniul curgerii viscoase), se poate considera c sedimentarea decurge n regim laminar, iar deplasarea acestor particule decurge n conformitate cu legea lui Stokes. n conformitate cu aceasta, viteza de sedimentare a particulelor sferice n cmp de fore centrifugal este: 1 ( l ) 2 2 2 ( l ) 2 2 v0C = c dc r = c d c ( n ) r (2.12) l l 18 9 n care c, l, l, dc au aceleai semnificaii ca i n ecuaia (2.1), este viteza unghiular a tamburului centrifugei [rad/s], r este distana pe care o parcurge particula de la suprafaa lichidului pn la peretele tamburului, iar n este turaia centrifugei [rot/s]. Comparnd ecuaiile (2.1) i (2.12) se poate scrie c:
v0C = v0G

2 r
g

= v0G z

(2.13)

adic viteza de sedimentare n cmp centrifugal este de z ori mai mare dect n cmp gravitaional. n centrifugele industriale, z variaz ntre 300 i 16 000; pentru centrifuge mici de laborator z poate atinge i 500 000 [30]. Sedimentarea are loc prin axa de rotaie deplasarea particulei dinspre centrul de deversare rotaie ctre peretele tamburului (fig. lichid 2.13). Creterea vitezei de deplasare a suprafaa particulei va mbunti sedimentarea. 1 lichidului Din ecuaia (2.12) se poate observa c 2 viteza particulei ntr-o centrifug dat traiectoriile poate fi crescut prin: particulelor solide - creterea vitezei () respectiv turaiei (n) centrifugei; - creterea diametrului particulei, dc; peretele - creterea diferenei de densitate tamburului dintre particul i lichid c l; - scderea viscozitii fazei lichide l. alimentare Durata sedimentrii, respectiv suspensie timpul necesr ca o particul s ajung de la suprafaa lichidului (r1) pn la Figura 2.13. Separarea particulelor solide peretele tamburului (r2) se poate ntr-o centrifug tubular continu calcula prin integrarea expresiei vitezei de sedimentare: v0C
36

dr 1 ( c l ) 2 2 = = dc r l dt 18

1 ( l ) 2 2 2 dt = c 18 l dc r dr 0 r1
t

(2.14)

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Integrnd ecuaia (2.14) se obine timpul necesar sedimentrii particulelor de diametru dc: 18l r t= 2 ln 2 (2.15) 2 d c ( c l ) r1

Cu ct particulele sunt mai mici, cu att timpul necesar sedimentrii lor este mai mare. Pentru atingerea duratei necesare sedimentrii, centrifugele discontinue sunt operate un timp cel puin egal cu durata sedimentrii. n cazul centrifugelor continue, atingerea duratei necesare sedimentrii, respectiv creterea timpului, se face prin micorarea debitului de alimentare cu suspensie. La un timp de sedimentare dat, se poate calcula diametrul minim al particulelor care sedimenteaz. Pentru centrifuge tubulare discontinue, diametrul minim al particulelor care sedimenteaz este: dm = 3 r2 r1 ( c l ) t 2l ln

(2.16)

iar pentru centrifuge tubulare continue: dm = 3 r2 2l m r1 V 2 ( c l ) L (r2 r12 ) ln

(2.17)

n care mV este debitul de alimentare cu suspensie [m3/s], iar L este lungimea tamburului centrifugei [m]. Performanele centrifugelor de diferite mrimi pot fi comparate prin intermediul factorului sigma, , concept introdus de ctre Ambler n 1952 [31]. Ca sens fizic, reprezint aria transversal echivalent a unui decantor gravitaional care ar produce acelai efect de sedimentare ca i centrifuga [3, 25]. Pentru centrifugele continue: m = V (2.18) 2v0G
unde mV este debitul de alimentare cu suspensie [m3/s], iar v0G este viteza de sedimentare n cmp gravitaional. Pentru mai multe centrifuge, de construcie asemenea, care separ aceeai suspensie (v0G = constant): mV 1 mV2 = = L = 2v0G = const (2.19) ecuaie care servete pentru compararea centrifugelor i pentru transpunerea model prototip; se recomand ca scara de transpunere s nu fie mai mare de 2 [25]. Ecuaiile pentru evaluarea factorului sigma depind de tipul constructiv al centrifugei. Pentru centrifugele cu talere conice [31]:
= 2 2 ( N 1) 3 3 r2 r1 3 g tan

(2.20)

n care, pe lng termenii definii anterior, N reprezint numrul de talere, r2 i r1 reprezint respectiv raza exterioar i cea interioar a talerului [m], iar este unghiul la vrf al talerului conic.
37

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

Pentru centrifuge tubulare, ecuaia (2.21) permite calculul factorului sigma cu o eroare de pn la 4% [32, 33]:
2 L 2 2 L r 2 2 2 = 3r2 + r1 = g g

(2.21)

n care L este lungimea tamburului, r1 este raza la suprafaa lichidului, iar r2 este raza peretelui interior al tamburului. Deoarece ntr-o centrifug tubular r1 i r2 au valori apropiate, se pot nlocui cu o raz medie r. Pentru centrifugele decantoare continue cu transportor elicoidal se poate utiliza ecuaia [34, 35]:
3 2 1 2 r 2 + 3r2 r1 + 4r12 (2.22) L1 r2 + r1 + L2 2 2 4 2 n care r1 i r2 reprezint respectiv raza interioar a lichidului i raza interioar a tamburului, L1 este lungimea prii cilindrice a tamburului, iar L2 este lungimea prii conice a acestuia. ntruct ecuaiile (2.20) (2.22) Tabelul 2.7. Factorul de eficien sunt valabile pentru condiii ideale de pentru diferite tipuri de centrifuge [36] operare, utilizarea lor pentru compararea Tipul de Factorul de diferitelor echipamente trebuie ntotdeauna centrifug eficien [%] nsoit i de teste experimentale, prin Cu talere conice 45 73 acestea evideniindu-se influena formei i Decantoare 54 67 Tubular 90 98 mrimii particulelor, a aglomerrii particulelor, a distribuiei neuniforme a curgerii n centrifug asupra performanelor centrifugelor. Date experimentale generalizate au permis stabilirea unor factori de eficien (tab. 2.7) care corecteaz ecuaia (2.18): (mV )real = v0G (2.23) = 2 g
2.4.2. Tipuri de centrifuge utilizate n procesele de bioseparare

n funcie de forma constructiv a tamburului centrifugei i de modul de evacuare a fazei solide, exist cinci tipuri principale de centrifuge de sedimentare (fig. 2.14) [35]. Centrifuga tubular. Din ecuaiile (2.11) (2.13) rezult c factorul de eficacitate al centrifugelor crete cu raza rotorului i cu ptratul turaiei; pe de alt parte, solicitarea mecanic a peretelui crete cu ptratul razei i cu ptratul turaiei [25]. Ca urmare a acestor dou rezultate, centrifugele cu eficaciti nalte sunt caracterizate constructiv printr-un tambur cilindric cu diametru mic, care se rotete cu turaie foarte mare. Rotorul tubular, antrenat la partea superioar de un electromotor, este nchis la ambele capete (pentru centrifugele discontinue) sau deschis (pentru centrifugele continue fig. 2.15). Rotorul este nchis ntr-o manta de protecie, care asigur i alimentarea cu suspensie la partea inferioar, precum i evacuarea produselor la partea superioar. Lichidul evacuat este pompat printr-un disc distribuitor, pentru a evita formarea aerosolilor sau a spumei. Pentru ndeprtarea fazei solide acumulate la
38

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

periferie, centrifuga trebuie oprit i demontat. Diametrul tamburului poate ajunge pn la 130 mm, putnd reine pn la 6 L de faz solid. n modelele industriale, factorul de eficacitate poate ajunge pn la 20 000 [37]. Aceste echipamente sunt utilizate frecvent n bioprocese, pentru separarea de vaccinuri, snge, baterii, etc.
Tipuri de centrifuge de sedimentare
Centrifuga tubular Centrifuga cu camere Centrifuga cu co neperforat Centrifuga decantoare cu transportor elicoidal Centrifuga cu talere Cu reinerea fazei solide Cu evacuarea fazei solide Cu duze de evacuare a fazei solide operare discontinu descrcare intermitent descrcare continu operare discontinu, descrcare manual operare semicontinu, descrcare intermitent operare i descrcare continu

Figura 2.14. Clasificarea centrifugelor de sedimentare [35] Centrifuga cu camere. Aceast centrifug utilizeaz un tambur nchis divizat n mai multe compartimente/camere (2 6) cilindrice verticale, pe care suspensia i parcurge consecutiv. innd seama de razele camerelor, acestea au factorul de eficacitate cresctor, de la interior spre exterior. Se poate realiza astfel o centrifugare fracionat, solidele de dimensiuni mari depunndu-se n camerele interioare, iar cele fine n camerele exterioare. n fig. 2.16 este prezentat o astfel de centrifug cu funtionare semicontinu: alimentarea cu suspensie i evacuarea decantatului sunt continue, iar ndeprtarea sedimentului este discontinu, necesitnd dezasamblarea centrifugei. Decantatul este evacuat prin intermediul unei pompe centripete (dispozitiv cu pipe similar unei pompe centrifuge cu funcionare invers: carcasa se rotete iar rotorul este staionar) care transform energia cinetic a lichidului la evacuare n for de presiune. Eficiena unei astfel de centrifuge este ridicat, datorit timpului de staionare ridical al lichidului n utilaj. Curirea este n schimb dificil, fapt care limiteaz concentraia suspensiei iniiale la 4 5 % v/v faz solid. Astfel de centrifuge lucreaz la 4500 8500 rot/min, putnd prelucra debite de 2,5 10 m3/h, la un diametru al tamburului de 335 615 mm, avnd o capacitate de reinere a solidelor de pn la 75 L [35]. Unele modele includ canale de rcire n interiorul pereilor tamburului, o manta de rcire exterioar i rcire a pompei centripete [37]. Sunt utilizate n special n industria alimentar pentru clarificare berii, vinului sau a sucurilor de fructe. 39

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

1 5 6

alimentare evacuare lichid centrifugat 2

suspensie evacuare lichid centrifugat 4

faza grea

faza uoar
3
3

suspensie/emulsie

Figura 2.15. Centrifug tubular

1 arbore; 2 tambur tubular; 3 alimentare cu emulsie/suspensie; 4 disc distribuitor; 5 evacuare faz grea; 6 evacuare faz uoar.

Figura 2.16. Centrifug cu camere

1 arbore; 2 alimentare suspensie; 3 perei cilindrici formnd camere; 4 dispozitiv cu pipe pentru evacuarea lichidului centrifugat.

Centrifuga decantoare cu transportor elicoidal. Este echipat cu un tambur conic sau cilindro-conic orizontal avnd un raport lungime : diametru de 1,5 : 3,5. Tamburul conine un transportor elicoidal care se rotete n aceeai direcie, dar cu o vitez uor diferit (5 100 rot/min). n aceste echipamente, forele centrifuge sunt mai mici dect n alte tipuri constructive; la turaii de 1600 6000 rot/min, factorul de eficacitate poate ajunge pn la maximum 5000. Construciile speciale pot atinge un factor de eficacitate de pn la 10 000 [37]. Centrifuga din fig. 2.17 b este alctuit dintr-un tambur conic exterior i un tambur cilindric, coaxial, interior, mprit n trei compartimente, dintre care cele dou din stnga au guri pe peretele lateral. Pe peretele exterior al tamburului cilindric este fixat un transportor elicoidal care se rotete solidar cu acesta, dar cu o turaie ceva mai mic. Suspensia este alimentat printr-un tub axial n compartimentul din mijloc al tamburului cilindric i este separat, prin centrifugare, n dou faze. Faza lichid se adun la baza conului tamburului exterior, de unde deverseaz, prin deschiderile laterale, spre racordul de evacuare. Sedimentul este preluat de pe pereii tamburului conic de ctre transportorul elicoidal i este deplasat ctre vrful conului. n drumul su, sedimentul este splat de ctre lichidul de splare adus n compartimentul din stnga al tamburului interior. Lichidul de splare se amestec i iese mpreun cu lichidul din suspensia iniial. 40

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

suspensie
4

lichid
1 3 9

ap de splare

solide

a.

solide

b.

lichid

Figura 2.17. Centrifug decantoare cu transportor elicoidal

a cu tambur cilindro-conic; b cu tambur conic. 1 arbore tubular pentru rotirea tamburului exterior; 2 tambur exterior (cilindro-conic sau conic); 3 arbore tubular pentru rotirea tamburului cilindric interior; 4 alimentarea suspensiei; 6 intrarea apei de splare; 7 suprafaa lichidului separat; 8 deschideri reglabile pentru deversarea lichidului; 9 deschideri pentru evacuarea sedimentului.

Centrifuga cu talere (separatorul cu talere) a fost conceput cu scopul de a micora distana parcurs de fazele suspensiilor sau emulsiilor. Prin table subiri, de form conic, se mparte volumul lichidului din centrifug ntr-un numr mare de straturi conice, nuntrul crora se face separarea fazelor. Faza grea se ndreapt spre exterior, ajunge la faa interioar a conului imediat superior pe care coboar spre periferia centrifugei i mai departe ctre dispozitivul de colectare i evacuare. Faza uoar se ndreapt spre centru, pe faa superioar a conului inferior i este condus separat ctre un alt dispozitiv de colectare i evacuare (fig. 2.18). n timpul centrifugrii, concentraia lichidului dintre talere variaz continuu de la concentraie mic n faza uoar (n apropierea prii centrale) la concentraie mare n faz grea (la periferie). Lichidul alimentat ntre discuri nu trebuie s deranjeze acest echilibru al concentraiilor; pentru aceasta discurile au orificii mari de alimentare n dreptul locului unde concentraia iniial a emulsiei/suspensiei corespunde concentraiei locale dintre discuri (practic locul orificiilor se plaseaz astfel nct faza care trebuie s rezulte n puritate mai mare s parcurg o distana mai mare ntre discuri). Amestecul supus separrii coboar prin tubul central i intr, de jos n sus, prin orificiile de alimentare din discuri n spaiul dintre acestea. Dup separare, faza uoar este colectat lng tubul central, iar faza grea la periferia tamburului. Pentru a evita curirea frecvent a fazei solide, operaie care necesit oprirea i demontarea, aceste centrifuge se utilizeaz la concentraii reduse de faz solid (sub 1 % v/v). Capacitatea tipic de reinere de solide este de 5 20 L. Sunt utilizate pe scar larg pentru separarea grsimilor din lapte. Pentru suspensii cu coninut mai ridicat de faz solid se folosesc centrifuge cu descrcare intermitent sau continu a fazei solide. Centrifuga cu descrcare intermitent a solidelor (fig. 2.19 a) este prevzut cu un numr de deschideri periferice nchise cu valve. Deschiderea valvelor se face prin intermediul unui mecanism controlat fie de un temporizator, fie de un senzor al grosimii stratului de sediment. Astfel de echipamente sunt folosite pentru suspensii care conin 2 6% v/v faz solid, sau pentru suspensii n care faza solid are tendina de sfrmare sau dezagregare la solicitri prin forfecare mari. Sunt utilizate pentru limpezirea diferitelor sucuri i extracte alimentare. 41

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

Alimentare Faza uoar Faza grea

Faza uoar

Faza grea

Solide

Alimentare

Flocularea particulelor

Coalescena picturilor

Figura 2.18. Centrifug cu talere cu reinerea fazei solide

alimentare suspensie evacuare lichid limpede

alimentare suspensie

evacuare lichid limpede

solide

solide

mecanism pentru deschiderea gurilor de evacuare a solidului

a.

b.

duze pentru evacuarea solidului

Figura 2.19. Centrifuge cu talere: a cu descrcarea intermitent a fazei solide; b cu duze pentru descrcarea fazei solide. 42

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Descrcarea continu a fazei solide sub form de nmol este posibil prin intermediul unor duze de evacuare amplasate simetric la periferia diametrului maxim al tamburului (fig. 2.19 b). Numrul i dimensiunile acesor duze sunt corelate astfel nct s se evite nfundarea acumularea fazei solide i nfundarea, dar i pentru meninerea unei concentraii rezonabile a nmolului evacuat. Uzual o astfel de centrifug are 12 24 duze cu deschiderea de 0,75 2 mm. Unele variante constructive permit recircularea parial a nmolului evacuat, splarea nainte de evacuare, etc. [35]. Centrifuga cu descrcare sub presiune a concentratului. Suspensiile de drojdii, bacterii, precum i unele precipitate proteice au o comportare pseudoplastic: viscozitatea aparent scade cu creterea vitezei de forfecare. Ca urmare a acestui fapt ele pot curge prin tuburi i canale chiar la concentraii ridicate. Concentratul adunat la periferia tamburului (fig. 2.20) este mpins de presiunea lichidului de alimentare, prin intermediul unor duze, ctre pompa centripet aflat la partea inferioar a rotorului. Aceasta preia concentratul i l evacueaz prin axul centrifugei. Aceste centrifuge sunt utilizabile numai pentru fluide pseudoplastice care nu mai au i alt fel de particule n componen.
concentrat de celule alimentare suspensie evacuare decantat (faza uoar) tambur discuri carcas

alimentare cu suspensie

lichid de cultur

insert de unic folosin manon de protecie

concentrat de celule (faza grea) pompe peristaltice tuburi de legtur

duze colectare concentrat rotor pomp centripet

Figura 2.20. Centrifug cu descrcare sub presiune a concentratului de celule

Figura 2.21. Insert de unic folosin utilizat n centrifugele Centritech

Centrifuga Centritech este prevzut n rotor cu un insert din plastic de unic folosin (fig. 2.21), n care lichidul de alimentare este introdus la partea superioar, iar lichidul centrifugat iese pe la partea superioar a captului opus al insertului. Faza grea (concentratul de celule) este evacuat intermitent prin ieirea de la partea inferioar. Aceast centrifug, cu un factor de separare de maximum 100 este utilizat pentru separarea celulelor animale din lichidul de cultur [38]. n tabelul 2.8 sunt prezentate caracteristicile principale ale centrifugelor utilizate n procesele de bioseparare. 43

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie Tabelul 2.8. Caracteristici ale separatoarelor centrifugale utilizate n biotehnologii
Tip Tubular Cu camere Decantoare cu transportor elicoidal Cu talere Descrcarea solidului* M M C M Debit alimentare [L/h] 20 7000 100 20000 20 120000 20 100000 20 100000 1000 150000 Coninut de solide [% vol.] <1 <5 5 50 <1 Debit solide [L/h] 0 0 < 50000 0 400 25000 1000 300000 1.000 170.000 110000 220000 Factor [m2] 1400 4500 Factor eficacitate z < 31000 < 9000 < 10000 < 10000 Aspect solide** PC PC NGS PC

Cu talere, desI < 25 < 3000 < 14500 NGF crcare radial Cu talere, desI < 15 < 1000 < 15000 NGF crcare axial Cu talere, des300 3000 35000 crcare cu C 2 30 < 11000 NS 250000 60000 180.000 duze Cu talere, des1000 150 69000 C 4 30 < 15000 NGF crcare sub 180000 40000 180000 *** presiune Centritech**** I 5 100 <1 < 15 na < 100 NFS (*) M manual; I intermitent; C continuu; (**) PC past consistent; NGS nmol gros semisolid; NGF nmol gros fluid; NS nmol subire; NFS nmol foarte subire; (***) Numai pentru crem de agregate monocelulare; (****) Numai pentru celule animale.

2.4.3.

Aplicaii ale separrii centrifugale n biotehnologii

Cea mai important utilizare a centrifugelor n biotehnologii este recoltarea celulelor, indiferent dac produsul este extracelular, intracelular sau este chiar celula nsi (fig. 2.22). n aval de recoltare, numrul aplicaiilor centrifugelor crete. Ele se pot utiliza pentru clasare (sortare dup dimensiuni), deshidratare, extracie lichid lichid, recuperarea precipitatelor. Aplicaiile prezentate mai jos nu sunt exhaustive, fiind date doar cu titlu exemplificativ; practic exist nenumrate variante de procese de separare n aval de bioreactor care implic i tehnici de centrifugare.
2.4.3.1. Separarea drojdiilor

Concentrarea drojdiei de panificaie s-a numrat printre primele aplicaii ale centrifugelor cu talere. La ora actual se utilizeaz centrifuge cu descrcare prin duze, sub presiune, a cremei de drojdie. Debitele vehiculate sunt printre cele mai mari din biotehnologii, pn la 150 m3/h lichid de fermentaie, cu pn la 25 % v/v celule de drojdie. Drojdia este apoi splat pentru creterea duratei de via. Raportul mV/ (ec. 2.19) este de circa 2.10-7 m/s, la o reducere de 99,9% a numrului de celule.
44

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Produse extracelulare

Corpi de incluziune

Produse intracelulare

Figura 2.22. Utilizarea separatoarelor centrifugale pentru recoltarea celulelor

n fabricile de bere, centrifugele sunt utilizate n mai multe etape ale procesului tehnologic. Dup fermentare, berea tnr conine pn la 80.106 celule/mL (2% v/v), pentru clarificarea ei fiind folosite centrifuge cu talere cu descrcare radial a fazei solide, prevzute cu dispozitive speciale de evacuare, pentru evitarea contactului cu atmosfera. Debitele vehiculate sunt de circa 75 m3/h. nainte de filtrarea final a berii, coninutul de mas celular al acesteia este mai redus, putndu-se utiliza centrifuge cu capaciti mai mici de reinere a fazei solide (fig. 2.23). Forma dispozitivului de intrare Figura 2.23. Centrifug din industria berii permite o accelerare treptat blnd, care 1 alimentare lichid; 2 distribuitor de accelerare; favorizeaz separarea proteinelor sensibile 3 talere; 4 pomp centripet; 5 fund culisant;
6 orificii evacuare solide; 7 arbore.

45

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

la forfecare. Tamburul are o singur ieire pentru faza lichid, la partea superioar, printr-o pomp centripet ncorporat. Solidele sunt evacuate radial. Scopul primar fiind cel al ndeprtrii celulelor, raportul mV/ este de circa 5.10-8 m/s. Debitul unor astfel de centrifuge, utilizate i n vinificaie la limpezirea mustului nainte de fermentaie i la limpezirea final a vinului, este de pn la 45 m3/h. Acest tip de centrifuge, n construcie septic, poate fi utilizat i n tehnologia ADN recombinat [37].
2.4.3.2. Separarea bacteriilor

n biotehnologiile moderne, pentru recoltarea bacteriilor se utilizeaz centrifuge cu discuri, cu evacuare sub presiune a masei celulare sau centrifuge decantoare. Pentru microorganisme avnd dimensiuni de circa 1 m se utilizeaz centrifuge cu descrcare axial. Dac concentraia solidelor este mare, necesitnd o frecven de descrcare la mai puin de 60 s, se utilizeaz centrifuge cu descrcare radial, mai costisitoare. Pentru suspensiile curate se poate utiliza centrifuga cu descrcare continu sub presiune prezentat n fig. 2.20. O valoare tipic mV/ pentru o recuperare de 99% a E. Coli K12 este de 10-8 m/s. Celulele de Corynebacterium, de dimensiuni ceva mai mari, ntlnite n biosinteza aminoacizilor, pot fi separate n centrifuge cu duze de descrcare sub presiune a solidelor, iar miceliile de Actinomyces se pot recolta cu centrifuge cu descrcare radial. Ca i n centrifugele cu duze, celulele sunt splate, cel mai adesea n dou trepte, pentru mbuntirea randamentului. Sunt cazuri cnd diluarea i resepararea nu este posibil datorit fragilitii celulelor, care s-ar putea rupe, compromind astfel etapele ulterioare de prelucrare. Pentru evitarea scderii randamentului, celulele trebuie recoltate la o umiditate minim. n aceste condiii se preteaz utilizarea centrifugelor decantoare. Valorile sczute ale acestor echipamente fac obligatorie flocularea celulelor nainte de recoltare. Adaosul de polimeri conduce la o eficien a separrii de 98 99% la rapoarte mV/ de 3.10-7 pentru un lichid de fermentaie cu un coninut de 12 15 % v/v Bacillus subtilis lipsit de spori. Coninutul de substan uscat (SU) al concentratului este de 27 28 % la z = 3200. Rezultatul este comparabil cu al centrifugelor cu duze sau cu descrcare intermitent a fazei solide care dau concentrate cu circa 15% mas bacterian. Capacitatea centrifugelor decantoare de a obine produse cu un coninut ridicat de SU este utilizat pentru concentrarea fazei solide provenite de la centrifugele cu duze sau de la unitile de ultrafiltrare a lichidelor de fermentaie de la biosinteza aminoacizilor sau antibioticelor. Avantajul const n mbuntirea randamentelor i reducerea costurilor cu depozitarea deeurilor. n cazul produciei de proteine monocelulare din hidrocarburi sau derivai ai acestora, bacteriile sunt preconcentrate pn la circa 6% SU n centrifuge cu duze de mare capacitate, iar apoi sunt floculate. Biomasa este apoi deshidratat pn la circa 30% SU n centrifuge decantoare, dup care este granulat i apoi uscat. Faza lichid rezultat din centrifuga decantoare este limpezit n separatoare de mare vitez i trimis la sterilizare mpreun cu lichidul limpede din faza de preconcentrare. De la sterilizare lichidul este recirculat n fermentator [39].
46

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 2.4.3.3. Separarea celulelor animale

n comparaie cu alte tipuri de celule, celulele animale au o vitez de cretere mai redus, sunt susceptibile la infecii prin numeroi virui, i, datorit cvasiabsenei peretelui celular, sunt mult mai fragile i deci sensibile la prelucrarea prin procedeele convenionale. Rolul centrifugrii n biotehnologia celulelor animale este n primul rnd acela de a separa fazele rezultate din bioreactor (fig. 2.24). Centrifugele sunt folosite fie pentru limpezirea masei de celule scoase din bioreactorul discontinuu, fie pentru reinerea masei celulare pentru prelucrare ulterioar, n cazul operrii continue. Realizarea acestor operaii depinde de faza n care se afl produsul util (intra- sau extracelular).
Iniiere cultur Bucl bioreactor preparare inocul Bucl bioreactor producie
Supernatant liber de celule pentru prelucrare n aval de bioreactor

Reciclare celule viabile > 99%

Reciclare celule viabile > 99%

Figura 2.24. Sistem de centrifuge integrat n biotehnologia celulelor animale

Figura 2.25. Centrifuge adaptate prelucrrii celulelor animale: a alimentare uzual; b alimentare hidroermetic; c evacuare prin duze VisCon Datorit fragilitii acestor celule, centrifugele utilizate sunt adaptate special prelucrrii acestora. ntruct celulele animale sunt mai sensibile la forfecare dect bacteriile sau drojdiile, dispozitivele de alimentare cu suspensie de celule i cele de evacuarea masei celulare ale centrifugelor sunt modificate (fig. 2.25). Alimentarea se face printr-un dispozitiv hidroermetic care evit supunerea celulelor la fore de 47

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie forfercare mari, prin alimentarea masei celulare sub nivelul de lichid existent deja n centrifug. Fa de separatoarele centrifugale convenionale cu duze pentru evacuarea solidelor, duzele VisCon patentate de Westfalia AG nu sunt amplasate la periferia tamburului, n zona cea mai deprtat de axa de rotaie, ci pe o circumferin mai mic, nuntrul tamburului. n aceast zon, forele de presiune sunt mai reduse, celulele fiind supuse unor fore de forfecare mai mici. Centrifugele utilizate pentru separarea celulelor animale au de regul factori de eficacitate ridicai (pn la 20 000), posibiliti de curire i sterilizare fr a fi necesar demontarea (CIP1 i SIP2) i metode specifice pentru evacuarea materialului celular acumulat n tambur. Se utilizeaz echipamente cu capaciti de prelucrare de 10 600 L/h (instalaii de laborator i semipilot), dar i de 1 15 m3/h (instalaii pilot i industriale) [40]. Se utilizeaz ns i centrifuge cu factori de eficacitate mici (250 300), cum sunt centrifugele Centritech, de ex. Pentru separarea celulelor animale exist i alte opiuni n afar de centrifugare: filtrarea tangenial, filtrarea n filtre rotitoare, separarea n dispozitive nclinate de sedimentare, mai mult sau mai puin dezavantajoase. 2.4.3.4. Separarea resturilor celulare

n cazurile n care produsele intracelulare nu formeaz corpi de incluziune, resturile celulare se ndeprteaz, de regul, imediat dup dezagregarea celulelor. Separarea este dificil, datorit faptului c prin dezagregare rezult particule foarte fine, de 0,2 0,5 m, i, n plus, viscozitatea sistemului este uzual ridicat. Diluarea suspensiei reduce viscozitatea, dar raportul mV/ reprezint doar 5 10% din valoarea pentru celule ntregi. Este necesar utilizarea centrifugelor cu turaii ridicate, cu evacuarea (continu sau intermitent) a solidelor. Acolo unde este posibil, se recomand flocularea resturilor celulare, n acest mod raportul mV/ putndu-se mri cu cel puin un ordin de mrime. De exemplu, prin flocularea resturilor celulare de drojdii cu borax, se pot ndeprta circa 80% din acestea ntr-o centrifug decantoare (la nivel de instalaie pilot), la o valoare mV/ de 4.10-4 m/s [37]. 2.4.3.5. Recuperarea i splarea corpilor de incluziune

n cazul n care produsul activ intracelular formeaz corpi de incluziune, este preferabil ndeprtarea resturilor celulare i a celorlai componeni celulari nainte de urmtoarea etap de prelucrare. Corpii de incluziune au o vitez de sedimentare mai ridicat dect resturile celulare, astfel nct ntr-o centrifug de clasare corpii de incluziune vor fi reinui, n timp ce resturile celulare vor prsi echipamentul odat cu faza lichid (fig. 2.26). Exist o interdependen puternic ntre metoda de omogenizare (numrul de treceri prin omogenizator, de ex. vezi i capitolul urmtor) i distribuia dup dimensiuni a particulelor rezultate pe de o parte i uurina splrii corpilor de incluziune pe de alt parte [41]. Exist o valoare optim a numrului de treceri.
1 2

CIP cleaning in place = curire pe loc (fr demontare) SIP sterilization in place = sterilizare pe loc (fr demontare)

48

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Separarea prin clasare nu este total, fiind necesar repetarea operaiei. Aceasta se face fie prin resuspendarea corpilor de incluziune separai, n cazul operrii discontinue, fie prin alimentarea continu simultan a concentratului de corpi de incluziune i a apei ntr-un rezervor de alimentare prevzut cu o bun amestecare, continund operaia pn la obinerea puritii dorite. Se utilizeaz centrifuge cu descrcare axial, sau mai bine radial a fazei solide, la un raport mV/ = (12).10-8 m/s. n vederea reducerii consumurilor de reactivi n etapele urmtoare, separarea final se face prin deshidratare, ntr-o centrifug decantoare la mV/ = 2.10-6 m/s [37].

Figura 2.26. Separarea corpilor de incluziune prin clasare centrifugal n procesul de obinere a hormonilor (insulina) 2.4.3.6. Fracionarea plasmei umane

Proteinele din plasma sangvin sunt separate prin procese fizice i chimice, bazate pe modificarea selectiv a trei parametri care afecteaz solubilitatea proteinelor n ap: temperatur, pH i concentraia alcoolului. Sngele uman const din faza roie i plasma limpede. Faza roie (cca. 40% din snge) este separat cu centrifuge speciale direct n punga de colectare de la donator. Plasma rmas este congelat i apoi trecut la fracionare. Doar 5% din plasm este alctuit din produi utili, restul fiind ap i electrolii (fig. 2.27). De aici pot fi extrai numeroi componeni valoroi. mediat dup congelare, din crioprecipitatul rezultat se pot separa concentratul de Factor VIII i complexul protrombinic. Plasma rmas este trecut la fracionare cu etanol prin procedeul Cohn (fig. 2.28), unde se recupereaz prin precipitare fraciunile individuale: fibrinogen, alfa, beta i gama globuline, albumine. Dup fracionare, proteinele se prelucreaz cu metode specifice, nainte de a fi utilizate n diverse domenii: chirurgie, tratarea infeciilor, reducerea deficitului proteic, malnutriie, etc.

49

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

Figura 2.27. Compoziia sngelui uman La fracionarea prin procedeul Cohn este necesar meninerea temperaturii n intervalul 3 6 C. Pentru aceasta se folosesc centrifuge cu camere cu capaciti ntre 60 1000 L/h, prevzute cu rcire tripl: (1) rcirea direct a tamburului, pentru ndeprtarea cldurii generate de frecarea aerului de tamburul care se rotete; (2) rcirea prii superioare a carcasei pentru preluarea cldurii agentului de rcire care rcete tamburul; (3) rcirea capacului pentru ndeprtarea cldurii din partea superioar a tamburului i din inelul de etanare (fig. 2.29). Soluia salin utilizat ca agent de rcire este alimentat la 20 C. Cu acest sistem de rcire se poate asigura un control al temperaturii cu o precizie de 0,3 C.

Figura 2.28. Fracionarea plasmei sangvine prin procedeul Cohn Una dintre noutile aprute n fracionarea sngelui uman o reprezint manipularea etan a solidelor. Un bun exemplu este hiperconcentratorul HyCon produs de Wesfalia AG, o centrifug la care mecanismul de antrenare (motor i reductor) i 50

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII centrifuga propriu-zis (tamburul i sistemul de evacuare a solidelor) sunt separate ermetic ntre ele prin inele de etanare cu gaz i sunt amplasate n ncperi diferite, centrifuga propriu-zis aflndu-se ntr-o ncpere steril amplasat sub ncperea (nesteril) n care se gsete antrenarea [42].

rcire capac

rcire carcas

rcire tambur

frecarea agentului de rcire de tambur

generare cldur

disipare cldur (maxim)

frecarea aerului de tambur

Figura 2.29. Centrifug cu camere prevzut cu circuite de rcire

Qin1 cldur generat prin frecarea tamburului cu aerul; Qin2 cldur generat prin frecarea lichidului de rcire de tambur; Qout1 cldur preluat de agentul de rcire a tamburului; Qout2 cldur preluat de agentul de rcire a carcasei; Qout2 cldur preluat de agentul de rcire a capacului. 1 alimentare centrifug; 2 evacuare lichid limpede; 3 pomp centripet; 4 intrare agent de rcire capac; 5 ieire agent de rcire capac; 6 ieire agent de rcire carcas; 7 cptueal exterioar demontabil; 8 intrare agent de rcire carcas; 9 ieire agent de rcire tambur; 10 intrare agent de rcire tambur; 11 cptueal interioar demontabil; 12 insert sub form de clopot.

O alt perfecionare const n rcirea tamburului centrifugei cu azot lichid, fapt care permite o mai bun ndeprtare a cldurii generate prin frecare, i un control mai bun al temperaturii. 2.5. Separarea prin microfiltrare Microfiltrarea, ultrafiltrarea i osmoza invers sunt procese de membran nrudite, diferena dintre acestea fiind mrimea particulelor care pot fi reinute (fig. 2.30). Particulele solide aflate n suspensie reinute prin microfiltrare au dimensiuni cuprinse ntre 0,1 i 10 m, n aceast categorie intrnd o serie de virui, bacterii, celule animale i vegetale. Membranele pentru microfiltrare pot fi ncadrate, n funcie de mecanismul filtrrii (fig. 2.5), fie n categoria filtrelor n adncime, fie n categoria filtrelor cu efect de sit. De obicei membranele de filtrare n adncime se utilizeaz pentru filtrarea fr ieire (dead-end filtration), acestea putnd reine o cantitate mai mare de solide.

51

Capitolul 2 Separarea masei celulare de lichidul de fermentaie

microfiltrare ultrafiltrare filtrare convenional

osmoz invers

diametrul porilor

Figura 2.30. Mrimea particulelor reinute prin diferite procese de filtrare [43] 2.6. Centrifugare sau microfiltrare ? Dup apariia microfiltrelor sterilizabile, utilizarea microfiltrrii pentru separri lichid-solid n biotehnologii a devenit o alternativ viabil. Ca regul general, pe msur ce cresc dimensiunile particulelor i scara de operare, centrifugarea este mai avantajoas dect microfiltrarea, i viceversa. Dac, de ex., pentru separarea E. Coli dintr-un bioreactor de 200 L, microfiltrarea este posibil, decizia aplicrii acestui procedeu de separare trebuie bine cntrit. Dac se dorete ulterior transpunerea la o scar mai mare a procesului pot aprea probleme. Este mult mai convenabil s se pstreze aceeai tehnologie i la scar mai mare, chiar dac aceasta nu este tocmai alegerea optim. n multe cazuri, rspunsul la ntrebarea din titlu l reprezint o combinaie de filtre i centrifuge.

52

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

3. Dezagregarea masei celulare

Dup separarea masei de celulare de lichidul de fermentaie, urmtoarea faz a procesului tehnologic depinde de locaia produsului dorit. Dac produsul dorit este excretat de ctre celule (etanol, acid citric, antibiotice), trebuie prelucrat lichidul de fermentaie, biomasa fiind un produs secundar. Dac produsul rmne n interiorul celulelor (aa cum se ntmpl n cazul enzimelor, proteinelor recombinate, etc.), lichidul de fermentaie va fi produsul secundar, iar masa celular trebuie prelucrat n vederea recuperrii produsului util dorit. Pentru a izola produsele intracelulare este necesar distrugerea membranei i a pereilor celulari, proces cunoscut drept dezagregarea celulelor (cell disruption). Procedeul utilizat pentru dezagregarea la scar industrial depinde de o serie de factori, ca: susceptibilitatea celulelor la rupere, caracteristicile de stabilitate ale produsului, uurina extraciei produsului din resturile celulare, viteza metodei, costurile asociate. 3.1. SUSCEPTIBILITATEA LA RUPERE A CELULELOR Forma i rezistena celulelor depinde n primul rnd de natura acestora. Celulele sunt caracterizate de o mare varietate de morfologii, structuri i mrimi, depinznd de vrst i de condiiile de cultur. Bacteriile pot aprea sub form de sfere, baghete, elici, filamente. Fungiile pot fi de tip micelar, pseudomicelar sau unicelular. Pereii celulari sunt responsabili de rezistena, rigiditatea i forma celulelor, acetia reprezentnd bariera major pentru punerea n libertate a produselor intracelulare. Cunoaterea structurii i compoziiei pereilor celulari este important n alegerea metodei de dezagregare adoptate. 3.1.1. Celule animale

Celulele animale sunt caracterizate de lipsa pereilor celulari. Acestea prezint doar o membran celular alctuit dintr-un strat dublu de lipide, slab sprijinit de 53

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor citoschelet (fig. 3.1). Lipsa unui perete celular rigid permite dezvoltarea unei mari diversiti de celule, esuturi i organe. Tot aceast lips permite ns i o dezintegrare uoar a unor astfel de celule. n plus, celulele animale fiind relativ mari (1 100 m), sunt foarte vulnerabile la forfecare.

Figura 3.1. Membrana celular [44] 3.1.2. Celule vegetale

Celulele vegetale au pereii constituii din carbohidrai compleci insolubili (celuloz i hemiceluloze), lignin i cear care nconjoar membrana plasmatic (fig. 3.2).

1 m d a Figura 3.2. Perei celulari vegetali [45] a structur; (b d) imagine microscopic a peretelui celular pentru: castan de ap (b), cartof (c), morcov (d) 54

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Microfibrilele celulozice care acoper membrana plasmatic ntr-o manier ntmpltoare confer acestor celule o oarecare protecie la forfecare. Dac celulele sunt de dimensiuni mari, vulnerabilitatea lor la forfecare crete. Proteinele din aceste celule pot fi legate i inactivate de ctre compuii fenolici care fac parte din unitile ligninice. 3.1.3. Fungii i drojdii

Ca i celulele mamiferelor, fungiile sunt eucariote cu ADN-ul organizat n cromozomi n interiorul nucleului. Peretele celular al fungiilor filamentoase i al drojdiilor este compus din circa 80 90% polizaharide (fig. 3.3). n fungiile filamentoase chitina este ncruciat cu glucani, n timp ce n fungiile inferioare i n drojdii exist un amestec coninnd manan i glucan. Fungiile mature nu au o structur discret a peretelui celular.
Celula de fungie Membrana si peretele celular manoproteine -(1,6)-glucan -(1,3)-glucan chitina membrana celulara (strat dublu de fosfolipide) ergosterol -(1,3)-glucan sintaza

Figura 3.3. Structura peretelui celular al fungiilor [46]

Figura 3.4. Structura peretelui celular al drojdiilor [47, 48] 3.1.4. Bacterii

Structura pereilor celulari ai procariotelor este unic, muli dintre compui identificai n acetia negsindu-se altundeva n natur. Exist dou tipuri structurale de baz pentru pereii celulari care au fost studiate detaliat: cele ale bacteriilor Gram pozitive(fig. 3.5), respectiv Gram negative (fig. 3.6). ntre cele dou tipuri de perei celulari exist deosebiri majore. Celulele Gram pozitive apar netede la microscopia 55

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor electronic de baleiaj, avnd un singur strat de peptidoglucan, n timp ce cele Gram negative au o suprafa ondulat, peretele celular fiind alctuit din trei straturi (fig. 3.6).

Bacillus cereus

Serattia marscenses

Figura 3.5. Bacterii Gram pozitive A streptococ B; B strat unic de peptidoglucan

Figura 3.6. Bacterii Gram negative C E. Coli; D strat triplu al peretelui celular

Celulele gram-negative prezint un strat suplimentar n exterior. Peretele grampozitiv este mult mai gros dect cel gram-negativ. Ambele tipuri de perei prezint un element comun, peptidoglucanul. Acesta este un strat gros i rigid compus din dou straturi suprapuse de zaharuri, N-acetilglucozamin (NAG) i acid N-acetil muramic (NAM) legate ntre ele prin puni de aminoacizi. NAM este un component specific pereilor celulelor bacteriene, nefiind identificat altundeva n natur. Structura schematic a pereilor celulari este redat n fig. 3.7.

b Figura 3.7. Structura peretelui celular: a bacterii gram-pozitive; b bacterii gram-negative

Diferenele dintre pereii celulari ai bacteriilor gram-pozitive i gram-negative influeneaz hotrtor comportarea acestor bacterii; implicit i condiiile de dezagregare necesare fiecrui tip de bacterii vor fi diferite. Tabelul 3.1 sumarizeaz diferenele dintre cele dou tipuri de perei celulari. 56

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Tabelul 3.1. Proprietile pereilor celulari [49]
Proprietate Grosimea peretelui, nm Numrul de straturi al peretelui Coninutul de peptidoglucan, % Acid teihoic n perete Coninut de lipide i lipoproteine, % Lipopolizaharide, % Sensibilitate la penicilin Digerat de lizozim Gram Pozitiv 20 80 1 Peste 50 Da 03 0 Da Da Gram Negativ 10 2 10 20 Nu 58 13 Mai puin Puin

Lizozima, utilizat frecvent pentru scindarea peptidoglucanilor, folosit ntr-un mediu izotonic, va ndeprta peretele celular extern al bacteriilor gram-pozitive, elibernd coninutul spaiului periplasmatic. Datorit stratului de lipopolizaharide, bacteriile gram-negative sunt mai puin susceptibile la lizozim. Susceptibilitatea lor poate fi mrit n prezen de acid etilediaminotetraacetic (EDTA), care destabilizeaz structura lipopolizaharidelor. 3.2. METODE DE DEZAGREGARE A CELULELOR Pentru dezagregarea celulelor, n scopul eliberrii produselor intracelulare, se utilizeaz dou categorii de metode: mecanice i nonmecanice. Prin metodele mecanice, peretele celular este distrus n totalitate; metodele nemecanice realizeaz doar permeabilizarea pereilor pentru anumii produi, celula pstrndu-i individualitatea (fig. 3.8).

Celul dezagregat mecanic

Celul permeabilizat nemecanic

Figura 3.8. Dezagregarea mecanic i permeabilizarea nemecanic a celulelor O clasificare mai detaliat a metodelor de dezagregare este prezentat n schema din fig. 3.9. Majoritatea metodelor sunt aplicabile la nivel de laborator sau pilot. 57

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor

Celule
Dezagregare mecanica
Forfecarea lichidului Ultrasunete Agitare mecanica Presiune Forfecarea solidului Deshidratare Macinare Fizica

Dezagregare nemecanica
Permeabilizare

Presiune

Chimica

Enzimatica

Figura 3.9. Clasificarea metodelor de dezagregare a celulelor 3.2.1. Metode mecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor

Aceast categorie de metode este larg utilizat, datorit productivitii ridicate i a eficienei sporite. Principiul metodelor const n aplicarea unor tensiuni de forfecare ridicate fie lichidului n care este dispersat masa celular, fie masei celulare nsi. ntruct o parte din energia mecanic introdus n sistem este disipat sub form de cldur, trebuie asigurat o rcire corespunztoare a masei celulare pentru a evita degradarea produselor datorit nclzirii excesive. 3.2.1.1. Forfecarea lichidului cu ajutorul ultrasunetelor

Ultrasunetele cu frecvene cuprinse ntre 20 50 kHz aplicate lichidelor produc fenomenul de cavitaie sonic. n principiu, undele de nalt frecven sunt generate electronic, iar energia mecanic este transmis lichidului prin intermediul unei sonde metalice care oscileaz cu aceeai frecven. Sonda este plasat n recipientul care conine masa celular, iar oscilaiile de nalt frecven produc o presiune nalt localizat care conduce la cavitaie i impact. Unda de oc format conduce la dezagregarea celulelor. Dezagregarea depinde de alegerea corespunztoare a parametrilor de lucru: pH, temperatur, tria ionic a mediului. Ultrasonarea d bune rezultate la dezagregarea culturilor microbiene. Eliberarea proteinelor pare a fi proporional cu consumul de putere i independent de concentraia celulelor, iar dezagregarea celulelor crete exponenial cu timpul de expunere la ultrasunete. Cinetica procesului este descris de ecuaia [50, 51]: 1 X = exp( kt ) (3.1)

n care t este timpul de ultrasonare, iar X este fracia de proteine eliberate. Constanta de vitez k depinde de puterea ultrasunetelor dup o relaie de forma:
58

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

k (W W0 )
0,9

(3.2)

unde W este puterea acustic, iar W0 reprezint puterea de cavitaie. Alte cercetri arat c ntre constanta de vitez i puterea acustic exist o dependen liniar [51]. ntruct generarea de cldur provoac degradarea proteinelor, nu se recomand folosirea pastelor celulare cu concentraii mai mari de 200 g/L, iar ultrasonarea se face n etape de maximum 30 de secunde, concomitent cu meninerea pe ghea a pastei celulare. Printre alte dezavantaje se poate meniona nivelul ridicat de zgomot n timpul procesrii (este necesar protecia auditiv a personalului), randamentul variabil i generarea de radicali liberi care pot reaciona cu alte molecule. Dei procesul se poate realiza n regim continuu, aplicabilitatea la scar industrial este limitat datorit consumurilor energetice ridicate i datorit faptului c ultrasunetele pot provoca denaturarea proteinelor i enzimelor [4].
3.2.1.2. Forfecarea lichidului prin agitare mecanic

Metoda este utilizat n special pentru dezagregarea esuturilor, folosind mixere i blendere de diverse construcii, difereniat pentru esuturile moi (ficat, creier, glande endocrine) i pentru cele tari (muchi cardiac). Utilizarea amestectoarelor cu ansamblu rotor-stator (fig. 3.10) reprezint o alt posibilitate de a provoca n lichid tensiuni de forfecare mari.
6

5 4

f
3 2

b i j k

c Figura 3.10. Agitatoare cu rotor i stator

a vedere general (1 ansamblu rotor stator; 2 tije susinere stator; 3 ax rotor; 4 flan de prindere pe recipient; 5 cuplaj; 6 motor de antrenare rotor); b spectru de curgere n zona agitatorului; c principiu de funcionare; d k tipuri constructive de ansambluri rotor stator.

59

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor

3.2.1.3. Forfecarea lichidului prin presurizare

Dezagregarea se realizeaz fornd trecerea suspensiei de mas celular la presiuni de 50 200 MPa printr-o valv cu un orificiu ngust, dup care urmeaz depresurizare brusc, care induce n lichid o tensiune de forfecare capabil de a distruge celulele. n plus, la ieirea din valv, celulele ntlnesc un inel de impact (fig. 3.11). Prin lovirea acestuia, precum i datorit schimbrilor brute de direcie la trecerea prin valv se completeaz procesul de dezagregare.

Inel de impact Scaunul valvei

Suspensie de celule

Valva

Presiune

Scaunul valvei Inel de impact

Figura 3.11. Valv de descrcare: a principiu de funcionare [3]; b seciune [52]

A dispozitiv manual de reglare a presiunii de descrcare; B resort; C valva; D scaunul valvei; E inel de impact.

Utilaje bazate pe astfel de dispozitive sunt utilizate pentru dezagregarea celulelor la scar industrial. Aceste utilaje sunt cunoscute sub diferite denumiri: omogenizator de nalt presiune, omogenizator Manton-Gaulin, pres francez. Datele experimentale arat c eficiena dezagregrii depinde mai ales de presiunea de operare i de numrul de treceri al masei celulare prin aparat [3, 4, 53], dar i de configuraia valvelor, de natura microorganismelor supuse dezagregrii i de compoziia mediului pe care au fost cultivate microrganismele [4, 53, 54]. Pentru corelarea eficienei dezagregrii cu parametrii de operare au fost propuse mai multe ecuaii. Astfel, pentru distrugerea celulelor de S. cerevisiae, considernd c procesul de dezagregare decurge dup o cinetic de ordinul I, cantitatea de produs intracelular eliberat poate fi calculat cu ecuaia [55]:
Rm 1 ln (3.3) R R = ln 1 X = k N P m n care Rm este cantitatea maxim de protein care poate fi eliberat din celul, R este cantitatea de protein eliberat dup N treceri succesive ale suspensiei de celule prin aparat, X = R/Rm este fracia de celule dezagregate, k este constanta de vitez a procesului de dezagregare celular (dependent de temperatur), P este presiunea de lucru, este un exponent care red rezistena la dezintegrare a celulelor, dependent de tipul de organism i de condiiile de multiplicare. Pentru E. coli, = 2,2 [54], iar pentru S. cerevisiae, = 2,9 [55]. O analiz bazat pe teoria turbulenei propune ecuaia [56]: 60

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

P P0 (3.4) R = 1 exp z n care R este cantitatea de protein eliberat, P este presiunea de lucru, P0 este presiunea de referin, z este o constant, iar este un parametru care depinde de concentraia celulelor. Pentru dezagregarea E. coli ntr-un omogenizator de tip Microfluidizer (fig. 3.12), se propune ecuaia:

1 b ln (3.5) = kN P 1 X n care exponentul b depinde de concentraia celulelor i de viteza specific de cretere a acestora [57].
2

1 Figura 3.12. Omogenizator de nalt presiune de tip Microfluidizer [58]

1 omogenizator; 2 micrografie celule nainte de prelucrare; 3 micrografie celule dup prelucrare

Ecuaiile 3.3 3.5 includ cte un termen care indic o dependen exponenial a gradului de dezagregare de temperatur. La fiecare cretere cu 10 MPa a cderii de presiune prin utilaj, temperatura crete cu 2 3 C, n funcie i de concentraia celulelor [53]. Creterea temperaturii, dei favorizeaz dezagregarea celulelor, nu este de dorit ntruct conduce la denaturarea produselor. De accea, suspensia celular trebuie rcit nainte i dup trecerea prin omogenizator i nu trebuie lsat s depeasc temperatura de 30 C. Sub aceast temperatur nu s-a sesizat pierderea activitii enzimatice sau a solubilitii proteinelor [59]. Rcirea se poate realiza fie cu azot rcit n prealabil, fie prin injectare de dioxid de carbon n interiorul valvei [4]. Un alt dispozitiv care permite obinerea unor tensiuni de forfecare ridicate n faza lichid care conine suspensia de mas celular este moara coloidal. Morile coloidale sunt sunt similare din punct de vedere constructiv amestectoarelor cu ansamblu rotor
61

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor

stator montate n flux. Deosebirile constau n faptul c n morile coloidale cantitatea de fluid reinut n zona de lucru este mai mare, iar n fluid se introduce mai mult energie per trecere. De asemenea, morile coloidale sunt prevzute cu un dispozitiv care permite reglarea distanei dintre rotor i stator, permind astfel un control mbuntit al vitezelor de forfecare i al timpului de retenie a materialului prelucrat n moar. n fig. 3.13 este redat o moar coloidal vertical, moara coloidal Premier. Piesa esenial a morii este rotorul tronconic (1) care se rotete foarte rapid la distan mic i reglabil de carcasa (2). Principalele caracteristici ale acestei mori sunt redate n tab. 3.2 [60].
Tabelul 3.2. Caracteristici ale morilor coloidale Premier [60]
Caracteristica Diametru maxim rotor [mm] Turaie rotor [rot/min] Debit prelucrat [m3/h] Putere necesar [kW] Distan minim rotor-carcas [mm] Mori industriale mici 75150-400 100 72003600 17000 0,023max. 6,8 0,70 max. 75 0,04-1,0 -

Figura 3.13. Moar coloidal vertical Premier [60]

1 rotor; 2 carcas; 3 urub reglare distan rotor carcas; 4 alimentare; 5 evacuare; 6 roat de transmisie.

Moara coloidal W250HB (Chemineer, Inc.) poate funciona n poziie orizontal (fig. 3.14), dar poate fi utilizat i n poziie vertical, prin adaptarea unui buncr de alimentare cu conduct de recirculare i montarea morii propriu-zise pe un stativ vertical. Ansamblul rotor stator poate fi cu suprafee de lucru plane sau canelate. Principalele dezavantaje ale morilor coloidale sunt faptul c necesit o pomp suplimentar pentru alimentare (consum suplimentar de energie) i au debite limitate.

4 2

5 1 2 b

3 a

c Figura 3.14. Moar coloidal W250HB (Chemineer, Inc.)

a vedere de ansamblu: 1 carcasa; 2 alimentare; 3 evacuare; 4 racord pentru splare; 5 dispozitiv pentru reglarea distanei rotor-stator; 6 cuplaj; 7 motor de antrenare; 8 batiu; b ansamblu rotor (1) stator (2) standard; c ansamblu rotor (1) stator (2) cu caneluri.

62

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 3.2.1.4. Forfecarea fazei solide prin mcinare

Forfecarea fazei solide prin mcinare se poate realiza n laborator n mojare cu pistil. Operaia este manual i laborioas. Uneori, pentru facilitarea eliberrii componentelor intracelulare, se adaug la biomaterial alumin sau nisip. O alt metod de laborator care nu necesit munc manual este cea care utilizeaz mese scuturtoare pe care materialul celular supus dezagregrii este amplasat n flacoane coninnd materiale abrazive. Metoda cea mai convenabil, att la scar de laborator, ct i n instalaiile pilot sau industriale, este cea a mcinrii n mori cu bile. Procedeul const n amestecarea la turaii ridicate a suspensiei de biomas cu bile confecionate din diferite materiale, distrugerea celulelor fiind cauzat att de forele de forfecare mari, ct i de coliziunea cu corpurile de mcinare sau cu pereii morii. Morile cu bile sunt disponibile n diferite configuraii i capaciti, de la mori discontinue de laborator cu capacitate de 40 mL, pn la mori continue care pot prelucra pn la 200 kg/h suspensii de drojdii sau pn la 20 kg/h suspensii de mas celular bacterian. n principiu, o moar cu bile este alctuit dintr-o carcas cilindric orizontal sau vertical, n interiorul creia se nvrte un agitator cu discuri dispuse concentric sau excentric. n carcasa n care s-au introdus n prealabil corpurile de mcinare (bilele), se introduce sub presiune pasta de celule care se supune dezagregrii. Evacuarea pastei de celule se face printr-un dispozitiv prevzut cu site, site vibratoare sau disc rotativ, cu rolul de a reine bilele n utilaj. Pentru prevenirea degradrii termice a masei celulare, carcasa morii este prevzut cu o manta prin care circul un agent de rcire. Cea mai cunoscut construcie este moara cu bile Dyno-Mill, redat n fig. 3.15.
1 8 6 5 2 3 4 7

bile

suspensie

fluid de rcire

Figura 3.15. Moar cu bile Dyno-Mill [53]

1 carcasa cilindric; 2 ax agitator; 3 discuri; 4 manta de rcire; 5 dispozitiv de reinere a bilelor; 6 antrenare ax agitator; 7 manometru; 8 termometru.

63

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor Bilele pot fi confecionate din sticl, metal, ceramic, cu observaia c exist anumite restricii de folosire. De exemplu, n industria alimentar i farmaceutic nu este permis utilizarea bilelor din sticl cu coninut de plumb [4]. Prezena bilelor este esenial: n absena lor dezagregarea celular nu are loc (fig. 3.16). Dup mcinare timp de 10 min ntr-o moar de tip GenoGrinder, celulele de drojdie rmn intacte (petele luminoase din fig. 3.16 a). Dup 5 min de mcinare n prezen de bile din sticl cu diametrul de 0,4 mm, circa 30% din celule sunt dezagregate (petele ntunecate din fig. 3.16 b). Dup alte 5 min de mcinare, aproape toate celulele au fost dezintegrate (fig. 3.16 c) [61].

a b c Figura 3.16. Influena bilelor asupra dezagregrii celulelor de drojdie [61] Pentru ca o moar cu bile s fie eficient, aceasta trebuie s realizeze un grad de dezagregare celular ct mai ridicat, cu un consum minim de energie. Aceti doi parametrii cheie ai morilor cu bile sunt influenai de un numr foarte mare de factori, att constructivi, ct i funcionali. Mecanismul dezagregrii este foarte complex, dezintegrarea celulelor aprnd ca rezultat al forfecrii att a fazei lichide, ct i a fazei solide datorit impactului bilelor ntr-un cmp de turbulen intens. Procesul poate fi descris satisfctor de o ecuaie cinetic de ordinul I, care pentru operarea n regim discontinuu, sau pentru operarea continu n condiiile curgerii cu deplasare total se scrie:
Rm 1 (3.6) ln R R = ln 1 X = k t m Deoarece la operarea continu exist un anumit grad de amestecare invers, un model mai apropiat de realitate ar fi cel al n reactoare continue cu amestecare perfect nseriate, caz n care ecuaia cinetic se scrie:
Rm 1 k = = 1+ Rm R 1 X n
n

(3.7)

n aceste ecuaii Rm este cantitatea maxim de protein care poate fi eliberat din celul, R este cantitatea de protein eliberat n timpul t, X = R/Rm este fracia de celule dezagregate (conversia, gradul de dezintegrare), k este viteza specific a procesului de dezagregare celular, = V/Q este timpul mediu de staionare, V este volumul liber total al camerei de mcinare, iar Q este debitul suspensiei de celule prin moar [62]. Pe lng caracteristicile constructive ale morii (volumul i geometria camerei de mcinare, numrul de discuri pe unitatea de volum de moar, geometria i materialul de construcie al discurilor), gradul de dezintegrare este influenat i de parametrii de 64

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII operare ai morii: viteza agitatorului, concentraia masei celulare, mrimea bilelor, concentraia bilelor, temperatura i debitul suspensiei [53]. Viteza agitatorului determin frecvena coliziunii bilelor i intensitatea forfecrii; ca urmare, ntre anumite limite, viteza specific a dezagregrii celulare este direct proporional cu viteza periferic a agitatorului [62]. Aceast vitez se recomand s fie de 5 15 m/s; la valori mai mari crete puternic consumul de energie, se genereaz mai mult cldur, se accentueaz eroziunea bilelor, iar produsele sensibile la forfecare se pot inactiva. Concentraia masei celulare are o influen mai complex asupra vitezei procesului. De exemplu, la dezagregarea S. cerevisiae, variaia concentraiei masei celulare ntre 4 20 % m/v nu influeneaz viteza procesului, confirmndu-se astfel cinetica de ordin I. Alte cercetri au artat c dezagregarea prezint un maxim la concentraii celulare de 35 40% (mas umed), dup care scade, scderea fiind mai pronunat la viteze mici de agitare. Fenomenul este atribuit modificrii comportrii reologice a suspensiei la modificarea concentraiei. Concentraia optim variaz de la caz la caz; trebuie inut cont i de faptul c la concentraii sczute ale suspensiei celulare cantitatea de cldur generat este mai mic, ceea ce este bine, ns consumul de putere pe unitatea de mas de celule prelucrate este mai mare, ceea ce reprezint un dezavantaj. La concentraii sczute (sub 5% solide) se observ o uzur avansat a morii i a bilelor. Drept urmare, optimul se determin experimental, situndu-se ntre 30 60%, sau, mai frecvent, ntre 40 50% (mas umed) [53]. Dimensiunile bilelor sunt dictate de mai multe considerente. De regul, viteza de dezagregare crete cu scderea diametrului bilelor, dar tendina de plutire a bilelor foarte mici i dificultile privind reinerea acestora n moar limiteaz diametrul minim al bilelor utilizate la 0,2 mm n aplicaiile de laborator i la 0,4 mm n aplicaiile industriale n regim continuu [53]. La aceeai ncrcare cu bile, exist un diametru optim al bilelor care depinde de natura celulelor supuse dezagregrii i de localizarea produsului dorit n interiorul celulei. Pentru dezagregarea celulelor vegetale, animale, a drojdiilor i a sporilor bacterieni, sunt recomandate bile din silice sau zircon avnd diametrul de 0,2 0,4 mm, n timp ce pentru dezagregarea mucegaiurilor i a fungiilor sunt recomandate bile din silice sau sticl avnd diametrul de 0,8 1,0 mm [63]. Bilele cu diametru mai mare sunt preferate cnd produsul este localizat n regiunea periplasmic, n timp ce pentru produsele citoplasmice se utilizeaz bile de dimensiuni mai mici [64]. Fracia volumic a bilelor (volumul bilelor/volumul camerei de mcinare) influeneaz favorabil eliberarea proteinelor din celule. Fracia de bile recomandat este de 80 90%, limita superioar fiind n general impus de consumul energetic ridicat i de dificultile legate de ndeprtarea cldurii degajate n timpul mcinrii. Dei temperatura influeneaz n mod favorabil viteza dezagregrii, cldura degajat n proces trebuie ndeprtat pentru a nu se produce denaturarea sau inactivarea produselor. Suspensia celular este rcit att la intrarea, ct i la ieirea din moar, iar moara este prevzut cu o manta prin care circul un agent de rcire, astfel nct procesul s se desfoare n intervalul de temperatur 5 40 C. n cazul morilor de capaciti mari (peste 20 L), rcirea prin manta nu este suficient, fiind necesar vehicularea agentului de rcire i prin axul i discurile agitatorului [64]. 65

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor Efectul debitului asupra vitezei procesului ar trebui s reflecte efectul timpului de staionare () al masei celulare n interiorul camerei de mcinare. Dac procesul decurge dup o cinetic de ordin I, conversia la o singur trecere prin moar ar trebui s scad cu creterea debitului. Odat cu creterea debitului, scade gradul de amestecare invers (dispersia longitudinal), astfel nct conversia nu mai poate fi exprimat ca o funcie simpl de debitul masei celulare. Pe de alt parte, consumul specific de putere (pe unitatea de mas de suspensie prelucrat) scade puternic cu creterea debitului. Din acest motiv se recomand operarea morilor cu bile la debite mari, scderea conversiei putnd fi contracarat prin recircularea parial a suspensiei prin camera de mcinare. Mai trebuie menionat faptul c prin creterea timpului de staionare (scderea debitului) viscozitatea suspensiei poate s scad, ntruct forfecarea prelungit poate provoca degradarea ADN, a crui structur este sensibil la forfecare [65]. Alte studii [66] coreleaz gradul de dezintegrare cu consumul energetic specific, ajungnd la concluzia c valorificarea maxim a energiei introduse n moar este atins pentru urmtoarea combinaie de parametri: bile de dimensiuni reduse, concentraii de mas celular medii spre ridicate, viteze de agitare sczute spre medii. Aceste rezultate pot sta la baza transpunerii la scar a procesului de dezagregare celular n mori cu bile. n cazul combinaiei de parametri: concentraii de mas celular reduse, viteze de agitare ridicate, bile de dimensiuni mari, gradul de dezintegrare a fost corelat cu frecvena strii de tensiune (care este proporional cu produsul dintre viteza de agitare i timpul de dezintegrare), iar corelaia a fost verificat experimental. Cteva valori orientative ale consumului energetic specific pentru dezagregarea unor microorganisme sunt redate n tab. 3.3. Tabelul 3.3. Consumuri energetice specifice la dezagregarea unor microorganisme n mori cu bile [4]
Microorganism Grad de dezintegrare [%] 40 42 65 80 80 80 85 95 95 85 90 Concentraia biomasei [% s.u.] 13,5 13,5 13,5 6,0 11,0 16,0 10 20 17,0 17,0 17,0 Consum energetic specific [J/g] 180 800 430 1960 900 900 930 720 790 720 790 930 1190

Saccharomices cerevisiae

Saccharomyces carlsbergensis Candida utilis

3.2.1.5.

Forfecarea fazei solide prin presurizare

Faza solid este format din pasta celular n prealabil ngheat. Prin extrudarea acestei paste printr-un orificiu ngust, la presiuni de pn la 550 MPa, se realizeaz dezagregarea celulelor. Datorit forelor de forfecare ridicate care apar la trecerea prin orificiu, efectului abraziv al cristalelor de ghea, modificrii dimensiunilor cristalelor de ghea, comportrii viscoplastice la curgerea suspensiei prin orificiu, are loc o distrugere avansat a masei celulare. n plus, prin extruderea pastei congelate se 66

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII conserv calitile biologice ale produselor intracelulare obinute [4]. Productivitatea metodei este influenat de temperatur, de natura i concentraia pastei celulare. Pentru realizarea practic a procesului sunt cunoscute dou dispozitive: presa Hughes i presa X. Aceste echipamente genereaz presiuni de 150 230 MPa. n timp ce presa Hughes poate fi utilizat doar la scar de laborator n regim discontinuu, presa X poate fi operat semicontinuu i se preteaz la transpunere la scar pentru nivele pilot i industriale [64]. 3.2.2. Metode nemecanice de dezagregare a celulelor i esuturilor

Metodele nemecanice de dezagregare implic fie deshidratarea, fie liza (permeabilizarea) fizic, chimic sau enzimatic (fig. 3.9) a pereilor celulari. Spre deosebire de metodele mecanice, metodele nemecanice nu distrug complet peretele celular, ci doar l permeabilizeaz, permind difuzia n exteriorul celulei a anumitor componeni. Dei metodele nemecanice au consumuri energetice inferioare metodelor mecanice de dezagregare a masei celulare, majoritatea lor sunt dezvoltate i aplicate la nivel de laborator sau, cel mult, de pilot. 3.2.2.1. Dezagregarea celulelor prin deshidratare

ndeprtarea apei din celul provoac deteriorarea membranei citoplasmice, crescndu-i astfel permeabilitatea. Deshidratarea se poate realiza prin liofilizare, uscare prin pulverizare, uscare n aer sau uscare sub vacuum. ndeprtarea apei se poate realiza i prin adugarea la materialul celular a unui solvent cu afinitate mare pentru ap: etanol, metanol sau aceton. Deshidratarea prezint dezavantajul c poate cauza denaturarea unor molecule proteice sau a altor componeni intracelulari utili [4]. 3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode fizice

Metodele fizice de permeabilizare au o eficien relativ redus, chiar dup un numr mare de cicluri. Principalele metode utilizate sunt: tratarea termic, nghearea dezghearea, decompresia exploziv i ocul osmotic. Tratarea termic este utilizabil doar n cazul produselor rezistente la temperatur, de exemplu n extracia enzimelor termostabile din bacterii. Viteza autolizei scade cu temperatura, n funcie i de tipul de organism utilizat. nghearea dezghearea este o tehnic n care suspensia de celule este ngheat ntr-o baie rcit cu un amestec de CO2 solid (zpad carbonic) i etanol, iar apoi este dezgheat la temperatura camerei [67]. Repetnd de mai multe ori ciclul de nghe dezghe, membranele celulare sunt distruse de ctre cristalele ascuite de ghea care ncep s creasc din interioul celulei. Durata procesului este destul de mare, iar unii componeni intracelulari pot fi sensibili la astfel de tratamente. Procedeul poate fi aplicat anumitor celule microbiene i eucariote din care se elibereaz proteinele 67

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor periplasmice i intracelulare. Procesul este influenat de natura celulelor, temperatura final de congelare, precum i de viteza proceselor de nclzire i de rcire. Trebuie menionat faptul c multe organisme sunt rezistente la un astfel de tratament datorit acumulrii intracelulare a unor compui care previn nghearea. Decompresia exploziv (bomba celular) necesit mai nti saturarea masei celulare cu azot sau alt gaz inert. Procesul decurge la presiuni ridicate, de pn la 175 MPa. Prin depresurizare brusc, gazul dizolvat n interiorul celulelor este eliberat rapid, bulele de gaz formate provocnd ruperea pereilor celulari i a membranelor. Pentru a preveni denaturarea proteinelor spumarea trebuie redus la minimum. Procesul poate fi aplicat doar celulelor uor de dezagregat, cum sunt celulele animale. E. coli, drojdiile, fungiile i sporii nu pot fi dezagregate corespunztor prin aceast metod [68]. ocul osmotic apare ca urmare a modificrii rapide a concentraiei srurilor din mediu. Mecanismul distrugerii are la baz capacitatea celulelor de a echilibra rapid concentraia lor intern cu cea a mediului extern, prin osmoz. De exemplu, celulele sunt incubate timp de 30 min ntr-o soluie cu presiune osmotic ridicat (20% zahaoroz, de. ex.), dup care sunt centrifugate i resuspendate n ap. Ptrunderea rapid a apei n celul (pentru echilibrarea concentraiei interne de zaharoz 20% cu cea extern 0%) produce o presiune hidrostatic (oc osmotic) care produce liza celular [4, 67]. Dei insuficient pentru distrugerea celulei, ocul osmotic poate elibera anumite proteine, sau poate fi o metod de intensificare a procesului de autoliz. Metoda este utilizabil pentru celule vegetale, animale, precum i pentru unele bacterii Gram negative. 3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode chimice

Permeabilizarea sau liza chimic este utilizat att pentru distrugerea pereilor celulari, ct i pentru extracia unor componeni intracelulari. Principalul dezavantaj al lizei chimice este introducerea n sistem a unor substane care ulterior trebuie ndeprtate, mrindu-se astfel costurile de producie. Un alt dezavantaj l reprezint timpul ndelungat necesar realizrii procesului. Tratarea cu solveni organici (toluen, eter, fenil-etil alcool, dimetilsulfoxid, metanol, etc.) conduce la formarea de canale prin membrana celular [67]. O parte din aceti solveni pot crea probleme la separarea produselor eliberate, iar unii dintre ei sunt toxici [4]. Compuii tensioactivi (detergeni ionici dodecilsulfat de sodiu i neionici Triton X-100), utilizai ca atare sau n combinaie cu ageni haotropici (clorur de guanidin, uree) sunt eficieni pentru eliberarea enzimelor legate de membrana celular. Aciunea detergenilor este puternic influenat de pH i de temperatur. Detergenii ionici sunt mai eficieni, ns pot determina i denaturarea moleculelor proteice eliberate. Alte dezavantaje legate de utilizarea detergenilor sunt spumarea, precipitarea, costul ridicat al detergenilor neionici, precum i dificultatea ndeprtrii din produsul final [4, 64, 67]. Bazele pot fi utilizate ca ageni ieftini de extragere a enzimelor intracelulare stabile la pH > 11, fr distrugerea peretelui celular. Metoda poate fi utilizat i la scar 68

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII industrial. O pretratare alcalin a celulelor slbete rezistena peretelui celular, facilitnd dezagregarea mecanic cu consumuri energetice mai reduse [69]. Acizii realizeaz cel mai rapid hidroliza componenilor care alctuiesc pereii celulari (6 12 h). Dei randamentele hidrolizei acide sunt ridicate, se produc pierderi n proteine, vitamine i compui aromatici [4]. Ali compui utilizai n liza chimic sunt srurile, zaharurile, esterii acetici, compui care induc plasmoliza, extrgnd materialul intracelular, n general fr denaturarea acestuia. Antibioticele pot fi de asemenea utilizate pentru distrugerea membranei celulare a unor microorganisme [4]. n general, atunci cnd se urmrete transpunerea la scar a procesului de dezagregare celular, adugarea de ageni chimici trebuie evitat, n special n producia substanelor proteice, n principal pentru a nu ncrca excesiv costurile, att cu chimicalele propriu-zise, ct i cu cheltuielile de ndeprtare a acestora. 3.2.2.2. Permeabilizarea celulelor prin metode enzimatice

Distrugerea pereilor celulari cu ajutorul enzimelor devine o tehnic din ce n ce mai atractiv, datorit avantajelor pe care le prezint: (i) selectivitate ridicat pentru un anumit produs (cu efecte benefice n izolarea i purificarea produsului); (ii) o vitez ridicat i un randament crescut n produsul eliberat; (iii) deteriorare minim a produsului eliberat; (iv) posibilitatea utilizrii unor condiii blnde de temperatur i pH; (v) absena producerii de resturi celulare. Aplicarea lizei enzimatice necesit n prealabil selectarea enzimei sau sistemului enzimatic care s corespund scopului propus i stabilirea condiiilor n care liza este eficient [4]. Mai mult dect orice alt tehnic, liza enzimatic necesit o bun nelegere a detaliilor structurii fizico-chimice a pereilor celulari. Nici o enzim nu este capabil s degradeze complet pereii celulari, datorit compoziiei complexe a acestora. Aa cum s-a mai artat, componentul de baz al structurii pereilor celulelor bacteriene este peptidoglucanul. n cazul bacteriilor gram-pozitive, o singur enzim poate liza celula, dar un amestec de enzime (glucozidaze i peptidaze) acionnd sinergetic pot ajuta liza peptidoglucanului. n cazul bacteriilor gram-negative este necesar o pretratare cu un agent tensioactiv pentru ndeprtarea membranei exterioare. Tabelul 3.4. Enzime importante n degradarea pereilor celulelor microbiene [53]
Organismul Bacterii Fungii, drojdii Enzima Glicozidaze Acetilmuramoil-L-alanil amidaze Peptidaze -(1,3)-glucanaze -(1,6)-glucanaze Mananaze Chitinaze Proteaze Celulaze

Alge

69

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor n tab. 3.4 sunt prezentate principalele enzime care pot ataca membrana celular a diverselor microorganisme. Majoritatea enzimelor litice sunt active i asupra pereilor celulelor moarte (liofilizate sau termolizate). Principala constrngere n utilizarea lizei enzimatice este dat de costul ridicat al enzimelor litice. Singura enzim litic disponibil la scar comercial este lizozima extras din albuul oulor de gin. Aceasta a fost frecvent utilizat n liza unor bacterii gram-pozitive, la o vitez de 5.104 UI/(kg.h) raportat la substana uscat [64]. Aceeai enzim este utilizat i pentru liza E. coli, cunoscut drept o bacterie cu perei celulari duri [67]. Pe lng costul ridicat al enzimelor litice, o alt problem, cea a impurificrii produsului, face ca liza enzimatic s fie nc utilizat cu reinere. De exemplu, enzimele derivate din ou pot provoca probleme dac urme din acestea rmn n proteinele purificate utilizate n scop terapeutic, tiut fiind faptul c unele persoane sunt alergice la ou [64, 67]. Enzimele extrase din drojdii sau din sistemul digestiv al gasteropodelor nu pot fi utilizate n procese transpuse la scar ntruct sunt amestecuri de enzime [67]. Impurificarea produsului ar putea fi evitat prin folosirea de enzime litice imobilizate pe un suport macromolecular [4, 70, 71]. La fel ca i alte procedee de dezagregare nemecanice, liza enzimatic este un proces lent, dar combinat cu alte metode se pot obine grade ridicate de dezagregare la viteze convenabile. Astfel, dezagregarea C. utilis n omogenizatoare de nalt presiune a fost mbuntit prin tratarea prealabil a celulelor cu zimolaz [65]. Celule de Bacillus cereus pretratate cu 0,5 g celozil1/g celule umede la pH = 5,5 i 30 C au fost dezagregate n proporie de 98% la o singur trecere printr-un omogenizator MantonGaulin la 70 MPa. Celulele netratate au fost dezagregate doar n proporie de 40% n aceleai condiii de lucru. Acelai tratament enzimatic a facilitat dezagregarea i n mori cu bile [72]. Un caz particular al lizei enzimatice este autoliza, proces n care celulele i produc singure enzimele litice. Ca proces de autodigerare, autoliza este un proces foarte lent, care are loc ntr-o perioad de ordinul zilelor, ceea ce reprezint un inconvenient major. Datorit acestui fapt, autoliza nu este o metod uzual pentru dezagregarea celulelor. Autoliza drojdiilor, proces realizat la scar industrial pentru obinerea autolizatelor de drojdie, necesit 12 24 h la 45 50 C [4]. Procesul poate fi accelerat prin uscarea sau nghearea dezghearea prealabil a celulelor. Alte metode de inducere a autolizei sunt plasmoliza cu ajutorul surfactanilor, solvenilor organici (toluen sau butanol), compuilor tiolici. Procesul de autoliz este influenat i de valoarea pH-ului, componena i concentraia mediului de cultur, stadiul de dezvoltare a microorganismului. Enzimele autolitice sunt importante pentru creterea i multiplicarea celulelor, dar odat ce sunt dereglate, ele atac peptidoglucanul peretelui celular bacterian. Exist experimentri n care, prin inginerie genetic, fie li s-a inhibat microorganismelor capacitatea de a-i sintetiza peretele celular, fie li s-a introdus informaia genetic pentru producerea de enzime litice [73].

Celozil enzim litic produs de Streptomyces coelicolor

70

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 3.3. INFLUENA DEZAGREGRII ASUPRA PROCESELOR ULTERIOARE DE SEPARARE Aa cum s-a artat i n paragraful 2.4.3.4, separarea resturilor celulare este o operaie dificil, datorit dimensiunilor reduse ale particulelor i a viscozitii ridicate a sistemului. Dezagregarea mecanic sau tratamentele litice produc resturi celulare de dimensiuni uneori sub 0,1 m, foarte dificil de separat. La astfel de dimensiuni, filtrarea i centrifugarea sunt puin eficiente. Centrifugarea poate fi utilizat pentru separarea resturilor celulare mai mari de 0,5 m. Sub aceast valoare, n medii viscoase n special, separarea prin centrifugare nu poate fi realizat dect eventual dup o floculare prealabil a resturilor celulare [74]. Filtrarea cu adjuvant n filtre celulare rotative este o metod utilizat pentru separarea resturilor celulare de drojdii [53]. Microfiltrarea n curent ncruciat are avantajul c previne formarea stratului de precipitat i nu necesit adjuvani costisitori. Dificultile care apar sunt legate de murdrirea membranelor i de apariia polarizrii de concentraie, care contribuie la scderea rapid a fluxului de permeat i limiteaz concentraia resturilor celulare n retenat. Pe lng aceste dezavantaje operaionale trebuie inut cont de faptul c poate avea loc adsorbia puternic a proteinelor pe resturile celulare, fenomenul depinznd de concentraie, temperatur, pH i trie ionic. Extracia n sisteme bifazice apoase este o metod atractiv pentru separarea celulelor i resturilor celulare din soluiile de proteine, dar este costisitoare i recuperarea reactanilor este dificil. Alegerea metodelor de dezagregare, dar i a condiiilor de realizare a dezagregrii reprezint o provocare: cantitatea de proteine intracelulare eliberat crete cu creterea gradului de mrunire al resturilor celulare [75], n schimb, pe msur ce dimensiunile resturilor celulare se micoreaz, separarea lor devine din ce n ce mai dificil [76]. Particulele submicronice trec uor n supernatant dup centrifugare, ntrzie precipitarea fracionat i au tendina de a colmata coloanele cromatografice sau membranele utilizate n procesele ulterioare de separare [74, 76]. Dimensiunile fragmentelor celulare rezultate la dezagregare depind i de metoda de dezagregare folosit, precum i de parametrii procesului. ntr-un studiu comparativ a fost observat comportarea resturilor celulare de E. coli obinute ntr-o moar cu bile, respectiv ntr-un omogenizator de nalt presiune [77]. Dei nu s-au observat diferene semnificative n ceea ce privete randamentul n proteine i viteza de eliberare a acestora, caracteristicile resturilor celulare (distribuia dup mrime, separabilitatea prin centrifugare i filtrare n adncime) au fost diferite n cele dou procedee de dezagregare utilizate. Timpul mediu de staionare a suspensiei celulare n moara cu bile nu afecteaz semnificativ distribuia dup mrime a resturilor celulare; n omogenizatorul de nalt presiune, cu creterea numrului de treceri prin aparat, spectrul dimensional al resturilor celulare se lrgete. n cazul celulelor de drojdii, s-a stabilit c presiunea minim la care are loc dezagregarea celulelor ntr-un omogenizator de nalt presiune este de 11,5 MPa [78], iar dimensiunile resturilor celulare depind de condiiile de multiplicare [59]. 71

Capitolul 3 Dezagregarea celulelor n multe cazuri s-a constatat c o pretratare a masei celulare cu ageni haotropici i detergeni, conduce la obinerea unor resturi celulare de dimensiuni mai mari dect n absena tratrii. Pretratarea este realizat i n scopul evitrii degradrii produselor labile eliberate din celule. Astfel, la suspensia de celule se pot aduga inhibitori de proteaze (pentru a proteja proteinele eliberate), antioxidani (pentru evitarea oxidrii punilor disulfidice), substane tampon (pentru meninerea pH-ului n intervalul dorit). De toate aceste adaosuri trebuie inut cont n etapele ulterioare de izolare, separare i purificare. Dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat a permis obinerea unui mare numr de proteine terapeutice sub form de corpi de incluziune n citoplasma unor bacterii, n special E. coli. Aceti corpi de incluziune sunt agregate amorfe de proteine, constnd n polipeptide pliate greit (frecvent denaturate), cu dimensiuni mari (0,8 1,5 m) i densiti mai ridicate (~ 1,2 1,35 kg/L) dect restul materialului celular. Pentru solubilizarea lor n ap este necesar utilizarea de detergeni sau de ageni haotropi [79]. Procedura standard de purificare a proteinelor din corpii de incluziune ncepe cu izolarea acestora din materialul rmas n urma dezagregrii masei celulare. Dezagregarea cea mai bun se obine n omogenizatoare de nalt presiune. Corpii de incluziune se separ prin centrifugare timp de 5 10 min n centrifuge de clasare cu z = 5.103 1.104, cnd produsele solubile i resturile celulare uoare trec n supernatant (vezi i paragraful 2.4.3.5) [79, 80]. O alternativ de separare este filtrarea membranar n curent ncruciat [81]. Corpii de incluziune astfel separai sunt apoi splai fie cu o soluie diluat de detergeni, fie cu un agent haotropic (uree sau clorhidrat de guanidin). Deseori se adaug ageni reductori (ditiothreitol, -mercaptoetanol) pentru ruperea punilor disulfidice incorecte. Proteina astfel solubilizat i redus este pregtit pentru purificare i repliere.

72

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

4. Separarea prin extracie

Extracia este procesul prin care unul sau mai muli componeni dintr-un amestec lichid omogen sau dintr-un amestec solid se separ, total sau parial, pe baza diferenei de solubilitate a acestora n unul sau mai muli solveni. Dac amestecul iniial supus separrii este lichid, operaia prin care se realizeaz separarea poart denumirea de extracie lichid lichid. Dac amestecul de separat este n faz solid, operaia de separare se numete extracie lichid solid [4, 82, 83], splare extractiv, percolare sau lixiviere [84, 85]. n literatura de limb englez termenii ncetenii pentru cele dou operaii unitare sunt respectiv liquid liquid extraction i leaching [86, 87]. Recomandrile IUPAC1 prevd utilizarea tremenului de distribuie lichid lichid (liquid liquid distribution) [88]. Dac extracia se realizeaz numai prin interaciuni de natur fizic ntre componentul care se extrage (solut) i solventul/solvenii de extracie discutm despre extracie fizic, iar dac ntre solut i extractant intervin i reacii chimice discutm despre extracie reactiv [4, 89]. Agenii de extracie (solvenii) clasici se gsesc n stare lichid, dar astzi se utilizeaz pe scar din ce n ce mai larg solveni la parametri critici sau deasupra acestora, cnd nu se mai poate face distincia dintre starea de lichid i cea de gaz, caz n care vorbim despre extracia cu fluide supercritice (FSC). Alte modaliti de realizare a extraciei n procesele de bioseparare (dar nu numai) implic utilizarea diverselor tipuri de membrane lichide (extracia prin membrane lichide sau pertracia), a fazelor apoase nemiscibile ntre ele (extracia n sisteme apoase bifazice SAB) sau a microemulsiilor (extracia prin micele inverse). ntruct bazele teoretice ale procesului de extracie, calculul procesului, echipamentele tipice utilizate i criteriile de alegere a acestora au fost discutate pe larg n cadrul cursului de Operaii Unitare, n acest capitol se va insista doar asupra acelor aspecte specifice utilizrii proceselor de extracie n separarea compuilor obinui prin biosintez, sau a celor extrai din produse naturale (microbiene, vegetale, animale).
1

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) - Uniunea Internaional pentru Chimie Pur i Aplicat

73

Capitolul 4 Separarea prin extracie 4.1. EXTRACIA FIZIC LICHID LICHID 4.1.1. Aspecte generale privind extracia lichid lichid

Se consider o soluie binar, omogen, format dintr-un dizolvant iniial A i un solut B. Din aceast soluie, solutul B se poate separa cu ajutorului unui alt solvent S dac: (i) S i A sunt total nemiscibili (cazul ideal) sau parial miscibili; (ii) B este solubil n S; (iii) la echilibru, concentraia solutului B n solventul S (YB) este mai mare dect concentraia aceluiai solut B n solventul iniial A (XB): YB > XB (4.1) Dup amestecarea soluiei de B n A cu solventul S i dup sedimentarea amestecului, se formeaz dou straturi: un strat de extract (B dizolvat n S, cu eventuale urme de A) i un strat de rafinat (component majoritar A, cu mai puin B dizolvat, eventual cu urme de S), care pot fi separate pe baza diferenei de densitate (fig. 4.1). Solutul B, solubil att n A ct i n S se repartizeaz ntre cei doi solveni dup un coeficient de distribuie (de partiie, de repartiie): Y conc. solutului B in faza de EXTRACT KN = B = (4.2) X B conc. solutului B in faza de RAFINAT

coeficient care, pentru sistemele ideale, respect legea de repartiie a lui Nernst (fig. 4.2) [90]. La valori supraunitare ale coeficientului de distribuie solutul trece preponderent n extract, n timp ce la valori subunitare ale acestuia, rmne preponderent n rafinat. Pentru KN = 1, solutul B se repartizeaz n mod egal ntre cei doi solveni A i S, separarea prin extracie nefiind posibil. Pentru scopuri practice, se consider posibil separarea prin extracie L L atunci cnd KN > 3.
YB
SOLVENT

(S)

B+S A+B
Amestecator Separator

EXTRACT

RAFINAT

c XB
a sisteme ideale: Y = KX b, c sisteme neideale: Y = KXn

B+A

Figura 4.1. Schema de principiu a extraciei fizice lichid lichid

Figura 4.2. Relaie de echilibru ntr-un sistem cu solveni nemiscibili

Pentru realizarea extraciei L L este necesar parcurgerea urmtoarelor etape: (i) contactarea soluiei iniiale (A + B) cu solventul S (amestecarea), (ii) solubilizarea i difuzia solutului B n solventul S (transferul de mas al solutului), (iii) separarea celor dou faze: extractul (E) i rafinatul (R), (iv) recuperarea solventului din extract (uzual prin distilare); (v) desolventarea rafinatului (prin distilare sau stripare).
74

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Ca operaie unitar, extracia L L este preferat distilrii atunci cnd: (i) volatilitatea relativ a componenilor amestecului de separat este apropiat de unitate; (ii) componentul volatil este n concentraie mare sau are cldur de vaporizare mare (apa, de ex.); (iii) temperatura la care s-ar face rectificarea este mare; (iv) substanele de separat sunt termolabile. Pe acest din urm considerent s-a impus extracia L L n separarea antibioticelor, nc din perioada n care procesul nc nu era bine fundamentat din punct de vedere teoretic. Viteza procesului de extracie, exprimat prin cantitatea (M) sau fluxul (J) de solut transferat: M = K A C t (4.3) J = K A C (4.4) depinde de coeficienii de transfer de mas ai solutului n fiecare faz (dependen redat prin expresia coeficientului global de transfer de mas, K), de aria interfacial de contact ntre cele dou faze lichide (A), precum i de fora motrice a procesului (diferena concentraiei solutului ntre soluia iniial i solvent, C). Pentru accelerarea transferului solutului, deci pentru mrirea vitezei de extracie, se poate mri valoarea coeficientului de transfer K (reducerea grosimii straturilor limit prin creterea turbulenei sau prin contactarea fazelor n microcanale), se poate mri aria interfacial A (dispersia unei faze n cealalt sub forma unor picturi de dimensiuni ct mai mici), sau se poate mri potenialul transferului, lucrnd n condiii ct mai deprtate de cele de echilibru, prin adugarea unor cantiti proaspete de solvent (realizarea procesului n contracurent, n trepte, sau cu reflux de solvent).
4.1.2. Aspecte particulare ale extraciei lichid lichid n bioprocese

Printre metodele de separare i purificare utilizate n biotehnologii, metodele de extracie lichid lichid sunt utilizate frecvent, datorit faptului c aceste metode (i) sunt bine cunoscute i testate industrial cu succes n alte aplicaii, (ii) sunt adesea ieftine, (iii) se preteaz la transpunerea la scar mare, n uniti cu funcionare continu [91]. Extracia L L este utilizat n special pentru separarea din mediul de cultur a unor metabolii (alcooli, acizi carboxilici, aminoacizi, antibiotice) [92, 93], pentru prepararea unor produse farmaceutice izolate din compui naturali sau obinute prin sintez parial (sulfamide, fenobarbital, antihistaminice, cortizon, estrogeni, alcaloizi), pentru rafinarea grsimilor vegetale i animale (procedeul Solexol de extracie cu propan, extracia cu furfural), pentru extracia proteinelor din pete, extracia vitaminelor A i D din uleiul de ficat de pete, extracia vitaminei E din uleiurile vegetale [94]. Pe msur ce scara de operare se mrete, extracia L L devine din ce n ce mai atractiv datorit pe de o parte faptului c problemele referitoare la transpunerea la scar sunt cunoscute i multe dintre ele rezolvate, iar pe de alt parte datorit costurilor de investiii i exploatare mult mai sczute comparativ cu alte metode de bioseparare, cum ar fi cromatografia de lichide.

75

Capitolul 4 Separarea prin extracie 4.1.2.1. Solveni de extracie

Un solvent ideal trebuie s fie selectiv, nemiscibil cu materia prim, ieftin i uor de recuperat, netoxic, neinflamabil i necoroziv. El nu trebuie s reacioneze ireversibil cu solutul. Viscozitatea sa trebuie s fie sczut: astfel consumurile energetice pentru vehiculare vor fi mai reduse i, n plus, o valoare mic a viscozitii influeneaz favorabil coeficienii de transfer de cldur i de mas. O diferen de densitate ct mai mare ntre solvent i materia prim mbuntete dispersia i mrete viteza de deplasare a picturilor, favoriznd astfel transferul de mas. Tensiunea interfacial trebuie s aib o valoare optim: la valori prea mari, dei se uureaz separarea fazelor se ngreuneaz dispersia, n timp ce la valori prea mici exist pericolul formrii unor emulsii stabile ntre materia prim i solvent, emulsii greu de separat. Solvenii utilizai n bioprocese trebuie n plus s nu denatureze biomoleculele extrase (peptide, proteine etc.). Ca regul general, cu ct biomoleculele sunt mai mari, cu att mai complex este structura lor spaial i cu att mai mare este riscul de denaturare. Drept urmare, peptidele mari i proteinele nu se preteaz la extracia clasic cu solveni organici, ele separndu-se prin extracie n sisteme apoase bifazice. Pentru extracia produselor de biosintez polare se utilizeaz alcooli, esteri, cetone, iar pentru extracia celor nepolare eter de petrol, diclormetan, dicloretan etc. n cazul solvenilor din prima categorie, principala problem este solubilitatea lor relativ ridicat n mediul apos. Creterea masei moleculare a acestor compui reduce solubilitatea lor n ap, dar mrete tendina de formare a unor emulsii stabile cu aceasta [4].
FORMULAREA PROBLEMEI FORMULAREA PROBLEMEI
- -se identific scopul proiectrii se identific scopul proiectrii

- -se specific criteriile de proiectare pe baza formulrii problemei se specific criteriile de proiectare pe baza formulrii problemei

Alegerea metodei i stabilirea constrngerilor Alegerea metodei i stabilirea constrngerilor

- -se identific acei compui care au proprietile dorite se identific acei compui care au proprietile dorite

Rezolvarea problemei cu ajutorul CAMD Rezolvarea problemei cu ajutorul CAMD (Computer Aided Molecular Design) (Computer Aided Molecular Design)

SOLUIA: SOLUIA: mai muli solveni poteniali mai muli solveni poteniali Analiza rezultatelor i verificarea lor Analiza rezultatelor i verificarea lor candidai promitori
- -verificarea final utiliznd simulri riguroase i experimentarea verificarea final utiliznd simulri riguroase i experimentarea

- -solvenii sugerai sunt analizai utiliznd unelte externe solvenii sugerai sunt analizai utiliznd unelte externe

Selectarea solventului Selectarea solventului

soluii inacceptabile din motive de performan, economice sau de securitate

SOLVENT SOLVENT

Figura 4.3. Algoritm pentru selectarea solvenilor [99] 76

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Alegerea solventului potrivit este etapa cheie n conceperea i proiectarea unui proces de extracie. Solventul selectat trebuie s se apropie ct mai mult de profilul solventului ideal, n acest fel realizndu-se gradul dorit de separare ntr-un numr minim de etape i, evident, cu costuri minime. La ora actual exist programe de calculator care permit alegerea solventului potrivit dintr-o baz de date [95 99]. Alegerea solventului se realizeaz printr-o abordare n mai multe etape. Mai nti se formuleaz problema: CE trebuie separat, DIN CE amestec se efectueaz separarea, CARE este elul final al separrii (puritatea extractului, coninutul final de solut n rafinat etc.). Odat formulat problema, se alege metoda de rezolvare i se precizeaz eventualele constrngeri la care este supus sistemul. Utiliznd un program de tip CAMD1 se obine o list a unor solveni fezabili, aranjai n ordine dup anumite criterii date. Cei mai potrivii solveni sunt apoi analizai individual n termeni de performan, eficacitate, eficien, impact de mediu, economicitate etc. Dac nu se gsete nici un solvent potrivit, se revine n formularea problemei relaxnd anumite constrngeri sau lrgind domeniul anumitor proprieti int (presiune de vapori, tensiune superficial, punct de fierbere etc.) (fig. 4.3). n acest mod, selectarea solvenilor devine o problem de proiectare care necesit o soluionare de tip ncercare eroare.
4.1.2.2. Echipamente de extracie

Extractoarele utilizate la nivel industrial trebuie s satisfac ntr-o ct mai mare msur, urmtoarele deziderate: (i) eficacitate de separare ct mai mare; (ii) producie specific (pe m3) ct mai mare; (iii) consum minim de energie mecanic i termic (inclusiv cea pentru recuperarea solventului); (iv) cost redus de investiie i exploatare; (v) adaptabilitate la condiii variate de lucru. Eficacitatea mare a extractoarelor se poate realiza prin intensificarea transferului de mas ntr-o unitate de extracie i prin repetarea de un numr mare de ori a acestei uniti. Intensificarea transferului se obine prin mrirea celor trei factori ai ecuaiei (4.4). Extractoarele pot fi clasificate dup mai multe criterii: - n funcie de modul de contactare a fazelor: o extractoare cu contact n trepte, o extractoare cu contactare diferenial. - n funcie de criteriul unitilor de extracie: o extractoare cu uniti distincte de extracie, o extractoare continue n contracurent. - n funcie de modul de amestecare: o extractoare fr agitare, o extractoare cu agitare mecanic, o extractoare pulsate, o extractoare centrifugale. O clasificare a principalelor tipuri de extractoare comerciale este prezentat n fig. 4.4.
1

CAMD Computer Aided Molecular Design proiectare molecular asistat de calculator

77

Capitolul 4 Separarea prin extracie

Extractoare comerciale

Contactare gravitaional a fazelor

Contactare centrifugal a fazelor Extractoare centrifugale

Curgere indus gravitaional Podbielniak De Laval Quadronic Luwesta Robatel

Clasificare dup tipul agitrii

Coloane neagitate
Coloane cu pulverizare Coloane cu umplutur Coloane cu talere perforate

Coloane pulsate
Coloane cu umplutur Coloane cu talere sit Coloane ciclice controlate Amestector-decantor

Coloane agitate mecanic

Alte dispozitive

Dispozitive rotative

Dispozitive reciproce

Contactoare rotative cu agitare Amestector-decantor Coloane Scheibel Coloana Oldshue-Rushton Contactoare cu discuri rotative Extractor cu discuri rotative asimetrice Coloana Kuhni Contactor Graesser

Contactoare cu talere deplasate alternativ pe veritical Coloane cu talere perforate Coloane cu talere sit i deversor Talere cu perforaii tanate Amestectoare statice Extractoare cu talere vibrate Extractoare ultrasonice Extractoare cu pompare parametric

Figura 4.4. Clasificarea extractoarelor comerciale [100]

Extractoarele utilizate n bioprocese trebuie s asigure separarea unor produse uor degradabile, ca urmare ele trebuie s asigure viteze mari de transfer de mas n condiiile unor timpi de contact i de separare a fazelor foarte scuri. Extractoarele comerciale care corespund acestor exigene sunt extractoarele centrifugale, extractoarele rotative cu agitare i extractoarele cu talere deplasate alternativ pe vertical [100].
4.1.2.2.1. Extractoare centrifugale

Extractoarele centrifugale sunt caracterizate de faptul c timpul de contactare a fazelor este scurt, permit prelucrarea unor amestecuri avnd o diferen mic de densitate ntre faze i care emulsioneaz uor, necesit un spaiu redus pentru amplasare. Dezavantajele principale sunt legate de costul ridicat al acestora precum i de ntreinerea mai pretenioas dect la alte categorii de extractoare [100]. Din punct de vedere constructiv se mpart n dou categorii principale: extractoare cu ax orizontal i extractoare cu ax vertical. 78

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Extractorul Podbielniak (fig. 4.5) a fost primul extractor centrifugal folosit la scar industrial, fiind introdus n practic n anii 1950 [101]. Extractorul este format dintr-o foaie metalic nfurat n spiral n jurul unui arbore care se rotete cu 2000 5000 rot/min. Introducerea i evacuarea celor dou faze se realizeaz axial. Faza uoar se trimite la periferia spiralei, iar faza grea se deplaseaz ctre axul extractorului. Constructiv i funcional, acest extractor poate fi considerat drept o coloan cu talere perforate nfurat n jurul unui arbore cilindric. Cmpul de fore centrifuge duce la reducerea nlimii echivalente a unei trepte teoretice (IETT), precum i a timpului de contact ntre faze. Datorit cmpului de fore centrifugal i diferenei de densitate are loc o curgere radial, n contracurent, a celor dou faze. Productivitatea acestor extractoare este de 2,5 10 m3 [4], dar poate ajunge i pn la 98 m3/h [100].
Faza grea Faza uoar

H F E G J C A

b
c
Figura 4.5. Extractor Podbielniak a principiu de funcionare; b seciune; c extractor pilot.
A intrare faz uoar; B ieire faz grea; C ieire faz uoar; D intrare faz grea; E zon de contact reglabil; F, G zone de separare reglabil; J, H conducte de alimentare cu lichide; 1 capac lateral demontabil; 2 site perforate concentrice; 3 suport; 4 carcasa rotor; 5 lagre; 6 arbore; 7 etanare; 8 racorduri pentru curire.

Extractorul Luwesta (fig. 4.6) este constituit dintr-o succesiune de regiuni de amestecare separare, cu circulaia fazelor n contracurent. Extractorul se construiete cu dou sau trei trepte, fiecare treapt fiind prevzut cu discuri de amestecare i conuri de separare. Fazele se introduc i se evacueaz prin axul central, amestecarea avnd loc la trecerea prin orificiile axului, n fiecare treapt. Solventul proaspt se introduce n treapta inferioar, iar soluia iniial n treapta superioar. Amestecul de lichide se separ sub aciunea forei centrifuge, iar apoi lichidele trec prin orificii diferite n ax, de unde sunt din nou distribuite n trepte diferite [102]. Au avantajul unor productiviti ridicate (1,25 120 m3/h ntr-o singur treapt), al unui timp de contact scurt (cteva secunde) i al necesarului redus de solvent. Pe lng dezavantajele comune extractoarelor centrifugale, mai prezint dezavantajul apariiei la periferia cilindrului rotativ a unor presiuni locale de peste 10 MPa, care modific diagrama fazelor i 79

Capitolul 4 Separarea prin extracie

diagrama de echilibru, cu efecte directe asupra numrului de trepte de contact nercesare obinerii a gradului de separare dorit [4].
Rafinat Solvent

Soluie inial

Extract

Faza uoar Faza grea

Figura 4.6. Extractor Luwesta [102]

1 discuri de amestecare; 2 conuri de separare; 3 ax central.

Figura 4.7. Extractor Alfa-Laval [87]

Extractorul Alfa-Laval (fig. 4.7) este un extractor cu ax vertical, n care ambele faze sunt alimentate sub presiune, la baza utilajului. Rotorul este format dintr-o serie de cilindri concentrici, prevzui cu aripioare elicoidale, care formeaz o serie de treceri sub form de spirale. Faza uoar este dirijat spre periferie, de unde curge spiralat spre ax, circulnd n contracurent cu faza grea introdus lng axul central. Datorit curgerii n spiral, lichidele parcurg un traseu lung de circa 25 m [87]. Extractoarele Alfa-Laval lucreaz la debite de alimentare de 5 9 m3/h, raportul dintre faza apoas i solvent fiind cuprins ntre 3:1 i 5:1, ajungnd chiar pn la 8:1 n cazul extraciei penicilinei G, care se extrage n proporie de 96 98% [4]. Extracia se poate realiza n cmp de fore centrifugal i n separatoare centrifugale cu discuri. Contactarea fazelor se poate realiza utiliznd amestectoare centrifugale de sine stttoare sau integrate n partea superioar a separatorului centrifugal. n cazul amestectoarelor centrifugale (fig. 4.8), fazele care trebuiesc contactate sunt pompate mpreun ntr-un tambur rotativ de amestecare, unde sunt accelerate centrifugal spre periferie, de unde amestecul este preluat de o pomp centripet, n canalele creia are loc amestecarea intens a fazelor. Caracteristicile amestecrii pot fi reglate prin modificarea turaiei electromotorului de antrenare a amestectorului, mrimea picturilor i gradul de turbulen variind cu viteza de rotaie. Amestectorul centrifugal poate fi ncorporat n separatorul centrifugal cu discuri (fig. 4.9), cu avantajul unei construcii mai compacte [103]. Amestecul de separat este alimentat prin racordul (1). Solventul proaspt sau extractul din treapta anterioar (n cazul extraciei n trepte n contracurent) alimentat prin racordul (4) se amestec cu rafinatul n pompa centripet (5). Extractul limpede este evacuat prin 80

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

racordul (2), iar rafinatul prin racordul (3). Amestecarea fazelor sub aciunea forei centrifuge are loc n camera de distribuie a tamburului centrifugei (6).

Figura 4.8. Amestector centrifugal Westfalia

1 alimentare cu soluie iniial i solvent; 2 tambur de amestecare; 3 pomp centripet; 4 evacuare amestec de lichide.

Amestectorul centrifugal poate fi cuplat i cu un separator centrifugal prevzut cu dispozitiv de autocurire a fazei solide (fig. 4.10), caz n care se poate realiza extracia din suspensii coninnd pn la 7% v/v faz solid [104].

Figura 4.9. Extractor centrifugal Westfalia cu amestector ncorporat

1 alimentare; 2 evacuare faz uoar; 3 evacuare rafinat; 4 solvent proaspt sau extract de la unitatea anterioar; 5 pomp centripet; 6 camera de distribuie a tamburului centrifugei.

Figura 4.10. Extractor centrifugal Westfalia pentru suspensii, cu dispozitiv de autocurire a fazei solide
1 alimentare suspensie + solvent; 2 evacuare faz uoar; 3 evacuare faz grea.

n contextul tendinei actuale de integrare a proceselor, de reducere a numrului de operaii prin folosirea unor echipamente complexe n care s se realizeze mai multe etape ale procesului tehnologic (reacie + separare), a fost conceput extractoruldecantor Westfalia, utilizat n extracia antibioticelor din lichidele de fermentaie, fr filtrarea prealabil a biomasei penicilinelor (fig. 4.11).
81

Capitolul 4 Separarea prin extracie

Figura 4.11. Extractor-decantor Westfalia [104]

1 alimentare cu suspensie (lichid de fermentaie + miceliu); 2 alimentare cu solvent; 3 evacuare rafinat; 4 zon de extracie n contracurent; 5 disc separator; 6 pomp centripet pentru evacuarea extractului.

Extractorul-decantor n contracurent este o centrifug decantoare orizontal cu tambur cilindro-conic prevzut cu un transportor elicoidal care se rotete cu o vitez mai mic cu 32 rot/min dect tamburul. Suspensia alimentat prin racordul (1) ptrunde n transportorul elicoidal printr-o serie de fante de distribuie practicate n acesta. Aici intr n zona de extracie (4), curgnd n contracurent cu solventul alimentat prin racordul (2). Rafinatul este descrcat gravitaional la captul conic al tamburului, prin racordul (3). Faza solid este preluat de ctre transportor i descrcat gravitaional mpreun cu rafinatul. Solventul se deplaseaz ctre captul cilindric al tamburului, fiind descrcat sub presiune prin intermediul pompei centripete (6) [104]. Tamburul are o lungime de 0,75 m i un diametru de 0,22 m, turaia sa fiind de 5000 rot/min. Debitul de alimentare cu lichid de fermentaie este de 1,3 2 m3/h, realizndu-se un grad de extracie a antibioticelor de 97 98% [4]. Contactorul centrifugal CINC (fig. 4.12) are o construcie original care i permite utilizarea ca unitate de extracie [105]. n principiu seamn cu centrifuga tubular, deosebindu-se ns de aceasta prin faptul c are dou racorduri de intrare (unul pentru soluia iniial i altul pentru solvent). Amestecarea fazelor i extracia au loc n spaiul inelar dintre rotor i carcas, spaiu caracterizat printr-o curgere particular, de tip Taylor Couette. Acest tip de curgere intensific transferul de mas, datorit reducerii dispersiei axiale, prin formarea de vrtejuri Taylor [106, 107]. Separarea fazelor are loc n interiorul rotorului, la fel ca ntr-o centrifug tubular obinuit. Prin conectarea mai multor astfel de uniti se poate realiza procesul de extracie n mai multe trepte, n contracurent. Astfel de uniti, cu factor de eficacitate z = 100 1000 se construiesc pentru capaciti de prelucrare ntre 0,1 i 136 m3/h, cele special destinate bioseparrilor fiind n construcie sanitar (oel inoxidabil sau Hastelloy) i prevzute cu sistem CIP [105, 108].
82

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

deversor FU colector FG deversor reglabil FG colector FU

extract

rafinat

FG FU FU interfa FG spaiu de vapori carcasa zon inelar de amestecare rotor ax disc distribuitor

Treapta I I Treapta

Treapta II Treapta II

a
Faza grea (FG)

intrare n rotor Faza uoar (FU) Amestec

soluie iniial

solvent proaspt

Treapta III Treapta III

Figura 4.12. Contactor centrifugal CINC a schem constructiv i funcional; b instalaie de extracie n trei trepte n contracurent 4.1.2.2.2. Extractoare rotative cu agitare

Dei utilizate pe larg n procesele de extracie cu solveni, aceste dispozitive sunt mai puin utilizate n procesele de bioseparare. n fig. 4.13 sunt prezentate principalele extractoare rotative de tip coloan, cu agitare mecanic.
Faza uoar Faza grea interfa

Faza uoar

Faza grea

Figura 4.13. Extractoare rotative cu agitare a coloan Scheibel; b contactor cu discuri rotative; c contactor cu discuri rotative asimetrice; d coloan Khni Coloana Scheibel este prevzut alternativ cu agitatoare cu dou pale montate pe un ax, i cu compartimente neagitate care servesc drept zone de separare, fiind prevzute cu site metalice deschise pentru mbuntirea coalescenei. Prezena sitelor 83

Capitolul 4 Separarea prin extracie

implic utilizarea unor faze lichide lipsite de impuriti solide (miceliu, mas celular), restrngndu-se astfel aria de aplicare a acestui echipament n procesele de bioseparare [109]. Alte construcii utilizeaz icane orizontale cu sau fr site, sau agitatoare de tip impeler [100]. Contactorul cu discuri rotative (CDR), are montate n interiorul coloanei mai multe icane inelare apropiate, ntre care se rotesc discurile amplasate simetric pe un ax central. Diametrul discurilor este mai mic dect deschiderea icanelor inelare. CDR folosete aciunea de forfecare a discurilor n micare rapid de rotaie pentru dispersia fazelor. Construcia are o seciune liber mare, ceea ce este avantajos pentru prelucrarea unor debite mari, dar aduce dezavantajul amestecrii inverse a fazelor. O variant a acestui echipament este coloana Oldshue Rushton, n care discurile rotative sunt nlocuite cu agitatoare tip turbin [87, 100]. Contactorul cu discuri rotative asimetrice (CDRA) este o perfecionare a CDR, arborele cu discuri fiind montat excentric fa de axul coloanei. Zonele de amestecare sunt separate de cele de sedimentare prin intermediul unei icane verticale. n acest fel se evit amestecarea invers caracteristic CDR [100]. Datorit divizrii coloanei, capacitatea CDRA este mai mic dect cea a CDR [110]. Extractorul Khni este bazat pe pricipii similare coloanelor Scheibel. Axul central este prevzut cu agitatoare tip turbin, turbinele fiind separate ntre ele prin intermediul unor discuri perforate (statoare). Curgerile axiale se suprapun peste cele radiale, crendu-se o curgere de tip vortex. Performanele acestor coloane se pot optimiza prin modificarea diametrului turbinelor i a ariei libere a discurilor perforate [87, 100, 102].
4.1.2.2.3. Extractoare cu talere pulsate

n aceste echipamente dispersia fazelor se realizez prin deplasarea alternativ pe vertical sau prin vibrarea talerelor n coloan (fig. 4.14). Fa de coloanele pulsate, n care energia este indus fazei lichide i nu amenajrilor interne, consumul energetic este mai sczut la acelai efect de amestecare i dispersie uniform a fazelor [100].

Figura 4.14. Tipuri de talere utilizate n coloanele cu talere pulsate [111] 84

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Extractorul Karr (fig. 4.15) este unul dintre cele mai cunoscute din aceast categorie. Coloana de extracie este prevzut n interior cu o serie de talere perforate i de icane, amplasate alternativ. Pachetul de talere este rigidizat pe circumferin cu ajutorul unor tirani i este susinut de un ax central. Acest ax este acionat cu ajutorul unui mecanism amplasat la partea superioar a coloanei, mecanism care confer axului i implicit pachetului de talere o micare vertical alternativ cu amplitudine mic i frecven mare.
1 2

Faza uoar

Faza grea

8 a orificii pentru tirani 3 4 6 Faza uoar orificii = 1,5 mm pas = 1,75 mm Suprafa liber = 58% b 7

5 900 mm c Faza grea

Figura 4.15. Extractor Karr [86] a extractor n curs de asamblare; b detalii talere; c schem de principiu.
1 ansamblu acionare talere; 2 etanare; 3 ican metalic; 4 taler perforat; 5 dispozitiv de control interfa; 6 ican din teflon; 7 tirani i distanieri; 8 ax central i distanieri; 9 plac superioar.

Coloanele Karr i-au gsit aplicarea n special n industria farmaceutic, n petrochimie i n tratarea apelor reziduale. La ora actual se construiesc astfel de extractoare de pn la 1,5 m diametru [86, 111]. Datorit suprafeei libere ridicate a talerelor (58%) poate fi utilizat pentru extracia bioproduselor direct din mediul de cultur, fr o prealabil separare a masei celulare [109].
4.1.2.2.4. Alte echipamente de extracie

La ora actual, procesele industriale de extracie L L sunt caracterizate de o eficaciate crescut, cuplat cu o valoare redus a capacitii de reinere i cu valori IETT
85

Capitolul 4 Separarea prin extracie

ct mai mici. n coloanele de extracie de acest tip sunt folosite diverse echipamente mecanice care asigur un grad ridicat de dispersie a unei faze n cealalt. ntr-o serie de procese, n general procese de bioseparare (extracia antibioticelor, vitaminelor, hormonilor, proteinelor etc.), utilizarea unei agitri agresive, impus de condiiile hidrodinamice din acest tip de aparate, afecteaz structura sau caracteristicile produselor obinute. De asemenea, timpul de contact prea ndelungat al solvenilor cu produsele extrase pot induce modificri calitative nepermise att n solut ct i n solvent. n aceste condiii este necesar minimizarea timpului de staionare al fazei disperse n aparatele de extracie. Un astfel de deziderat poate fi atins n coloanele de extracie cu rotoare cilindrice care, n ciuda capacitii de prelucrare reduse, au avantajul unei eficaciti mrite, datorit regimului de curgere asigurat. n spaiul inelar ngust dintre rotoare, sau dintre rotor i stator, datorit vitezei diferite de micare a pereilor cilindrici, curgerea este de tip Couette Taylor. Cele dou fluide se stratific, iar la interfa apar vrtejurile Taylor, prin intermediul crora se asigur un transfer de mas foarte intens (fig. 4.16). Extractorul poate funciona n poziie orizontal sau vertical (fig. 4.17), putnd fi echipat cu unul sau dou rotoare cilindrice [87, 106, 107].
suport superior ieire faza uoar

vrtejuri Taylor intrare faza grea ieire faza grea intrare faza uoar
coloan

icane

scuturi conice rotor

ieire faza uoar

intrare faza grea intrare faza uoar

scuturi conice ax inele din carbon ieire faza grea

cilindru interior

cilindru exterior

suport inferior

suport inferior

Figura 4.16. Schema de principiu a unui extractor Taylor Couette bifazic [107]

Figura 4.17. Extractor cu un rotor cilindric vertical [87]

4.1.3.

Aplicaii ale extraciei fizice lichid lichid n bioprocese

Extracia fizic lichid lichid are relativ puine aplicaii n bioprocese, datorit incompatibilitii solvenilor organici clasici cu produsele de biosintez. Dup cum reiese din tab. 4.1, majoritatea acizilor carboxilici i aminoacizilor au valori extrem de reduse ale coeficienilor de distribuie n solveni organici, extracia lor nefiind posibil n acest sistem, ci doar ca extracie reactiv. Doar antibioticele se preteaz la extracia cu solveni organici, metoda fiind aplicat la scar industrial.
86

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Tabelul 4.1. Coeficieni de distribuie ai unor biocompui n solveni organici [112, 113]
Categoria Solut Acid propanoic Solvent n-hexan ciclohexan MIBC* ciclohexanon n-butanol MIBC n-butanol izobutanol dietileter dietileter MIBC n-butanol izobutanol dietileter MIBC n-butanol izobutanol dietileter MIBC izobutanol dietileter MIBC izobutanol dietileter MIBC izobutanol dietileter MIBC n-butanol dietileter MIBC n-butanol izobutanol KN 0,05 0,06 2,15 3,30 3,20 0,14 0,73 0,66 0,16 0,15 0,19 1,20 0,96 1,50 1,40 3,30 4,60 0,15 0,21 0,92 0,02 0,04 0,36 0,35 0,55 1,80 0,003 0,02 0,16 0,009 0,09 0,29 0,30 0,01 0,02 0,20 0,07 0,02 0,30 110 23 120 0,17 0,6 17 100 0,01 32 0,06 12 0,10 Observaii

Acid lactic Acid piruvic Acid succinic

Acid fumaric Acizi carboxilici Acid maleic Acid malic Acid itaconic Acid tartric Acid citric

25 C

Aminoacizi

Glicin Alanin Lizin Acid glutamic Acid -aminobutiric Acid -aminocaproic Celesticetin Cicloheximid Eritromicin Limcomicin Gramicidin Novobiocin Penicilin F Penicilin K

n-butanol

25 C

Antibiotice

n-butanol diclormetan acetat de amil n-butanol benzen cloroform - metanol acetat de butil acetat de amil acetat de amil

pH = 4,2 pH = 7,0 pH = 10,5 pH = 4,0 pH = 6,0 pH = 4,0 pH = 6,0

* MIBC metil-izobutil-ceton

87

Capitolul 4 Separarea prin extracie 4.1.3.1. Extracia antibioticelor

Separarea prin extracie L L a antibioticelor se face, de regul, dup separarea masei celulare, dar exist i procedee care permit extracia lor din lichidul de fermentare nefiltrat sau din biomas. Extractul este purificat ulterior prin reextracie, precipitare, cromatografie de schimb ionic, cristalizare [92]. Dac antibioticul este slab acid, avnd un pK sczut, pH-ul utilizat n extracie trebuie sczut pn sub valoarea pK, pentru a obine antibioticul n form acid nedisociat. Dac ns antibioticul este slab bazic, cu pK ridicat, valoarea pH-ului trebuie crescut n timpul extraciei peste valoarea pK, n vederea obinerii antibioticului n form bazic nedisociat. Dac solubilitatea n ap a antibioticului este foarte ridicat, lichidul de fermentaie se satureaz cu o sare (uzual sulfat de potasiu), care provoac cristalizarea prin salefiere a antibioticului, uurnd extracia acestuia [92]. Valoarea pH-ului influeneaz puternic att coeficientul de distribuie, ct i gradul de extracie. Pentru exemplificare, n tab. 4.2 se prezint variaia coeficientului de distribuie al penicilinei G ntre ap i diveri solveni organici la diverse valori pH, iar n tab. 4.3 gradul de extracie al penicilinelor n acetat de butil n funcie de valoarea pH-ului fazei apoase [4]. Tabelul 4.2. Coeficieni de distribuie ai penicilinei G n sisteme ap solvent organic la 0 C [4]
Solvent Metil-etil-ceton Dimetilciclohexan Metilciclohexan Ciclohexan Furfurilacetat Metil-i-butil-ceton Dimetilftalat Acetat de amil Dietiloxalat Valoarea coeficientului de distribuie, KN pH = 0 pH = 4 180 19 160 15 80 7 62 4 44 4 33 3 30 2,7 20 1,8 20 1,8

Tabelul 4.3. Gradul de extracie al unor peniciline i precursori de biosintez ai acestora n acetat de butil [4]
Compus Penicilina G Penicilina F Penicilina K Acid fenilacetic pH = 2 98 100 100 98 Gradul de extracie [%] pH = 3 pH = 4 pH = 5 95 75 21 100 97 89 100 80 62 98 96 89 pH = 6 10 39 12 39

Dac extracia antibioticelor se face cu un solvent nepolar, cum este acetatul de butil, gradul de extracie va fi maxim numai dac antibioticele se gsesc n soluia apoas supus extraciei sub form nedisociat. n faza apoas, penicilinele disociaz datorit gruprii carboxilice conform echilibrului:
P COOH[]aq
+ P COO[]aq + H[]aq

(4.5)

88

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII n care pKa = 2,75 pentru penicilina G i pKa = 2,70 pentru penicilina V. Ca urmare, pentru a exista n stare nedisociat, pH-ul fazei apoase din care se realizeaz extracia va trebui s fie mai mic de 2,7. Pentru grade de extracie maxime, valoarea pH trebuie s scad sub 2 (tab. 4.3). n medii puternic acide ns, viteza de dezactivare a penicilinelor este foarte ridicat: la pH = 1,5 i 35 C timpul de inactivare al penicilinei G este de numai 4 minute. Ca urmare, pH-ul utilizat la extracie reprezint un compromis ntre stabilitatea penicilinei i valoarea gradului de extracie, respectiv a coeficientului de distribuie [114]. Pentru minimizarea timpului de meninere a penicilinei la pH sczut, contactarea fazei apoase cu solventul de extracie se face nainte de acidulare, iar amestecul de lichid de fermentaie-solvent este amestecat cu soluia de H2SO4 4 6% n amestectoare in-line, de mare eficien. Tot pentru stabilizarea penicilinelor extracia decurge la temperaturi sczute (0 3 C), n extractoare cu timp de contact scurt ntre faze (extractoare Podbielniak). Dup separarea fazelor, pentru stabilizarea produsului, se neutralizeaz urmele de acid antrenate n faza organic prin adugare de soluie apoas de fosfat de potasiu, carbonat sau acetat de sodiu sau potasiu, pn la atingerea pH = 6, cnd penicilina este reextras i stabilizat sub form de sare n soluia apoas [4, 94, 115]. Purificarea se poate realiza printr-o nou extracie la pH = 2 2,5 urmat de neutralizare cu fosfat de potasiu 2% pn la pH = 6. Solventul epuizat este recirculat la extracie, mpreun cu solventul recuperat din rafinat prin distilare. Impuritile organice coextrase mpreun cu penicilina sunt ndeprtate prin adsorbie pe crbune activ. O schem de principiu a acestui procedeu de fabricaie este redat n fig. 4.18 [115].

Ap

Solvent Acid

C activ n solvent Solvent

Lichid de fermentaie coninnd penicilina G sau V

Miceliu

Rafinat (cu solvent) la distilare Extracie Tratare cu C activ Solvent Solvent

C activ (cu solvent + impuriti) la distilare Filtrare CH3-COOK (Na) n solvent Solvent + impuriti la distilare

Filtrare lichid de fermentaie

Aer cald

Penicilina G sau V, sare de Na sau K Filtrare i uscare cristale

Solvent + impuriti la distilare Splare cristale Filtrare cristale Cristalizare

Figura 4.18. Schema de principiu a instalaiei de extracie i purificare a penicilinelor [115] 89

Capitolul 4 Separarea prin extracie 4.1.3.2. Extracia alcoolilor

Etanolul i butanolul sunt cei mai importani alcooli obinui prin fermentaie din materii prime regenerabile. Una din problemele cu care se confrunt producerea fermentativ a etanolului este aceea a inhibrii activitii drojdiilor cnd concentraia etanolului n lichidul de fermentaie depete 12% masice. Datorit acestui fapt concentraia etanolului obinut prin fermentaie nu depete 5 10% vol [92]. Din lichidul de fermentaie, calea clasic de recuperare a etanolului este distilarea. n comparaie cu aceasta, extracia cu solveni implic cheltuieli de investiii mai mari cu circa 60% [116]. Totui, ndeprtarea prin extracie a etanolului n timpul fermentaiei ar permite creterea randamentului n alcool. Cercetrile sunt ndreptate spre fermentarea extractiv in situ [117, 118]. Solventul utilizat trebuie s prezinte un coeficient de distribuie ridicat pentru etanol, s nu formeze emulsii stabile care s ngreuneze extracia, s nu aib efecte adverse asupra masei celulare. n literatur sunt menionai drept posibili solveni dodecanolul, i-alcooli superiori, n-alcooli superiori, tributilfosfat, dibutilftalat, dodecan, fluorocarburi, i-acizi carboxilici superiori [92], sisteme apoase bifazice [119]. O instalaie de fermentare extractiv in-situ este redat n fig. 4.19 [115]. Lichidul de fermentaie este scos din bioreactor i trecut printr-o instalaie de ultrafiltrare. Retenatul cu mas celular de la ultrafiltrare este recirculat n bioreactor, iar permeatul este trecut n coloana de extracie, unde circul n contracurent cu solventul. Rafinatul de la extracie este trecut printr-o coloan cu crbune activ care are rolul de a reine urmele de solvent, dup care este recirculat n bioreactor [120].
rafinat solvent retenat

crbune activ

extract

permeat fermentare ultrafiltrare adsorbie extracie

Figura 4.19. Instalaie de fermentare extractiv in-situ [115] 4.1.3.3. Extracia acizilor carboxilici

Acizii organici obinui prin fermentaie pot fi separai i prin extracie, un studiu artnd c n calitate de ageni de extracie pot fi utilizai compui organici coninnd legturi C=O, P=O, sau amine alifatice cu mas molecular mare [113]. La fabricarea acidului acetic din materii prime petroliere se formeaz alturi de produsul dorit i cantiti semnificative de acizi formic i propionic. Un procedeu dezvoltat de Distillers Company, procedeu care poate fi utilizat i pentru prelucrarea 90

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII acidului acetic obinut prin fermentare, folosete pentru separarea acidului acetic din masa de reacie apoas extracia cu acetat de i-amil. n acest solvent acidul acetic este extras aproape integral, mpreun cu o anumit cantitate de ap. Extractul este deshidratat prin distilare azeotrop, utiliznd acelai solvent ca antrenant pentru ap. Rafinatul apos de la extracie, care conine mici cantiti de acid acetic i de solvent, este stripat n vederea recuperrii solventului i acidului, dup care este descrcat [94, 115]. Analiza economic arat c introducerea etapei de extracie aduce economii importante n costurile de investiii i de exploatare (tab. 4.4) [121]. Tabelul 4.4. Comparaie ntre procesele de deshidratare a acidului acetic [121]
Proces Distilare azeotrop Extracie cu solveni i distilare azeotrop Cheltuieli de capital 100 % 40 50 % Consum de abur 100 % 20 42 % Cheltuieli de exploatare 100 % 50 %

Acidul citric se obine pe scar larga prin fermentaia mediilor coninnd melas, glucoz sau zaharoz, utiliznd culturi de Aspergillus niger. Lichidul de fermentaie rezultat conine un amestec de acizi organici (citric, aconitic, succinic, malic, fumaric) n care acidul citric reprezint 80 95% [2]. Din acest amestec acidul citric se separ prin precipitare cu ioni Ca2+. Citratul de calciu obinut este filtrat, splat, tratat cu acid sulfuric. Soluia de acid citric separat prin filtrare de sulfatul de calciu solid este apoi trecut la purificare (adsorbie pe crbune activ, schimbtori de ioni), concentrare prin evaporare, cristalizare, filtrare, uscare [2, 115]. Procedeul Lurgi de fabricare evit formarea deeului de sulfat de calciu. Dup separarea lichidului de fermentaie de masa celular prin filtrare la vid, n faza lichid se adaug un agent de precipitare (~1 L/t acid citric monohidrat de puritate farmaceutic) pentru ndeprtarea proteinelor i a altor compui organici. Precipitatul format se ndeprteaz prin filtrare membranar, soluia de acid citric fiind apoi purificat prin adsorbie pe crbune activ, schimb ionic i concentrat prin evaporare. Din soluia concentrat acidul citric este cristalizat, centrifugat, uscat i ambalat [122]. Acidul citric de fermentaie poate fi separat i cu ajutorul extraciei L L, folosind ca ageni de extracie amine cu mas molecular mare (extracie reactiv) sau extractani organofosforici. Solventul ales trebuie s aib un coeficient de distribuie bun pentru acidul citric, dar mai mic de 10, pentru a permite reextracia uoar cu ap, precum i o tendin redus de emulsionare. Reextracia trebuie realizat cu ap i nu cu soluii bazice, pentru a evita formarea citrailor, fapt care ar anula avantajele extraciei cu solveni comparativ cu procedeul clasic de precipitare. Extracia cu tri-n-butilfosfat (TBP) dizolvat n Shellsol A este puternic dependent de temperatur (fig. 4.20), un proces eficient realizndu-se prin extracie la 22 C, urmat de stripare cu ap la 60 C [123]. Acidul butiric, cu utilizri n industria alimentar, farmaceutic i parfumerie se poate obine prin fermentare, ns aplicabilitatea procedeului este restrns datorit concentraiilor reduse obinute (20 30 g/L) i datorit formrii simultane a acidului acetic [124]. Acidul butiric st la baza unor medicamente utilizate pentru tratamentul cancerului colorectal i al hemoglobinopatiilor [25] i este de dorit ca n astfel de aplicaii s fie utilizat un compus obinut din produse naturale. Din amestecul de reacie acidul butiric poate fi extras cu decanol [126]. 91

Capitolul 4 Separarea prin extracie Acidul lactic utilizat ca aditiv alimentar se obine prin fermentare folosind glucoza ca substrat. Din mediul 30 de cultur acesta se poate recupera prin extracie cu izopropileter [94], ns mult mai eficient este extracia reactiv a 20 acestuia. 10 Acizii carboxilici aromatici nu se obin prin fermentare, ntruct ei sunt rareori sintetizai de ctre micro10 20 30 40 50 organisme. Acidul salicilic reprezint o Concentraia acidului citric n rafinat [g/L] excepie, el fiind sintetizat de ctre Figura 4.20. Izoterme de extracie a Pseudomonas aeruginosa prin bioacidului citric cu TBP [123] transformarea naftalinei [92]. Din lichidul de cultur acest aminoacid poate fi extras cu xilen, cu sau fr adaos de amine [91].
40

4.2. EXTRACIA N SISTEME APOASE BIFAZICE Cu toate avantajele extraciei cu solveni fa de alte metode de separare, utilizarea sa este limitat la extracia unor componente biologice cu structur simpl i stabilitate relativ ridicat. Moleculele de natur proteic sunt polare, iar solubilitatea lor n solveni organici nepolari este redus. n plus, solvenii organici pot provoca denaturri ale substanelor proteice n timpul extraciei. Datorit acestui fapt, pentru separarea din faza apoas a proteinelor prin extracie lichid lichid, este necesar gsirea unui solvent care, spre deosebire de solvenii organici uzuali, s aib capacitate mare de solubilizare pentru proteine, s nu le denatureze i s produc o tensiune interfacial sczut. Deoarece solventul care corespunde cel mai bine acestor deziderate este chiar apa, singura problem care rmnea de rezolvat era gsirea lacunei de miscibilitate, respectiv a zonei n care un sistem apos devine eterogen, aprnd dou faze nemiscibile ntre ele. Primele sisteme apoase eterogene au fost observate nc din 1896 de ctre Beijerinck [127], n cercetrile efectuate asupra unor soluii apoase de gelatin i agar, iar mai recent de ctre Albertsson [128], care a pus n eviden coexistena fazelor apoase nemiscibile ntre care se pot partiiona macromolecule i diverse particule. 4.2.1. Formarea sistemelor apoase bifazice

Sistemele apoase bifazice (SAB) se pot utiliza n procesele de separare a proteinelor prin extracie L L. Tehnica se bazeaz pe incompatibilitatea a doi polimeri hidrofili diferii la dizolvarea lor ntr-un solvent uzual cum este apa, sau pe incompatibilitatea dintre un polimer hidrofil i o sare anorganic. Lacunele de miscibilitate pot aprea n diferite sisteme apoase; acestea se bazeaz pe interaciuni polimer polimer, polimer sare, sau pe termoseparare. Un caz aparte l reprezint extracia bazat pe afinitate, care poate fi privit i ca un proces de extracie reactiv [129]. 92

Concentraia acidului citric n extract [g/L]

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Majoritatea polimerilor hidrofili, naturali sau sintetici, sunt solubili n ap. La concentraii sczute ale polimerilor n soluia apoas, sistemul este omogen. La o anumit concentraie a polimerilor, strict determinat i msurabil prin metode turbidimetrice, se produce separarea fazelor. Valorile concentraiilor la care sistemul devine eterogen depinde de masa molecular a polimerilor, scznd cu creterea acesteia. Cel mai cunoscut i studiat sistem pe baz de polimeri este cel bazat pe polietilenglicol (PEG) i dextran (fig. 4.21).
A

4 C
M

20 C

F B

Figura 4.21. Diagrama de echilibru a sistemului PEG / Dextran la 4 i 20 C [128] Curba care trece prin punctele AFB poart denumirea de curb binodal. Orice punct situat sub aceast curb reprezint o soluie omogen de PEG i dextran n ap. Punctele situate pe aceast curb reprezint rapoartele concentraiilor de PEG, respectiv dextran, la care se produce separarea fazelor. Deasupra curbei binodale sistemul este bifazic, fiind format din dou faze apoase nemiscibile: o faz apoas superioar, faza uoar, bogat n PEG i o faz apoas inferioar, faza grea, bogat n dextran. n punctul M, de exemplu, sistemul la echilibru este format din faza uoar superioar, de compoziie corespunztoare punctului A i din faza grea inferioar de compoziie corespunztoare punctului B. Dreapta care unete punctele A i B poart denumirea de linie de legtur sau conod. Toate amestecurile eterogene obinute pentru proporii ntre concentraiile PEG i dextranului situate pe aceeai conod vor avea aceeai compoziie a fazelor, diferind doar prin volumele ocupate de aceste faze. Raportul volumelor fazelor formate se poate exprima prin raportul dintre distanele de la punctul corespunztor la extremitile conodei: Vsup MB = (4.6) Vinf MA n care Vsup i Vinf reprezint volumele fazei superioare, respectiv inferioare. Punctul F este aa-numitul punct critic, n care conoda este reprezentat de un singur punct pe curba binodal. n acest punct, adugarea unei cantiti infinitezimale de ap conduce la formarea a dou faze apoase nemiscibile, de volum i compoziie identice. Ca urmare, orice component adugat va avea un coeficient de distribuie KN = 1, coeficientul de distribuie reprezentnd raportul dintre concentraia componentului n faza superioar, Ci, sup i concentraia componentului n faza inferioar, Ci, inf [129]: C K N = i ,sup (4.7) Ci ,inf 93

Capitolul 4 Separarea prin extracie Cu creterea lungimii conodei, compoziia fazelor la echilibru devine din ce n ce mai diferit, iar coeficientul de distribuie se modific n mod corespunztor, permind realizarea separrilor. SAB pot fi obinute i prin amestecarea, n anumite proporii, a polimerilor cu electrolii (fig. 4.22), acestea fiind uneori mai performante dect SAB care conin numai polimeri [4]. Cele mai utilizate SAB sunt redate n tab. 4.5 [4]. Tabelul 4.5. SAB frecvent utilizate [4]
Polietilenglicol Polipropilenglicol Alcool polivinilic Polivinilpirolidon Dextran Metoxi-polietilenglicol Polietilenglicol Alcool polivinilic Polivinilpirolidon Hidroxi-propildextran Dextran Metilceluloz Hidroxi-propildextran Dextran Hidroxi-propildextran Dextran Dextran Dextran K3PO4 K3PO4 K3PO4, MgSO4, (NH4)2SO4, Na2SO4, formiat de Na (K), tartrat de Na (K) K3PO4

Alcool polivinilic Metilceluloz Etil-hidroxiceluloz Hidroxi-propildextran Polipropilenglicol Metoxi-polietilenglicol Polietilenglicol

Figura 4.22. Diagrama de echilibru a sistemului PEG 4000 / Fosfat de potasiu [128]

Polivinilpirolidon

Pe lng sistemele polimer polimer i polimer sare exist i alte alternative de SAB. O dezvoltare recent o constituie utilizarea detergenilor neionici cu grupri hidrofile oxietilenice. La temperaturi sczute exist o singur faz, format din lichidul de fermentaie i micelele de detergent, detergentul interacionnd mai ales cu proteinele hidrofobe. La creterea temperaturii peste o anumit valoare (dependent de sistem), apare turbiditatea care indic apariia unei faze noi. Aceast temperatur mai este numit i punct de tulburare (cloud point). Valoarea sa depinde n special de numrul mediu al gruprilor oxietilenice din detergent. De exemplu, un detergent C12EO5 are punctul de tulburare la 23 25 C. Separarea fazelor, datorat hidratrii reversibile a gruprilor polare de la extremitile moleculei conduce la formarea unei faze mbogite n detergent i a uneia srcite n detergent. Micelele sufer un proces de agregare n structuri laminate avnd proteina hidrofob ntr-o aa-numit faz coacervat cu un coninut de 70 80% ap [130]. Procesul este redat schematic n fig. 4.23. Un proces similar este i extracia cu micele inverse, discutat n subcapitolul 4.3. Anumii copolimeri polietilen (PE) polipropilenoxid (PPO) prezint de asemenea proprietatea de deshidratare reversibil a gruprilor oxidice ntr-un domeniu atractiv de temperatur [131-133]. Iniial se folosete un SAB de tip polimer polimer pentru trecerea proteinei 94

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII n faza bogat n copolimer PE/PPO. Dup aceast prim separare, soluia de de copolimer este nclzit deasupra punctului de tulburare, ceea ce duce la separarea fazelor i trecerea aproape integral a proteinei n faza srac n polimer.
Protein Agregat proteintensid Detergent Micel Substan nedorit

Figura 4.23. Soluia apoas de detergent sub i peste punctul de tulburare [129] 4.2.2. Mecanismul extraciei biopolimerilor

Extracia biopolimerilor se realizeaz datorit interaciunilor de tip van der Waals create ntre molecula proteic i polimerul hidrofil sau ntre gruprile proteinelor, cu solubilizarea acestora ntr-o anumit faz [4]. Un sistem de extracie este proiectat astfel nct proteina dorit s treac n faza superioar (PEG, de ex.), iar materialul care trebuie ndeprtat, inclusiv celulele i resturile celulare, s treac n faza inferioar (sare sau dextran). Puterea de separare a unui sistem este caracterizat de gradul de extracie (Y) i de factorul de separare (F), dependeni de raportul volumelor fazelor (R) i de coeficientul de distribuie (KN). Gradul de extracie n faza superioar este definit prin relaia: nsup 1 = Ysup = (4.8) nsup + ninf Vinf 1 1+ Vsup K N n care n este numrul de moli de protein dorit n volumul fazei superioare (Vsup), respectiv inferioare (Vinf). Factorul de separare este definit ca produs ntre coeficientul de distribuie i raportul volumelor fazelor: V F = K N R = K N sup (4.9) Vinf Valorile Y, KN i R se influeneaz reciproc. De regul, Ysup crete la creterea lui KN la R = ct., sau la creterea lui R la KN = ct. (fig. 4.24). Coeficientul de distribuie KN nu depinde de concentraia proteinei i (ci), atta timp ct concentraia ci este mult mai redus dect concentraia polimerilor i atta timp ct nu are loc formarea unor compleci. Dup Bronstedt, exist o corelaie exponenial ntre KN i aria suprafeei (masa molecular) a proteinei i: Ai ln K N = (4.10) k T 95

Capitolul 4 Separarea prin extracie

Figura 4.24. Interdependena dintre gradul de extracie (Ysup), coeficientul de distribuie (KN) i raportul volumic al fazelor (R) [134]

unde este un factor dependent de potenialul chimic, Ai este suprafaa disponibil de interaciune, k este constanta lui Boltzmann, iar T este temperatura absolut (K). Astfel, celulele i resturile celulare vor prezenta, chiar la valori mici, un coeficient de distribuie tinznd spre zero ntr-o faz i spre infinit n cealalt faz, datorit valorii ridicate a suprafeei disponibile de interaciune; metaboliii prezint valori KN aproximativ unitare, iar proteinele au valori KN cuprinse ntre 0,1 i 10. Pe baza dependenei date de ecuaia (4.10) s-au putut izola antigenii de suprafa ai hepatitei B (avnd mase moleculare de 1.106 2.106 Da) ca vaccin produs din culturi de drojdii recombinante [135]. Principalii factori care influeneaz valoarea constantei de distribuie sunt: componenii care formeaz cele dou faze, respectiv natura, concentraia i masa molecular a polimerilor, tipul i concentraia ionilor din sistem, pH-ul, temperatura, adaosul de ali componeni (ageni haotropici, de ex.), concentraia celulelor i a resturilor celulare [4, 129, 136]. Solubilizarea proteinelor este dictat de hidrofobicitatea polimerilor existeni n soluia apoas. Aceasta crete n ordinea [4]: dextran sulfat < carboxi-metildextran < dextran < hidroxi-propildextran < metilceluloz < alcool polivinilic < polietilenglicol < polipropilenglicol Hidrofobicitatea unui polimer este cu att mai mare cu ct masa sa molecular este mai mare. Datorit acestor lucruri, n sistemul PEG dextran sau PEG sare poate fi crescut concentraia proteinei n faza superioar prin utilizarea unui PEG cu mas molecular medie mic. Concomitent, distribuia masei moleculare a polimerului controleaz hidrofobicitatea relativ a celor dou faze, respectiv gradul de extracie. Datorit migrrii ionilor din fazele apoase se stabilete un, potenial electric de o parte i de alta a interfeei de separare, acesta influennd hotrtor distribuia macromoleculelor cu sarcin electric (proteine, acizi nucleici). O modificare minor a concentraiei sau triei ionice poate conduce la modificri majore ale coeficientului de distribuie, aa cum rezult i din fig. 4.25.
96

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

KN L-2-hidroxiizocaproat dehidrogenaza D-lactat dehidrogenaza - amilaza Log KN impuriti

Concentraie K3PO4 [% masice]

Concentraie NaCl [% masice]

Figura 4.25. Influena compoziiei i a triei ionice a mediului asupra coeficientului de distribuie: a partiia enzimelor n funcie de concentraia fosfatului de potasiu [137]; b partiia -amilazei n funcie de concentraia clorurii de sodiu [136] Concentraia proteinelor nu manifest nici un efect asupra repartiiei acestora ntre cele dou faze doar n domeniul concentraiilor foarte reduse (sub 1 g/L), aceast limit depinznd de tipul proteinei [4]. Valoarea pH-ului controleaz disocierea gruprilor ionizabile ale proteinelor i, implicit distribuia acestora ntre cele dou faze. Odat cu variaia pH-ului se produc modificri n disocierea ionilor polivaleni (PO43+), ceea ce va afecta potenialul electric dintre faze, respectiv distribuia proteinelor. n sistemele PEG sare, de ex., s-au constatat variaii de 2 3 ordine de mrime ale KN pentru intervale nguste de pH (fig. 4.26).

Figura 4.26. Distribuia -amilazei pure n sisteme apoase bifazice PEG 4000 (10% masice) fosfat (11,5% masice) n funcie de pH [136] Afinitatea biospecific dintre moleculele proteice i anumii liganzi (liganzi de afinitate) ataai unuia dintre polimeri poate fi utilizat pentru mbuntirea separrii. Ca liganzi de afinitate se utilizeaz colorani, acizi grai, glutation etc. [91, 136, 138]. Rezultate deosebite au dat i ionii compleci de Cu(II)-iminodiacetat n sisteme PEG 97

Capitolul 4 Separarea prin extracie

dextran sau PEG sare [139, 140]. Pentru extracia unui antibiotic glicopeptidic, vancomicina, a fost utilizat drept ligand de afinitate D-alanil-D-alanina n sisteme PEG 8000 dextran i PEG 8000 K3PO4 [141]. Sensibilitatea coeficienilor de distribuie la variaia temperaturii este redus. Temperatura modific forma diagramelor de echilibru de faze (fig. 4.21). La scderea temperaturii, separarea fazelor decurge la concentraii mai sczute de polimer n sistemele PEG dextran, ceea ce nseamn un consum mai redus de polimeri, i la temperaturi mai ridicate n sistemele PEG sare, ducnd la creterea consumului de polimer. Temperatura modific de asemenea distribuia biomoleculelor (tab. 4.6), o temperatur mai sczut conducnd la o mai bun separare a proteinelor ntre ele. n conformitate cu ecuaia (4.10), scderea temperaturii conduce la creterea coeficientului de distribuie [142]. Scderea temperaturii conduce ns la creterea viscozitii. Utilizarea polimerilor hidrofili mbuntete stabilitatea enzimelor, astfel nct extracia poate avea loc la temperatura camerei cu o pierdere minim a bioactivitii. Rcirea SAB nu este necesar dect n cazul n care sunt implicate proteine foarte fragile [91].
Tabelul 4.6. Coeficientul de distribuie al lizozimei i catalazei n diverse SAB [143]
Temp. [C] 4 25 40 4 25 40 4 25 40 4 25 40 KN lizozim 0,54 0,44 0,85 0,35 0,31 0,53 0,65 0,47 0,98 0,58 0,36 0,72 KN catalaz 0,046 0,063 0,174 0,014 0,016 0,020 0,22 0,21 0,43 0,052 0,042 0,068 Factor de separare 11,7 7,0 4,9 25 19,4 26,5 3,0 2,2 2,3 11,2 8,6 10,6 SAB 12,2 % Dextran 10 8,4 % PEG 4000 10,0 % Dextran 10 5,6 % PEG 20000 11,3 11,5 % Dextran 500 7,9 % PEG 4000 10,3 % Dextran 500 7,65 % PEG 20000

4.2.3.

Proiectarea procesului de extracie n sisteme apoase bifazice

Proiectarea unui proces de extracie n SAB implic mai multe etape, i anume: (i) stabilirea caracteristicilor moleculelor proteice care trebuiesc separate; (ii) selectarea mai multor SAB capabile de a realiza separarea componentului dorit; (iii) alegerea dintre acestea a sistemului de extracie adecvat, n funcie de influena diverilor factori (natura soluiei proteice iniiale, trie ionic, pH, temperatur etc); (iv) stabilirea schemei de flux a procesului de extracie necesare pentru obinerea puritii dorite, n condiiile eliminriicompuilor cu activitate concurent (enzime care pot transforma un substrat ntr-un mod nedorit, de ex.). Un component oarecare i din soluia iniial va trece n faza superioar sau n cea inferioar, dup cum coeficientul de distribuie KN,i este supraunitar sau subunitar (ec. 4.7). Dac KN,i 3, compusul i poate fi extras ntr-o singur treapt. Cnd KN,i este sczut, gradul de extracie n una din faze poate fi mrit utiliznd un volum mai mare din solventul cu afinitate mai mare pentru componentul respectiv:

98

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Yi ,sup =

Vsup Ci ,sup V0 Ci ,0

Vsup Ci ,sup Vsup Ci ,sup + Vinf Ci ,inf

(4.11)

n care, pe lng notaiile anterioare, V0 volumul iniial al fazei care conine componentul i, Ci,0 concentraia componentului i n faza iniial. Analog: V C Vinf Ci ,inf (4.12) Yi ,inf = inf i ,inf = V0 Ci ,0 Vsup Ci ,sup + Vinf Ci ,inf Gradul maxim de recuperare al componentului i n fiecare faz ntr-o unitate teoretic de extracie, rezult din ecuaiile (4.11) i (4.12), mprind att numrtorul ct i numitorul fraciei cu Ci,sup, respectiv cu Ci,inf: Vsup Vinf (Yi ,sup ) max = (Yi ,inf ) max = (4.13) Vinf Vsup K N ,i + Vinf Vsup + K N ,i
Schema general de separare prin extracie cu SAB a unui amestec obinut prin distrugerea celulelor este redat n fig. 4.27.
sare Dextran sau sare Faza superioar: - produs - proteine impurificatoare Faza superioar: - PEG - proteine impurificatoare

PEG

celule distruse

Faza inferioar: - fragmente celulare - proteine - acizi nucleici - polizaharide

Faza inferioar: - produs

Figura 4.27. Schema general a procesului de extracie selectiv a moleculelor proteice din lichidul intracelular

n general, atingerea unor puriti dorite se realizeaz prin 2 4 etape succesive de separare (tab. 4.7). Componenii secundari ai soluiei iniiale (proteine, acizi nucleici, polizaharide) sunt separai prin extracie fie n faza srii (dac sunt hidrofili), fie n faza polimerului (dac sunt hidrofobi). n cazul n care, dup prima etap de extracie, n faza superioar se gsete o cantitate nsemnat de componeni secundari alturi de produsul 99

Capitolul 4 Separarea prin extracie

util, aceast faz se supune unei noi extracii cu o soluie concentrat de sruri. n final, moleculele proteice pot fi recuperate din soluia de sruri prin ultrafiltrare sau diafiltrare [4].
Tabelul 4.7. Izolarea i purificarea enzimelor cu SAB [144, 145]
Enzima Pullulanaz Glucozizomeraz Fumaraz Aspartaz Penicilinacilaz Glucozdehidrogenaz Leucindehidrogenaz Leucindehidrogenaz Formiatdehidrogenaz D-Lactatdehidrogenaz L-Hidroxiizocaproatdehidrogenaz Organismul Klebsiela pneumoniae Streptomyces Brevibacterium ammoniagenes E. coli Bacillus megaterium Bacillus sphaericus Bacillus cereus Candida boidinii Lactobacillus confusus Numr de etape 4 1 2 3 3 3 2 2 4 2 3 Factor de purificare global 6,3 2,5 22 18 12 33 3,1 2,4 3,8 1,9 20 Grad de extracie global [%] 70 86 70 82 75 83 87 89 70 91 66

4.2.4.

Aplicaii ale extraciei n sisteme apoase bifazice

Extracia n SAB are numeroase aplicaii n separarea celulelor, organelor celulare, proteinelor, acizilor nucleici, enzimelor intracelulare etc., att la scar de laborator, dar i la scar pilot sau industrial. O list a biomoleculelor purificate la scar pilot i industrial prin extracie n SAB este redat n tab. 4.7 4.8.
Tablelul 4.8. Biomolecule purificate la scar industrial prin extracie n SAB [138]
Acil-arilamidz Alcooldehidrogenaz -Amilaz Aspartat -decarboxilaz a/b Proteine clorofiliene Cromatofori Formaldehiddehidrogenaz Formiatdehidrogenaz -Galactozidaz Glucoz-6-fosfatdehidrogenaz -Glucozidaz Hexakinaz D-2-Hidroxiizocaproatdehidrogenaz Izoleucil-tRNAsintetaz Izopropanoldehidrogenaz NADkinaz Fosfofructokinaz Fosfolipaz Fosforilaz Hibrid protein stafilococal A -galactozidaz Proteine din zer

Extracia n SAB utilizeaz acelei principii ca i extracia fizic L L clasic. n consecin, se pot utiliza aceleai echipamente pentru amestecarea i separarea fazelor. Diferena rezid n proprietile diferite ale SAB n comparaie cu cele ale sistemelor clasice (faz apoas faz organic) ntlnite n extracia fizic L L, cea mai notabil diferen fiind tensiunea interfacial extraordinar de sczut (tab. 4.9).
Tabelul 4.9. Proprieti fizice ale SAB [134]
Compoziia sistemului 9 % PEG 4000, 2 % dextran T-500 7 % PEG 4000, 1,25 % dextran brut 16 % PEG 4000, 13 % fosfat [kg/m3] 1010 1046 1085 sup [mPa.s] 3,0 2,7 12 inf [mPa.s] 94 2000 2,1 disp [mPa.s] 3,4 4,0 [mN/m] 1,25 Ref. bibl. [146] [146] [147]

100

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

n aplicaiile la scar mare, cele mai utilizate SAB sunt PEG dextran ap i PEG sare ap, datorit aplicabilitii cvasigenerale, viscozitii i diferenei de densitate acceptabile. n plus sunt netoxice i biodegradabile, fiind certificate de ctre farmacopeele din cele mai multe ri [138]. Un dezavantaj ar fi costul ridicat al dextranului purificat (de ordinul sutelor de dolari pe kg). Reducerea costurilor se poate face prin nlocuire cu dextran brut, dextran brut hidrolizat sau amidon hidroxipropilic [138, 142]. Dextranul brut conduce la o soluie cu viscozitate mai ridicat, n timp ce dextranul hidrolizat reduce viscozitatea soluiei [142].
4.2.5. Procesul tehnologic de extracie n siateme apoase bifazice

n general, pentru purificarea proteinelor intracelulare, dup fazele de dezagregare a celulelor, adugarea componenilor SAB (PEG, dextran, fosfat etc.) i ajustarea pHului, are loc amestecarea suspensiei pentru atingerea echilibrului de faze. Amestecarea se poate realiza fie n vase cu agitare prevzute cu icane, fie n amestectoare statice [148]. Necesarul de energie este sczut datorit tensiunii interfaciale reduse, iar echilibrul este atins foarte rapid, n circa 30 s, dac amestecarea asigur un regim de curgere turbulent [149]. Separarea fazelor se poate face gravitaional sau centrifugal. Se recomand separarea centrifugal n cazul viscozitii ridicate a sistemului, sau n cazul diferenelor mici de densitate dintre faze [134]. Centrifugarea are avantajul suplimentar al unor randamente mai ridicate, tiut fiind faptul c la acceleraii mari antrenarea resturilor celulare este mai sczut.
Recirculare PEG PEG + sare 1 2 2 7 sare 7

suspensie celular 3 4 2 3

1 bioreactor; 2 pompe; 3 moar cu bile; 4 schimbtor de cldur; 5 amestectoare in-line; 6 separatoare centrifugale; 7 rezervoare.

5 faza inferioar 6 5 7

faza superioar

6 7 produs

resturi celulare i proteine

PEG i produse secundare

Figura 4.28. Schema procesului tehnologic de extracie a proteinelor intracelulare n sisteme apoase bifazice [134]

Dup separarea iniial, la faza superioar se adaug o sare, pentru a genera un nou sistem bifazic, n care proteina de interes s se gseasc n faza inferioar (fig. 4.27). Pe lng aceast tehnic, proteina din faza de polimer poate fi separat prin centrifugare, adsorbie, ultrafiltrare sau electroforez [150]. n procesele la scar mare,
101

Capitolul 4 Separarea prin extracie

concentrarea i condiionarea produsului din faza inferioar a sistemului bifazic secundar se realizeaz prin ultrafiltrare sau diafiltrare, faza superioar fiind recirculat [134, 151]. De asemenea, n anumite condiii, din faza inferioar a sistemului bifazic secundar, proteina poate fi recuperat prin cromatografie de interaciune hidrofob [129]. Un proces tehnologic tipic de extracie a unei proteine n SAB este redat n fig. 4.28. Extracia n SAB se realizeaz de obicei n arje, ns poate fi mai economic realizarea ei n flux continuu. n general exist trei posibiliti de prelucrare n regim continuu (fig. 4.29): extracia n echicurent, extracia n contracurent i extracia n curent ncruciat, fiecare dintre ele prezentnd avantaje i dezavantaje (tab. 4.10). Pentru capaciti mari de producie, extracia n contracurent ofer un randament mai ridicat, la un consum minim de chimicale [148].
Tabelul 4.10. Avantaje i dezavantaje ale modurilor de contactare n extracia continu n SAB [129]
Contactare Echicurent Curent ncruciat Contracurent Potrivit pentru KN sczut KN ridicat KN sczut Consumuri ca la curent ncruciat ca la echicurent cele mai sczute Randament mediu cel mai sczut cel mai ridicat Factor de purificare mediu cel mai ridicat cel mai sczut

(F) alimentare; (S) solvent; (E) extract; (R) rafinat.

Figura 4.29. Modaliti de contactare a fazelor n extracia n SAB: a echicurent; b curent ncruciat; c contracurent.

Pentru o purificare avansat a biomoleculelor extrase este necesar realizarea extraciei n mai multe trepte. Nu toate echipamentele de extracie L L sunt potrivite extraciei cu SAB, mai ales atunci cnd proprietile celor dou faze sunt prea asemntoare, ori cnd tensiunea interfacial este prea redus. Pentru extracia n trepte cu SAB au fost testate baterii de amestectoare decantoare, coloane Khni [152], extractoare centrifugale Podbielniak [153], coloane cu pulverizare [154, 155], coloane cu talere sit [156], coloane cu umplutur [157], toate putnd fi exploatate cu succes cu luarea unor msuri de precauie mpotriva nnecrii. Rezultate bune s-au obinut i cu extractorul Graesser n separarea -lactalbuminei din zer cu SAB PEG sare [158]. Acest extractor, format dintr-un rotor orizontal prevzut cu cupe (de unde i denumirea de contactor n ploaie cu glei1) care se rotete lent n interiorul unui tambur
1

Raining bucket contactor denumirea alternativ n limba englez a extractorului Graesser

102

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

alimentat pe la extremiti cu fazele supuse extraciei (fig. 4.30). Este singurul extractor care disperseaz att faza uoar n faza grea, ct i faza grea n faza uoar [86, 87]. Pentru prevenirea nnecrii s-a redus viteza de rotaie de la 20 rot/min la 2 5 rot/min i s-a inversat sensul de rotaie al rotorului cu cupe, reducndu-se astfel i intensitatea amestecrii [159].

a b Figura 4.30. Extractor Graesser (actualmente RTL SA Londra) [160] a seciune transversal; b vedere interioar.
sensul normal de rotaie; sensul de rotaie la extracia n SAB.

4.2.6.

Recuperarea chimicalelor i reducerea costurilor

Pentru a reduce costurile ridicate cu reactivii i cu depozitarea deeurilor se recomand reciclarea sau recircularea materialelor auxiliare. Recuperarea polimerilor dup extracia biomoleculelor este o etap important att la scar de laborator, ct i n instalaia industrial. Posibilitatea de a recupera i recircula uor polimerii utilizai ar face mult mai atractiv extracia cu SAB n instalaii de mare capacitate [161]. n literatur sunt menionate cateva modaliti de recuperare a polimerilor i srurilor utilizate n extracia cu SAB. Astfel, din fluxurile lipsite de faz solid fosfatul poate fi recuperat prin cristalizare la 6 C [134]. Pentru recircularea PEG s-a propus extracia lui cu cloroform [161], dar mult mai viabil s-a dovedit ns reextracia salin a proteinelor din faza bogat n PEG (fig. 4.28), cu formarea astfel a unei soluii reciclabile de PEG liber de protein [134, 162]. Tot pentru separarea PEG de enzimele extrase se propun ultrafiltrarea, dializa, sau reinerea enzimei pe un adsorbant adecvat [163]. A fost demonstrat posibilitatea recirculrii detergenilor [164] prin extracie cu alcooli alifatici inferiori (fig. 4.31), precum i posibilitatea recuperrii srurilor [165] prin exploatarea lacunelor de miscibilitate n sistemele ternare ap sare alcooli alifatici inferiori (fig. 4.32). n acest din urm caz, amestecul de alcool (etanol) i faz bogat n sare este trimis ntr-un evaporator unde este concentrat n vederea ndeprtrii i reciclrii etanolului. Soluia de sare este concentrat, la nevoie, ntr-un al doilea evaporator, de unde este apoi recirculat n procesul de extracie a proteinelor. Majoritatea apei evaporate poate fi de asemenea reciclat [166]. Mai recent s-a demonstrat formarea SAB n condiii normale (25 C i presiune atmosferic) ntre PEG 2000, respectiv PEG 4000 i carbamatul de amoniu. Carbamatul fiind volatil, poate fi recuperat din sistemul de extracie i recirculat sub form de amoniac i dioxid de carbon [167]. 103

Capitolul 4 Separarea prin extracie n principiu, chimicalele auxiliare (PEG, sruri, detergeni etc.) introduse n procesul de extracie cu SAB pot fi recuperate i recirculate n proporie de peste 90%, conducnd la un proces cu costuri rezonabile i acceptabil din punct de vedere al problemelor de mediu.

Solubilizare Lichid de fermentaie Recirculare detergeni

Omogenizat de celule

PEG

sare

Extracia proteinelor Faza de coacervat Extracie cu 2-metil-1-propanol Faza apoas de la extracia secundar Cromatografie de schimb anionic

Recirculare sare

Extracia primar
Faza inf. bogat n sare: resturi celulare, proteine, acizi nucleici Faza sup. bogat n PEG: produs

sare

Recirculare sare

Extracia secundar
Faza inf. bogat n sare: produs Faza sup. bogat n PEG

Purificare 160 x Randament total 80 % Puritate analitic

Ultrafiltrare
Soluie de sare Concentrat: produs

Figura 4.31. Schema de flux a extraciei colesteroloxidazei utiliznd SAB bazate pe detergeni [164] 4.2.7.

Figura 4.32. Schema de flux a extraciei cu SABPEG sare, cu recircularea extractanilor [165]

Transpunerea la scar a extraciei n sisteme apoase bifazice

Unul dintre avantajele exctraciei n SAB l reprezint uurina transpunerii la scar a procesului, prin simpla cretere proporional a cantitii ingredientelor utilizate [144, 145, 168]. Echipamentele industriale de separare centrifugal existente pe pia pot fi selecionate utiliznd conceptul (vezi subcap. 2.4.1). Numai n perioada 1982 1995 au fost transpuse la scar industrial 27 de procese, marea majoritate utiliznd sisteme PEG sare, pentru separarea i purificarea enzimelor, antigenului hepatitei B, interferonului, lactalbuminelor, lactoglobulinelor, hemoglobinei, precum i a altor proteine terapeutic active [129]. Scara de operare a acestor procese variaz de la 24 kg celule prelucrate / arj pn la 50 m3 material celular prelucrat / arj [169]. Exist instalaii cu capaciti de 500 kg drojdii / 24 h n care procesul de extracie a enzimelor este asistat de calculator [170], procesul putnd fi realizat n arje sau continuu, prin extracie n contracurent [171]. n fig. 4.33 sunt prezentate rezultatele obinute n transpunerea la scar a separrii i purificrii formiatdehidrogenazei obinute din Candida boidinii n SAB PEG K3PO4. Transpunerea la scar la un factor de aproape 4.104 a patru etape diferite de separare nu a influenat semnificativ gradul de separare realizat [144]. 104

Recirculare PEG

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Alte cheltuieli, 2.9 Materia prima, 35.5

Aparatura de control, 33.9

Grad de separare [%]

Utilitati, 0.4 Forta de munca, 13.3 Materiale auxiliare, 14

Ape reziduale, 4.8 Ultrafiltrare, 9.8 Extractie 2, 6.6 Fermentare, 40.1

Factor de transpunere la scar

Scara de 10 cm3 [%] Scara industrial [%]
Extractie 1, 21.5 Dezagregare , 17.2

Figura 4.33. Transpunerea la scar a diferitelor etape de izolare i purificare a formiatdehidrogenazei din Candida boidinii [144] 4.2.8.

Figura 4.34. Structura costurilor de fabricaie a fumarazei din Brevibacterium ammoniagenes [172]

Aspecte economice ale extraciei n sisteme apoase bifazice

Costurile recuperrii i concentrrii biomoleculelor prin extracie n SAB depind n mod hotrtor de sistemul utilizat, de scara de operare, dar i de ali factori. La separarea i purificarea fumarazei obinute din Brevibacterium ammoniagenes printr-un proces discontinuu n arje a 100 kg, gradul global de extracie utiliznd SAB PEG K3PO4 n dou trepte a fost de 70% [172]. Structura costurilor este redat n fig. 4.34. Calculul costurilor a fost efectuat pe baza relaiei: 1,13CM + 2,6C L + 1,13C E + 0,13C I (4.14) CT = Y n care CT sunt costurile totale, CM costurile cu materialele, CL costurile cu fora de munc, CE costurile energetice, CI costurile de investiii, Y gradul de extracie. Separarea i purificarea fumarazei obinute din Saccharomyces cerevisiae a fost de asemenea analizat din punct de vedere al costurilor, comparndu-se extracia discontinu cu extracia continu n curent ncruciat, cu i fr reciclarea chimicalelor [148]. Datele obinute sunt redate n tab. 4.11. Estimarea costurilor s-a fcut cu relaia: CT = 1,13CM + 2,6C L + 1,13CU + 1,6C I (4.15)

n care CT sunt costurile totale, CM costurile cu materialele, CL costurile cu fora de munc, CU costurile cu utilitile, CI costurile de investiii. Se poate constata o important reducere a costurilor cu materialele: 24% n procesul continuu i 43% n procesul discontinuu. Reducerile totale ale costurilor sunt
105

Capitolul 4 Separarea prin extracie

ns mai modeste (14% n procesul continuu i 5% n cel discontinuu) datorit ponderii mari a costurilor cu fora de munc.
Tabelul 4.11. Evaluarea costurilor n producia fumarazei din S. cerevisiae [148]
Costuri1

Fr recirculare Cu recirculare Modificare2 [%] Disc. Cont. Disc. Cont. Disc. Cont. Cu materiale 2,483 2,48 1,41 1,89 -43 -24 Cu fora de munc 1,34 1,00 1,66 0,91 24 -8 Cu investiiile 0,14 0,18 0,14 0,23 0 28 Cu utilitile 0,015 0,018 0,016 0,02 8 19 Costuri totale 6,5 5,69 6,19 4,88 -5 -14 1 Valori preluate din [162] 2 Valori exprimate n % de modificare comparnd procesul discontinuu (Disc.) respectiv continuu (Cont.) n variantele cu i fr recuperarea i recircularea chimicalelor 3 Valori relative, bazate pe ec. (4.15). Concentraia biomasei n procesul discontinuu a fost de 25% v/v, iar n procesul continuu de 20% v/v.

Extracia n SAB este o tehnic cu consumuri energetice sczute, i investiii minime, necesitnd ns cheltuieli mari cu fora de munc i cu materialele. Costurile materialelor pot fi reduse semnificativ printr-o alegere corespunztoare a rapoartelor volumice ale fazelor, prin introducerea de noi SAB i n special prin perfecionarea proceselor de recuperare recirculare [166]. Durata procesului poate fi sensibil redus prin utilizarea separrii centrifugale; aceasta nu numai c duce la obinerea unor randamente superioare, ci i la obinerea unor produse calitativ superioare, datorit absenei unei degradri proteolitice semnificative [173, 174]. Aspectele economice ale extraciei n SAB folosind liganzi de afinitate au fost de asemenea analizate, constatndu-se puternica dependen a costurilor totale ale extraciei de costul iniial i reciclabilitatea liganzilor de afinitate utilizai [175, 176]. Pentru o evaluare economic corect, este important de tiut c extracia n SAB este o tehnologie integrativ, permind ndeprtarea solidelor i creterea activitii specifice a produselor ntr-o singur etap. n plus, produsul poate fi separat de acizii nucleici cu mas molecular mic i poate fi concentrat, mbuntindu-se astfel performana urmtoarelor etape de separare. Pentru exemplificare, n fig. 4.35 este redat schema de principiu a obinerii -amilazei din Bacillus sp. prin tehnologia convenional i prin extracia n SAB. Extracia n SAB s-a realizat la scar mare (capacitate de 50 m3). Fa de procesul convenional, procesul utiliznd extracia n SAB necesit mai puine etape, randamentul global fiind de 80% la extracia ntr-o singur treapt i de 95% la extracia n dou trepte, fa de numai 70% prin procedeul convenional. Costurile se reduc cu 35% la extracia ntr-o singur treapt i cu 50% la extracia n dou trepte [169]. Dei nou i relativ puin utilizat n practica industrial, extracia n SAB este o tehnic important pentru izolarea i separarea moleculelor proteice. Numrul mare de cercetri n domeniu (mii de articole publicate), numrul crescut de aplicaii brevetate i implementate la nivel pilot i industrial, corelate cu creterea mrimii produciei de proteine terapeutice vor face din aceast tehnic o alternativ atractiv n biotehnologiile industriale, mai ales dac se rezolv tehnico-economic problema recuperrii i recirculrii eficiente a chimicalelor de proces.
106

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Fermentaie Condiionare lichid de fermentaie

Fermentaie Condiionare lichid de fermentaie Centrifugare

Biomas Biomas Filtrare / centrifugare Concentrare Precipitare Recuperare precipitat Filtrat Filtrat Solubilizare enzim Filtrare Material Material insolubil insolubil Decolorare Finisare Formularizare Decolorare Finisare Formularizare Ap Ap Sare Sare Biomas Biomas Propilenglicol Propilenglicol

Figura 4.35. Obinerea -amilazei din Bacillus sp.: a procedeul convenional; b - procedeul prin extracie n SAB [169] 4.3. EXTRACIA CU MICELE INVERSE Dac extracia clasic L L realizeaz distribuia biomoleculelor ntre o faz apoas i o faz organic distinct, iar extracia n sisteme apoase bifazice realizeaz distribuia biomoleculelor ntre dou faze apoase distincte, extracia cu micele inverse implic trecerea biomoleculelor din faza apoas iniial ntr-o faz organic distinct prin intermediul unei microemulsii de tip ap-n-ulei (A/U). Aceast microemulsie este format din aa-numitele micele inverse: asociaii sferice de molecule de compui tensioactivi (surfactani) care ncorporeaz un mediu apos i care se gsesc dispersate ntr-un solvent nepolar. Utilizarea sistemelor micelare inverse este relativ recent, primele studii sistematice asupra acestor sisteme fiind efectuate la sfritul anilor 1980 [177 - 182]. 4.3.1. Formarea i proprietile micelelor inverse

Surfactanii sunt molecule constituite dintr-un cap polar hidrofil (atras de ap) i o coad hidrofob o caten hidrocarbonat (atras de ulei) fig. 4.36. Adugarea n 107

Capitolul 4 Separarea prin extracie ap a unui astfel de surfactant foreaz lanurile hidrocarbonate hidrofobe s se asocieze astfel nct s minimizeze contactul cu moleculele de ap. Asocierea moleculelor de surfactant conduce la formarea unor agregate de diverse forme (fig. 4.37) [183]. Forma surfactantului joac un rol important n formarea agregatelor. Dac apa solubilizeaz n mod egal att captul polar ct i catena hidrocarbonat, agregatele nu se mai formeaz.
catene hidrocarbonate (hidrofobe)

capt polar (hidrofil)

Figura 4.36. Reprezentarea schematic a unui surfactant: a cu o singur caten hidrofob; b cu dou catene hidrofobe. Dac molecula de surfactant are un capt polar voluminos i o caten hidrofob redus, de form conic (fig. 4.37 a), moleculele tind s se asocieze ntr-un agregat sferic, cu catenele formnd un miez interior, nconjurat de o suprafa exterioar alctuit din capetele polare. O astfel de asociaie este o micel normal (fig. 4.37 b). La concentraii reduse de surfactant micela normal este sferic, cu un diametru dictat de lungimea catenei hidrocarbonate i de mrimea captului polar. Sistemul este dinamic, n sensul c moleculele implicate n formarea micelelor prsesc agregatul, fiind nlocuite de altele care se mic liber n volumul fazei apoase. n cteva microsecunde nlocuirea tuturor moleculelor de surfactant dintr-o micel este complet, iar forma sferic amicelei normale se pstreaz ntotdeauna. Dac molecula de surfactant are un capt polar mic i o caten hidrocarbonat voluminoas, ramificat (semnnd cu un dop de ampanie fig. 4.37 c), moleculele se asociaz ntr-un agregat sferic n care miezul este format din capetele polare i suprafaa extern din catenele hidrofobe, agregat numit micel invers (fig. 4.37 d) [181] sau microemulsie de tip A/U. Spre deosebire de micelele normale, mrimea micelelor inverse crete liniar cu cantitatea de ap adugat n sistem [178]. n sistemele care conin cantiti mari att de ulei ct i de ap, forma i dimensiunile agregatelor se modific, cu formarea de canale cilindrice interconectate, coninnd faza apoas n interior (fig. 4.37 e). n aceste sisteme, spaiul este divizat n dou volume distince de ap i ulei, separate de stratul de surfactant care formeaz o suprafa continu n form de ea. Structura devine astfel dublu-continu (bicontinu) att n ap ct i n ulei. La adugare de ap, moleculele de surfactant se reorganizeaz sub forma unui film plan sau lamelar (fig. 4.37 f), sistemul devenind opalescent i birefringent. Recent s-a demonstrat c se poate forma o emulsie stabil i din supra-agregate n sisteme coninnd doi surfactani funcionalizai, capabili s formeze legturi puternice ntre ei [184]. Surfactanii se organizeaz ntr-o faz de form lamelar care nu mai este plan ci spaial, de forma unei cepe (fig. 4.37 g), form numit i sferulit. Formarea tuturor acestor structuri este explicat prin factorii geometrici specifici moleculelor de surfactant [183, 185], fiind valabil doar pentru soluii diluate. La creterea concentraiei de surfactant structurile se modific i se complic [186]. 108

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Ap

Figura 4.37. Forme de agregate rezultate prin organizarea moleculelor de surfactant n soluiile coloidale: a surfactant de form conic; b micel normal; c surfactant de form dop de ampanie; d micel invers cu coninut variabil de ap; e cilindri interconectai; f faz lamelar plan; g faz lamelar spaial (sferulit sau ceap) [186] Surfactanii se clasific de regul n funcie de sarcina captului hidrofil existent dup disocierea n ap. n acest sens exist surfactani neionici i surfactani ionici, care la rndul lor pot fi anionici, cationici, sau amfiionici. Cei mai importani surfactani utilizai n extracia cu micele inverse sunt prezentai n tab. 4.12. De menionat c aceti compui trebuie s fie compatibili cu sistemele biochimice n care acioneaz. Sunt cunoscui numeroi surfactani care formeaz micele inverse n medii nepolare, cei mai muli dintre ei necesitnd ns i prezena unui co-surfactant. Unul dintre puinii surfactani care poate forma micele inverse fr co-surfactant este bis(2etilhexil) sulfosuccinatul de sodiu, cunoscut mai mult sub denumirea de AOT [177]. Surfactantul amfiionic 1,2-dioctanoic-sn-glicero-3-fosfocholin formeaz micele inverse doar n prezena alcoolilor alifatici drept co-surfactani [187].

109

Capitolul 4 Separarea prin extracie Tabelul 4.12. Surfactani frecvent utilizai n extracia cu micele inverse
Tip anionic Denumire dodecilsulfat de sodiu bis(2-etilhexil) sulfosuccinat de sodiu Denumire comercial SDS Formul chimic

anionic

AOT

anionic

acid cholic sare de sodiu

anionic

acid deoxicholic sare de sodiu

anionic

N-lauril sarcosin sare de sodiu

110

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

bromur de cetiltrimetilamoniu

cationic

CTAB

cationic

clorur de trioctilmetilamoniu

TOMAC

amfiionic

1,2dioctanoicsn-glicero-3fosfocholin

neionic

monooleat de sorbitan

Span 80

neionic

oleil poli(10) oxietilen eter monooleat de poli(20) oxietilen sorbitan

Brij 96

neionic

neionic

Triton X 100

neionic

laurildimetilaminooxid

Interaciunea dintre micelele inverse i ap prezint o importan deosebit. Datorit miezului polar ele pot ngloba apa, dizolvnd-o n solvenii organici nepolari. Raportul molar ap surfactant (w0) influeneaz puternic proprietile micelelor inverse. Apa din interiorul micelei inverse este parial legat de capetele hidrofile ale surfactantului; numai peste anumite valori w0 aceasta se comport ca i apa liber (fig. 4.38). De exemplu, n micelele inverse formate de AOT, pn la w0 = 6 8 apa este legat de capetele hidrofile ale surfactantului; de abia la valori w0 > 6 8 apa se comport ca i apa liber [177, 180]. 111

Capitolul 4 Separarea prin extracie

centrul micelar proprietile apei libere proprietile fizice ale apei micelare

molecule de surfactant

w0 = [H2O] / [surfactant]

periferia micelar

Figura 4.38. Proprietile apei nglobate n micele inverse: a schema unei micele inverse de AOT [189]; b variaia proprietilor fizice ale apei n micele inverse [190] Micelele inverse au, de regul, diametrul ntre 2 i 20 nm [188]. Dimensiunile micelelor inverse formate de AOT depind de temperatur i de coninutul de ap nglobat, respectiv de raportul molar ap surfactant [177]. Ele variaz, la temperatura camerei, ntre 2 nm (w0 = 0) i 15 nm (w0 = 60). Micelele inverse de AOT i mresc diametrul la creterea concentraiei de ap, dac concentraia AOT rmne constant. La coninut de ap constant, creterea concentraiei de AOT conduce la micorarea diametrului micelelor inverse. Dac att concentraia apei, ct i concentraia AOT cresc n acelai raport, mrimea micelelor rmne aproximativ constant, mrindu-se doar numrul acestora (fig. 4.39).

Concentraia AOT

Concentraia apei

Figura 4.39. Efectul coninutului de ap i al concentraiei surfactantului asupra micelelor inverse de AOT: A crete concentraia AOT; B crete concentraia apei i concentraia AOT n acelai raport; C crete concentraia apei [177] Micelele inverse sunt dispersate uniform n solvenii organici nepolari, formnd sisteme omogene, stabile termodinamic. Practic apa este dizolvat sub form de micropicturi, stabilizate interfacial de surfactant, n mediul organic nepolar [191]. Aceste sisteme sunt foarte dinamice: amestecnd o soluie de micele inverse de diametru mare cu o soluie de micele inverse de diametru mic, n cteva secunde se obine o soluie coninnd micele inverse avnd un diametru intermediar [192]. 112

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII n fig. 4.40 este redat diagrama de echilibru a unui sistem ternar ap AOT izooctan la temperatura de 15 C. Se pot remarca pe diagram: domeniul emulsiilor U/A, domeniul cristalelor lichide, domeniul emulsiilor A/U.A, precum i domeniul microemulsiilor A/U.
IZOOCTAN

U/A ulei n ap A/U ap n ulei

A/U U/A A/U A

T = 288 K

Cristale lichide AP AOT

Figura 4.40. Diagrama sistemului ternar ap AOT izooctan la 15 C Datorit polaritii mediului lichid din interiorul micelei inverse, aici se pot solubiliza compui polari ca aminoacizi, enzime, proteine, compui care sunt insolubili sau instabili n solveni organici obinuii [193]. Este interesant de notat c dimensiunile micelelor inverse pot depinde de natura compusului dizovat n faza apoas intern. Astfel, micelele inverse de AOT n hexan (w0 = 6) care conin ADN au un diametru de 100 150 nm, n timp ce aceleai micele, dar fr ADN ncorporat, au doar 10 nm n diametru [194]. 4.3.2. Mecanismul extraciei n micele inverse

Micelele inverse au capacitatea de a extrage biomoleculele n apa din faza intern dispersat ntr-un solvent organic (hexan, izooctan etc.). Capacitatea de extracie depinde de punctul izoelectric (pI) al proteinelor, respectiv de pH-ul i tria ionic a soluiei din care se realizeaz extracia. Principiul procesului de extracie este redat n fig. 4.41. Solventul organic permite organizarea micelelor inverse i separarea apei din faza intern de volumul de ap din faz din care se extrag componenii dorii. Electroliii i proteinele solubilizate n faza apoas intern pot fi schimbate ntre micelele inverse, pentru acest tip de transfer fiind propuse trei mecanisme posibile [180, 192, 195]. Un prim mecanism implic fuziunea tranzitorie a dou micele inverse ntr-o pictur dimer cu via foarte scurt. n timpul existenei picturii dimere, are loc redistribuia solutului prin difuzie, dup care pictura dimer se desparte formnd dou 113

Capitolul 4 Separarea prin extracie micele inverse (fig. 4.42 a). Al doilea mecanism implic difuziunea mleculelor solutului prin stratul dublu de surfactant format la punctul de contact dintre dou micele inverse care nu fuzioneaz (fig. 4.42 b), n timp ce al treilea mecanism implic migrarea solutului prin faza organic dintre dou micele inverse (fig. 4.42 c).
+
Faza organic

Protein Micele inverse Faza organic

a +
Faza apoas

b +
Surfactant Micel invers incluznd proteina Protein Substan nedorit

Figura 4.41. Schema de principiu a extraciei n micele inverse [129]

Figura 4.42. Mecanisme posibile de transfer a solutului ntre micelele inverse [196]

Procesul global de transfer de mas interfazic prin care solutul trece din faza apoas n faza de micel invers este rezultatul a trei procese elementare, fiecare dintre ele putnd fi determinant de vitez: (i) difuzia solutului (proteinei) din faza apoas ctre interfaa dintre faza apoas i faza organic, respectiv difuzia micelei inverse din faza organic ctre interfa; (ii) includerea solutului n micela invers la interfa; (iii) difuzia micelelor inverse n volumul fazei organice (fig. 4.43).
FAZA ORGANICA micela inversa

(i)

(iii)

(ii) (i)

PROTEINA FAZA APOASA

Figura 4.43. Mecanismul transferului interfazic al proteinelor din faza apoas n faza organic prin intermediul micelelor inverse [136] 114

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 4.3.3. Factorii care influeneaz transferul biomoleculelor n micelele inverse

Principalii factori care influeneaz repartiia biomoleculelor ntre faza apoas extern i faza apoas intern din micelele inverse sunt pH-ul, tria ionic, tipul electrolitului din faza apoas, tipul i natura surfactantului, tipul solventului organic. Repartiia proteinelor i aminoacizilor n micelele inverse este controlat de interaciunile electrostatice dintre moleculele ncrcate electric i prile hidrofile ale surfactanilor, dar i de unele fenomene de respingere n funcie de mrime, care depind de dimensiunile relative ale micelelor inverse ca molecule gazd (host) i de dimensiunile biomoleculelor, ca molecule oaspete (guest) [89]. Valoarea pH-ului determin sarcina net a proteinelor, aceasta trebuind s confere proteinei o sarcin net de semn opus sarcinii captului polar al surfactantului, astfel nct s apar o atracie electrostatic ntre suprafaa proteinei i captul polar hidrofil de la suprafaa intern a micelelor inverse. Fora motoare a procesului de transfer a proteinelor este diferena de potenial. Experimental s-a constatat c diferena dintre pH-ul mediului i pI-ul proteinei trebuie s fie cuprins ntre 1 i 2 pentru ca eficiena extraciei s fie ridicat, iar denaturarea s fie minim [193, 197-199]. n cazul utilizrii surfactanilor anionici, pH-ul trebuie s fie mai mic dect pI-ul, iar n cazul surfactanilor cationici, pH-ul trebuie s fie mai mare dect pI-ul [200, 201]. Tria ionic joac un rol important n procesele de solibilizare. Concentraii mari de sruri n faza apoas extern ecraneaz interaciunile electrostatice ntre proteine i captul polar al surfactantului, reducnd fora motoare disponibil pentru solubilizarea proteinelor. Creterea triei ionice face ca interaciunile repulsive dintre capetele polare ncrcate electric ale surfactanilor s se micoreze, micorndu-se astfel raza micelei inverse. Dac raza micelei inverse devine mai mic dect raza agregatului proteic extracia nu mai poate avea loc. Studii efectuate cu diverse sruri (NaCl, NaSCN, Na2CO3, KCl, CsCl, BaCl2) indic o puternic reducere a cantitii de ap nglobate n micela invers; la o cretere a concentraiei de NaCl de 0,6 M, de ex., raportul molar w0 scade de la 50 la 15 [191, 198]. Un alt efect al creterii triei ionice este acela de a determina ionii s migreze nspre microfaza apoas din interiorul micelei inverse, oblignd astfel proteinele s migreze din aceast zon. Prin modificarea controlat a pH-ului i a triei ionice se poate realiza separarea unor proteine n funcie de mrimea acestora [193, 202, 203]. Efectul pH-ului i al triei ionice a soluiei asupra gradului de solubilizare al unor molecule n micele inverse este ilustrat n fig. 4.44. Efectul de ecranare a interaciunilor electrostatice protein surfactant este influenat i de mrimea ionilor din sistem [199, 204, 205]. Ionii K+, mai voluminoi dect ionii Na+, ecraneaza mai puternic, reducnd solubilizarea ribonucleazei A i a taumatinului n micelele inverse [191]. Cantitatea de ap nglobat n micelele inverse nu este influenat de anionul srii, dar depinde puternic de cationul acesteia. Cationii din faza apoas sunt interschimbabili cu contraionii surfactantului, fapt care duce la modificarea dramatic a coninutului de ap din microfaza apoas intern [191].

115

Capitolul 4 Separarea prin extracie

Figura 4.44. Efectul pH-ului i al triei ionice a soluiei asupra solubilizrii unor biomolecule: ( ) citocrom C; ( ) lizozima; () ribonucleaza A; a sistem AOT izooctan cu 0,1 M KCl; b sistem AOT izooctan fr control de pH [203] Concentraia surfactantului afecteaz att transferul proteinei n faza de micele inverse, ct i reextracia acesteia. O concentraie ridicat de surfactant poate ntrzia procesul de reextracie. Proteinele cu mas molecular mic pot fi extrase mai uor dect cele voluminoase, utiliznd concentraii reduse de surfactant [206]. Co-surfactanii sunt substane care favorizeaz dizolvarea surfactantului n faza organic i stabilizeaz micelele inverse formate [198], dar mecanismul aciunii acestora nu este nc pe deplin elucidat [207]. Deoarece surfactanii cationici formeaz micele inverse foarte mici (w0 < 3), prezena co-surfactanilor este imperios necesar [193]. Surfactanii anionici formeaz micele inverse mari (w0 = 20 115), astfel nct adugarea de co-surfactani nu este obligatorie [208, 209]. Co-surfactanii uzuali sunt alcoolii alifatici cu caten liniar C4 C10 i alcoolul benzilic [180, 197, 206, 210, 211]. Cu ct raportul volumic dintre faza apoas (Vaq) i faza organic (Vorg) este mai redus, cu att procesul devine mai economic, iar bioprodusul este obinut ntr-o form mai concentrat. Creterea raportului volumic conduce la scderea gradului de extracie. O cretere a raportului fazic de la 1 la 5 duce la o scdere de numai 5% a gradului de extracie pentru peroxidaz [212], n timp ce creterea raportului fazic de la 1 la 4 duce la scderea gradului de extracie de la 87% la 63% n cazul inulinazei [193]. Natura i tipul solventului pot influena transferul biomoleculelor din faza apoas n faza organic. Solvenii utilizai nu trebuie s fie miscibili cu apa. Solvenii uzuali utilizai n extracia cu micele inverse sunt hidrocarburi alifatice (n-octan, i-octan, heptan, ciclohexan) sau aromatice (benzen), amestecuri de hidrocarburi (kerosen), cloroform [180, 213]. ntr-un studiu referitor la extracia tripsinei s-a constatat c gradul de extracie este ridicat (circa 70%) n cazul utilizrii kerosenului drept solvent, dar scade la jumtate (circa 35%) cnd se utilizeaz ca solvent ciclohexanul [213]. Unii autori [209] explic acest lucru prin aceea c solventul este capabil de a denatura forma i structura micelelor inverse. Caracterul hidrofob sau hidrofil al biomoleculelor extrase influeneaz, de asemenea, procesul. De exemplu, aminoacizii cu structur hidrofil sunt ncorporai n interiorul micelelor inverse, pe cnd cei hidrofobi la interfaa acestora [4]. Temperatura, care influeneaz proprietile fizico-chimice ale micelelor inverse, are un rol important n special n procesele de reextracie a biomoleculelor. 116

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 4.3.4. Reextracia din micele inverse

Reextracia sau extracia invers este operaia prin care biomoleculele nglobate n microfaza apoas intern din micelele inverse sunt trecute din nou n volumul unei faze apoase. Procesul de reextracie este lent i dificil de realizat fr pierderea semnificativ a activitii bioprodusului separat, fiind unul dintre principalele impedimente care nu au permis deocamdat implementarea extraciei cu micele inverse la nivel industrial. Pentru reextracia proteinelor din faza de micel invers au fost studiate i propuse mai multe procedee, printre care se numr modificarea pH-ului [136, 214], a temperaturii [193, 204, 215 - 217], utilizarea unor particule adsorbante de silice care rein proteinele, apa i compuii tensioactivi din faza micelelor inverse [218], utilizarea zeoliilor pentru deshidratarea fazei de micele inverse [4], distrugerea fazei de micele inverse i eliberarea proteinelor prin adugarea unor cantiti ridicate de solvent organic (acetat de etil) [219, 220], adugarea unor soluii care conin ioni de Ca2+ (CaCl2) sau K+ (KCl), care nlocuiesc ionii Na+ din structura surfactantului i formeaz un complex hidrofob cu acesta [136, 221]. Reextracia proteinelor este afectat de valoarea pH-ului i de concentraia srurilor n soluia de alimentare i n soluia utilizat pentru reextracie [214]. Este de dorit ca tria ionic a soluiei n care se face reextracia s fie ct mai mare, iar pH-ul s fie similar cu valoarea pI a proteinei care trebuie purificat [197]. Sarcina proteinei trebuie s fie aceeai cu cea a captului polar al surfactantului pentru a se permite eliberarea proteinei din micela invers. De ex., pentru reextracia -amilazei dintr-o faz cu micele inverse de AOT n i-octan s-a folosit o soluie apoas coninnd 0,5 M NaCl i soluie tampon acid acetic acetat de sodiu. Separarea fazelor dup reextracie s-a realizat prin centrifugare [222]. Dei modificarea pH-ului este foarte eficient pentru reextracie, aceasta poate cauza i degradarea moleculelor proteice, respectiv pierderea activitii enzimelor extrase. Temperatura are o influen puternic asupra proprietilor micelelor inverse. Eficiena reextraciei poate fi mbuntit prin creterea temperaturii. Creteri importante ale gradului de recuperare al enzimelor cu creterea temperaturii de reextracie au fost observate n cazul -amilazei [215], -chimotripsinei [204], glucoamilazei [217], inulinazei [193] etc. Majoritatea studiilor efectuate arat c mrirea temperaturii duce la creterea raportului w0, n final ajungndu-se la distrugerea micelelor inverse, cu formarea unei faze apoase distincte n care sunt concentrate majoritatea biomoleculelor extrase. Aceast faz este separat apoi prin centrifugare [4]. Deoarece la creterea temperaturii se produce inactivarea termic a enzimelor, temperatura la care se realizeaz procesul de reextracie reprezint un compromis ntre cantitatea de protein recuperat i activitatea sa enzimatic. Pentru majoritatea enzimelor, domeniul optim al temperaturilor de reextracie este cuprins ntre 30 38 C (tab. 4.13), la peste 40 C observndu-se o scdere accentuat a activitii enzimatice. Tabelul 4.13. Temperaturi de reextracie optime pentru pstrarea activitii enzimatice
Enzima Temperatura de reextracie corespunztoare activitii enzimatice maxime [ C] Referina bibliografic -amilaz 32 [216] glucoamilaz 35 [217] inulinaz 37 [193] -chimotripsin 38 [204]

117

Capitolul 4 Separarea prin extracie Comparativ cu celelalte metode, reextracia prin modificarea temperaturii este deocamdat cea mai eficient modalitate de recuperare a biomoleculelor, aa cum reiese i din datele prezentate n tab. 4.14. Tabelul 4.14. Comparaie ntre dou procedee de reextracie a -amilazei [4]
Caracteristicile procesului Activitate iniial [%] Pierderi la extracie [%] Eficien total [%] Factor de concentrare al soluiei finale Reextracie fr creterea temperaturii cu creterea temperaturii 100 100 3 12 30 50 73 10 2000

Cercetri mai recente iau n calcul facilitarea procesului de reextracie prin utilizarea la formarea micelelor inverse a co-surfactanilor, n vederea unui control mai bun al proprietilor i structurii acestora [223 - 226]. Alcoolii avnd proprieti amfifile1 ar putea fi buni ageni de modificare ai micelelor inverse. Un studiu efectuat pentru reextracia albuminei din ser bovin (BSA) i a citocromului c din micele inverse de AOT/i-octan a pus n eviden faptul c prezena unor cantiti mici de alcooli alifatici drept co-surfactani poate accelera procesul de reextracie, existnd o dependen clar ntre viteza de reextracie i lungimea catenei alifatice a alcoolului [227]. La concentraii egale de co-surfactant, efectul accelerator scade n ordinea (fig. 4.45): octanol (octOH) > hexanol (HexOH) > AOT fr co-surfactant > propanol (PrOH)
Grad de reextracie citocrom c [%]

Grad de reextracie BSA [%]

Timp [ore]

Timp [ore]

Figura 4.45. Efectul adaosului de co-surfactant n micelele inverse de AOT/i-octan asupra gradului de reextracie al BSA (a) i citocromului c (b) [227] Mai multe studii cinetice [228 - 231] arat c etapa determinant de vitez a procesului de reextracie este procesul de desolubilizarea a proteinei la interfa, proces descris de ecuaia [227]:
1

Amfifil - att caracter hidrofil datorit gruprii OH, ct i caracter hidrofob datorit catenei alifatice

118

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

(1 + K N ) Caq 1 (4.16) ln 1 0 1+ KN Corg n care: KR constanta de vitez a procesului de reextracie, KN = (C*aq)/(C*org) constanta de distribuie la echilibru, durata procesului, Coorg concentraia iniial a proteinei n faza organic, Caq concentraia actual a proteinei n faza apoas. K R =
4.3.5. Procesul tehnologic de extracie cu micele inverse

Etapele principale ale procesului tehnologic de extracie cu micele inverse sunt extracia propriu-zis (extracia direct) procesul prin care biomoleculele sunt transferate din faza apoas iniial n microfaza apoas din interiorul micelelor inverse, i reextracia (extracia invers) procesul prin care biomoleculele sunt stripate din interiorul micelelor inverse ntr-o nou faz apoas. Pe lng aceste procese principale, n tehnologia extraciei cu micele inverse mai intervin i alte etape, aa cum reiese din schema de flux redat n fig. 4.46.
ap solvent organic surfactant soluie protein brut soluie salin solvent organic recuperat

1 5 3 4 2 6

faz apoas

soluie protein purificat faz apoas + impuriti

amestecare

separare

Figura 4.46. Schema de principiu a procesului tehnologic de extracie cu micele inverse: 1 prepararea microemulsiei; 2 separarea microemulsiei; 3 extracia direct; 4 separarea fazelor; 5 reextracia (striparea biomoleculelor); 6 separarea fazelor i recuperarea solventului

ntr-o prim etap are loc formarea microemulsiei de micele inverse dispersate n solvent organic. n acest sens se prepar un amestec de solvent organic, surfactant i ap, ntr-o proporie care s asigure valoarea concentraiei micelare critice (CMC), respectiv a concentraiei minime de surfactant la care se formeaz micelele inverse. Microemulsia este separat de faza apoas n exces i trecut n procesul de extracie. Extracia se poate realiza principial n dou moduri: (i) prin amestecarea fazei organice care conine micelele inverse cu faza apoas care conine proteina i impuritile hidrosolubile rezultate n urma dezagregrii masei celulare (glucide, lipide, acizi nucleici etc.); (ii) prin suspendarea pulberii de protein brut n microemulsia de micele
119

Capitolul 4 Separarea prin extracie

inverse n solvent organic [136]. Transferul proteinei n faza micelar invers este facilitat printr-o agitare blnd, avnd n vedere tensiunea interfacial foarte mic din sistem: 1 2 mN/m fa de 8 50 mN/m n sistemele clasice de extracie cu solveni organici [232]. Avantajul tensiunii interfaciale mici este timpul de contact redus necesar realizrii transferului proteinei n interiorul micelelor inverse. Dup extracie se realizeaz separarea fazelor prin decantare gravitaional sau prin centrifugare la vitez mic. Faza organic, coninnd proteina ncapsulat n micelele inverse este trimis la reextracie, care se poate realiza prin una din metodele prezentate n paragraful 4.3.4. n urma reextraciei micelele inverse sunt distruse, formndu-se o faz apoas care conine proteina purificat. Acast faz apoas este separat de faza organic pe baza diferenei de densitate, prin decantare gravitaional sau centrifugal. Faza organic este recirculat n etapa de preparare a microemulsiei, iar faza apoas este prelucrat n vederea recuperrii proteinei. Una din problemele ntmpinate o reprezint pierderile de surfactant n faza apoas rezultat la prepararea microemulsiei i n faza apoas n care este reextras proteina [222]. Datorit acestui fapt este necesar utilizarea de surfactant proaspt, fapt care duce la creterea costului separrii. Procesul poate fi realizat n regim discontinuu sau continuu. Pentru extracia discontinu a -amilazei s-au folosit flacoane de 50 mL nchise etan, agitate timp de 2 min la 250 rot/min pentru realizarea extraciei i centrifugate timp de 5 min la 3500 rot/min pentru separarea fazelor [211]. De asemenea, au mai fost utilizate celule cu agitare [228, 233] i celule rotative de difuzie [234].
60 mm Faza micelar invers 2 Faza micelar invers 1 25 mm
60 mm

EXTRACIE
Soluie apoas iniial

REEXTRACIE
Soluie de stripare 65 mm

300 mm

Probe faz dispers

Soluie apoas epuizat

Soluie protein purificat Faza apoas continu

Faza dispers cu micele inverse

Figura 4.47. Instalaie de extracie continu cu dou uniti agitator/decantor [222]

Figura 4.48. Coloan cu pulverizare [232]

Cu toate c extracia continu este un proces eficient i cu un numr redus de etape de purificare a biomoleculelor, datele din literatur asupra acestui subiect sunt relativ srace. Este relatat utilizarea a dou uniti de extracie agitator/decantor pentru separarea -amilazei din soluii apoase cu micele inverse de TOMAC (fig. 4.47) [222], utilizarea unui contactor cu discuri rotative perforate pentru separarea cutinazei pure recombinate cu micele inverse de AOT [235], a unei coloane cu pulverizare pentru recuperarea proteinelor intracelulare din Candida utilis [236], a extractorului Graesser
120

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

pentru separarea lizozimei din albuul de ou cu micele inverse AOT n i-octan i AOT/TOMAC/i-octan [237]. O coloan cu pulverizare operat n regim semicontinuu (faza continu stagnant, faza dispers alimentat continuu) cu micele inverse de AOT n i-octan este redat n fig. 4.48 [232]. Comparativ cu alte echipamente, aceste coloane sunt caracterizate prin simplitate constructiv, costuri mici de operare i flexibilitate n exploatare [238]. Procesul de extracie cu micele inverse este eficient i selectiv, posibil de realizat n sistem continuu, cu consumuri reduse de energie, uor de transpus la scar. La transpunerea la scar a procesului de extracie cu micele inverse de BDBAC1 a -amilazei din lichid de fermentaie filtrat, de la 10 mL la 2 L, n vase prevzute cu icane i cu agitatoare cu brae, se observ o scdere cu 15 20 % a activitii enzimatice [198]. Rezultate similare s-au obinut i la transpunerea la scar a extraciei inulinazei de la 10 mL la 5 L, constatndu-se o scdere a activitii enzimatice de la 90 la 77 % [197]. Denaturarea enzimelor este explicat fie prin timpul mai lung necesar separrii la scar mare, fie prin micorarea vitezei de transfer datorit complexrii enzimei cu surfactantul existent n faza apoas [198].
4.3.6. Aplicaii ale extraciei cu micele inverse

Din studiile efectuate pn n prezent s-a demonstrat posibilitatea utilizrii procesului de extracie cu micele inverse pentru recuperarea unor produse de biosintez intra- i extracelulare: proteine, peptide, acizi nucleici, acizi organici, antibiotice, steroizi. Cu toate c procesul de extracie cu micele inverse a fost intens cercetat, aplicarea sa la scar industrial se las nc ateptat [239, 240], principalele motive ale neimplementrii fiind pe de o parte dificultatea reextraciei proteinelor n faza apoas i pe de alt parte imposibilitatea reutilizrii micelelor inverse datorit pierderilor importante de surfactant n faza apoas. O alt problem, care conduce la reducerea randamentului global al procesului de extracie, este prezena n soluiile apoase reale rezultate la dezagregarea masei celulare a unor compui impurificatori (acizi nucleici, zaharuri, peptide etc.) a cror comportare este puin cunoscut; au fost raportate ns fenomene de denaturare i precipitare la interfa n cazul extraciei cu micele inverse din soluii obinute n urma dezagregrii masei celulare de Saccharomyces cerevisiae [241].
4.3.6.1. Extracia cu micele inverse n prezena masei celulare

Studii efectuate pentru separarea -amilazei din lichide de fermentaie filtrate, respectiv cu un coninut de cca. 1% biomas umed au condus la rezultate identice, prezena masei celulare neinfluennd n mod semnificativ procesul de extracie [198]. Concluzii similare au fost trase i n cazul separrii inulinazei din Kluyveromyces marxianus [197]. n ambele situaii, dup separarea prin centrfugare a fazelor, celulele s-au gsit n faza organic, sub forma unui strat ntre faza organic i cea apoas. Acest strat, care ar putea ngreuna procesul de extracie la scar industrial, rezult probabil datorit adsorbiei moleculelor de surfactant pe suprafaa celulelor ncrcat cu sarcini
1

BDBAC abreviere pentru clorura de (n-benzil-n-dodecil-n-bis(2-hidroxietil)amoniu

121

Capitolul 4 Separarea prin extracie

electrice contrare, prin interaciuni electrostatice sau prin formarea unor perechi de ioni [198]. n exemplele menionate, nu a fost raportat liza celulelor, dei alte studii indic liza celulelor n prezena surfactanilor. Astfel, este menionat liza celulelor de Acetobacter vinelandii ntr-un mediu de micele inverse coninnd drept surfactant CTAB [242]. Din celulele de Candida utilis s-au extras direct proteinele intracelulare folosindu-se ca surfactani SDS, CTAB sau Triton X-100 cuplat cu un agent reductor [243]. Cu sau fr liza celulelor, cu sau fr partiia masei celulare ntre faze, este posibil extracia micelar invers direct din lichidul de fermentaie, fr o separare prealabil a masei celulare. Eliminarea etapei de separare a masei celulare n procesul de prelucrare n aval de bioreactor este un alt argument pentru utilizarea extraciei cu micele inverse la scar industrial.
4.3.6.2. Izolarea i renaturarea proteinelor

n cazul proteinelor intracelulare coninute n corpii de incluziune, micelele inverse pot fi folosite cu succes n izolarea i rempachetarea corect (renaturarea) proteinelor denaturate, principiul procesului fiind redat n fig. 4.49.
corp de incluziune

protein solubilizat
SPLARE

proteina renaturat

micela invers

Figura 4.49. Schema de principiu a renaturrii proteinelor n micele inverse [136]

Dac gradul de renaturare n cazul ribonucleazei A, de natur hidrofil, a fost de 100%, metoda s-a dovedit a fi necorespunztoare pentru renaturarea interferonului , a crui natur hidrofob conduce la conglomerarea sa n timpul procesului de extracie [244, 245].
4.3.6.3. Sinteza proteinelor n micele inverse

Sinteza proteinelor in vitro, n absena celulelor (cell free protein synthesis) se poate realiza fie pe cale chimic, fie pe cale enzimatic, fiecare metod avnd avantaje
122

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

i dezavantaje [246]. ntruct micelele inverse, prin nsi natura lor, prezint o compartimentare obligatorie, ele ar putea reprezenta un mediu potrivit pentru sinteza in vitro a proteinelor. Este semnalat sinteza in vitro a interleucinei umane 2, o protein scurt, format dintr-o secven de 156 aminoacizi, n micele inverse de Brij 96 n ciclohexan [247], precum i sinteza in vivo a -galactozidazei n plasmid recoltat din E. coli i micele inverse de Tween 85 n palmitat de i-propil [248]. n cazul sintezei unor proteine mai voluminoase, cum ar fi, de exemplu proteina albastr fluorescent (BFP1) sau proteina mbuntit verde fluorescent (EGFP2), prezena micelelor inverse are un efect advers asupra randamentului n protein fig. 4.50, 4.51. Una dintre explicaii este secvena mai mare de aminoacizi (238) necesar sintezei EGFP [196].

Intensitatea fluorescenei [unit .abs.]

Timp [minute]

Intensitatea fluorescenei [unit .abs.]

Timp [minute]

Figura 4.50. Sinteza cell free a EGFP la 23 C [196]

A n micele inverse cu 140 mM Brij 96 / ciclohexan i 1,8 % vol soluie apoas; B n ap; C EGFP format n ap n 3,5 h a fost adugat la micele inverse cu 140 mM Brij 96 / ciclohexan i 1,8 % vol soluie apoas

Figura 4.51. Sinteza cell free a EGFP la 37 C n prezena:[196]

A 29 mM Brij 96; B 29 mM AOT; C n absena surfactanilor

Pentru sinteza EGFP se recomand utilizarea unor compartimente mai mari, cum sunt, de ex., emulsiile A/U. O astfel de emulsie, format din 4,5% vol. Span 80, 0,5% vol. Tween 80, 5% soluie apoas n ulei mineral, a fost utilizat pentru prima dat n sinteza cell-free a proteinelor [249, 250]. n fig. 4.52 este redat schema de principiu a procesului de sintez a proteinelor n emulsii A/U. n cazul proteinelor fluorescente, micrografiile pun n eviden cantitatea de protein format prin intensitatea fluorescenei probei (fig. 4.53, 4.54).

1 2

BFP Blue Fluorescent Protein; EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein;

123

Capitolul 4 Separarea prin extracie

Plasmid Premix Extract S30 20 aminoacizi

Combinarea fazelor lichide apoase la 4 oC

Amestec apos de Plasmid, Premix, extract S30 i 20 Aminoacizi amestec de sintez cell-free

Emulsificare la 4 oC

Amestec de sintez cel-free n picturi de emulsie A/U

Figura 4.52. Schema de principiu a procesului de sintez cel-free a proteinelor n emulsii de tip A/U [196]

Figura 4.53. Sinteza cell-free a EGCP n emulsie A/U cu 0,45% vol Span 80; 0,05% vol Tween 80; preparare la 4 C, incubare la 37 C [196]
a 0 min; b 11 min; c 23 min; d 32 min; e 44 min; f 57 min; g 21 h; Control negativ: h 0 min; i 21 h. Bara reprezint 50 m

Figura 4.54. Sinteza cell-free a BFP n emulsie A/U cu 0,45% vol Span 80; 0,05% vol Tween 80; preparare la 4 C, incubare la 37 C [196]
a 15 min; b 1,25 h; c 3,25 h; d 5 h; e 23 h; Control negativ: f 30 min; g 1,5 h; h 5,25 h. Bara reprezint 50 m

124

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 4.4. EXTRACIA CU AFRONI Afronii sunt uniti distincte de fluid, ncapsulate prin intermediul unui film subire de surfactant (balona de spun), ntr-un alt fluid [251]. Reprezentarea schematic a unui afron este redat n fig. 4.55.
Suprafaa exterioar a filmului de surfactant Suprafaa interioar a filmului de surfactant
Suprafaa exterioar a filmului de surfactant Suprafaa interioar a filmului de surfactant

Film

Film

Miez gazos

Miez lichid

Strat dublu electric Volumul fazei lichide

Strat dublu electric

Volumul fazei lichide

b Afron coloidal lichid (CLA) a Afron coloidal gazos (CGA) Figura 4.55. Reprezentarea schematic a afronilor coloidali Diametrul mediu al afronilor coloidali gazoi (CGA) este de 25 150 m, n timp ce diametrul mediu al afronilor coloidali lichizi (CLA) este de 0,1 50 m (Fig. 4.56). Att CGA ct i CLA prezint o serie de proprieti deosebite, dintre care se remarc stabilitatea extraordinar i proprietile coloidale. CGA nu prezint coalescen i pot fi pompai la fel ca apa. CLA preparai n mod corespunztor pot fi depozitai timp de civa ani n recipiente bine nchise, fr o deteriorare vizibil. De asemenea, CLA pot forma dispersii stabile n ap [252].

Figura 4.56. Microfotografii ale unor afroni [253] a CGA din soluie de HTAB (bromur de hexadeciltrimetilamoniu C19H42NBr); b CLA din kerosen 125

Capitolul 4 Separarea prin extracie Afronii coloidali gazoi (CGA) se pot obine prin agitarea energic la temperatura camerei a unei soluii de surfactant. Procesul decurge ntr-un recipient prevzut cu 2 4 icane amplasate simetric i avnd nlimea mult mai mare dect nivelul soluiei din recipient, agitarea soluiei realizndu-se cu ajutorul unui disc rotitor antrenat de un motor electric avnd turaia de 5000 10000 rpm (fig. 4.57). Dup cteva minute de agitare se obin CGA care se separ ridicndu-se la suprafaa soluiei. Aceti CGA pot avea o porozitate (fracie de goluri) de pn la 70%, uzual de peste 50%. Bulele de gaz ncapsulate sunt stabile i prezint un spectru ngust i reproductibil al diametrelor. Stabilitatea afronilor este condiionat de concentraia surfactantului, care trebuie s fie mai mare dect concentraia micelar critic. n cazul utilizrii surfactanilor ionici, tria ionic a soluiei este hotrtoare pentru stabilitatea afronilor. Stabilitatea maxim se obine n soluii de NaCl 0,002 0,05 mM [254]. Majoritatea aplicaiilor CGA se bazeaz pe o serie de proprieti ale acestora, cum ar fi: (i) suprafaa interfacial mare; (ii) posibilitatea de a adsorbi particule la interfaa microbulelor; (iii) stabilitatea [255]. Dintre aplicaiile posibile ale CGA se pot enumera: procesele de separare, recuperarea ieiului, stingerea incendiilor, sinteza materialelor, fermentarea i bioreactoarele. O serie de utilizri ale CGA sunt sintetizate n tab. 4.15. Tabelul 4.15. Aplicaii ale CGA
CGA

motor electric > 6000 rpm lichid spumant

Aplicaia Remedierea solurilor contaminate cu hidrocarburi Epurarea apelor contaminate cu metale Epurarea apelor contaminate cu colorani Extragerea minereurilor prin flotaie

Ref. [256 258] [259 261] [253, 262, 263] [264] [252] [257] [265, 266] [267 271]

icane

disc rotitor

ndeprtarea algelor din apele poluate Curirea nisipului mbibat cu iei Flotaia celulelor de drojdii Separarea proteinelor

Figura 4.57. Dispozitiv pentru obinerea CGA

Separarea proteinelor se poate realiza prin utilizarea unor CGA preparai din diveri surfactani. Astfel, CGA provenii din AOT se pot utiliza la separarea lizozimei, ribonucleazei, proteinelor din zer, iar CGA din Triton X114 pentru separarea enzimelor recombinante din bulionul de cultur. Pentru separarea proteinelor din zer se pot utiliza i CGA din CTAB sau Tween [272]. Folosind CGA preparai dintr-o soluie de AOT, s-a separat din zer -lactoglobulina, gradul maxim de separare (86%) obinndu-se la pH = 8 [273]. La scar de laborator, procesul de separare a proteinelor cu ajutorul CGA implic urmtoarele etape (fig. 4.58): prepararea CGA utiliznd un dispozitiv similar celui din fig. 4.57, amestecarea CGA cu soluia care conine proteina, transferul proteinei n faza de afron, separarea fazei de afron i recuperarea proteinei din aceasta. La contactul proteinelor cu afronii, acestea se adsorb pe surfactant prin fore electrostatice i/sau hidrofobe. Este posibil formarea unui complex ntre surfactant i protein prin neutralizarea sarcinilor electrice, fapt care conduce la precipitarea proteinei. Faza de 126

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII afron se separ uor de faza lichid, datorit faptului c avnd un volum liber mare (~50%), are densitate mic i se ridic la suprafaa fazei lichide.

FAZA AFRON

CGA

agitator magnetic

soluie protein

amestec CGA - protein

FAZA LICHID

Figura 4.58. Separarea proteinelor cu ajutorul CGA [274] a prepararea CGA; b adugarea CGA la soluia de protein; c amestecarea fazelor; d separarea fazelor Deocamdat nu exist aplicaii la scar industrial ale separrii cu afroni, mai fiind nc de elucidat anumite aspecte ale mecanismului i selectivitii separrii. De asemenea, nu au fost nc studiate aspectele referitoare la transpunerea la scar a procesului. Exist i cercetri referitoare la comportarea reologic i la transferul termic al afronilor coloidali gazoi [275]. Utilizarea la scar industrial a separrii cu afroni este atractiv, deoarece scade numrul etapelor necesare separrii unui anumit bioprodus. Astfel, prin extracia cu afroni s-ar putea nlocui secvena de operaii: centrifugare filtrare extracie cromatografie. 4.5. EXTRACIA REACTIV Dup cum indic i denumirea procedeului, extracia reactiv implic existena unei reacii chimice ntre solutul care trebuie extras i solvent sau unul dintre componenii acestuia. Dac n extracia fizic L L este necesar utilizarea unor solveni a cror solubilitate reciproc cu solventul iniial s fie ct mai mic i care s prezinte selectivitate ridicat i inerie chimic fa de solut (pentru diminuarea pierderilor la recuperare), n extracia reactiv este necesar adugarea n solvent a unui agent de extracie (extractant) capabil s reacioneze reversibil cu solutul, formnd un compus miscibil cu solventul (fig. 4.59). n acest mod se poate mri fie capacitatea de reinere a solventului, fie selectivitatea separrii. Conform reprezentrii din fig. 4.59, procesul de extracie reactiv comport mai multe etape. ntr-o prim etap, la soluia de solut iniial (B) n solventul iniial (A) se adaug solvent (S) mpreun cu agent de extracie (X). Agentul de extracie X reacioneaz reversibil cu B, formnd un compus BX solubil n S: B + X BX (4.17) 127

Capitolul 4 Separarea prin extracie Dup separarea fazelor, n rafinat mai rmn urme de B dizolvat n solventul iniial A. Extractul obinut, care conine compusul rezultat n urma reaciei dintre solutul B i extractantul X, este trecut la etapa de reextracie (stripare), n vederea eliberrii solutului B i regenerrii extractantului X. n prezena agentului de stripare M are loc reacia de descompunere a lui BX: BX B + X (4.18)

Solutul B este ulterior recuperat din faza de rafinat de la reextracie. Extractul, format din solventul S i extractantul regenerat X este recirculat la etapa de extracie reactiv.
Recirculare solvent i extractant
SOLVENT

(S)

BX + S

AGENT DE STRIPARE

S + X

(M)

EXTRACTANT

BX + S A + B
Extracie reactiv B+X BX Separare faze Reextracie (stripare) BX B+X

S + X B + M
Separare faze

(X)

SOLVENT INITIAL

(A + B)

+ SOLUT

A + B

B + M

Figura 4.59. Schema de principiu a procesului de extracie reactiv

Iniial, extracia reactiv a fost utilizat pentru separarea unor compui anorganici, aplicarea la scar industrial fiind impulsionate de cercetrile referitoare la extracia din minereuri a uraniului folosit n energetica nuclear. Ulterior, au fost puse la punct procedee de recuperare i a altor metale: beriliu, wolfram, vanadiu, zirconiu, hafniu, lantanoide, metale platinice etc. [276]. Dup 1960, studiile asupra extraciei reactive s-au orientat ntr-o msur din ce n ce mai mare, spre stabilirea condiiilor de separare a compuilor de biosintez: acizi organici, aminoacizi, antibiotice [4].
4.5.1. Mecanismul extraciei reactive

n ipoteza n care solubilitatea reciproc a solvenilor A i S este nul, procesul de extracie reactiv const n urmtoarele etape (fig. 4.60.a): - difuzia extractantului X din volumul fazei organice ctre interfa; - difuzia solutului B din volumul fazei apoase ctre interfa; - reacia (4.17) ntre solut i extractant la interfa; - difuzia produsului reaciei (4.17) de la interfa ctre volumul fazei organice. n mod similar, reextracia (striparea) va implica urmtoarele etape (fig. 4.60.b): - difuzia compusului solut extractant (BX) din volumul fazei organice ctre interfa; 128

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

descompunerea compusului BX la interfa conform reaciei (4.18); difuzia solutului B de la interfa ctre volumul fazei apoase; difuzia extractantului X de la interfa ctre volumul fazei organice.
a Extracie b Reextracie (stripare)

BX

BX B
X + B

BX

B X
BX
Faza apoas interfaa
Gradul de extracie

Faza apoas

interfaa

X
Faza organic

Faza organic

Figura 4.60. Mecanismul extraciei reactive (a) i al reextraciei (b)

n anumite cazuri, n funcie de solubilitatea componenilor sistemului de extracie n cealalt faz, locul de desfurare al reaciei (4.17) dintre solutul B i extractantul X poate fi situat fie la interfa, fie n faza apoas, fie n faza organic. Viteza procesului global de extracie reactiv este dictat de viteza celui mai lent proces elementar: difuzia solutului B ctre interfa, difuzia extractantului X ctre interfa sau reacia chimic (4.17). Dac unul din procesele de difuziune are viteza mult mai mic dect viteza reaciei chimice, acela va fi procesul limitativ (determinant de vitez), iar procesul este controlat difuzional. Dac dimpotriv, reacia chimic este lent, viteza reaciei fiind mult mai mic dect viteza proceselor elementare de difuziune, determinant control control control de vitez va fi reacia (4.17), procesul cinetic difuzional mixt global fiind controlat cinetic. Cnd vitezele proceselor elementare sunt comparabile ca ordin de mrime, procesul global decurge dup un model cinetic combinat transfer de mas reacie chimic. Procesul elementar limitativ depinde de condiiile de operare: dac procesul este controlat Intensitatea amestecrii difuzional, prin intensificarea agitrii masei de reacie se poate mri viteza Figura 4.61. Modificarea procesului difuziunii, astfel nct procesul s determinant de vitez n extracia reactiv devin controlat cinetic (fig. 4.61). Pentru descrierea matematic a procesului de extracie reactiv exist numeroase modele. Unul dintre acestea este modelul Wang Langemann (1994) [277], cunoscut i drept modelul nestaionar al celor dou filme [89]. Dei nu este un model nou, el 129

Capitolul 4 Separarea prin extracie

combin ntr-un mod original o serie de ipoteze specifice modelelor clasice de transfer: modelul celor dou filme al lui Whitman (1923), modelul Lewis Whitman (1924), modelul rennoirii suprafeei al lui Higbie (1935), modelul rennoirii ntmpltoare a suprafeei al lui Danckwerts (1951) [90]. Modelul a fost folosit pentru a descrie un proces de transfer de mas nestaionar n dou straturi limit, de o parte i de alta a interfeei, n prezena unei reacii ireversibile de ordin I. Ipotezele modelului sunt urmtoarele: - ntre cele dou faze lichide exist o interfa a crei arie medie poate fi cunoscut sau estimat, chiar i experimental; - exist dou straturi limit, laminare de ambele pri ale interfeei, avnd grosimile 1 i 2 n cele dou faze; - n straturile limit difuziunea are loc prin mecanism molecular; - n a doua faz are loc o reacie ireversibil de ordin I; - concentraiile din volumul celor dou faze lichide nu variaz n timp; la interfa se consider ntotdeauna echilibrul descris de legea lui Henry. Pe baza acestor ipoteze, ecuaiile modelului de transfer de mas sunt:
C1 2C = D1 21 pentru 1 < x < 0 t x C2 2C2 = D2 k R C2 pentru 0 < x < 2 t x 2 cu urmtoarele condiii la limit i condiii iniiale: C1 = C1,V pentru x = 1 , t > 0
C1 = K N C2 pentru x = 0, t > 0 C C1 = D2 2 pentru x = 0, t > 0 x x C2 = C2,V pentru x = 2 , t > 0 D1 C1 = C1,V pentru t = 0 C2 = C2,V pentru t = 0

(4.19) (4.20)

(4.21)

n care: C concentraia componentului transferat [kmol.m-3]; D difuzivitatea [m2.s-1]; kR constanta vitezei de reacie [s-1]; KN coeficientul de distribuie al speciei transferate ntre cele dou faze; t timpul [s]; x coordonata n direcia transferului de mas; grosimea stratului limit [m]. Indici: 1 faza 1; 2 faza 2; V volumul fazei lichide. Rezolvnd ecuaiile (4.19 4.20) cu condiiile la limit (4.21) se obine profilul de concentraie n fiecare strat limit. Din profilurile de concentraie obinute se poate calcula fluxul instantaneu de transfer de mas:
130

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

N (t ) = D1 C1 x

(4.22)
x =0

n ipoteza c interfaa se rupe parial i aleatoriu, refcndu-se n acelai timp, iar durata medie de via a turbioanelor la interfa este dat de legea de distribuie a lui Danckwerts:
(t ) = s e st

(4.23)

se poate calcula fluxul mediu de component transferat:

N = s N (t ) e st dt
0

(4.24)

Rezolvarea integralei (4.24) conduce la o expresie a debitului mediu de component transferat n funcie de un timp adimensional caracteristic, :

D1 s

(4.25)

n ecuaiile (4.23 4.25), s reprezint viteza de rennoire a suprafeei [s-1]. n cazul general (regim nestaionar i reacie chimic), expresia fluxului mediu de component transferat are doi termeni, primul reprezentnd debitul transferat n condiii staionare, iar al doilea reprezentnd contribuia transferului nestaionar datorat turbulenei la interfa. Dac termenul nestaionar dispare i relaia de calcul a debitului mediu de component transferat devine: D (C cosh 2 K N C2,V ) (4.26) N = 2 1 1,V 2 1 cosh 2 + K N Dr2 sinh 2 n care:
kR D2 D1 D2

2 = 2

(4.27)

Dr =

(4.28)

Un alt caz particular este cel n care nu are loc reacia chimic (kR = 0), caz n care N se reduce la expresia: C K N C2,V (4.29) N = 1,V 1 2 + KN D1 D2 expresie identic cu cea obinut de Lewis i Whitman [278] prin aplicarea teoriei celor dou filme n cazul transferului de mas interfazic. Modelul Wang Langemann arat c profilurile concentraiilor n cele dou faze precum i fluxul mediu de component transferat depind de trei parametri: grosimea straturilor limit (1, 2), viteza de rennoire a suprafeei (s). Aceti parametri depind n general de hidrodinamica sistemului, n unele cazuri putnd fi determinai pe cale experimental. ntruct sunt puine reacii chimice n sisteme L L care decurg dup o cinetic de ordin I (n majoritatea cazurilor de extracie reactiv ntlnindu-se reacii de ordin fracionar), modelul descris anterior, precum i altele similare, prezint mai mult importana teoretic, ele neputnd fi aplicate n proiectare.
131

Capitolul 4 Separarea prin extracie 4.5.2. Ageni de extracie

Alegerea agentului potrivit pentru extracia reactiv este hotrtoare pentru realizarea cu succes a separrii. Pentru combinaia solvent-extractant exist dou categorii de criterii de selectare. n prima categorie intr criteriile care sunt eseniale pentru separare, cum ar fi selectivitatea, recuperabilitatea, diferena de densitate fa de rafinat. Criteriile din cea de-a doua categorie nu sunt hotrtoare, dar pot mbunti separarea i/sau o pot face mai eficient din punct de vedere economic. Unele proprieti ale solventului (extractantului) pot fi contradictorii, caz n care trebuie aleas o soluie de compromis [279]. Selectivitatea. Un factor de separare ridicat permite realizarea extraciei ntr-un numr mai redus de trepte. Puritatea extractului sau a rafinatului pot fi mbuntite prin creterea cantitii de solvent utilizate. Dac alimentarea este un amestec complex din care trebuie separai mai muli componeni, selectivitatea de grup devine o caracteristic important. Capacitatea de extracie. O valoare ridicat a coeficientului de distribuie ntre faze indic o capacitate ridicat a solventului pentru solut i permite utilizarea unor rapoarte mai reduse solvent/alimentare. ntruct acest parametru este funcie de temperatur, un gradient termic aplicat procesului de extracie poate conduce la creterea capacitii de extracie. Creterea temperaturii poate conduce ns la scderea selectivitii. Adugarea unor componeni cum ar fi antisolvenii, poate modifica valoarea coeficientului de distribuie. De cele mai multe ori este necesar realizarea unui compromis ntre selectivitate i capacitatea de extracie. Utilizarea refluxului de rafinat sau de extract poate mbunti puritatea, fie a rafinatului, fie a extractului. Un factor sensibil l reprezint valoarea pH-ului la care se realizeaz extracia, respectiv striparea. n cazul unor separri dificile, se utilizeaz un gradient de pH n zona de concentrare, pentru optimizarea refluxului [280]. Recuperabilitatea solventului. Solventul trebuie s poat fi recuperat ct mai uor. Dac n extracia fizic L L recuperarea se realizeaz prin distilare sau distilare urmat de stripare, n extracia reactiv recuperarea se realizeaz fie prin modificarea pH-ului, fie prin modificarea triei ionice, ambele ducnd la descompunerea compusului format ntre solut i extractant. Cu alte cuvinte, se aleg acele condiii de pH i trie ionic, care favorizeaz deplasarea echilibrului reaciei (4.18) spre dreapta. Densitatea. Diferena de densitate dintre extract i rafinat trebuie s fie suficient de mare (minimum 150 kg.m-3) pentru a uura separarea fazelor prin decantare. O diferen de densitate mai mare permite creterea capacitii utilajelor. La diferene de densitate mici ntre faze sunt necesare extractoare centrifugale costisitoare. Viscozitatea i punctul de topire. O viscozitate prea ridicat reduce eficiena transferului de mas i provoac dificulti la vehiculare i dispersie. O viscozitate sczut permite o sedimentare rapid i o capacitate mai mare (uzual faza mai viscoas este faza dispers). Temperatura de realizare a procesului este de regul determinat de viscozitate. Este de preferat ca punctul de topire al solventului s fie mai sczut dect temperatura mediului nconjurtor, pentru a uura manipularea sa. Solubilitatea. Solubilitatea reciproc a solventului de extracie cu solventul iniial din care se realizeaz extracia reactiv trebuie s fie ct mai sczut. n caz contrar,
132

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

este necesar o etap suplimentar de separare pentru recuperarea solventului din rafinat. Tensiunea interfacial. O tensiune interfacial ridicat permite o sedimentare rapid datorit coalescenei facile a picturilor de faz dispers, permind astfel creterea capacitii instalaiei de extracie. O tensiune interfacial sczut faciliteaz dispersia fazelor, cu obinerea unei arii mari a interfeei, fapt care conduce la creterea eficienei separrii. n acest caz ns va fi necesar un volum mai mare de utilaj pentru separarea fazelor. O tensiune interfacial mult prea sczut accentueaz tendina de formare a emulsiilor. Faza dispers. Amenajrile interne ale coloanelor de extracie nu trebuie s fie udate de ctre faza dispers, fapt care ar conduce la scderea capacitii coloanei. Adeseori transferul de mas de la faza continu ctre faza dispers mbuntete coalescena picturilor; n picturi mari, eficiena transferului de mas este mai redus. Toxicitatea i inflamabilitatea. Pentru procesarea produselor alimentare sunt acceptai doar solvenii netoxici. n general, orice pericol asociat cu solventul va necesita msuri de siguran suplimentare. n consecin, solvenii organici alifatici sunt preferabili celor aromatici. Corozivitatea. Utilizarea unor solveni corozivi conduce la creterea costului echipamentelor, care vor trebui confecionate din materiale anticorozive. De asemenea, astfel de solveni pot necesita prelucrri costisitoare nainte sau dup utilizare. Stabilitatea termic i chimic. Este important avnd n vedere necesitatea reciclrii solventului. n special acesta trebuie s fie rezistent la descompunere n timpul recuperrii, n coloanele de stripare, de ex. Uneori sunt necesare msuri suplimentare pentru a preveni degradarea solvenilor. De exemplu, n cazul furfuralului, este necesar limitarea temperaturii, operarea ntr-o atmosfer protectoare de azot i deaerarea alimentrii. Disponibilitate i cost. Solventul trebuie s fie uor disponibil. Nu conteaz att preul solventului, ct costurile anuale datorate pierderilor inevitabile de solvent n timpul operrii. Impactul asupra mediului ambiant. Solventul nu trebuie doar s fie compatibil cu procesele de prelucrare din amonte i din aval de extracie, ci i cu mediul ambiant (pierderi minime prin evaporare, solubilizare i antrenare). n general, cerinele impuse extraciei reactive sunt similare cu cele impuse extraciei fizice L L. Viscozitatea fazei organice trebuie s fie sub 2 mPa.s-1, punctul de fierbere ntre 150 250 C, iar densitatea ntre 750 900 kg.m-3. Punctul de aprindere trebuie s fie cu cel puin 25 K mai ridicat dect temperatura de operare, fiind recomandat o valoare de peste 55 C. La aceeai mas molecular, solvenii aromatici sunt mai polari, deci mai solubili n ap, dect cei alifatici. Preul mai ridicat i toxicitatea mai mare a solvenilor aromatici, face ca n practica industrial s fie preferai solvenii alifatici. Degradarea solventului este de regul neglijabil n comparaie cu degradarea extractantului. Extractantul se poate degrada chimic, termic sau prin radiaii. De asemenea el poate fi otrvit prin complexare ireversibil cu solutul extras. De exemplu, n hidrometalurgie, la interfaa dintre stratul apos i cel organic apare i se concentreaz o faz cu coninut de substane de natur mineral sau biologic, faz care reduce transferul de mas i scade eficiena extraciei. Aceast faz
133

Capitolul 4 Separarea prin extracie

apare datorit precipitrii substanelor dizolvate i coloidale (n special silice) la tensiuni de forfecare mari. Fenomenul este favorizat de prezena acizilor humici [281]. Principalele clase de ageni de extracie care se utilizeaz pentru separarea produselor de biosintez sunt derivaii organofosforici, aminele cu mas molecular ridicat i compuii macrociclici de tip eteri-coroan sau derivai ai calixarenelor.
4.5.2.1. Derivai organofosforici

Derivaii organofosforici sunt cunoscui pentru capacitatea lor de a realiza extractia cu viteze i randamente ridicate. Acetia sunt folosii fie individual, fie n amestec cu ali extractani (extracie reactiv sinergetic) pentru separarea metalelor, a compuilor anorganici, a compuilor organici. n funcie de structura chimic, derivaii organofosforici pot fi: acizi organofosforici, esteri neutri ai acidului fosforic, acizi fosfonici, acizi fosfinici, fosfinoxizi. Toi aceti extractani au la baz acidul ortofosforic, gruprile OH ale acestuia fiind substituite parial sau total cu radicali organici (fig. 4.62). O prezentare a agenilor de extracie organofosforici comerciali este redat n tab. 4.16.

O P HO

OH

O P R3

R1 R2

OH

Acid ortofosforic

Derivat organofosforic

Figura 4.62. Structura general a extractanilor organofosforici

Structura chimic a agenilor de extracie determin mecanismul reaciilor implicate n extracia reactiv. Astfel, extracia cu acizi organofosforici decurge prin intermediul schimbului ionic, n timp ce extracia cu esteri neutri sau fosfinoxizi decurge prin formarea unor specii solvatate [4]. Schimbul ionic implic existen solutului din faza apoas sub form cationic, la interfa stabilindu-se echilibrul:

(R CH (COOH ) NH 3 )[+aq ] + (HX )[ org ]

[(R CH (COOH ) NH ) X ]
+ 3

[ org ]

+ H + (4.30)

indicii [aq] i [org] referindu-se respectiv la faza apoas i la cea organic. n cazul formrii speciilor solvatate, la interfa se stabilete echilibrul:

(R COOH )[ aq ] + m(TOPO )[org ]

[(R COOH ) m(TOPO )][org ]

(4.31)

134

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Tabelul 4.16. Ageni de extracie organofosforici comerciali[4, 276, 282]
Clasa Structur R1 = R2 = OH R3 = C4H9CH(C2H5)CH2O R1 = OH R2 = R3 = C4H9CH(C2H5)CH2O R1 = OH R2 = R3 = p-CH3(CH2)6C6H5O R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)3O R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)7O R1 = OH R2 = C4H9CH(C2H5)CH2 R3 = C4H9CH(C2H5)CH2O R1 = OH R2 = R3 = C4H9CH(C2H5)CH2 R1 = OH R2 = R3 = CH3(CH2)3CH2CH(CH3)CH2 R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)7 R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)5 Denumire tiinific comercial acid mono-(2MEHPA etilhexil) fosforic acid di-(2-etilhexil) fosforic acid di-p-octilfenil fosforic tri-n-butilfosfat tri-n-octilfosfat ester mono-(2etilhexil) al acidului mono-(2-etilhexil) fosforic acid di-(2-etilhexil) fosfinic acid di(2,4,4 trimetilpentil) fosfinic tri-n-octilfosfinoxid tri-n-hexilfosfinoxid DEHPA OPPA TBP TOP PC88A (P-507) P-229 CYANEX 272 TOPO (CYANEX 921) THPO

Acizi organofosforici

Esteri neutri ai acidului fosforic Acizi organofosfonici

Acizi organofosfinici

Fosfinoxizi

4.5.2.2.

Amine cu mas molecular ridicat

Aminele alifatice cu caten lung i srurile acestora sunt utilizate pe scar larg ca extractani pentru metale, acizi minerali, acizi carboxilici, aminoacizi, antibiotice etc. din urmtoarele motive: - performane superioare comparativ cu ali extractani; - posibilitatea separrii unei game largi de compui chimici; - similaritatea dintre mecanismul reaciilor implicate cu cel al reaciilor care au loc la separarea pe schimbtori de ioni; datorit acestui fapt se poate prevedea comportarea sistemului de extracie. Din punct de vedere al structurii chimice, extractanii de tip aminic se clasific dup numrul atomilor de hidrogen substituii cu radicali organici n: amine primare, amine secundare, amine teriare, sruri cuaternare de amoniu. Dup natura radicalului hidrocarbonat, aminele pot fi alifatice (cu caten normal sau ramificat) sau aromatice. O clasificare a agenilor de extracie comerciali pe baz de amine este redat n tab. 4.17. Pentru ca o amin s poat fi utilizat n extracia reactiv, ea trebuie s ndeplineasc cumulativ urmtoarele condiii [4, 283]: (i) s aib o capacitate ridicat de extracie; (ii) s aib o hidrofobicitate ridicat; (iii) s fie uor solubil n solveni organici; (iv) s formeze cu solutul compui puternic hidrofobi; (v) s permit o separare rapid a fazelor, respectiv s aib o tendin de emulsionare ct mai redus; (vi) s fie stabile din punct de vedere chimic, n special la radiaii i ageni oxidani, pentru a putea fi regenerate i reutilizate n ct mai multe cicluri de extracie. 135

Capitolul 4 Separarea prin extracie Tabelul 4.17. Ageni de extracie comerciali de tip aminic [4, 276, 282]
Clasa Amine primare RNH2 Structur R = CH3(CH2)6CH2 R = CH3(CH2)8CH2 R = CH3(CH2)10CH2 R = (CH3)3C(CH2C(CH3)2)4 R1 = R2 = CH3(CH2)6CH2 R1 = C9H19CH=CHCH2 R2 = CH3C(CH3)2(CH2C(CH3)2)2 R1 = CH3(CH2)11 R2 = CH3C(CH3)2(CH2C(CH3)2)2 R1 = R2 = CH3(CH2)12 R1 = R2 = (CH3)2CH(CH2)7 R1 = R2 = CH3(CH2)9 R1 = CH3(CH2)7 R2 = C5H4N R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)5 R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)7 R1 = R2 = R3 = (CH3)2CH(CH2)5 R1 , R2 , R3 = amestec n C8 C10 Amine teriare R1R2R3N R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)9 R1 = R2 = R3 = (CH3)2CH(CH2)7 R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)11 R1 = R2 = R3 = CH3(CH2)12 R1 = R2 = CH3 R3 = CH3(CH2)7 R1 = R2 = R3 = C28H57 R1 = CH3(CH2)7 R2 = CH3(CH2)9 R3 = CH3(CH2)11 R1 = CH3 R2 = R3 = R4 = CH3(CH2)7 X- = ClR1 = CH3 R2 = R3 = R4 = amestec n C8 C10 X- = Cltri-n-decilamin tri-i-decilamin tri-n-dodecilamin tri-n-tridecilamin dimetil-n-octil-amin Amberlite XE 204 n-octil-n-decil-ndodecil-amin clorur de metil-tri-noctilamoniu clorur de metil-tri-n(C8 C10) amoniu Adogen 368 TOMAC Adogen 464 Aliquat 336 Adogen 464 HOE S 2706 Denumire tiinific comercial n-octilamin n-decilamin n-dodecilamin trialchil-metilamin Primene JMT di-n-octilamin n-lauril-trialchilmetilamin n-dodecenil-trialchilmetilamin di-n-tridecilamin di-2-metil-nonilamin di-n-decilamin n-octil-aminopiridin tri-n-hexilamin tri-n-octilamin tri-i-octilamin THA TOA Alamine 300 Adogen 381 Alamine 308 Hostarex A 324 Alamine 336 Adogen 364 Hostarex A 327 Alamine 310 Adogen 363 Alamine 304 Adogen 383 Amberlite LA-1 Amberlite LA-2 Adogen 283 HOE F2562 DDA

Amine secundare R1R2NH

Sruri cuaternare de amoniu R1R2R3R4N+X-

Datorit caracterului puternic bazic, conferit de gruparea aminic, aceti extractani fac parte din categoria anioniilor lichizi. Extracia cu amine decurge fie prin procese de schimb anionic, fie prin asociere n faza organic, fie prin formare de perechi de ioni [284].
136

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Capacitatea de extracie a aminelor i derivailor acestora crete odat cu creterea masei moleculare. Ea depinde, de asemenea, i de configuraia moleculei: compuii simetrici au o capacitate de extracie mai bun dect cei asimetrici, la aceeai mas molecular. De asemenea, capacitatea de extracie se mrete prin substituirea unei catene alifatice cu o grupare aromatic [4]. Hidrofobicitatea aminelor este mai ridicat dect cea a srurilor corespunztoare, aminele fiind preferate srurilor lor n procesele de extracie. Solubilitatea n solveni nepolari a aminelor primare crete cu creterea lungimiii catenei hidrocarbonate. Prezena unei a doua catene hidrocarbonate (n cazul aminelor secundare) duce la creterea solubilitii n solveni nepolari i la scderea solubilitii n solveni polari. Aminele teriare cu catene hidrocarbonate lungi sunt practic insolubile n ap, dar sunt complet miscibile cu solvenii nepolari [283]. Solubilitatea srurilor aminelor primare n solveni organici scade cu reducerea polaritii solventului, astfel nct n hidrocarburi alifatice aceti derivai sunt foarte puin solubili. Solubilitatea poate fi mrit prin adugarea n solvent a unui alcool. Srurile aminelor secundare i teriare sunt mai solubile n solveni organici dect srurile aminelor primare, n special dac solventul este perfect anhidru [4]. Bazicitatea maxim o prezint aminele secundare, acestea fiind adecvate separrii compuilor acizi [4]. Dac n cazul aminelor primare i secundare bazicitatea variaz puin cu lungimea catenei hidrocarbonate, bazicitatea aminelor teriare crete cu creterea numrului de atomi de carbon din molecul. Ordinea bazicitii aminelor n solveni organici polari este aceeai ca n soluie apoas, putnd fi atribuit unui efect de solvatare [283]. Tendina de emulsionare, cu formarea unor emulsii mai mult sau mai puin stabile, reprezint principalul dezavantaj al utilizrii aminelor i srurilor acestora n extracia reactiv. ntruct aminele cu caten lung sunt ageni tensioactivi, emulsionarea poate fi evitat prin alegerea corespunztoare a solventului, a concentraiei extractantului, precum i prin modificarea parametrilor fazei apoase (pH, concentraia unor electrolii etc.) [4]. 4.5.2.3. Compui macrociclici

Compuii macrociclici utilizai ca extractani fac parte din categoria eterilorcoroan (fig. 4.63) i a calixarenelor (fig. 4.64). Structurile macrociclice ale acestor compui delimiteaz caviti intramoleculare de forme i dimensiuni diverse. Astfel, diametrul cavitilor formate variaz ntre 0,12 0,15 nm pentru eterii 14-coroan-4 i 0,34 0,43 nm pentru eterii-21-coroan-7 [285]. n aceste caviti pot fi reinute chimic specii ionice sau moleculare, formndu-se compleci cu stabilitate ridicat, stabilitate care este determinat de raportul dintre mrimea ciclului i cea a speciei chimice extrase (fig. 4.65). Pentru accentuarea caracterului hidrofob sau pentru creterea gradului de extracie, acestor extractani le pot fi ataai diveri substitueni aromatici, carboxilici sau alchilici. Cel mai cunoscut extractant din aceast categorie este eterul dibenzo-18coroan-6 (fig. 4.63.d), cunoscut sub denumirea comercial DBC 18 [276].

137

Capitolul 4 Separarea prin extracie

Figura 4.63. Eteri-coroan: a 12-coroan-4; b 15-coroan-5; c 18-coroan-6; d dibenzo-18-coroan-6; e benzo-15-coroan-5; f diciclohexil-18-coroan-6; g dibenzo-21-coroan-7; h diciclohexil-24-coroan-8 (neplanar)[285]

Figura 4.64. Calixarene: a structur general; b calix[4]arene: reprezentare plan; c calix[4]arene: reprezentare pseudo-tridimensional; d para-terbutilcalix[4]aren; e - para-ter-butilcalix[6]aren; f - para-ter-butilcalix[8]aren [286] 138

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Figura 4.65. Compleci ai compuilor macrociclici: a ion K+ coordinat de eter-18-coroan-6 [287]; b vas antic grecesc (calix), a crui form a inspirat denumirea calixarenelor [286]; c molecul de derivat benzenic coordinat de para-ter-butilcalix[5]aren

Extractanii cu structur macrociclic sunt utilizai la transportul printr-o membran lichid organic a diferitelor specii chimice ntre dou faze apoase cu valori diferite ale pH-ului, proces care a avut ca model sistemele biologice. Astfel, unii ionofori naturali din categoria antibioticelor (monesina, lascalocidul, valinomicina, nigericina fig. 4.66) au capacitatea de a transporta diveri cationi i anioni prin membranele celulare, n sensul sau mpotriva gradientului de concentraie al speciilor ionice respective [4].

Figura 4.66. Ionofori naturali: a monesina [4]; b lascalocidul [4]; c valinomicina [288]

Dac la extracia i transportul prin membrane lichide este meninut diferena de pH dintre soluiile apoase, solutul poate fi transportat chiar mpotriva gradientului s u de concentraie. Extractanii macrociclici sunt utilizai, de regul, pentru separarea metalelor i aminoacizilor.
139

Capitolul 4 Separarea prin extracie 4.5.2.4. Sinergismul agenilor de extracie

n anumite situaii, capacitatea de extracie a unui amestec de extractani este mai mare dect suma capacitilor de extracie ale fiecrui extractant considerat separat [276]. Fenomenul, observat i studiat la nceputul anilor 1960, poart denumirea de sinergism i exprim faptul, aparent paradoxal, c ntregul este mai mare dect suma tuturor prilor componente. Extractanii care genereaz acest efect nu reacioneaz ntre ei, dar pot extrage separat solutul, sau pot forma cu acesta o combinaie puternic hidrofob. Extracia reactiv sinergic poate fi estimat cantitativ prin intermediul coeficientului sinergic (sau sinergetic), CS: E AB CS = lg E A + EB (4.32)
n care EA i EB reprezint coeficienii individuali de extracie ai solutului cu extractanii A i B, EAB reprezint coeficientul de extracie al solutului cu amestecul extractanilor A i B: E AB = E A + E B + E AB (4.33) iar EAB reprezint un coeficient de amplificare. n funcie de valoarea acestui coeficient, extracia reactiv sinergic poate fi pozitiv (EAB > 0) sau negativ (EAB < 0). Pentru extracia reactiv sinergic se folosesc, principial, patru tipuri de combinaii ntre extractani: (i) agent de chelatizare + ligand neutru; (ii) acid organofosforic + ligand neutru; (iii) doi extractani neutri; (iv) doi extractani cu caracter acid. Extractanii neutrii utilizai recent sunt derivaii compuilor de tip etercoroan. Prima i ultima categorie de combinaii sunt specifice extraciei reactive a metalelor. Celelalte combinaii pot fi aplicate att la extracia metalelor, ct i pentru extracia acizilor minerali sau a compuilor organici [4]. Dei nc nu este pe deplin lmurit, mecanismul extraciei sinergice implic formarea unui complex mixt care conine solutul i cei doi extractani. Dei tipul reaciilor care intervin n proces difer de la un sistem de extracie la altul, efectul sinergic apare ca rezultat a dou fenomene simultane: (i) modificarea capacitii de extracie individual a extractanilor; (ii) modificarea structurii speciei moleculare extrase. Astfel, unul dintre extractani complexeaz solutul, iar cellat mrete hidrofobicitatea complexului format, n condiiile n care configuraia structural a extractanilor nu genereaz mpiedicri sterice. Cu ct diferena de polaritate dintre extractani este mai mare, cu att efectul sinergic va fi mai puternic. Mrirea eficienei extraciei prin folosirea a doi extractani neutri cu valori foarte diferite ale constantei dielectrice s-ar putea explica prin aceea c derivatul cu polaritate mai redus va solvata solutul, solubilizarea complexului format fiind favorizat de mrirea constantei dielectrice a solventului organic prin adugarea solventului cu polaritate mai ridicat [4].

140

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 4.5.3. 4.5.3.1. Echipamente pentru extracia reactiv Instalaii cu uniti distincte amestector decantor

De regul, procesele de extracie reactiv decurg n echipamente similare celor proiectate pentru extracia fizic L L. Majoritatea instalaiilor folosesc uniti individuale amestector decantor amplasate n cascad (fig. 4.67), care permit reglarea individual a pH-ului, stabilirea fazei disperse i a timpului de staionare, n funcie de cinetica transferului de mas i de hidrodinamica sistemului. Dezavantajul acestor instalaii l reprezint forfecarea neuniform n unitile de amestecare, fapt care conduce la o distribuie larg a diametrului picturilor fazei disperse. Datorit acestei neuniformiti n dimensiunea picturilor apar pierderi de solvent prin antrenare n rafinat, pierderi evideniate prin scderea eficienei de extracie. Un alt dezavantaj este zestrea mare de solvent comparativ cu alte extractoare [279, 289, 290]. Unitile individuale amestector decantor sunt preferate atunci cnd numrul treptelor de extracie este redus (1 2 trepte) i cnd debitele prelucrate sunt mari [279].
AMESTECTOR DECANTOR faza uoar plac perforat interfa

nmol

faza uoar

faza grea

faza grea

interfa

faza grea

faza uoar

faza uoar

faza uoar
AMESTECTOARE

interfa

faza grea faza uoar faza grea zon de amestecare

faza grea faza uoar faza grea

clapete de reglare faza uoar faza grea

zon de sedimentare

Figura 4.67. Instalaie de extracie reactiv cu uniti distincte amestector decantor (A D): a unitate cu o singur treapt A D [289]; b cascad orizontal de uniti A D [289]; c cascad vertical de uniti A D [290] 141

DECANTOARE

Capitolul 4 Separarea prin extracie 4.5.3.2. Extractoare tip coloan fr agitare mecanic

Cnd numrul treptelor de extracie este mai mare sunt preferate extractoarele de tip coloan. Acestea au avantajul unui necesar mai redus de solvent, pierderile de solvent sunt mai mici, iar spaiul necesar amplasrii este de asemenea mai redus [279, 289]. Datorit timpului de staionare limitat, coloanele de extracie sunt utilizabile doar pentru procesele cu cinetic rapid, cnd echilibrul se atinge n mai puin de 1 minut [279]. Coloanele fr agitare (fig. 4.68) sunt simple; ele pot fi fr amenajri interioare (coloane cu pulverizare fig. 4.68 a), cu umplutur (fig. 4.68 b) sau cu talere (fig. 4.68 c, d).
FU FG FG FG FG FU FU FU

FU FG

FU FG

FU FG

FU FG

Figura 4.68. Extractoare tip coloan fr agitare mecanic: a coloan cu pulverizare; b coloan cu umplutur; c coloan cu talere pentru dispersarea fazei uoare; d coloan cu talere pentru dispersarea fazei grele [279] FG faza grea; FU faza uoar Coloana cu pulverizare, dei simpl i ieftin, are eficiena sczut din cauza amestecrii axiale puternice care apare n faza continu datorit ascensiunii picturilor prin aceasta. Pentru a contracara amestecarea axial, coloanele sunt prevzute cu amenajri interioare, care au i rolul de a favoriza ruperea i coalescena picturilor, mbuntindu-se astfel transferul de mas. De regul se folosesc aceleai tipuri de umpluturi ca i n cazul distilrii, cu toate c parametrii hidrodinamici sunt alii n cazul extraciei. Performanele extractorului cresc semnificativ cnd acesta este echipat cu corpuri de umplere cu suprafa specific mare i fracie de goluri mic, sau cu umpluturi structurate [279]. 4.5.3.3. Extractoare tip coloan cu agitare mecanic

n coloanele de extracie fr agitare, hidrodinamica dispersiei este controlat de ctre proprietile fizice i de ctre debitele vehiculate prin coloan. Pentru o mai bun 142

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII flexibilitate n operare, este necesar decuplarea hidrodinamicii de debitul vehiculat. Acest lucru se realizeaz prin folosirea unor dispozitive de agitare mecanic (fig. 4.69).
FU FU FU FU FU

FG

FG

FG

FG

FG

FU

FU

FU

FU

FU

FG

FG

FG

FG

FG

Figura 4.69. Extractoare tip coloan cu agitare mecanic [279]: a coloan cu discuri rotative; b coloan Karr; c coloan Oldshue-Rushton; d coloan Khni; e coloan Scheibel. Agitarea mrete aria interfacial i viteza de rupere i coalescen a picturilor, mrind eficiena transferului de mas n coloan. Preul pltit este de regul o uoar scdere a capacittii de producie i o proiectare, respectiv transpunere la scar, mai sofisticate. Majoritatea instalaiilor noi de extracie reactiv folosesc coloane cu agitare datorit flexibilitii ridicate n operare: mrimea picturilor se poate regla independent de debitele de alimentare, ceea ce duce la minimizarea pierderilor de solvent n condiiile meninerii eficienei. 4.5.3.4. Alte tipuri de extractoare

Extractoarele centrifugale se preteaz la prelucrarea lichidelor cu particule solide de dimensiuni mici (lichide de fermentaie, de ex.), cu capacitate de spumare ridicat i care necesit timpi de contact scuri. Pentru extracia reactiv a produselor de biosintez se folosesc aceleai tipuri de extractoare centrifugale care au fost descrise n subcapitolul consacrat extraciei fizice L L (p. 78 83). Extractoarele centrifugale prezint avantajul unei bune separri a fazelor chiar n condiiile unei diferene mici de densitate i la valori reduse ale tensiunii interfaciale. n centrifugele moderne n contracurent se pot atinge cteva trepte de echilibru ntr-un singur utilaj, ca rezultat al construciei interne a acestuia [291]. 4.5.4. Extracia reactiv a produilor de biosintez

Pn n prezent sunt cunoscute i aplicate cel puin la nivel de laborator i pilot procedee de extracie reactiv din medii apoase a acizilor organici, aminoacizilor, 143

Capitolul 4 Separarea prin extracie antibioticelor. Exist cercetri intense pentru lrgirea domeniului de aplicabilitate al extraciei reactive i la alte clase de compui de biosintez. 4.5.4.1. Extracia acizilor carboxilici

Acizii carboxilici sunt produse utilizate pe scar larg n industria chimic, farmaceutic i alimentar. Cu toate c obinerea lor pe cale fermentativ din resurse regenerabile este cunoscut de mai bine de un secol, marea majoritate a produciei actuale de acizi carboxilici este bazat pe materii prime petroliere. Tehnologiile fermentative nu s-au impus nc datorit dificultii recuperrii produselor finite. ntruct acizii carboxilici au valori extrem de reduse ale coeficienilor de distribuie n solveni organici (vezi tab. 4.1), nu este posibil separarea lor prin extracie fizic L L, ci numai prin extracie reactiv. Ca ageni de extracie se pot utiliza derivaii organofosforici sau aminele cu mas molecular mare [113].
4.5.4.1.1. Extracia acizilor carboxilici cu derivai organofosforici

La extracia acizilor carboxilici cu derivai organofosforici (esteri neutri sau fosfinoxizi) are loc solvatarea solutului din faza apoas, respectiv stabilirea unor legturi coordinative sau dipol-dipol ntre solut i extractant. La modul general, solvatarea poate fi descris de o ecuaie de forma: R COOH [ aq ] + mR1 R2 R3 PO[ org ] R COOH mR1 R2 R3 PO[ org ] (4.34)

n care m reprezint numrul de solvatare al acidului carboxilic. Constanta de echilibru (constanta de extracie) este dat de expresia: R COOH mR1 R2 R3 PO[ org ] K ex = (4.35) m R COOH [ aq ] R1 R2 R3 PO[ org ]

][

] ]

ea depinznd puternic de hidrofobicitatea acidului extras (tab. 4.18), dar i de bazicitatea extractantului. La extracia acizilor carboxilici din soluii apoase 0,1 M cu TBP nediluat la 25 C, coeficienii de distribuie cresc n ordinea: acid tartric (0,6), acid malic (1,3), acid lactic (1,4), acid citric (2,0), acid maleic (3,6), acid succinic (5,7), acid propionic (8,4) [293, 294].
Tabelul 4.18. Constantele de echilibru la extracia unor acizi carboxilici cu TOPO dizolvat n hexan [295]
Acid carboxilic Kex Acizi monocarboxilici Acid acetic 5,32 Acid glicolic 0,67 Acid propionic 37,9 Acid lactic 1,19 Acid piruvic 1,67 Acid butiric 51,9 Acid citric Acid carboxilic Acizi dicarboxilici Acid succinic Acid fumaric Acid malic Acil L-maleic Acid itaconic Acid tartric Acizi tricarboxilici 19,61 Acid izocitric Kex 21,2 174,5 33,5 3,52 80,8 2,19 32,7

144

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Se poate concluziona c acizii monocarboxilici sunt mai uor de extras dect cei dicarboxilici, iar prezena gruprilor OH n structura acidului micoreaz puternic extractabilitatea acestuia [113]. n cazul derivailor organofosforici neutri, bazicitatea, respectiv eficiena extraciei, cresc n ordinea [4]: tributilfosfat < dibutilfosfat < tributilfosfinoxid, respectiv cu creterea numrului de legturi directe C P (tab. 4.19) [113].
Tabelul 4.19. Constantele de echilibru la extracia unor acizi carboxilici cu extractani organofosforici [113]
Acid Propionic Succinic Malic Tartric Lactic Lactic Citric Extractant TOPO TOPO TBP TBP TBP DEHPA TBP Solvent n-hexan n-hexan n-dodecan n-dodecan n-dodecan dietilbenzen CCl4 T [C] 25 25 20 20 20 25 Parametrii din ecuaia (4.35) m Kex 59,0 1 152,0 2 0,11 2 0,04 2 0,26 38,0 1 0,04 3

Extracia reactiv a acizilor mono- i dicarboxilici cu TBP decurge 1 acid lactic cu randamente superioare extraciei 2 acid malic 3 acid citric acizilor minerali, n condiii 4 acid tartric experimentale identice [295]. La extracia acizilor carboxilici cu TBP coeficientul de distribuie scade, iniial rapid, cu creterea concentraiei acidului n faza apoas iniial (fig. 4.70). Efectul este mai pregnant la extracia cu soluii concentrate de TBP. Concentraia iniial a acidului carboxilic n faza apoas [mol/L] Utilizarea TBP prezint i o serie de dezavantaje, cum ar fi viscozitatea Figura 4.70. Distribuia acizilor carboxilici ntre ap i TBP nediluat n funcie de ridicat i tendina de hidroliz n concentraia iniial a acidului n faza apoas mediu acid la dibutilfosfat care este un la echilibru la 20 C [113] puternic agent complexant [4].
4.5.4.1.2. Extracia acizilor carboxilici cu amine
Coeficientul de distribuie, [HA]org/[HA]aq

n cazul extraciei cu amine, mecanismul extraciei depinde, printre altele, i de numrul gruprilor carboxilice din molecula acidului. La extracia acizilor monocarboxilici cu un extractant aminic Q, n sistem se stabilesc urmtoarele echilibre succesive [296]: - disocierea acidului carboxilic n faza apoas:
R COOH [ aq ] R COO[ ] + H [+ ] aq aq

(4.36)

extracia fizic a acidului carboxilic nedisociat:

145

Capitolul 4 Separarea prin extracie

R COOH[ aq ] -

R COOH[ org ]

(4.37)

extracia reactiv a acidului carboxilic prin formarea unui complex (o sare) cu amina la interfa:
R COO[ ] + H [+ ] + Q[ org ] aq aq R COOH Q[ org ] R COOH nQ[ org ]

(4.38) (4.39)

extracia reactiv cu formarea unor aduci aminici la interfa:

R COO[ ] + H [+ ] + nQ[ org ] aq aq

extracia reactiv cu formarea unor aduci acizi la interfa:

Q R COOH mR COOH [ org ] (4.40)

R COO[ ] + H [+ ] + Q[ org ] + mR-COOH [ org ] aq aq

dimerizarea srii n faza organic: 2 R COOH Q[ org ]

(R COOH )2 Q2[org ]

(4.41)

La extracia acizilor dicarboxilici au loc reacii similare, expresia general a echilibrului la interfa putndu-se scrie sub forma: mR(COOH )2[ aq ] + pQ[ org ] [R(COOH )2 ]m Q p[org ] (4.42) n funcie de raportul molar solut extractant se disting trei tipuri de reacii interfaciale prin care decurge extracia reactiv: - la valori m << p are loc formarea de sruri n faza organic: (4.43) R(COOH )2[ aq ] + 2Q[ org ] R(COOH )2 Q2[ org ] la valori m ~ p la formarea complexului hidrofob solutul i extractantul vor participa n proporie echimolecular: R(COOH )2[ aq ] + Q[ org ] R(COOH )2 Q[ org ] (4.44) la valori m >> p, exist posibilitatea apariiei celei de-a treia faze, o emulsie stabil, cu un coninut ridicat de compleci acizi, insolubili att n faza apoas, ct i n faza organic: mR(COOH )2[ aq ] + Q[ org ] [R(COOH )2 ]m Q[org ] (4.45)

n scopul separrii rapide a emulsiei create de apariia celei de a treia faze, n solventul organic se adaug un modificator de faz (alcool alifatic cu caten lung, uzual n sau i-decanol), component care mrete solubilitatea complexului n faza de extract. Dac solventul este nepolar, poate aciona el nsui ca modificator de faz [4]. n cazul acizilor policarboxilici sunt posibile aceleai reacii interfaciale ca i n cazul acizilor dicarboxilici. Dac structura acizilor este voluminoas, n faza organic se vor forma n special sruri de amoniu, prin legarea parial sau total a gruprilor carboxil de ctre extractani [4]. Regenerarea extractantului i eliberarea solutului se realizeaz prin tratarea fazei organice cu o soluie apoas bazic: NaOH, KOH, Na2CO3, K2CO3 etc. Utilizarea unor sruri cuaternare de amoniu poate conduce la modificarea mecanismului reaciei interfaciale, procesul decurgnd prin schimb ionic:
R COO[ ] + Q + Cl[ ] aq org R COO Q[+ ] + Cl[ ] org aq

(4.46)

146

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Procesul de extracie reactiv a acizilor carboxilici cu amine, respectiv gradul de extracie, este influenat de numeroi factori, cei mai importani fiind natura i concentraia extractantului, tipul diluantului, natura i concentraia iniial a acidului, temperatur, pH, precum i o serie de condiii de operare, cum ar fi durata i viteza agitrii, durata separrii fazelor, raportul fazic apos : organic etc. n cazul extraciei cu sruri cuaternare de amoniu gradul de extracie depinde i de dimensiunea anionului organic, care controleaz hidrofobicitatea complexului interfacial format. Coeficienii de distribuie ai acizilor carboxilici ntre faza apoas i faza organic cu coninut de amin depind de hidrofobicitatea acidului carboxilic, bazicitatea aminei, polaritatea solventului i concentraiei iniiale a acidului n faza apoas (tab. 4.20).
Tabelul 4.20. Coeficieni de distribuie (KN) ai unor acizi carboxilici la extracia cu amine n diferii solveni organici [4]
Extractant Amberlite LA-1 Amberlite LA-2 Adogen 283-D Adogen 381 Adogen 364 Adogen 368 Adogen 363 Alamine 366 Metil-ditridecil amina Acid acetic Solvent Chevron 25 cloroform Chevron 25 cloroform 2-heptanon cloroform 2-heptanon cloroform 2-heptanon cloroform 2-heptanon cloroform 2-heptanon cloroform 2-heptanon cloroform metil-i-amil ceton KN* 1,27 2,26 4,48 3,82 4,48 9,86 3,46 9,65 32,11 1,72 7,79 1,98 9,69 1,83 8,23 1,58 7,82 2,24 9,68 3,54 Extractant Acid citric Solvent n-hexan parafine + MIBC toluen acetat de etil MIBC 2-etilhexanol alcool i-amilic n-butanol toluen MIBC cloroform 2-etilhexanol KN* 0,2 2,9 0,63 9,6 1,4 10,8 2,5 23,0 3,1 27,5 2,1 70,0 2,7 87,8 3,1 168,3 0,55 6,0 4,8 34,0 17,7 136 31,7 177,0

Alamine 336

Tri-dodecilamin

* - intervalul de valori corespunde reducerii concentraiei iniiale a acidului n faza apoas

Modificarea valorilor coeficienilor de distribuie ai unor acizi carboxilici la extracia cu sruri cuaternare de amoniu este redat n fig. 4.71 i 4.72. Se poate constata c valoarea KN, deci i eficiena extraciei crete cu creterea numrului de atomi de carbon din molecula acidului, deci cu creterea hidrofobicitii acestuia, dar n mod paradoxal scade cu creterea pH-ului soluiei apoase. Acest lucru este pus pe seama modificrii mecanismului de extracie n prezena srii cuaternare de amoniu [297]. Exist numeroase cercetri care ncearc s elucideze multiplele aspecte ale extraciei reactive a acizilor carboxilici cu amine cu mas molecular mare. Majoritatea acestora sunt efectuate cu soluii sintetice de acizi carboxilici, avnd drept scop studierea fie a echilibrului n diverse sisteme, fie a cineticii extraciei reactive. Alte studii se ocup cu modelarea matematic a procesului, n vederea stabilirii unor modele utilizabile pentru optimizarea procesului sau pentru proiectarea echipamentelor de extracie.
147

Capitolul 4 Separarea prin extracie

11 10
Coeficientul de distribuie, KN

Acid acetic Acid propionic Acid butiric

9
Coeficientul de distribuie, KN Coeficient de distributie

8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 pH 6

Concentraia iniial a acidului propionic n faza apoas [mol.L-1]

Figura 4.71. Variaia coeficientului de distribuie al acidului propionic cu concentraia sa iniial n faza apoas [298]

Figura 4.72. Variaia coeficienilor de distribuie ai unor acizi carboxilici cu pH-ul fazei apoase la extracia cu TOMAC [299]

Punerea n practic la nivel industrial a proceselor de extracie reactiv se lovete de dou dificulti majore: (i) procesele de fermentare conduc la obinerea unui amestec de acizi carboxilici care trebuie separai; (ii) n lichidul de fermentaie, pe lng acizii carboxilici se gsesc i alte produse secundare, nutrieni neconsumai, care ngreuneaz procesul de extracie. n tab. 4.21 sunt prezentate comparativ rezultatele obinute la extracia reactiv a acidului lactic cu TOA n i-decanol din soluii sintetice, respectiv din lichid de fermentaie [300]. Se poate constata c n cazul lichidului de fermentaie, gradul de extracie a acidului lactic a fost de trei ori mai redus dect n cazul extraciei din soluii sintetice.
Tabelul 4.21. Rezultate ale extraciei acidului lactic cu TOA n i-decanol la 5 C [300]
Parametrul pH iniial pH la echilibru % Acid lactic n faza apoas iniial % Acid lactic n faza apoas la echilibru % Acid lactic n faza organic la echilibru Coeficient de distribuie, KN Randament de extracie, % soluii model 2,50 3,83 2,45 0,24 4,92 20,27 90,32 Extracie din: lichid de fermentaie 2,50 5,27 2,27 1,61 1,54 0,96 29,49

ntruct structura compuilor formai ntre acizii carboxilici i aminele utilizate ca extractani depinde att de numrul gruprilor carboxilice din molecula acidului, ct i de raportul molar acid/amin utilizat la extracie exist posibilitatea separrii selective a acizilor carboxilici prin extracie reactiv. Dac extracia decurge prin mecanismul formrii perechilor ionice, separarea acizilor carboxilici este posibil dac valorile constantelor de aciditate ale acesora difer cu cel puin un ordin de mrime (respectiv valoarea pKa difer cu cel puin o unitate) [301]. Valorile pKa pentru acizii carboxilici ntlnii n procesele fermentative sunt redate n tab. 4.22.
148

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Tabelul 4.22. Valorile constantelor de disociere, pKa, ale unor acizi carboxilici la 25 C [113]
Acidul Propionic (propanoic) Lactic (2-hidroxipropanoic) Piruvic (2-oxopropanoic) Succinic (butandioic) Fumaric (trans-butendioic) Maleic (cis-butendioic) Malic (hidroxi-butandioic) Itaconic (2-metilen-butandioic) Tartric (2,3-dihidroxi-butandioic) Citric (2-hidroxipropan-1:2:3tricarboxilic) Izocitric (1-hidroxipropan-1:2:3tricarboxilic) Structur CH3-CH2-COOH CH3-CH(OH)-COOH CH3-CO-COOH HOOC-CH2-CH2-COOH HOOC-CH=CH-COOH HOOC-CH=CH-COOH HOOC-CH2-CH(OH)-COOH HOOC-CH2-(C=CH2)-COOH HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH HOOC-CH2-(C(OH)-COOH)-CH2-COOH HOOC-CH2-(CH-COOH)-CH(OH)-COOH pKa 4,85 3,86 2,49 4,20 ; 5,64 3,02 ; 4,38 1,93 ; 6,14 3,22 ; 4,70 3,65 ; 5,13 3,01 ; 4,38 3,13 ; 4,76 ; 6,40 3,29 ; 4,71 ; 6,40

La fermentaia citric, pe lng acidul citric aflat n concentraie de aproximativ 50 g/L, n lichidul de fermentaie mai exist i acizii dicarboxilici malic i succinic (circa 4 g/L). La extracia cu Amberlite LA-2 n acetat de butil, reacia (4.39) duce la formarea unor aduci de tip R(COOH)2.Q2 n cazul acizilor succinic i malic, respectiv R(COOH)3.Q n cazul acidului citric. Dac extractantul este deficitar stoichiometric faa de coninutul total de acizi din lichidul de fermentaie (raport molar acizi dicarboxilici : extractant = 1), gradul de extracie al acizilor malic i succinic este de 95%, n timp ce gradul de extracie al acidului citric este de numai 4%. Adugarea 2-octanolului ca modificator de faz mrete i mai mult diferena dintre gradele de extracie ale celor dou grupe de acizi [4]. ncercri similare, pe soluii sintetice de acid tartric (5 g/L), malic (2g/L) i citric (0,25 g/L), tot cu Amberlite LA-2 ca extractant i acetat de butil ca solvent, s-a reuit separare selectiv a acidului tartric de ceilali acizi carboxilici (fig. 4.73). Metoda poate fi aplicat pentru recuperarea acidului tartric din produsele secundare rezultate n procesul de vinificaie [302].
Acid tartric Acid malic i citric Selectivitate

Eficiena extraciei [%] Concentraie extractant [g/L] a b Figura 4.73. Variaia gradului de extracie (a) i a selectivitii (b) la extracia acizilor carboxilici cu Amberlite LA-2 n acetat de butil [303] 0 5 10 30 50 Concentraie extractant [g/L]

149

Capitolul 4 Separarea prin extracie

La obinerea acidului lactic prin fermentare, n mediul de cultur se pot aduga o serie de acizi organici, cu scopul creterii productivitii tulpinii. Aceti acizi (citric, acetic) trebuie separai de acidul lactic din lichidul final de fermentaie. A fost studiat extracia reactiv selectiv a acizilor acetic i lactic cu un extractani fosfinoxidici i aminici comerciali (Cyanex 923, respectiv Hostarex A 327) n acetat de butil i kerosen. Acidul citric a fost extras doar ntr-o proporie redus (55% cu Cyanex 923, 75% cu Hostarex A 327). Reextracia s-a realizat cu HCl, procesul fiind selectiv pentru acidul lactic. Randamentul global de separare al acidului lactic a fost modest: 22% cu Cyanex 923, respectiv 37% cu Hostarex A 327 [304]. Extracia selectiv a acidului succinic din lichidul de fermentaie care Acid succinic Acid piruvic conine i ali acizi carboxilici se poate Acid acetic realiza cu eficien i selectivitate ridicat folosind ca extractant TOA. Aceasta extrage cu precdere acizii acetic, piruvic i srurile acesora [305, 306]. Recent a fost pus la punct un procedeu de recuperare a acidului succinic produs de un microorganism recombinant, Mannheimia succiniciproducens, prin pH extracie reactiv, distilare la vid i Figura 4.74. Efectul pH-ului asupra cristalizare. Procedeul permite obinerea coeficientului de distribuie al acizilor de acid succinic 99,76% puritate cu un carboxilici [308] randament global de 73,09% [307]. (extractant: 0,25 mol/kg TOA n 1-octanol la 25 C; Separarea impurificatorilor (acid acetic, concentraia iniial a acizilor n lichidul de acid piruvic) se realizeaz prin extracie fermentaie: acid succinic 22,3 g/L; acid piruvic n mai multe etape cu TOA (0,25 mol/kg) 7,0 g/L, acid acetic 1,8 g/L) n 1-octanol la pH = 5, cnd coeficientul de distribuie al acidului succinic este sub 0,1 (fig. 4.74). n tab. 4.23 este prezentat compoziia fazei lichide n diverse etape ale procesului de extracie.
Coeficient de distribuie, KN

Tabelul 4.23. Evoluia compoziiei fazei lichide n procesul de extracie [308]

Dup etapa de extracie Lichidul de fermentaie 1 2 3 Acid succinic 32,2 34,8 35,2 35,6 Acid maleic 2,3 0,3 0,3 0,3 Acid acetic 2,6 1,6 1,4 1,1 Acid piruvic 10,1 8,0 7,1 6,6 Acid fumaric 1,2 0,1 0,1 0,1 Glucoz 49,4 53,6 54,3 54,9 Alte componente 2,2 1,7 1,6 1,4 Total SU 100,00 100,00 100,00 100,00 Not: Compoziia exte exprimat n procente masice de component raportat la total substan uscat (SU) Component

Dei exist numeroase eforturi pentru dezvoltarea tehnologiilor de extracie reactiv a acizilor carboxilici, fiind patentate zeci de variante, la scar industrial este cert aplicarea unui singur procedeu, extracia acidului citric cu o amin teriar, urmat de reextracie cu ap la temperatur ridicat [309]. 150

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII 4.5.4.2. Extracia aminoacizilor

Aminoacizii, care sunt componenii structurali de baz ai proteinelor i enzimelor, se pot obine prin biosintez sau prin hidroliza proteinelor. Ca i n cazul altor produse de biosintez, problema dificil o reprezint separarea aminoacizilor din lichidul de fermentaie sau din hidrolizatul proteic. Cei 20 de aminoacizi eseniali, care se gsesc n proteinele naturale, pot fi clasificai n funcie de polaritatea radicalului R pe care sunt grefate gruprile amino i carboxil n aminoacizi: (i) cu radical R alifatic nepolar; (ii) cu radical R aromatic; (iii) cu radical R polar, neutru electric; (iv) cu radical R polar, ncrcat pozitiv; (v) cu radical R polar, ncrcat negativ. n tab. 4.24 sunt prezentate cteva dintre proprietile aminoacizilor eseniali [310]. Tabelul 4.24. Clasificarea i unele proprieti ale aminoacizilor eseniali [310]
Aminoacid Abreviere Simbol Valori pKa pK1 pK2 (COOH) (NH3+) pKR (R) pI Indice hidro* patic

(i) Cu radical R alifatic nepolar Glicin Gly G 2,34 9,0 5,97 -0,4 Alanin Ala A 2,34 9,69 6,01 1,8 Prolin Pro P 1,99 10,96 6,48 1,6 Valin Val V 2,32 9,62 5,97 4,2 Leucin Leu L 2,36 9,60 5,98 3,8 Izoleucin Ile I 2,36 9,68 6,02 4,5 Metionin Met M 2,28 9,21 5,74 1,9 (ii) Cu radical R aromatic Fenilalanin Phe F 1,83 9,13 5,48 2,8 Tirozin Tyr Y 2,20 9,11 10,07 5,66 -1,3 Triptofan Trp W 2,38 9,39 5,89 -0,9 (iii) Cu radical R polar, neutru electric Serin Ser S 2,21 9,15 5,68 -0,8 Treonin Thr T 2,11 9,62 5,87 -0,7 Cistein Cys C 1,96 10,28 8,18 5,07 2,5 Asparagin Asn N 2,02 8,80 5,41 -3,5 Glutamin Gln Q 2,17 9,13 5,65 -3,5 (iv) Cu radical R polar, ncrcat pozitiv Lizin Lys K 2,18 8,95 10,53 9,74 -3,9 Histidin His H 1,82 9,17 6,00 7,59 -3,2 Arginin Arg R 2,17 9,04 12,48 10,76 -4,5 (v) Cu radical R polar, ncrcat negativ Aspartat Asp D 1,88 9,60 3,65 2,77 -3,5 Glutamat Glu E 2,19 9,67 4,25 3,22 -3,5 * - pe o scal care combin hidrofobicitatea i hidrofilicitatea gruprilor R; poate fi utilizat pentru msurarea tendinei unui aminoacid de a trece ntr-un mediu apos (valori negative) sau unul hidrofob (valori pozitive)

Datorit structurii lor amfionice, aminoacizii se gsesc n soluie apoas sub diferite forme ionice (cation, amfion, anion), n funcie de valoarea pH-ului (fig. 4.75). Extracia acestor compui nu poate fi realizat dect prin utilizarea unor extractani, cei 151

Capitolul 4 Separarea prin extracie mai utilizai fiind derivaii acizilor organofosforici [311], aminele cu mas molecular mare [92, 301], eterii-coroan [312 - 314].
R CH COOH NH+ 3 cation R CH COONH+ 3 amfion R CH COONH2 anion

pH

Figura 4.75. Structuri ionice ale aminoacizilor n funcie de pH-ul soluiei apoase
4.5.4.2.1. Extracia aminoacizilor cu derivai organofosforici

La extracia aminoacizilor cu D2EHPA, n sistem se stabilete urmtorul echilibru interfacial, extracia decurgnd prin schimb ionic [311]: R CH (COOH ) NH 3+ [ aq ] + HX [ org ] R CH (COOH ) NH 3+ X [ org ] + H + [ aq ] (4.47) Dac aminoacidul este bazic, la valori pH sczute el exist ca dianion, astfel nct echilibrul de extracie se poate scrie: R + CH (COOH ) NH 3+ [ aq ] + 2 HX [ org ] [ R + CH (COOH ) NH 3+ ] [ X ]2[ org ] + 2 H + [ aq ] (4.48)

Separarea aminoacizilor cu D2EHPA este posibil doar dac acetia se gsesc n faza apoas n form cationic. Acest lucru este posibil doar la valori pH mai mici dect valoarea pH-ului izoelectric. O valoare prea mic a pH-ului conduce ns la protonarea extractantului, acesta nemaiputnd lega cationul aminoacidului. Ca urmare, va exista un domeniu optim de pH pentru extracia aminoacizilor. Acest domeniu, n care gradul de extracie este maxim, este redat, pentru civa aminoacizi, n diagramele din fig. 4.76. n afar de valoarea pH-ului, extracia aminoacizilor este influenat i de concentraia extractantului, a substanelor tensioactive existente n sistem, de intensitatea amestecrii etc. Att n cazul biosintezei, ct i n cazul hidrolizei proteinelor, se obin amestecuri de aminoacizi, a cror separare este mai dificil. La biosinteza fenilalaninei se formeaz i triptofan, a crui comportare este similar cu cea a fenilalaninei. Prezena triptofanului n masa de reacie determin reducerea coeficientului de distribuie al fenilalaninei, comparativ cu extracia din sisteme pure [4]. Cercetri experimentale au artat c separarea selectiv a aminoacizilor din amestecuri, este posibil doar pentru grupe de aminoacizi. Se pot separa aminoacizii n funcie de aciditatea acestora, prin extracie cu D2EHPA, la diverse valori ale pH-ului fazei apoase (fig.4.77). ntruct gradul de extracie ntr-o singur treapt este redus, este necesar utilizarea mai multor trepte de extracie (tab. 4.25). n procesele de fabricare industrial a aminoacizilor, extracia reactiv nu s-a impus deocamdat. Sunt folosite cu precdere procesele de separare bazate pe schimb ionic (cromatografie de schimb ionic, cromatografie de excluziune) urmate de cristalizare [315]. 152

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Grad de extracie [% masice]

Glicin

Alanin

Triptofan

Arginin

Lizin

Histidin

Cistein

Acid aspartic

Acid glutamic

pH faz apoas
Figura 4.76. Efectul valorii pH-ului soluiei apoase asupra gradului de extracie al aminoacizilor cu D2EHPA n acetat de butil [316] Tabelul 4.25. Condiii de separare selectiv a unor grupe de aminoacizi din amestec prin extracie reactiv cu D2EHPA n acetat de butil [316]
Grupa de aminoacizi extrai Interval de pH Aminoacizi neutri* 5,0 5,5 Aminoacizi bazici** 4,0 4,5 Histidin 3,0 3,5 Aminoacizi acizi 2,0 2,5 * - fr cistein; ** - cu cistein, fr histidin Grad de extracie ntr-o treapt [% masice] 20 25 18 25 40 60 63 Numr de trepte necesar 9 10 5 3

153

Capitolul 4 Separarea prin extracie

SOLUIE DE AMINOACIZI

Acetat de butil + D2EHPA

Extracie reactiv pH = 5,0 5,5

Aminoacizi neutri: Gly, Ala, Trp

Acetat de butil + D2EHPA

Extracie reactiv pH = 4,0 4,5

Aminoacizi bazici: Arg, Lys + Cys

Acetat de butil + D2EHPA

Extracie reactiv pH = 3,0 3,5

Histidin

Acetat de butil + D2EHPA

Extracie reactiv pH = 2,0 2,5

Aminoacizi acizi: Asp, Glu

Figura 4.77. Schem de principiu pentru extracia selectiv a aminoacizilor dintr-un amestec cu D2EHPA n acetat de butil [316] Pentru o serie de extractani acizi dizolvai n toluen, capacitatea de extracie scade n ordinea: arginin > fenilalanin > alanin > glicin > acid aspartic cu observaia c la valori pH sczute, la extracia cu D2EHPA i D2EHPA(S) se inverseaz ordinea nre arginin i fenilalanin. Capacitatea de extracie a extractanilor scade n ordinea: DNNSA1 > D2EHPA(S) > D2EHPA > Versatic 10 adic n ordinea invers a valorilor constantelor lor de disociere, pKa [317].
4.5.4.2.2. Extracia aminoacizilor cu amine

n cazul extraciei cu amine, la interfa se formeaz perechi ionice hidrofobe, ntre aminoacidul protonat, un anion din faza apoas i extractantul din faza organic:
R CH ( NH 3+ ) COOH [ aq ] + A[ aq ] + Q[ org ] R CH ( NH 3+ A ) COOH Q[ org ] (4.49)

Pentru ca aminoacidul s fie protonat, trebuie ca pH-ul fazei apoase s fie mai mic dect pH-ul punctului izoelectric (pI) al aminoacidului respectiv. Reextracia aminoacidului i regenerarea aminei se realizeaz prin tratarea fazei organice cu o soluie de carbonat de sodiu.
1

154

DNNSA acid dinonilnaftalensulfonic; D2EHPA(S) acid di(2-etilhexil)monotiofosforic; D2EHPA acid di(2-etilhexil)fosforic; Versatic 10 acid neodecanoic, R1R2CH3COOH

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Cnd extracia are loc cu sruri de amoniu, aminoacidul trebuie s se gseasc sub form anionic. Acest lucru se ntmpl atunci cnd pH-ul fazei apoase este mai mare dect pH-ul punctului izoelectric (pI) al aminoacidului respectiv. n aceste condiii, n sistem se stabilesc urmtoarele echilibre: - disocierea aminoacidului n faza apoas:
R CH ( NH 2 ) COOH [ aq ] + HO [ aq ] H 2O + R CH ( NH 2 ) COO [ aq ] (4.50)

extracia reactiv a anionului aminoacidului printr-o reacie de schimb ionic la interfa:

R CH ( NH 2 ) COO Q + [ org ] + X [ aq ] (4.51)

R CH ( NH 2 ) COO [ aq ] + QX [ org ]

coextracia anionului OH- sau a altui anion mineral (clorur, sulfat, fosfat etc.) prezent n soluia apoas:
HO [ aq ] + QX [ org ] M n [ aq ] + nQX [ org ] Q + HO [ org ] + X [ aq ]
+ Qn M n [ org ] + X [ aq ]

(4.52) (4.53)

Reextracia aminoacidului se realizeaz prin tratarea fazei organice cu o soluie apoas de acid clorhidric. Concentraia ionilor de hidrogen din faza apoas este hotrtoare pentru eficiena extraciei, aceasta determinnd forma ionic a aminoacidului. Astfel, acidul glutamic (pI = 3,22) poate fi extras cu amina secundar Amberlite LA-2 doar la pH < 3,22, n timp ce acidul aspartic (pI = 2,77) poate fi extras cu o sare cuaternar de amoniu doar la pH > 2,77. Se poate constata faptul c la pH = pI extracia aminoacizilor cu amine sau sruri cuaternare de amoniu nu este posibil (fig. 4.78). La extracia aminoacizilor cu sruri 100 sare cuaternara de amoniu cuaternare de amoniu, la valori ridicate ale 90 pH-ului fazei apoase, este posibil extracia n amina 80 paralel a anionilor existeni n lichidul de 70 fermentaie (sulfat, fosfat, carbonat), lucru 60 care poate duce la reducerea eficienei extraciei. Chiar dac aceti anioni sunt 50 ndeprtai din lichidul de fermentaie anterior 40 extraciei, coextracia ionului OH- nu poate fi 30 evitat. 20 Pentru separarea aminoacizilor sau a 10 pI = 6 srurilor acestora din lichidul de fermentaie 0 se pot utiliza extractani acido-bazici cuplai, 0 2 4 6 8 10 12 14 pH aa-numiii extractani ABC, alctuii dintr-un schimbtor de cationi lichid (uzual un derivat Figura 4.78. Influena pH-ului fazei organic al acidului fosforic) i un schimbtor apoase asupra gradului de extracie de anioni lichid (o amin cu mas molecular al aminoacizilor mare), care acioneaz simultan. Aceti ageni de extracie, utilizai iniial pentru recuperarea unor sruri minerale (MgCl2, ZnSO4, LiCl etc.) din soluii apoase [318, 319], au fost propui ulterior i pentru recuperarea acizilor minerali tari [320] i a acizilor carboxilici [321].
Grad de extractie [%]

155

Capitolul 4 Separarea prin extracie De exemplu, valina se poate extrage dintr-o soluie apoas avnd iniial 70 g/L aminoacid folosind ca extractant ABC un amestec coninnd 0,5 mol/L Alamin 336, 0,5 mol/L D2EHPA i 30% octanol ntr-un solvent organic. Extracia se realizeaz la temperatura ambiant, cu un raport [aq] : [org] = 5 : 1. Dup 7 trepte de extracie, gradul de recuperare al valinei este de peste 90%, obinndu-se un extract organic cu 13,1 g/L valin. De aici aminoacidul se reextrage cu ap, la temperatur ambiant, folosind un raport [aq] : [org] = 1 : 2,3. Dup 5 trepte de extracie, aminoacidul se extrage practic cantitativ, rezultnd o soluie apoas cu 30 g/L valin. n mod similar se pot extrage i ali aminoacizi, dar i sruri ale acestora, cum ar fi clorhidratul de lizin sau monoglutamatul de sodiu [322].
4.5.4.2.3. Extracia aminoacizilor cu eteri-coroan i calixarene

Eterii-coroan pot extrage aminoacizii din soluii apoase acide (pH < pI), n care acetia se gsesc sub form cationic. Procesul de extracie are loc prin mecanismul perechilor ionice [cationul aminoacidului se cupleaz cu un contraion (A-)] n conformitate cu urmtorul mecanism [4]: - transferul extractantului (eterul-coroan CR) n faza apoas: (4.54) CR[ org ] CR[ aq ]

reacia extractantului cu cationul aminoacidului, n faza apoas: R CH (COOH ) NH 3+ [ aq ] + CR[ aq ] R CH (COOH ) NH 3+ CR[ aq ] (4.55)
R CH (COOH ) NH 3+ A CR[ aq ] (4.56) R CH (COOH ) NH 3+ A CR[ org ]

reacia complexului cationic cu contraionul, n faza apoas: transferul perechii ionice complex cationic contraion n faza organic:
R CH (COOH ) NH 3+ A CR[ aq ]

R CH (COOH ) NH 3+ CR[ aq ] + A[ aq ]

(4.57)

Acidul HA care trebuie s furnizeze contraionul A- este ales astfel nct valoarea pKa s fie apropiat de cea a aminoacidului. Procesul global de extracie poate fi descris de ecuaia: R CH (COOH ) NH 3+ [ aq ] + CR[ org ] + A[ aq ] R CH (COOH ) NH 3+ A CR[ org ] constanta de extracie fiind dat de expresia: K ex = (4.58)

[R CH (COOH ) NH ] [A ] [CR ]
+ 3 [ aq ] [ aq ] [ org ]

[R CH (COOH ) NH

+ 3

A CR[ org ]

(4.59)

Pentru extracia unor aminoacizi cu eter 18-coroan-6 n 1,2-dicloretan, valorile Kex sunt redate n tab. 4.26. Compoziia molar a complexului extras este de 1 : 1 : 1 (cation : extractant : anion). Constanta de extracie depinde de masa molecular a aminoacidului (cu ct acesta este mai hidrofob, cu att Kex este mai mare); dependena nu este suficient de puternic pentru a realiza separarea selectiv a aminoacizilor. O separare selectiv se poate realiza prin modificarea pH-ului fazei apoase.
156

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Tabelul 4.26. Constantele de extracie ale unor aminoacizi cu eter 18-coroan-6 n 1,2-dicloretan [4]
Aminoacid D,L triptofan L leucin L fenilalanin L metionin lg Kex 5,01 5,78 5,12 4,62 Aminoacid L-izoleucin L valin L -alanin L cistein lg Kex 4,90 4,34 4,34 3,24

Tot din soluii apoase acide se pot extrage la temperatura camerei la pH = 1,5 4,0 triptofanul, glicina, alanina, leucina, iar la pH = 1,5 5,5 lizina i arginina, folosind ca extractant eterul diciclohexil-18-coroan-6 dizolvat ntr-un lichid ionic, BmimPF6 (hexafluorofosfat de 1-butil-3-metilimidazoliu). Eficiena extraciei este de 92 96%, att pentru aminoacizii hidrofili, ct i pentru cei mai puini hidrofili. Raportul molar ntre aminoacid i eterul-coroan n complexul format este de 1:1 n cazul aminoacizilor monocarboxilici i de 1:2 n cazul aminoacizilor dicarboxilici. Procesul este influenat de Ph, concentraia aminoacizilor, concentraia eterului-coroan, precum i de raportul fazic [aq]:[org]. Sistemul de extracie a fost testat cu succes i pentru recuperarea aminoacizilor din lichidul de fermentaie [323]. Pentru separarea unor produse de biosintez au fost sintetizai extractani din clasa polisiloxanilor pe care au fost grefai eteri-coroan. Aceti derivai au fost utilizai pentru extracia selectiv a compuilor care conin grupri aminice protonate, din amestecuri de amine secundare i teriare (separarea norcodeinei) [4]. Derivaii guanidinici biciclici cu grupare puternic hidrofob silil-eter, pe care se grefeaz eteri-triaza-coroan, dizolvai n diclor metan prezint o capacitate sporit de complexare i extracie pentru fenilalanin, triptofan, leucin i glicin, permind separarea acestora de serin, lizin i acid glutamic (fig. 4.79) [324].
100 Grad de extractie [%] 80 60 40 20 0 Phe Trp Leu 18.6 9.8 2.6 64.4 41.6 44.6 22.5 0.25 Gly Aminoacizi 0.1 0.9 Ser 0.1 0.2 Lys 0.1 0.1 Glu 1 2

Figura 4.79. Extracia aminoacizilor cu derivai guanidinici [324] 157

Capitolul 4 Separarea prin extracie

Tot pentru extracia aminoacizilor nepolari au fost sintetizai extractani alctuii din dou subuniti: una pe baz de eter-coroan pentru legarea ionului amoniu, alta pe baz de derivat de uree, pentru legarea gruprii carboxil (fig. 4.80 a). Un astfel de extractant dizolvat n cloroform extrage aminoacizii nepolari n ordinea: Phe > Ile > Leu > Val > Ala extracia aminoacizilor polari (Ser, Asp, His, Tyr) fiind practic neglijabil n acest sistem [325].

N H N H

N+ PF6

Figura 4.80. Extractani sinergetici pentru aminoacizi nepolari: a pe baz de eter-coroan i derivat de uree [325]; b pe baz de eter-coroan i porfirinai de lantanide [326]

Extractani similari (fig. 4.80 b 1,2,3) au fost obinui i din porfirinai ai lantanidelor (fig. 4.80 b 4,5,6) grefai pe derivai de eteri benzo-18-coroan-6 (fig. 4.80 b 7). Acetia dizolvai n diclormetan pot extrage aminoacizii din soluii apoase neutre cu o eficien dubl fa de derivatul porfirinic simplu sau fa de amestecul fizic derivat porfirinic eter-coroan (fig. 4.81). Studii recente au artat c derivaii calixarenelor sunt extractani selectivi pentru aminoacizi i derivaii acestora. ntre cationul amoniu al aminoacidului i atomii de oxigen ai moleculei gazd se realizeaz un complex 1:1 care trece apoi uor n faza organic. Includerea moleculei oaspete de aminoacid n cavitatea calixarenei provoac asimetrizarea moleculei gazd. Pentru extracia unui ester al triptofanului s-a utilizat un derivat carboxilic al unei calix[6]arene, reextracia realizndu-se ntr-o soluie apoas acid [327]. Calix[6]arenele au o capacitate de extracie superioar derivailor
158

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

organofosforici, cum ar fi D2EHPA, aceasta depinznd de structura calixarenei i de diametrul cavitii acesteia, de numrul gruprilor carboxilice i de natura radicalului alchilic. Proprietile moleculei oaspete, hidrofobicitatea n mod special, influeneaz de asemenea procesul de extracie [328]. Calix[4]arenele i p-ter-butil-calix[4]arenele substituite cu fenil-etil-amin au proprieti extractante pentru esterii metilici ai unor -aminoacizi, ct i pentru unele -amine chirale [329].

Figura 4.81. Extracia aminoacizilor cu extractani sinergetici eter-coroan porfirinat de lantanide [326]
Condiii de lucru: faza apoas = 125 nmol aminoacid n 2,5 mL ap (pH = 5,9 6,2); faza organic = 125 nmol extractant n 10 mL CH2Cl2

4.5.4.3.

Extracia antibioticelor
100

Aa cum s-a precizat n paragraful 4.1.3.1., separarea penicilinelor de biosintez din lichidul de fermentaie se realizeaz prin extracie fizic cu acetat de butil. Datorit polaritii reduse a solventului, penicilina trebuie s se gseasc n stare nedisociat, pentru ca Extractie fizica gradul de extracie s fie maxim. Acest peniciline G si V lucru se ntmpl la pH < 2, valoare la Extractie reactiva penicilina G care viteza de inactivare a penicilinelor Extractie reactiva este foarte ridicat. n aceste condiii, penicilina V extracia reactiv apare ca o soluie fiabil pH de separare a penicilinelor i a antibioticelor -lactamice n general. La Figura 4.82. Influena valorii pH-ului fazei extracia cu Amberlite LA-2, gradul de apoase asupra gradului de extracie al extracie al penicilinelor G i V este de 97 penicilinelor [4]
80

Grad de extractie [%]

Grad de extractie [%]

60

40

20

159

Capitolul 4 Separarea prin extracie

98% chiar i la valori pH = 5 n faza apoas (fig. 4.82). La acest pH, timpul de semiinactivare a penicilinei G este de 92 ore, pericolul degradrii chimice fiind practic ndeprtat [4]. La extracia reactiv, la interfa, se stabilete urmtorul echilibru ntre penicilina din faza apoas i amina din faza organic:
P COO [ aq ] + H + [ aq ] + A[ org ] P COOH A[ org ]

(4.60)

Din cauza structurii voluminoase pe care o au att penicilinele, ct i extractantul, n complexul rezultat n urma reaciei (4.60) ele se vor gsi n raport molar de 1:1 [4]. Extracia reactiv a penicilinelor cu amine este influenat de valoarea pH-ului fazei apoase iniiale, concentraia iniial a extractantului, concentraia iniial a antibioticului, timpul de contact, raportul volumic [aq]:[org]. Gradul de extracie depinde puternic de structura antibioticului extras, n special datorit solubilitii acestuia, aa cum reiese din tab. 4.27.
Tabelul 4.27. Gradul de extracie al unor antibiotice -lactamice la extracia reactiv cu TOA n cloroform [33]
Antibiotic Benzilpenicilina Cloxacilina Dicloxacilina Ampicilina Meticilina Carbenicilina Amoxicilina Epicilina Bayercilina Fenoximetilpenicilina Clometacilina Oxacilina Gradul de extracie [%] 0,01 mol/L TOA 0,1 mol/L TOA 92,0 92,1 96,8 96,2 98,9 99,1 23,1 71,3 94,6 98,5 84,4 66,8 0,5 1,4 22,4 66,8 98,3 97,6 98,4 98,3 97,8 98,8 99,0 100

Reextracia se realizeaz n soluii apoase de carbonat sau fosfat de sodiu sau potasiu. La reextracia cu carbonat de sodiu, de ex., are loc urmtorul proces:
2 P COOH A[ org ] + Na2CO3[ aq ] 2 P COO Na + [ aq ] + A[ org ] + CO2 + H 2O (4.61)

n general, reextracia decurge cu randamente mari i fr degradare antibioticelor la pH neutru. La reextracia penicilinei G, la valori pH = 7,2 7,5, pierderile totale de antibiotic, att n etapa de extracie reactiv cu Amberlite LA-2, ct i n etapa de reextracie, nu au depit 0,3% [331, 332]. Un agent de extracie mai performant s-a dovedit a fi DITDA (di-izo-tridecilamina) n butanol; gradul de extracie al penicilinei G este de 95% (la pH = 5), iar gradul de reextracie (la pH = 8,5) este aproape 100%. n plus, DITDA este de 20 de ori mai ieftin dect Amberlite LA-2 [301]. ntruct aceti extractani aminici sunt toxici pentru celule, ei nu pot fi utilizai pentru extracia in situ. La extracia reactiv a antibioticelor cu sruri cuaternare de amoniu, are loc la interfa o reacie de schimb ionic:
+ NR4 Cl [ org ] + P COO [ aq ] + P COO NR4[ org ] + Cl [ aq ]

(4.62)

160

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Reextracia se poate realiza cu o soluie apoas de acid clorhidric:
+ P COO NR4 [ org ] + HCl[ aq ] + P COO [ aq ] + H [+ ] + NR4 Cl[ ] aq org

(4.63)

n medii neutre, echilibrul reaciei (4.62) este independent de pH. Aceast independen de pH are i o serie de inconveniente; dac valoarea constantei de echilibru este mare, reextracia decurge dificil, ea neputnd fi mbuntit prin modificarea pH-ului, ci numai printr-o reacie care s ndeprteze ionul P-COO- din sistem [301]. La extracia cu TOMAC n kerosen a mai multor antibiotice (teicoplanin, rifampicin, chitasamicin, penicilin G) s-a constatat c gradul de extracie crete cu creterea pH-ului (la pH > pK) i c viteza extraciei este cu circa dou ordine de mrime mai mare dect viteza procesului de reextracie, n ambele cazuri determinant de vitez fiind difuziunea prin faza organic. La concentraii mari de antibiotic sau de extractant, determinant de vitez devine reacia care decurge la interfa [333]. La extracia antibioticelor din clasa cefalosporinelor cu Aliquat 336 n diveri solveni s-a constatat c valorile constantei de echilibru ale reaciei (4.62) se coreleaz bine cu hidrofobicitatea antibioticelor i cu dipol-momentul solvenilor. Constanta de echilibru a reaciei de reextracie a cefalosporinelor (4.63) este mai mare dect valorile aceleiai constante pentru co-extracia ionilor tampon, existnd astfel posibilitatea separrii selective a antibioticelor [334]. Cefalosporina C poate fi extras cu clorur de tri-n-octilamoniu n acetat de butil. Pentru a evita descompunerea antibioticului, reextracia se realizeaz cu o soluie tampon de carbonat [335]. Srurile cuaternare de amoniu sunt extractani mai eficieni pentru antibiotice dect aminele secundare sau teriare. La extracia unor compui cu structur tiazolidin-lactamic (acid olivanic, acid clavulanic, penicilin V, amoxicilin, acid fenoxiacetic), eficiena extraciei crete n ordinea extractanilor: Amberlite LA-2 clorhidrat < Alamine 336 clorhidrat << Aliquat 336 i n ordinea solvenilor: 1-butanol < tributilfosfat < hexan < dietileter < diclormetan < acetat de butil Cel mai eficient sistem de extracie este format din Aliquat 336 n acetat de butil, gradul de extracie realizat fiind de peste 98,6 % [336]. Acest sistem de extracie s-a dovedit a fi foarte performant i pentru extracia acidului 6-aminopenicilanic, compus care reprezint nucleul activ al tuturor penicilinelor substituite [337, 338]. O sare cuaternar de amoniu cu comportare aparte este sulfatul acid de tetrabutilamoniu (TBAHSO4). Acest extractant este solubil n faza apoas, echilibrul extraciei reactive stabilindu-se n aceast faz: TBA+ [ aq ] + P COO [ aq ] P COO TBA+[ org ] (4.64) Utiliznd TBAHSO4 exist posibilitatea separrii penicilinei V de acidul fenoxiacetic, un precursor al biosintezei acesteia (fig. 4.83), sau a altor antibiotice dintr-un amestec. Gradul de extracie al penicilinei V cu TBAHSO4 variaz foarte mult cu natura solventului (fig. 4.84).

161

Capitolul 4 Separarea prin extracie

100

80 70 60

cu extractant fara extractant

90

81.6
80 70

76.7

77.7

Grad de extractie [%]

50 40 30 20 10

Grad de extractie [%]

60 50 40

33
30 20 10

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 Hexan Acetat de amil 1-octanol Diclormetan

pH

Figura 4.83. Influena pH-ului fazei apoase asupra gradului de extracie a acidului fenoxiacetic cu TBAHSO4 n diclormetan [336] 4.5.4.4.

Figura 4.84. Influena solventului asupra gradului de extraie a penicilinei V cu TBAHSO4 [336]

Alte aplicaii ale extraciei reactive

Dei deocamdat fr aplicaii la nivel industrial, n literatura de specialitate sunt semnalate i alte aplicaii ale extraciei reactive pentru separarea unor compui naturali sau obinui prin biosintez. De asemenea, extracia reactiv poate fi utilizat pentru ndeprtarea din ap a unor poluani, cum ar fi, de exemplu, fenolii.
4.5.4.4.1. Extracia acizilor organici din produse naturale

Acidul gluconic se gsete n fructe, miere i vin, fiind utilizat ca aditiv alimentar i regulator de aciditate. n soluie apoas se afl n echilibru cu un ester ciclic, D-glucono--lactona (fig. 4.85).

acid gluconic

D-glucono--lactona

Figura 4.85. Echilibrul acid gluconic glucono -lactona n faz apoas [339] 162

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Este un agent chelatizant puternic n mediu alcalin, n special pentru Ca2+, Fe3+, Al3+, Cu2+; pe baza acestei proprieti este utilizat ca ingredient n produsele de curire, pentru ndeprtarea depunerilor anorganice [339]. La extracia acidului gluconic din soluii apoase cu Alamine 336 n diferii solveni, s-a constatat c gradul de extracie crete cu creterea concentraiei iniiale a aminei n faza organic, iar eficiena solvenilor crete n ordinea: ciclohexan < hexan < toluen < propanol < metil-izobutil-ceton Extracia are loc prin mecanismul formrii perechilor de ioni, polaritatea solventului favoriznd solvatarea complexului n faza organic [340]. Acidul cinamic este un compus natural derivat din fenilalanin, care se gsete n scorioar, rina arborelui Liquidambar, balsamul de Peru, storax, untul de shea (Vittelaria paradoxa) etc. [341]. Poate fi obinut prin extracie din produse vegetale, prin sintez chimic sau prin biosintez [342, 343]. Este utilizat n obinerea aromatizanilor, a indigoului sintetic i a anumitor produse farmaceutice. Principala sa utilizare este ns n parfumerie, unde este folosit sub form de esteri (metilic, etilic, benzilic) [343]. Dintre izomeri, izomerul trans (fig. 4.86) este cel care se ntlnete frecvent i care are cea mai ridicat activitate biologic.
100

durata extraciei = 60 secunde

Extraction degree, % Gradul de extracie [%]

80 60 40 20 0

10

20

30

40

50

60

70

-1 Concentraia extractantului Amberlite LA-2 [g/L] Concentration of Amberlite LA-2, g l

Figura 4.86. Structura acidului trans-cinamic

Figura 4.87. Influena concentraiei extractantului asupra gradului de extracie a acidului cinamic [342]

Din soluii apoase, acidul cinamic poate fi extras cu Amberlite LA-2 n n-heptan, un solvent care nu este toxic pentru microorganismele implicate n biosintez, existnd astfel posibilitatea realizrii extraciei reactive in situ. Cercetrile efectuate [342] au artat c gradul de extracie crete cu creterea concentraiei iniiale a extractantului de la 0 la 25 g/L. La concentraii de extractant ntre 25 60 g/L, gradul de extracie rmne constant (80%), pentru o concentraie iniial a acidului cinamic n faza apoas de 0,2 g/L (fig. 4.87). ntre amin i acid se formeaz un complex stoichiometric 1:1, reacia fiind foarte rapid, determinante de vitez fiind procesele difuzionale.

163

Capitolul 4 Separarea prin extracie

4.5.4.4.2. Extracia vitaminelor

Vitaminele sunt compui organici eseniali care fie nu sunt sintetizai de ctre organismul uman sau animal, fie sunt produi doar n cantiti insuficiente [344], avnd un rol vital n reglarea proceselor metabolice i a activitii celulare. La separarea prin extracie reactiv se preteaz vitaminele hidrosolubile, cu caracter acid. Acestea se comport la extracie similar cu acizii carboxilici. Vitamina B3, cunoscut i ca vitamina PP, niacin, niacinamid, hexaniacinat, corespunde compuilor nicotinamid i acid nicotinic (fig. 4.88). Se gsete n diverse produse de origine vegetal i animal, cantiti mari aflndu-se n alunele de pmnt prjite (22,10 mg/100 g), orz (5,4 g/100 g), nap alb (5,40 g/100 g), seminele de floareasoarelui (4,50 g/100 g), migdale (4,40 g/100 g), fin de gru (4,3 g/100 g), orez (4,10 g/100 g) [345].

acid nicotinic

nicotinamid

Figura 4.88. Componenii vitaminei B3 Se poate obine prin oxidarea enzimatic a 5-etil-2-metilpiridinei sau prin hidroliza total a 3-cianopiridinei, ambele procese decurgnd sub aciunea nitrilazei bacteriene. Peste 60% din producia mondial este destinat mbuntirii hranei psrilor, porcinelor, rumegtoarelor, petilor i animalelor de companie, restul utilizndu-se n preparate multivitaminice, cereale pentru micul dejun, buturi rcoritoare [346].
Coeficientul de distribuie, KD= C[org]/C[aq]

Coeficientul de distribuie, KD= C[org]/C[aq]

Concentraia iniial a acidului nicotinic = 0,105 kmol/m3

Concentraia iniial a acidului nicotinic [kmol/m3]

Concentraia iniial a TBP [% v/v]

Figura 4.89. Distribuia acidului nicotinic ntre ap i diferii solveni organici [347] 164

Figura 4.90. Influena concentraiei iniiale a extractantului i a solventului asupra extraciei acidului nicotinic [347]

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Acidul nicotinic poate fi recuperat din faza apoas fie prin extracie fizic, fie prin extracie reactiv. Extracia fizic decurge cu rezultate modeste, cei mai buni solveni dovedindu-se 1-octanolul i metil-izobutil-cetona (fig. 4.89). Ca agent de extracie reactiv se poate utiliza TBP ca atare sau dizolvat n diferii solveni organici. Gradul maxim de extracie se obine cu TBP pur; cel mai indicat solvent pentru TBP este metilizobutil-cetona (fig. 4.90). Solventul se regenereaz prin stripare cu un volum redus de soluie alcalin [347]. Vitamina B9 sau acidul folic a fost descoperit n anii 1930, fiind izolat din frunzele de spanac n 1941 i ulterior sintetizat n 1946 [345, 348, 349]. n structura acesteia i a celorlali acizi folici exist un rest pteridinic i un rest de acid glutamic grefate pe acidul p-aminobenzoic (fig. 4.91).

Acid p-aminobenzoic

Pteridin Acid glutamic

Figura 4.91. Structura acidului folic Acidul folic este puin solubil n ap (8,5 g/100 mL la 20 C), stabil n mediu acid. Se distruge rapid n soluii neutre sau alcaline, n prezena cldurii, luminii i a compuilor cu sulf. Dei se poate obine prin extracie din produse vegetale (frunze de spanac, cereale, lmi etc.), animale (ficat), sau prin biosintez cu ajutorul unor microorganisme modificate genetic, singura metod economic de producie la scar industrial o reprezint deocamdat sinteza chimic [350], cu toate c randamentul total nu depete 40 50%, iar puritatea produsului este de 80% [345]. Separarea i purificarea acidului folic din lichidele de fermentaie implic filtrarea biomasei i sorbia acidului pe anionii, dup o purificare prealabil a filtratului prin tratamente termice i chimice. Eluia de pe schimbtorii de ioni se realizeaz cu soluii de NaOH n condiii blnde, stabilitatea produsului fiind maxim n intervalul de pH = 4 12 [345]. La separarea prin extracie reactiv, utilizarea aminei secundare Amberlite LA-2 permite obinerea unor valori ridicate ale gradului de extracie [351]. Vitamina C sau acidul ascorbic este una dintre cele mai cunoscute i mai studiate vitamine. Acidul ascorbic are doi enantiomeri, activitate biologic avnd doar izomerul levogir. Fiind un reductor puternic, se oxideaz foarte rapid transformndu-se n acid dehidroascorbic (fig. 4.92). Dei microorganismele, plantele i majoritatea animalelor au capacitatea de a sintetiza vitamina C, primatele (inclusiv omul) i-au pierdut aceast abilitate [353]. Vitamina C, pe lng rolul su important pe care l are n nutriie, are i alte utilizri. Din totalul de peste 80.000 tone produse anual, circa o treime se utilizeaz n industria 165

Capitolul 4 Separarea prin extracie farmceutic (multivitamine, tablete, siropuri, comprimate efervescente etc.), restul utilizndu-se n special n calitate de conservant n industria alimentar [354] sau n industria cosmetic [345].

[O] [H]

Figura 4.92. Forma redus (stnga) i oxidat (dreapta) a acidului ascorbic [352] Vitamina C se obine prin extracie din diferite materii prime vegetale, prin sintez chimic, prin biosintez sau prin procedee combinate de sintez chimic i biosintez [354]. Indiferent de metoda de obinere, separarea i purificarea necesit numeroase etape, care implic consumuri ridicate de materiale i energie. Soluia final din care trebuie extras acidul ascorbic conine numeroase produse secundare, cel mai important dintre acestea fiind acidul 2-cetogluconic. n ciuda faptului c fiecare etap a procesului decurge cu randamente de 90%, conversia global a glucozei n acid ascorbic nu depete 60% [354, 355]. Studiile efectuate arat c la extracia acidului ascorbic cu Amberlite LA-2 n acetat de butil separarea decurge prin intermediul unei reacii interfaciale de ordinul I ntre acid i extractant:
CO HO HO H HO C C C C H (aq) O HO CO C O (o) H

HNR1R2

(o)

R2R1H2N

+ -

O C C C

H HO

(4.65)

CH2OH

CH2OH

[aq]

[org]

[org]

Procesul este controlat de concentraia extractantului n faza organic i de valoarea pH-ului fazei apoase. Un grad de extracie de 90% se obine la o concentraie iniial a extractantului de 160 g/L i un pH = 1 n faza apoas iniial [356]. Gradul de extracie poate fi mbuntit cu 6 23% prin adugarea unui modificator de faz (2octanol), care mrete polaritatea solventului [357]. Modelarea matematic a procesului de extracie arat c eficiena extraciei este influenat n proporie de 91,1% de ctre concentraia iniial a extractantului n faza organic i de ctre pH-ul fazei apoase, ceilali factori (intensitatea amestecrii, temperatura, raportul volumic al fazelor etc.) influennd procesul ntr-o mai mic msur [358]. 166

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

100
Grad de extracie [%] % Extraction degree,

Grad de extracie [%]

80 60 40 20 0

cu 2-octanol with2-octanol fr 2-octanol without 2-octanol CLA-2 = 160 g/L

pH

ie L ] tra [g / en nt c a on ct C tra ex

4
pH

pH

10

Figura 4.93. Influena pH-ului fazei apoase i a concentraiei extractantului la extracia reactiv a acidului ascorbic cu Amberlite LA-2 n acetat de butil [358]

Figura 4.94. Influena adaosului de modificator de faz asupra gradului de extracie a acidului ascorbic cu Amberlite LA-2 n acetat de butil [356]

4.5.4.4.3. Extracia selectiv a enantiomerilor

Foarte muli compui organici cu activitate biologic posed atomi de carbon asimetrici i implicit izomerie optic sau chiralitate. n marea majoritate a cazurilor, compuii extrai din surse naturale au aceeai chiralitate: majoritatea aminoacizilor eseniali sunt (L)-aminoacizi, majoritatea zaharurilor sunt (D)-glucide. La sinteza chimic a acestor compui se obin amestecuri racemice, amestecuri formate n proprii egale din cei doi enantiomeri. Dei proprietile fizice ale enantiomerilor sunt identice, exceptnd direcia de rotaie a planului luminii polarizate, activitatea lor biologic poate fi mult diferit. De exemplu, n cazul betablocantelor (propranolol, atenolol, metoprolol etc.) doar izomerul (S) este activ, avnd aceeai structur cu noradrenalina (fig. 4.95). Izomerul (R) este inactiv. Neproducnd efecte secundare, acesta este doar un balast izomeric [359].

(S)-propranolol

noradrenalin

Figura 4.95. Structuri similare pentru betablocant i hormonul adrenergic n alte cazuri, cei doi enantiomeri au reacii fiziologice diferite: unul dintre enantiomerii naproxenului este util n calmarea durerilor artritice, cellalt provoac otrvirea ficatului fr a avea un efect analgezic; (S)-limonenul are arom de lmie, n timp ce (R)-limonenul are arom de portocal. Alte exemple sunt redate n fig. 4.96 [360, 361]. Datorit acestui comportament, separarea enantiomerilor reprezint o necesitate, n special n aplicaiile farmaceutice, cosmetice, alimentare etc. 167

Capitolul 4 Separarea prin extracie

(S)-asparagina (R)-asparagina gust amar gust dulce

(S)-carvona (R)-carvona aroma de chimen aroma de menta

(R, R)-cloramfenicol antibacterial

(S, S)-cloramfenicol inactiv

(S, S)-ethambutol tuberculostatic

(R, R)-ethambutol provoaca orbire

Figura 4.96. Reacii fiziologice diferite ale enantiomerilor Separarea izomerilor optici dintr-un amestec racemic este dificil, dat fiind faptul c proprietile fizice ale enantiomerilor sunt identice. Cu excepia separrii prin cristalizare, toate metodele de separare necesit prezena unui agent de separare chiral. O alt posibilitate o reprezint separarea diastereoizomerilor: enantiomerii reacioneaz n prealabil cu un compus optic pur, rezultnd diastereoizomeri. Acetia, avnd proprieti fizice diferite, pot fi separai prin diverse procedee (fig. 4.97).
Separarea diastereoizomerilor prin Separarea distilare, extracie, diastereoizomerilor i a altor derivai Cristalizare Separarea direct a enantiomerilor Cromatografie Tehnici de membran Extracie reactiv
analiz preparativ de laborator industrial

Separri chirale

Figura 4.97. Principalele metode de separare a compuilor chirali i scara la care se aplic n prezent [359] Extracia reactiv, ca metod de separare a enantiomerilor, implic utilizarea a doi solveni, un solvent de extracie i un solvent de splare (fig. 4.98). Acest procedeu este cunoscut sub denumirea de extracie fracionat. Cei doi solveni trebuie s fie nemiscibili, sau cu miscibilitate foarte redus. Ei trebuie s aib polaritate i densitate ct mai diferite, circulnd prin extractor n contracurent, fiecare dintre ei extrgnd selectiv cte unul din componenii amestecului de separat. Dac extractorul este un aparat tip coloan, cei doi solveni se alimenteaz pe la capetele acestuia, iar amestecul de separat printr-un punct intermediar, care mparte coloana n dou zone: o zon situat deasupra punctului de alimentare, denumit zon de extracie i o zon situat dedesubtul alimentrii, denumit zon de splare (fig. 4.99). 168

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Solvent de splare (W) Extract (S + A)

Extract (S + A) Solvent de splare (W)

Zon de extracie

ALIMENTARE (F) [A + B]
ALIMENTARE (F) [A + B] Zon de splare

Rafinat (W + B) Solvent de extracie (S)

Rafinat (W + B)

Solvent de extracie (S)

Figura 4.98. Schema de principiu a extraciei fracionate

Figura 4.99. Coloan de extracie fracionat

La nivel de laborator se utilizeaz diverse echipamente, constnd, de regul din dou uniti independente, echivalente zonelor de extracie, respectiv de splare. Frecvent utilizat este extractorul fracional Takeuchi, compus din dou coloane rotative din sticl, nclinate (fig. 4.100). Echipamentele de laborator sunt caracterizate de dimensiunea redus a acestora, numrul mare de trepte teoretice de extracie, timpul mare de staionare n aparat (2 24 h); toate acestea conduc la obinerea unor produse de puritate avansat, dar cu o productivitate foarte redus (1 10 mg/h).

EXTRACT Solvent greu (de splare)

Alimentare

RAFINAT Solvent uor (de extracie) P pompe

Figura 4.100. Extractor fracional Takeuchi [362] 169

Capitolul 4 Separarea prin extracie Pentru a se putea realiza separarea enantiomerilor prin extracie fracionat reactiv (FREX), unul dintre solveni va trebui s conin agentul de extracie enantioselectiv. ntruct recunoaterea moleculelor chirale este mai selectiv ntr-un mediu hidrofob, solventul organic S este, de regul, purttorul extractantului [363]. Un sistem de extracie versatil, foarte studiat, este acela bazat pe alchil derivai de (L)-prolin sau (L)-hidroxiprolin. Aceti compui solubilizai n butanol, sunt capabili s extrag ionii de Cu(II) din faza apoas, formnd cu acetia un complex chiral, avnd un raport Cu : Ligand = 1 : 2 (fig. 4.101) [364]. Reacia care are loc se poate scrie:
Cu 2+ [ aq ] + 2 HLig[ org ] CuLig 2[ org ] + 2 H + [ aq ]

(4.66)

Complexul astfel format, CuLig2, are posibilitatea de a schimba unul din liganzii chirali cu un enantiomer al unui aminoacid existent n faza apoas. Se formeaz astfel un complex mixt, ligandul chiral pus n libertate rmnnd n faza organic, nefiind solubil n ap. Aminoacidul existent n faza apoas, nedisociat, poate trece n faza organic, unde poate avea loc capturarea sa de ctre complexul cupric al (L)-(hidroxi) prolinei (fig. 4.102): HD[ aq ] HD[ org ] (4.67)

HL[ aq ]
HD[ org ] + CuLig 2[ org ] HL[ org ] + CuLig 2[ org ]
KD KL

HL[ org ]
DCuLig [ org ] + HLig[ org ] LCuLig [ org ] + HLig[ org ]

(4.68) (4.69) (4.70)

unde HD, HL reprezint respectiv (D)-aminoacidul i (L)-aminoacidul, iar KD i KL reprezint respectiv constantele de echilibru ale reaciilor (4.69) i (4.70). Dac KD KL, reacia de schimb de liganzi este enantioselectiv. Unul dintre enantiomeri va fi extras n faza organic n cantitate mai mare, cellalt concentrndu-se n faza apoas. Repetndu-se procedura, n final, dup n trepte de extracie, faza organic, respectiv cea apoas, vor conine cte un singur enantiomer, realizndu-se astfel separarea.
Faza organic

Faza apoas

Figura 4.101. Structura chimic a complexului Cu(II) cu N-dodecil-(L)-hidroxiprolina 170

Figura 4.102. Extracia n faza organic a fenilalaninei de ctre Cu(II)- N-decil-(L)-hidroxiprolin [365]

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII Sistemul bazat pe compleci de Cu(II) N-alchil-(L)-(hidroxi)prolin n diveri alcooli (n-butanol, n-amilalcool, n-octilalcool) a fost utilizat pentru separarea selectiv a enantiomerilor unor aminoacizi (leucina, izoleucina, norleucina, valina, norvalina, fenilalanina) [364, 365], acizi carboxilici (acid mandelic [366], acid -ciclohexilmandelic [367]), aminoalcooli (fenilglicinol, 2-amino-1-feniletanol, 2-aminobutanol, efedrin, norefedrin) [359, 368, 369], amine (feniletilamin, 2-aminopentan) [359, 368, 369] i chiar antibiotice [370]. Aceste sisteme au dezavantajul existenei n sistem a ionului amoniu (pentru reglarea pH-ului) i a ionilor de cupru, ioni care trebuie ulterior separai din faza apoas n care se concentreaz unul dintre enantiomeri [368]. Pentru separarea unor beta-blocante s-au utilizat sisteme bazate pe didodecil-(L)tartrat i acid boric n sistemul cloroform ap [371, 372], iar pentru aminoalcooli i amine s-au utilizat diferii dialchiltartrai i tartrai alturi de hexafluorofosfai in cloroform [373 375]. Dei versatilitatea sistemelor este bun, selectivitatea de numai 1,2 1,6 este prea redus pentru aplicarea la scar industrial; n plus apare dezavantajul coextraciei unui contra-ion puternic lipofil, [PF6]-. Un alt sistem de extracie selectiv a enantiomerilor este cel bazat pe derivai de eteri-coroan. Sistemul a fost conceput iniial pentru separarea aminelor chirale prin HPLC/CSP1 [376, 377]. Aceti derivai de eteri-coroan conin un rest fenolic a crui grupare OH se afl n interiorul coroanei, servind ca grupare de legtur pentru gruparea aminic. n poziia para se gsete o grupare 2,4-dinitrofenilazo, care pe lng faptul c este o grupare cromofor, conduce la creterea capacitii de legare a aminelor neutre i a aminoalcoolilor [378]. Selectivitatea acestor derivai este influenat de aranjamentul substituenilor pe inelul eterului-coroan: compuii avnd gruprile C6H5 localizate lng puntea de dietilenglicol (1 i 2 din fig. 4.103) sunt mai selectivi dect cei care au gruprile C6H5 amplasate lng gruparea fenolic (3 i 4 din fig. 4.103).

Figura 4.103. Derivai de eteri-coroan cu selectivitate chiral pentru amine i aminoalcooli [376] n timp ce eterii coroan n conformaie (S,S,S,S) s-au dovedit a fi selectivi pentru izomerii R ai compuilor: 2-aminopropan-1-ol, 2-amino-3-metilbutan-1-ol i 2-amino-2feniletan-1-ol, eterii n conformaie (R,S,S,R) s-au dovedit a fi selectivi pentru izomerii S ai acelorai aminoalcooli. Aceast selectivitate poate fi explicat prin factorii sterici care pot sau nu favoriza includerea aminei n cavitatea eterului-coroan [376].

HPLC/CSP cromatografie de nalt performan pe faz chiral staionar

171

Capitolul 4 Separarea prin extracie Un derivat piridinic de eter-coroan (fig. 4.104) a fost sintetizat i i-a fost testat selectivitatea pentru diferite amine i aminoalcooli chirali (fig. 4.105). Macrociclul chiral a prezentat o bun selectivitate pentru sec-butilamina (2), pentru compuii (3) (5) a prezentat o selectivitate redus, iar pentru (1) i (6) nu a fost enantioselectiv [379].

(S,S)

Figura 4.104. Eter azofenolic piridino-18-coroan-6

Figura 4.105. Compui model pentru testarea enantioselectivitii eterului azofenolic piridino-18coroan-6 asupra aminelor primare chirale

Studii mai ample au fost efectuate cu eterul-coroan azofenolic prezentat n fig. 4.106 [359]. Acesta a fost testat ca extractant n diferii solveni, cei mai eficieni dovedindu-se diclormetanul i, ntr-o mai mic msur, toluenul. Cu toate acestea, pentru aplicaiile la scar mai mare se recomand utilizarea toluenului ca solvent, acesta fiind mai puin duntor mediului nconjurtor dect diclormetanul. Drept compui model de extras s-au folosite aminele i aminoalcoolii avnd o structur asemntoare efedrinei (fig. 4.107).

(1) fenilglicinol

(2) 2-amino-1-feniletanol

(3) 2-aminobutanol

(4) norefedrina

(5) efedrina

(6) feniletilamina

(7) 2-aminopentan

Figura 4.106. Eter azofenolic 18-coroan-6 [359]

Figura 4.107. Compui model pentru testarea enantioselectivitii eterului azofenolic 18-coroan-6 asupra unor amine chirale de tip efedrinic [359]

S-a constatat c acest eter-coroan are o selectivitate bun (peste 1,7) pentru majoritatea compuilor testai (tab. 4.28), iar faptul c valorile coeficienilor de distribuie sunt mari la concentraii relativ sczute de extractant, permite utilizarea acestui compus n instalaii de capacitate ridicat [368]. Faptul ca 2-aminopentanul nu a putut fi separat poate conduce la concluzia c pentru recunoaterea chiral este necesar prezena unei a doua grupri funcionale (fenil sau hidroxil) n molecula-int. De 172

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII asemenea, selectorul (eterul-coroan) ar putea fi enantioselectiv i pentru alte amine primare chirale, cu cel puin nc o grupare funcional n molecula lor: aminoacizi, aminalcooli, amine aromatice [359, 368]. Tabelul 4.28. Separarea chiral a unor aminoalcooli i amine prin extracie reactiv cu eter-coroan azofenolic (2 mMol/L) n diclor metan [368]
Enantiomer T [C] pH D1 D2 Selectivitate 5,0 1,3 1,7 3,2 2,1 1,0 Fenilglicinol 25 9,0 4,0 0,8 2-Amino-1-feniletanol 5 10,0 5,6 4,2 Norefedrin 5 8,7 4,5 2,6 2-Aminobutanol 5 9,9 1,9 0,6 Feniletilamin 5 9,2 20,4 9,9 2-Aminopentan 5 9,9 6,2 6,0 D1 coeficientul de distribuie al enantiomerului cel mai puternic extras D2 coeficientul de distribuie al enantiomerului cel mai slab extras Enantiomerul preferat R R (+) R S

Studiile cinetice indica faptul c extracia aminoalcoolilor cu eteri-coroan azofenolici decurge n domeniul difuzional, reacia chimic nefiind etapa determinant de vitez [369]. La extracia ntr-o singur treapt, selectivitatea operaional este influenat n special de valoarea constantei de complexare dintre eterul-coroan i enantiomeri (care depinde de tipul solventului i de temperatur), precum i de concentraia extractantului. Raportul de distribuie al enantiomerilor ntre faza apoas i cea organic este puternic influenat de pH [380]. Reextracia aminoalcoolilor din faza organic se poate realiza fie prin modificarea pH-ului (n cazul feniletilaminei), fie prin modificarea temperaturii (n cazul fenilglicinolului). Pentru modificarea pH-ului nu se recomand utilizarea acizilor minerali, ci a dioxidului de carbon. O presiune parial de circa 0,02 MPa a CO2 este suficient pentru reducerea pH-ului unei soluii cu 2 mMol/L feniletilamin pn la valoarea 6. n aceste condiii are loc decomplexarea de eterul-coroan i trecerea aminei n faza apoas, fenomen vizbil prin modificarea clar i rapid a culorii fazei organice de la purpuriu nchis la portocaliu [359, 380]. Flexibilitatea extraciei reactive fracionate cu derivai axzofenolici ai eterilor coroan a fost demonstrat la scar redus ntr-un contactor cu membran avnd circa dou trepte teoretice de extracie att n zona de extracie, ct i n zona de splare (fig. 4.108). Figura 4.108. Instalaie de extracie reactiv fracionat (FREX) de tip contactor cu membran [381] 173

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. U.S. Congress, Office of Technology Assessment: Biotechnology in a Global Economy, OTA-BA-494, Washington, DC, U.S. Government Printing Office, October 1991 Jurcoane, ., Ssrman, E., Lupescu, I., Rou, A., Berehoiu Tamba, R., Banu, A., Rdoi, F.: Tratat de biotehnologie, 1, Ed. Tehnic, Bucureti, 2004 Doran, P.M.: Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, London, 1995 Cacaval, D., Oniscu, C., Galaction, A.-I.: Inginerie biochimic i biotehnologie, 3 Procese de separare, Ed. Performantica, Iai, 2004 Shuler, M.L.: Bioprocess engineering in: Encyclopedia of Physical Science and Technology, 2 (Meyers, R.A. ed.), Academic Press, Orlando, 1987 Berruex, L.G., Freitag, R.: Separation and Purification of Biochemicals in: Encyclopedia of Physical Science and Technology, 3rd ed. (Meyers, R.A. ed.), Academic Press, Orlando, 2001 Harrison, R.G., Todd, P., Rudge, S.R., Petrides, D.P.: Bioseparations Science and Engineering, Oxford University Press, New York, 2003 Petrides, D.P.: Bioprocess Design, http://www.intelligen.com, 2000 Petrides, D.P., Cooney, C.L., Evans, L.B.: An Introduction to Biochemical Process Design, in: Chemical Engineering Problems in Biotechnology (Shuler, M.L. ed.), 1, American Institute of Chemical Engineers, 1989, 351 372 www.lsbu.ac.uk/water/kosmos.html http://ron.proz.com/kudoz/1229225#2932486 Hunter, R.J.: Foundations of Colloid Science, 1, Clarendon Press, Oxford, 1987 Calleja, G.B.: Microbial Aggregation, CRC Press, Boca Raton, 1984 Bilanovic, D., Shelef, G., Sukenik, A.: Biomass, 1988, 17, 65 76 Boonaert, C.J.-P., Dupont-Gillain, C.C., Dengis, P.B., Dufrne, Y.F., Rouxhet, P.G.: Cell Separation, Flocculation, in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), 2, Wiley Interscience, New York, 1999 * * * Degrmont Water Treatment Handbook, 6th ed., 1, Lavoisier Publishing, Paris, 1991 Nakamura, J., Miyashiro, S., Hirose, Y.: Agric. Biol. Chem., 1976, 40, 377 383 Kurane, R., Takeda, K., Suzuki, T.: Agric. Biol. Chem., 1986, 50, 2301 2307 Takagi, H., Kadowaki, K.: Agric. Biol. Chem., 1985, 49, 3151 3157 Agerkvist, I., Eriksson, L., Enfors, S.-O.: Selective flocculation with chitosan in Escherichia coli disintegrates: Effects of pH and nuclease treatment, Enzyme Microb. Technol., 1990, 12(8), 584590 Ferenci, T., Lee, K.-S.: Recovery of bacteria from growth media by starch-dependent floc formation, Biotechnol. Bioeng., 1991, 38(3), 314 318 Sharma, B.P.: Cell Separation, Sedimentation in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), 2, Wiley Interscience, New York, 1999 Li, D.-H., Ganczarczyk, J.J.: Water Res., 1987, 21, 257 262 Maia, A.B.R.A., Nelson, D.L.: Application of gravitational sedimentation to efficient cellular recycling in continuous alcoholic fermentation, Biotechnol. Bioeng., 1993, 41(3), 361 369 Bratu, E.A.: Operaii unitare n ingineria chimic, 2, Ed. Tehnic, Bucureti, 1984 Kalyanpur, M.: Membrane Separations, in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), 3, Wiley Interscience, New York, 1999

Bibliografie
27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. Levy, R.V., Jornitz, M.W.: Types of Filtration in: Sterile Filtration (Jornitz, M.W. ed.), Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, 2006, 98, 1 26 Oniscu, C., Tehnologia produselor de biosintez, Ed. Tehnic, Bucureti, 1978 * * * Advanced Filtration Technology, Larox OY Company Brochure, Lappeenranta, 1993 Hsu, H.-W.: Separations by Centrifugal Phenomena, John Wiley, New York, 1981 Ambler, C.M.: The evaluation of centrifuge performance, Chemical Engineering Progress, 1952, 48, 150 158 Ambler, C.M.: Centrifugation in: Handbook of Separation Techniques for Chemical Engineers (Schweitzer, P.A. ed.), 2nd ed., McGraw-Hill, New York, 1988 Dahlstrom, D.A., et al: Liquid-Solid Operations and Equipment in: Perrys Chemical Engineers Handbook (Perry, R.H., Green, D.W. ed.): 7th ed., McGraw-Hill, New York, 1997 Ambler, C.M.: J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng., 1959, 1, 185 205 Svarovsky, L: Separation by centrifugal sedimentation in: Solid Liquid Separation (Svarovsky, L. ed.), 4th ed., Butterworth-Heinemann, Oxford, 2000 Axelsson, H. in: Comprehensive Biotechnology, 2: The Principles of Biotechnology: Engineering Considerations (Clooney, C.L., Humphrey, A.E. ed.), Pergamon Press, Oxford, 1985, 325 346 Axelsson, H.: Cell Separation, Centrifugation, in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), 2, Wiley Interscience, New York, 1999 Apelman, S., Bjrling, T.: Biotech. For. Eur., 1991, 8, 356 358 Mayer, M., Woernle, R.: Chem.-Ing.-Tech., 1985, 57, 152 153 Hanle, D.D.: Centrifuges, Animal Cells in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), 2, Wiley Interscience, New York, 1999 Middelberg, P.J., ONeill, B.K., Bogle, I.D.L.: Trans. Inst. Chem. Eng., 1992, 70, 8 12 Westfalia Separator Industry: Pharmaceutical Biotechnology. Components, Systems, Installations, Brochure 9997-8203-010/0503 EN, disponibil la: http://www.westfalia-separator.com/pdfs/9997-8203-010.pdf Baker, R.W.: Membrane Separation in: Encyclopedia of Separation Science (Wilson, I.D. ed.), 1, Academic Press, London, 2000 http://www.ncnr.nist.gov/programs/reflect/rp/biology/cell_membrane.html http://microscopy.fsu.edu/cells/plants/cellwall.html http://www.doctorfungus.org/thedrugs/antif_pharm.htm http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Biochemicals/Enzyme_Explorer/Key_Resources/Lysing_Enz ymes.html http://www.leica-microsystems.com/WebSite/ImageGallery.nsf/ http://www.microbiologytext.com/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=60 Doulah, M.S.: Biotechnol. Bioeng., 1977, 19, 649 660 Kuboi, R., Umakoshi, H., Takagi, N., Komasawa, I.: Optimal disruption methods for the selective recovery of -galactosidase from Escherichia coli, J. Ferment. Bioeng., 1995, 79(4), 335 341 Hetherington, P.J., Follows, M., Dunnill, P., Lilly, M.D.: Trans. Inst. Chem. Eng., 1971, 49, 142 148 Garcia, F.A.P.: Cell Disruption and Lysis in: Encyclopedia of Bioprocess Technology (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), 2, Wiley Interscience, New York, 1999 Engler, C.R., Robinson, C.W.: Effects of organism type and growth conditions on cell disruption by impingement, Biotechnol. Lett., 1981, 3, 83 88 Hetherington, P.J., Follows, M., Dunnill, P., Lilly, M.D.: Release of protein from bakers yeast (Saccharomyces cerevisiae) by disruption in an industrial homegeniser, Trans. Inst. Chem. Eng., 1971, 49, 142 148 Doulah, M.S., Hammond, T., Brookman, J.S.G.: Biotechnol. Bioeng., 1975, 17, 845 858 Sauer, T., Robinson, O.W., Glick, B.R.: Biotechnol. Bioeng., 1989, 33, 1330 1342 http://www.microfluidicscorp.com/pdf/tb_hc.pdf Siddiqi, S.F., Bulmer, M., Shamlou, P.A., Titchener-Hooker, N.J.: The effects of fermentation conditions on yeast cell debris particle size distribution during high pressure homogenization, Bioprocess Eng., 1995, 14(1), 1 8 Bratu, E.A.: Operaii unitare n ingineria chimic, 1, Ed. Tehnic, Bucureti, 1984 http://www.btc-bti.com/applications/yeasthomogenization.htm Limon-Lason, J., Hoare, M., Orsborn, C.B., Doyle, D.J., Dunnill, P.: Biotechnol. Bioeng., 1979, 21, 745 774 http://www.btc-bti.com/product_literature/grindingmedia.htm Chaplin, M., Bucke, C.: Enzyme Technology, Cambridge University Press, 1990 (text abreviat, disponibil online la: http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.html , postat 20.12.2004) Baldwin, C.V., Robinson, C.W.: Enhanced disruption of Candida utilis using enzymatic pretreatment and high-pressure homogenization Biotechnol. Bioeng., 1994, 43(1), 46 56 Bunge, F., Pietzsch, M., Mller, R., Syldatk, C.: Mechanical disruption of Arthrobacter sp. DSM 3747 in stirred ball mills for the release of hydantoin-cleaving enzymes, Chem. Eng. Sci., 1992, 47(1), 225 232

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. Majors, R.E.: Sample Preparation for Large-Scale Protein Purification, LCGC North America, August 1, 2005, disponibil la: http://neuro_healthcentersonline.mediwire.com/main/Default.aspx?P=Content&ArticleID=172950 http://www.microfluidicscorp.com/cell_disruption/cell_disruption.html Lee, C.H., Tsang, S.K., Urakabe, R., Rha, R.A.: Biotechnol. Bioeng., 1979, 21, 1 17 Ropars, M., Marchal, R., Pourquie, J., Vandercasteele, J.P.: Large scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass, Bioresource. Technol., 1992, 42(2), 197 203 Petre, M., Zarnea, G,, Adrian, P., Gheorghiu, E.: Biodegradation and bioconversion of cellulose wastes using bacterial and fungal cells immobilized in radiopolymerized hydrogels, Resource, Conversion and Recycling, 1999, 27(2), 309 332 Vogels, G., Kula, M.-R.: Combination of enzymatic and/or thermal pretreatment with mechanical cell disintegration, Chem. Eng. Sci., 1992, 47(1), 123 131 Dabora, R.L., Cooney, C.L.: Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 1990, 43, 11 30 Clarkson, A.I., Lefevre, P., Titchener-Hooker, N.J.: A study of process interactions between cell disruption and debris clarification stages in the recovery of yeast intracellular products, Biotechnol. Prog., 1993, 9(5), 462 467 Keshavarz, E., Bonnerjea, J., Hoare, M., Dunnill, P.: Disruption of a fungal organism, Rhizopus nigricans, in a high-pressure homogenizer, Enzyme Microb. Technol., 1990, 12(7), 494 498 Carlson, A., Signs, M., Liermann, L., Boor, R., Jem, K.J.: Biotechnol. Bioeng., 1995, 48, 303 315 Agerkvist, I., Enfors, S.-O.: Characterization of E. coli cell disintegrates from a bead mill and high pressure homogenizers, Biotechnol. Bioeng., 1990, 36(11), 1083 1089 Siddiqi, S.F., Titchener-Hooker, N.J., Shamlou, P.A.: Simulation of particle size distribution changes occurring during high-pressure disruption of bakers' yeast, Biotechnol. Bioeng., 1996, 50(2), 145 150 Mukhopadhyay, A.: Biotreatment, downstream processing and modeling, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 1997, 56, 61 109 Wong, H.H., ONeill, B.K., Middelberg, A.P.J.: A mathematical model for Escherichia coli debris size reduction during high pressure homogenisation based on grinding theory, Chemical Engineering Science, 1997, 52(17), 2883 2890 Bailey S.M., Mragher, M.M.: Biotechnol. Bioeng., 1997, 56, 304 310 Kasatkin, A.G.: Procese i aparate principale n tehnologia chimic, ed a 2-a, Ed. Tehnic, Bucureti, 1963 Bratu, E.A.: Operaii unitare n ingineria chimic, 3, Ed. Tehnic, Bucureti, 1985 Dobre, T., Floarea, O.: Separarea compuilor chimici din produse naturale, Ed. Matrix Rom, Bucureti, 1997 Stoica Guzun, A., Stroescu, M., Dobre, T., Floarea, O.: Operaii de transfer interfazic, Ed. Matrix Rom, Bucureti, 2001 Perry, R.H., Green, D.W. (ed.): Perrys Chemical Engineers Handbook, 7th ed., McGraw-Hill, New York, 1997 Richardson, J.F., Harker, J.H.: Coulson and Richardsons Chemical Engineering, 2, 5th ed., Particle Technology and Separation Processes, Butterworth-Heinemann, Oxford, 2002 Rydberg, J.: Introduction to solvent extraction, in Principles and Practices of Solvent Extraction (Rydberg, U., Musikas, C., Choppin, G.R. eds.), Marcel Dekker, New York. 1992 Stoica Guzun, A., Floarea, O., Dobre, T.: Transfer de mas i reacie chimic la interfaa lichid lichid, Ed. Matrix Rom, Bucureti, 2000 Gavril, L.: Fenomene de transfer, 2, Transfer de cldur i de mas, Ed. Alma Mater, Bacu, 2000 Gu, T.: Liquid liquid partitioning methods for bioseparations, in: Handbook of Bioseparations (Ahuja, A. ed.), 2, Academic Press, New York, 2000 Schgerl, K.: Solvent Extraction in Biotechnology: Recovery of Primary and Secondary Metabolites, Springer-Verlag, Berlin, 1994 Thornton, J.D.: Science and Practice of Liquid Liquid Extraction, 2, Oxford University Press, New York, 1992 Lo, T.C., Baird, M.H.I.: Solvent Extraction, in: Encyclopedia of Physical Science and Technology, Chemical Engineering, (Meyers, R.A. ed.), 3rd ed., Academic Press, Orlando, 1987 Horvath, A.L.: Molecular Design, Elsevier, Amsterdam, 1992 Seader, J.D., Henley, E.: Separation Process Principles, John Wiley, New York, 1998 Mavriounioutis, M. (ed.): Special issue on design of chemical compounds, Computers and Chemical Engineering Journal, 1998, 22, 713 Harper, P., Gani, R., Kolar, P., Ishikawa, T.: Computer aided molecular design with combined molecular modeling and group contribution, Fluid Phase Equilibria, 1999, 337, 158 160 Harper, R.G.P.M., Hostrup, M.: Solvent Based Separation in: : Encyclopedia of Separation Science (Wilson, I.D. ed.), Academic Press, London, 2000 Lo, T.C., Baird, M.H.I.: Liquid Liquid Extraction in: Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical technology, 4th ed., 10, Wiley Interscience, New York, 1994 Barson, N., Beyer, G.H.: Chem. Eng. Progr., 1953, 49, 243

Bibliografie
102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. Tudose, R.Z., Ibnescu, I., Vasiliu, M., Stancu, A., Cristian, G., Lungu, M.: Procese, operaii, utilaje n industria chimic, Ed. Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1977 Brunner, K.H.: Separatoren und Dekanter fr die kontinuierliche Extraktion, 3rd ed., Westfalia Separator AG, Oelde, 1991 Westfalia AG: Extraction, disponibil la: http://www.westfalia-separator.com/pdfs/9997-7651-010.pdf Meikrantz, D.H., Meikrantz, S.B., St. George, M.: Continuous Liquid Liquid Extraction via an Improved Centrifugal Contactor, Symposium on Extraction Practice, AIChE Spring National Meeting, March 8 12, 1998 Trandafir, I.: Studii n extracia lichid lichid, Tez de doctorat, Universitatea Tehnic Gh. Asachi Iai, 2003 Baier, G.: Liquid Liquid Extraction Based on a New Flow Pattern: Two Fluid Taylor Couette Flow, Ph.D. Dissertation, University of Wisconsin Madison, May 1999 Meikrantz, D.H., Macaluso, L.L., Flim, W.D., Heald, C.J., Mendoza, G., Meikrantz, S.B.: A New Annular Centrifugal Contactor for Pharmaceutical Processes, Chemical Engineering Communications, 2002, 189(12), 1629 1639 Chisti, Y.: Strategies in Downstream Processing, in: Bioseparation and Bioprocessing: A Handbook, 2 (Subramanian, G. ed.), Wiley-VCH, New York, 1998 Reissinger, K.-H., Schrter, J.: Selection Criteria for Liquid-Liquid Extractors, Chem. Eng., November 1978, 109 118 Baird, M.H.I., Rao, N.V.R., Prochazka, J., Sovova, H.: Reciprocating-plate columns, in: Liquid Liquid Extraction Equipment (Godfrey, J.C., Slater, M.J. eds.), Wiley Interscience, New York, 1994 Belter, P.A., Cussler, E.L., Hu, W.-S.: Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, Wiley, New York, 1988 Kertes, A.S., King, C.J.: Extraction chemistry of fermentation product carboxylic acids, Biotechnology and Bioengineering, 1986, 28, 269 282 Reuben, B.G., Sjoberg, K.: Chemtechnol., 1981, 11, 315 Wennersten, R.: Extraction of Organic Compounds in: Solvent Extraction Principles and Practice (Rydberg, J., Cox, M., Musicas, C., Choppin, G.R. eds.), 2nd ed., Marcel Dekker, New York, 2004 Essien, D.E., Pyle, D.L.: Fermentation ethanol recovery by solvent extraction in: Separations for Biotechnology (Verrrall, M.S., Hudson, M.J. eds.), Ellis Horwood, Chichester,1987 Roffler, S.R., Blanch, H.W., Wilke, C.R.: In-situ extractive fermentation of acetone and butanol, Biotechnology and Bioengineering, 1988, 31, 135-143 Weatherley, L.R.: Some current developments and extraction techniques in: Science and Practice of LiquidLiquid Extraction (Thornton, J.D. ed.), 2, Oxford University Press, New York, 1992 Mattiasson, B., Suominen, M., Andersson, E., Haggstrom, L., Albertsson, P.-., Hahn-Hgerdahl, B.: Solvent production by Clostridium acetohutylicum in aqueous two phase systems, Enzyme Engineering, 1982, 6, 153 155 Wang, H.Y., Robinson, E.M., Lee, S.S.: Biotechnol. Bioeng. Symp., 1981, 11, 555 565 Lloyd-Jones, E.: Chem Ind., 1967, 1590 Lurgi Life Science Technologies GmbH: Citric Acid by a Gypsum-free Process, Technical Brochure 260e/5.00/10 Wennersten, R.J.: Chem. Tech. Biotechnol., 1983, 33, 85 Zigov, J., turdik, E.: Advances in Biotechnological Production of Butyric Acid, J. Ind. Microbio. & Biotech., 2000, 24, 153 Pouillart, P.R.: Role of butyric acid and its derivatives in the treatment of colorectal cancer and haemoglobinopathies, Life Sciences, 1998, 63(20), 1739 1760 Kirbalar, .I.: Liquid-Liquid Equilibria of the Water + Butyric Acid + Decanol Ternary System, Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2006, 23(3), 365 374 Beijerinck, M.W.: ber eine Besonderheit der lslichen Strke, Zentralbl. Bakteriol., 1896, 2, 697 699 Albertsson, P.A.: Partition of Cell Particles and Macromolecules, John Wiley & Sons, New York, 1986 Kula, M.-R., Selber, K.: Protein Purification, Aqueous Liquid Extraction in: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation (Flickinger, M.C., Drew, S.W. eds.), John Wiley Interscience, New York, 1999 Terstappen, G.C., Ramelmeier, R.A., Kula, M.-R.: Protein partitioning in detergent-based aqueous two-phase systems, J. Biotechnol., 1993, 28(2-3), 263 275 Alred, P.A., Kozlowski, A., Harris, J.M., Tjerneld, F.: Application of temperature-induced phase partitioning at ambient temperature for enzyme purification, J. Chromatogr. A, 1994, 659(2), 289 298 Johansson, H.-O. Karlsstrm, G., Mattiasson, B., Tjerneld, F.: Bioseparation, 1995, 5, 269 279 Persson, J., Nystrm, L., Ageland, H., Tjerneld, F.: Purification of recombinant apolipoprotein A-1Milano expressed in Escherichia coli using aqueous two-phase extraction followed by temperature-induced phase separation, J. Chromatogr. B, 1998, 711(1-2), 97 109 Hustedt, H., Kroner, K.H., Kula, M.-R. in: Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems (Walter, H., Brooks, D.E., Fisher, D. eds.), Academic Press, Orlando, 1985, 529 587

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

135. 136. 137. 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153. 154. 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166. 167. Kubek, D.J. in: Protein Purification Process Engineering, (Harrison, R.G. ed.), Marcel Dekker, New York, 1994, 87 114 Asenjo, J.A., Chaudhuri, J.B.: Innovative separation methods in bioprocessing in: Separation Processes in the Food and Biotechnology Industries Principles and Applications (Grandison, A.S., Lewis, M.G. eds.), Woodhead Publishing, Cambridge, 1996 Schtte, H., Hummel, W., Kula, M.-R.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 1984, 19, 167 176 Diamond, A.D., Hsu, J.T.: Aqueous two-phase systems for biomolecule separation, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1992, 47, 89 135 Wnschell, G.E., Naranjo, E., Arnold, F.: Aqueous two-phase metal affinity extraction of heme proteins, Bioproc. Eng., 1990, 5(5), 199 202 Chung, B.H., Bailey, D., Arnold, F.H.: Metal Affinity Partitioning in: Methods in Enzymology, 228 (Walter, H., Johansson, G. eds.), Academic Press, San Diego, 1994, 167 179 Lee, C.K., Sandler, S.I.: Vancomycin partitioning in aqueous two-phase systems: effects of pH, salts, and an affinity ligand, Biotechnol. Bioeng., 1990, 35(4), 408 Kula, M.-R.: Extraction and purification of enzymes using aqueous two-phase systems, Appl. Biochem. Bioeng., 1979, 2, 71 95 Zaslavsky, B.Y.: Aqueous Two-Phase Partitioning: Physical Chemistry and Bioanalytical Applications, Marcel Dekker, New York, 1995 Kroner, K.H., Schtte, H., Stach, W., Kula, M.-R.: J. Chem. Technol. Biotechnol., 1982, 32, 130 137 Schtte, H., Kroner, K.H., Hummel, W., Kula, M.-R.: Ann. N.Y. Acad. Sci., 1983, 413, 270 282 Hart, R.A., Ogez, J.R., Builder, S.E.: Bioseparation, 1995, 5, 113 121 Kelley, B.D., Wang, D.I.C., Hatton, T.A.: Affinity-based reversed micellar protein extraction. I: Principles and protein-ligand systems, Biotechnol. Bioeng., 1993, 42(10), 1199 1208 Papamichael, N., Hustedt, H.: Enzyme Recovery by Continuous Crosscurrent Extraction in: Methods in Enzymology, 228 (Walter, H., Johansson, G. eds.), Academic Press, San Diego, 1994, 573 584 Fauqueux, P.-F., Hustedt, H., Kula, M.-R.: J. Chem. Technol. Biotechnol., 1985, 35B, 51 59 Johansson, G.: Recovery of Proteins and Phase-Forming Chemicals in: Methods in Enzymology, 228 (Walter, H., Johansson, G. eds.), Academic Press, San Diego, 1994, 569 573 Minuth, T., Thmmes, J., Kula, M.-R.: Extraction of cholesterol oxidase from Nocardia rhodochrous using a nonionic surfactant-based aqueous two-phase system, J. Biotechnol., 1995, 38(2), 151 164 Hustedt, H., Kroner, K.-H., Menge, U., Kula, M.-R.: Enzyme Eng., 1988, 5, 45 47 Kula, M.-R., Kroner, K.H., Hustedt, H.: Adv. Biochem. Eng., 1982, 24, 73 118 Jafarabad, K.R., Sawant, S.B., Joshi, J.B., Sikdar, S.K.: Enzyme and protein mass transfer coefficient in aqueous two-phase systems. I: spray extraction columns, II: York-Scheibel extraction columns, Chem. Eng. Science, 1992, 47(1), 57 68, 69 73 Sawant, S.B., Joshi, J.B., Sikdar, S.K.: Hydrodynamics and mass transfer characteristics of spray column for two phase aqueous extraction, Biotechnology and Bioengineering, 1990, 36, 109 Bhawsar, P.C.M., Pandit, A.B., Sawant, S.B., Joshi, J.B.: Enzyme mass transfer coefficient in a sieve plate extraction column, The Chemical Engineering Journal, 1994, 55, B1 B17 Patil, T.A., Jafarabad, K.R., Sawant, S.B., Joshi, J.B.: Enzyme mass transfer coefficient in aqueous two phase system using a packed extraction column, The Canadian Journal of Chemical Engineering, 1991, 69, 548 556 Dos Reis Coimbra, J., Thmmes, J., Meirelles, A., Kula, M.-R.: Bioseparation, 1995, 5, 259 268 Dos Reis Coimbra, J., Thmmes, J., Kula, M.-R.: Continuous separation of whey proteins with aqueous twophase systems in a Graesser contactor, J. Chromatogr. A, 1994, 668(1), 85 94 Couper, J.R., Penney, W.R., Fair, J.R., Walas, S.M.: Chemical Process Equipment: Selection and Design, 2nd ed., Gulf Professional Publishing, Burlington, 2005 Carlsson, A.: Factors influencing the use of aqueous two-phase for protein purification, Separation Science and Technology, 1988, 23(8-9), 765 Papamichael, N., Brner, B., Hustedt, H.: Continuous aqueous phase extraction of proteins: automated processing and recycling of process chemicals, J. Chem. Technol. Biotechnol., 1992, 54(1), 47 55 Kula, M.-R., Kroner, K.L., Hustedt, H.: Purification of enzymes by liquid-liquid extraction, Advances in Biochemical Engineering, 1982, 24, 73 118 Minuth, T., Thmmes, J., Kula, M.-R.: A closed concept for purification of the membrane-bound cholesterol oxidase from Nocardia rhodochrous by surfactant-based cloud-point extraction, organic-solvent extraction and anion-exchange chromatography, Biotechnol. Appl. Biochem., 1996, 23(2), 107 116 Greve, A., Kula, M.-R.: Cost structure and estimation for the recycling of salt in a protein extraction process, Bioprocess Eng., 1991, 6(4), 173 177 Greve, A., Kula, M.-R.: Recycling of salt from the primary bottom phase of a protein extraction process, J. Chem. Technol. Biotechnol., 1991, 50(1), 27 42 van Berlo, M., Luyben, K.C.A.M., van der Wielen, L.A.M.: Polyethylene glycol-salt aqueous two-phase systems with easily recyclable volatile salts, Journal of Chromatography B, 1998, 711(1-2), 61 68

Bibliografie
168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179. 180. 181. 182. 183. 184. 185. 186. 187. 188. 189. 190. 191. 192. 193. 194. 195. 196. 197. 198. 199. Hart, R.A., Lester, P.M., Riefsnyder, H., Ogez, J.R., Builder, S.E.: Large scale, in situ isolation of periplasmic IGF- from E. coli, Bio/Technology, 1994, 12(11), 1113 1117 Kim, C.Y., Brewer, J.W., Brothers, C.E., Farver, T.F., Lee, E.K.: 3rd Chemical Cong. of North America, Toronto, Canada, June 5 10, 1988 Hustedt, H., Brner, B., Kroner, K.H., Papamichael, N.: Biotechnol. Tech., 1987, 1, 49 54 Hustedt H., Papamichael, N.: Enzyme Eng., 1988, 9, 135 139 Kroner, K.H., Hustedt, H., Kula, M.-R.: Process Biochem., 1984, 19, 170 179 Hellebust, H., Veide, A., Enfors, S.: J. Biotechnol., 1988, 7, 185 198 Pulliam, T.R., Winston, S., Bentley, W.E.: Tryptophan regulated expression and aqueous two-phase separation of recombinant HIV-fusion peptides, Enzyme and Microbial Technology, 1997, 20(1), 46 51 Johansson, G., Andersson, M.: J. Chromatogr., 1984, 303, 39 Cordes, A., Kula, M.-R.: Large-Scale Purification of Formate Dehidrogenase in: Methods in Enzymology, 228 (Walter, H., Johansson, G. eds.), Academic Press, San Diego, 1994, 600 617 Zulauf, M., Eicke, H.F.: Inverted Micelles and Microemulsions in the Ternary-System H2O-Aerosol-OTIsooctane as Studied by Photon Correlation Spectroscopy, Journal of Physical Chemistry, 1979, 4, 480 486 Pileni, M.P., Zemb, T., Petit, C.: Solubilization by reverse micelles: Solute localization and structure perturbation, Chem. Phys. Lett., 1985, 118, 414 420 Luisi, P.L.: Enzymes Hosted in Reverse Micelles in Hydrocarbon Solution, Angewandte Chemie International Edition in English, 1985, 6, 439 450 Luisi, P.L., Giomini, M., Pileni, M.P., Robinson, B.H.: Reverse Micelles as Hosts for Proteins and Small Molecules, Biochimica et Biophysica Acta, 1988, 1, 209 246 Pileni, M.P. (ed.): Reverse micelles, Elsevier, Amsterdam, 1989 Peng, Q., Luisi, P.L.: The Behavior of Proteases in Lecithin Reverse Micelles, European Journal of Biochemistry, 1990, 188(2), 471 480 Evans, D.F., Mitchell, D.J., Ninham, B.W.: Oil, water and surfactant: properties and conjectured structure of simple microemulsions, J. Phys. Chem.,1986, 90, 2817 2825 Andr, P., Filankembo, A., Lisiecki, I., Petit, C., Gulik-Krzywicky, T., Ninham, B.W., Pileni, M.P.: Supraaggregation: Microphase formation in complex fluids, Adv. Mater., 2000, 12(2), 119 123 Hyde, S. et al. eds.: The Language of Shape: The Role of Curvature in Condensed Matter: Physics, Chemistry and Biology, Elsevier, Oxford, 1997 Pileni, M.P.: The role of soft colloidal templates in controlling the size and shape of inorganic nanocrystals, Nature Materials, 2003, 2, 145 150 Peng, Q.: Biological Function and Conformation of Proteases in Reverse Micelles, ETH Diss No. 9114, Eidgenssische Technische Hochschule Zrich, 1990 Walde, P., Giuliani, A.M., Boicelli, C.A., Luisi, P.L.: Phospholipid-Based Reverse Micelles, Chemistry and Physics of Lipids, 1990, 53, 265 288 El Seoud, O.A.: Acidities and Basicities in Reversed Micellar Systems in: Reverse Micelles: Biological and Technological Relevance of Amphiphilic Structures in Apolar Media (Luisi, P.L., Straub, B.E. eds.), Plenum Press, New York, 1984, 81 93 Higuchi, W.I., Misra, J.: Solubilization in Nonpolar Solvents - Influence of Chain Length of Solvent on Solubilization of Water by Diocryl Sodium Sulfosuccinate, Journal of Pharmaceutical Sciences, 1962, 51(5), 455 458 Rabie, H.R., Vera, J.H.: Generalized Water Uptake Modelling of Water-in-Oil Microemulsions. New experimental results for Aerosol-ot-Isooctane-water-salts systems, Fluid Phase Equilibria, 1996, 122, 169 186 Fletcher, P.D.I., Howe, A.M., Robinson, B.H.: The Kinetics of Solubilisate Exchange between Water Droplets of a Water-in-Oil Microemulsion, Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions I, 1987, 83, 985 1006 Pessoa Jr, A., Vitolo, M.: Recovery of Inulinase Using BDBAC Reversed Micelles, Proc. Biochem., 1998, 33(3), 291 297 Hanley, A.B., Grinfeld, E., Baxter, R.L.: The Cleavage of Nucleic Acids in Reversed Micelles Using Site Specific Endonucleases, Biocatalysis, 1990, 3, 253 258 Eicke, H.F., Shepherd, J.C.W., Steinemann, A.: Exchange of Solubilized Water and Aqueous-Electrolyte Solutions between Micelles in Apolar Media, Journal of Colloid and Interface Science, 1976, 56(1), 168 176 Pietrini, A.V.: Biochemical Reactions in Micro- and Nanocompartments, ETH Diss No. 15216, Eidgenssische Technische Hochschule Zrich, 2003 Pessoa Jr, A., Vitolo, M.: Separation of Inulinase from Kluyveromyces marxianus using Reversed Micellar Extraction, Biotechnol. Techn., 1997, 11(6), 421 422 Krei, G., Meyer, U., Brner, B., Hustedt, H.: Extraction of -Amylase Using BDBAC-Reversed Micelles, Bioseparation, 1995, 5, 175 183 Andrews, B.A., Pyle, D.L., Asenjo, J.A.: Effect of pH and Ionic Strength on the Partitioning of Four Proteins in Reversed Micelle Systems, Biotechnol. Bioeng., 1993, 43(11),1052 1058

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

200. 201. 202. 203. 204. 205. 206. 207. 208. 209. 210. 211. 212. 213. 214. 215. 216. 217. 218. 219. 220. 221. 222. 223. 224. 225. 226. 227. 228. 229. 230. Fletcher, P.D.I., Parrot, D.: The partitioning of proteins between water-in-oil microemulsions and conjugate aqueous phases, Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions I, 1988, 84(4), 1131 1144 Krei, G.A., Hustedt, H.: Extraktion von Enzymen Mittels Reverser Mizelle, Bio Engineering, 1992, 47(1), 99 111 Regalado, C., Asenjo, J.A., Pyle, D.L.: Studies on the Purification of Peroxidase from Horseradish Roots Using Reversed Micelles, Enz. Microb. Technol., 1996, 18(5), 332 339 Gklen, K.E., Hatton, T.A.: Liquid-liquid extraction of low-molecular weight proteins by selective solubilisation in reversed micelles, Sep. Sci. Technol., 1987, 22, 831 841 Marcozzi, G., Correa, N., Luisi, P.L., Caselli, M.: Protein Extraction by Reversed Micelles: a Study of the Factors Affecting the Forward and Backward Transfer of -Chymotrypsin and its Activity, Biotechnol. Bioeng., 1991, 38(10), 1239 1246 Andrews, B.A., Haywood, K.: Effect of pH, Ion Type and Ionic Strength on Partitioning of Proteins in Reversed Micelle Systems, J. Chromat. A, 1994, 668(1), 55 60 Pires, M.J., Aires-Barros, M.R., Cabral, J.M.S.: Liquid-Liquid Extraction of Proteins with Reversed Micelles, Biotechnol. Prog., 1996, 12(3), 290 301 Kilikian, B.V., Bastazin, M.R., Minami, N.M., Gonalves, E.M.R., Pessoa Jr., A.: Liquid-liquid extraction by reversed micelles in biotechnological processes, Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2000, 17(1), 29 38 Castro, M.J.M., Cabral, J.M.S.: Reversed Micelles in Biotechnological Processes, Biotech. Adv., 1988, 6, 151 167 Kadam, K.I.: Reversed Micelles as a Bioseparation Tool, Enzyme Microb. Technol., 1986, 8, 266 273 Chang, Q.L., Chen, J.Y.: Purification of Industrial -amylase by Reversed Micellar Extraction, Biotechnol. Bioeng., 1995, 48, 745 748 Chang, Q.L., Chen, J.Y., Zhang, X.F., Zhao, N.M.: Effect of the Cosolvent Type on the Extraction of Amylase with Reversed Micelles: Circular Dichroism Study, Enz. Microb. Technol., 1997, 20, 87 92 Regalado, C., Asenjo, J.A., Pyle, D.L.: Protein Extraction by Reversed Micelles: Studies on the Recovery of Horseradish Peroxidase, Biotechnol. Bioeng., 1994, 44, 674 681 Chang, Q.L. and Chen, J.Y.: Reversed Micellar Extraction of Trypsin: Effect of Solvent on the Protein Transfer and Activity Recovery, Biotechnol. Bioeng., 1995, 46, 172 174 Shiomori, K., Kawano, Y., Kuboi, R., Komasawa, I.: Effective Purification Method of Large Molecular Weight Proteins Using Conventional AOT Reversed Micelles, J. Chem. Eng., 1995 Dekker, M.: Enzyme recovery using reversed micelles, Ph.D. diss., Agricultural University of Wageningen, Department of Food Engineering, Wageningen, Netherlands, 1990 Dekker, M., Koenen, P.H.M., vant Riet, K.: Trans. I. Chem. Eng., 1991, 69(C), 54 Forney, C.E., Glatz, C.E.: Extraction of Charged Fusion Proteins in Reversed Micelles: Comparison between Different Surfactant Systems, Biotechnol. Prog., 1995, 11, 260 264 Leser, M.E., Wei, G., Luisi, P.L., Maestro, M.: Application of reverse micelles for the extraction of proteins, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, 135, 629 635 Wolbert, R.B.G., Hilhorst, R., Voskuilen, G., Nachtegaal, H., Dekker, M., vant Riet K., Bijsterbosch, B.H.: Protein transfer from an aqueous phase into reversed micelles: the effect of protein size and charge distribution, Eur. J. Biochem., 1989, 184, 627 633 Carlson, A., Nagarajan, R.: Biotechnol. Prog., 1992, 8, 85 Hu, Z., Gulari, E.: Protein extraction using the sodium bis(2-ethylhexyl) phosphate (NaDEHP) reverse micellar system, Biotechnol. Bioeng., 1996, 50(2), 203 206 Dekker, M., vantt Riet, K., Bijsterbosch, B.H., Fijneman, P., Hilhorst, R.: Mass transfer rate of protein extraction with reversed micelles, Chem. Eng. J., 1986, 33, B27 B33 Kelley, B., Wang, D.C., Hatton, T.A.: Affinity-based reversed micellar protein extraction. II: Effect of cosurfactant tail length, Biotechnol. Bioeng., 1993, 42(10), 1209 1217 Sun, Y., Ichikawa, S., Sugiura, S., Furusaki, S.: Affinity extraction of proteins with a reversed micellar system composed of Cibacron Blue-modified lecithin, Biotechnology and Bioengineering, 1998, 58(1), 58 64 Zhang, T., Lit, H., Chen, J.: Biochem. Eng. J., 1999, 4, 17 21 Hong, D.P., Lee, S.S., Kuboi, R.: Conformational transition and mass transfer in extraction of proteins by AOT-alcohol-isooctane reverse micellar systems, J. Chromatography B, 2000, 743(1-2), 203 312 Lee, S.-S., Lee, B.-K., Choi, J.-S., Lee, J.-P.: Effect of Alcohol Addition on Back-Extraction of BSA and Cytochrome c Using AOT Reverse Micellar System, Bull. Korean Chem. Soc. 2001, 22(8), 897 902 Dekker, M., vant Riet, K., Bijsterbosch, B.H., Wolbert, R.B.G., Hilhorst, R.: Mass transfer rate of protein extraction with reversed micelles, Chem. Eng. Sci., 1990, 45(9), 2949 2957 Nishiki, T., Sato, A., Kataoka, T.: Solv. Ext. in the Process Industries, 1993, 2, 840 Yamada, Y., Kuboi, R., Komasawa, I.: Extraction of enzymes and their activities in AOT reverse micellar systems modified with nonionic surfactants, J. Chem. Eng. Japan, 1994, 27(3), 404 409

Bibliografie
231. 232. 233. 234. 235. 236. 237. 238. 239. 240. 241. 242. 243. 244. 245. 246. 247. 248. 249. 250. 251. 252. 253. 254. 255. 256. 257. 258. Nishiki, T., Muto, A., Kataoka, T., Kato, D.: Back extraction of proteins from reversed micellar to aqueous phase : Partitioning behaviour and enrichment, Chemical Engineering Journal and The Biochemical Engineering Journal, 1995, 59(3), 297 301 Lye, G.J., Asenjo, J.A., Pyle, D.L.: Reverse micellar mass-transfer processes spray column extraction of lysozime, AIChE J., 1996, 42(3), 713 726 Lye, G.J., Asenjo, J.A., Pyle, D.L.: Protein extraction using reverse micelles: Kinetics of protein partitioning, Chem. Eng. Sci., 1994, 49(19), 3195 3204 Albery, W.J., Choudhery, R.A., Atay, N.Z., Robinson, B.H.: Rotating diffusion cell studies of microemulsions kinetics, J. Chem. Soc. Faraday Trans. I, 1987, 83(8), 2407 2419 Carneiro-da-Cunha, M.G., Aires-Barros, M.R., Tambourgi, E.B., Cabral, J.M.S.: Recovery of a Recombinant Cutinase with Reversed Micelles in a Continuous Perforated Rotating Disc Contactor, Biotechnol. Techn., 1994, 8, 413 418 Han, D.H., Lee, S.J., Hong, W.H.: Separation of Intracellular Proteins from Candida utilis Using Reversed Micelles in a Spray Column, Biotechnol. Techn., 1994, 8, 105 110 Jarudilokkul, S., Stuckey, D.C.: Continuous forward and back extraction of lysozyme from egg white using reverse micelles, Separation Science and Technology, 2001, 36(4), 657 669 Lo, T.C.: Commercial liquid-liquid extraction equipment in: Handbook of Separation Techniques for Chemical Engineers (Schweitzer, P.A. ed.), McGraw-Hill, New York, 1988 Kelley, B.D., Wang, D.I.C., Hatton, T.A.: Affinity-based reversed micellar protein extraction. I: Principles and protein-ligand systems Biotechnol. Bioeng., 1993, 42(10), 1199 1208 Pires, M.J., Cabral, J.M.S.: Liquid-liquid extraction of a recombinant protein with reverse micelles, J. Chem. Technol. Biotechnol., 1994, 61(3), 219 224 Chaudhuri, J.B.: 2nd Interlaken Conference on Advances in Purification of Recombinant Proteins, Interlaken, Switzerland, March, 1991 Giovenco, S., Verheggen, F., Laane, C.: Purification of intracellular enzymes from whole bacterial cells using reversed micelles, Enz. Microb. Technol., 1987, 9, 470 473 Han, D.H., Lee, Y.S., Hong, W.H., Direct Recovery of Intracellular Proteins from Candida utilis Using Reversed Micelles in Combination with a Reducing Agent, Biotechnol. Techn., 1993, 8, 545 550 Hagen, A.J., Hatton, T.A., Wang, D.I.C.: Protein refolding in reversed micelles, Biotechnol. Bioeng., 1990, 35(10), 955 965 Hagen, A.J., Hatton, T.A., Wang, D.I.C.: Protein refolding in reversed micelles: interactions of the protein with micelle components, Biotechnol. Bioeng., 1990, 35(10), 966 975 Guzmn, F., Barberis, S., Illanes, A.: Peptide synthesis: chemical or enzymatic, Electronic Journal of Biotechnology, 2007, 10(2), 279 314, disponibil la: http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue2/full/13/ Nametkin, S.N., Kolosov, M.I., Ovodov, S.Y., Alexandrov, A.N., Levashov, A.V., Alakhov, V.Y., Kabanov, A.V.: Cell-Free Translation in Reversed Micelles, FEBS Letters, 1992, 309(3), 330 332 Haering, G., Pessina, A., Meussdoerffer, F., Hochkoeppler, S., Luisi, P.L.: Solubilization of Bacterial-Cells in Organic-Solvents via Reverse Micelles and Microemulsions, Annals of the New York Academy of Sciences, 1987, 506, 337 344 Tawfik, D.S., Griffiths, A.D.: Man-Made Cell-Like Compartments for Molecular Evolution, Nature Biotechnology, 1998, 16(7), 652 656 Griffiths, A.D., Tawfik, D.S.: Miniaturising the laboratory in emulsion droplets, Trends in Biotechnology, 2006, 24(9), 395 402 Sebba, F.: Sep. Sci. Techol., 1985, 20, 331 Sebba, F.: Foams and Biliquid Foams: Aphrons, Wiley, New York, 1987 Lee, D.W., Hong, W.H., Hwang, K.Y.: Removal of an Organic Dye from Water Using a Predispersed Solvent Extraction, Separation Science and Technology, 2000, 35(12), 1951 1962 Kommalapati, R.R., Roy, D., Valsaraj, K.T., Constant, W.D.: Characterization of colloidal gas aphron suspensions generated from plant-based natural surfactant solutions, Separation Science and Technology, 1996, 31, 2317 2333 Bredwell, M.D., Worden, R.M.: Mass transfer properties of microbubbles: 1. Experimental studies, Biotechnology Progress, 1998, 14, 31 38 Kommalapati, R.R., Valsaraj, K.T., Constant, W.D., Roy, D.: Soil flushing using colloidal gas aphron suspensions generated from a plant-based surfactant, Journal of Hazardous Materials, 1998, 60, 73 78 Roy, D., Valsaraj, K.T., Constant, W.D., Darji, M.: Removal of hazardous oily waste from a soil matrix using surfactants and colloidal gas aphron suspensions under different flow conditions, Journal of Hazardous Materials, 1994, 38, 127 144 Jutaporn, P., Jarudilokkul, S., Vitaya, V.B: Removal of Pyrene in Pumice by Biodegradable Surfactant in the Forms of Colloidal Gas Aphron and Aqueous Solution, Paper 9-016 (P), Proceedings of the 2nd Regional Conference on Energy Technology Towards a Clean Environment, 12-14 February 2003, Phuket, Thailand

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

259. 260. 261. 262. 263. 264. 265. 266. 267. 268. 269. 270. 271. 272. 273. 274. 275. 276. 277. 278. 279. 280. 281. 282. 283. 284. 285. 286. 287. 288. 289. 290. 291. Roy, D., Kommalapati, R.R., Valsaraj, K.T., Constant, W.D.: Soil flushing of residual transmission fluid: application of colloidal gas aphron suspensions and conventional surfactant solutions, Water Research, 1995, 29, 589 595 Ciriello, S., Barnett, S.M., Deluise, F.J.: Removal of heavy-metals from aqueous-solutions using microgas dispersions, Separation Science and Technology, 1982, 4, 521 534 Cabezon, L.M., Caballero, M., Diaz, J.M., Perezbustamante, J.A.: Multi-elemental separation and determination of some heavy-metals (Cu, Co, Cd, and Ni) in tap water and high salinity media by CGA (Colloidal Gas Aphron) coflotation, Analysis, 1991, 4, 123 127 Roy, D., Valsaraj, K.T., Kottaisa, S.A.: Separation of organic-dyes from waste-water by using colloidal gas aphrons, Separation Science and Technology, 1992, 27, 573 588 Basu, S., Malpani, P.R.: Removal of methyl orange and methylene blue dye from water using colloidal gas aphron effect of processes parameters, Separation Science and Technology, 2001, 36(13), 2997 3013 Cilliers, J.J., Bradshaw, D.J.: The flotation of fine pyrite using colloidal gas aphrons, Minerals Engineering, 1996, 9, 235 241 Subramaniam, M.B., Blakebrough, N., Hashim, M.A.: Clarification of suspensions by colloidal gas aphrons, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1990, 48, 41 60 Hashim, M.A., Sengupta, B., Subramaniam, M.B.: Investigations of the flotation of yeast-cells by colloidal gas aphrons (CGA) dispersions, Bioseparation, 1995, 5, 167 173 Jauregi, P., Varley, J., Gilmour, S.: Characterization of gas aphrons for subsequent use for protein recovery, Chemical Engineering Journal, 1997, 65, 1 11 Jauregi, P., Varley, J.: Colloidal gas aphrons: A novel approach to protein recovery, Biotechnology and Bioengineering, 1998, 59, 471 481 Noble,M., Brown, A., Jauregi, P., Kaul, A., Varley, J.: Protein recovery using gasliquid dispersions, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1998, 711(1-2), 31 43 Amiri, M.C., Valsaraj, K.T.: Effect of gas transfer on separation of whey protein with aphron flotation, Separation and Purification Technology, 2004, 35, 161 167 Jarudilokkul, S., Rungphetcharat, K., Boonamnuayvitaya, V.: Protein separation by colloidal gas aphrons using nonionic surfactant, Separation and Purification Technology, 2004, 35, 23 29 Jauregi, P.: Recovery of value added food products using colloidal gas aphrons, SCI London, 30th March, 2006 Fuda, E., Bhatia, D., Jauregi, P.: Selective separation of -lactoglobulin from sweet whey using CGAs generated from the cationic surfactant CTAB, Biotechnology and Bioengineering, 2005, 90(5), 532 542 Jauregi, P., Varley, J.: Colloidal gas aphrons: potential applications in biotechnology, Trends in Biotechnology, 1999, 17, 389 395 Tseng, H., Pilon, L., Warrier, G.R.: Rheology and convective heat transfer of colloidal gas aphrons in horizontal mini-channels, International Journal of Heat and Fluid Flow, 2006, 27, 298 310 Perescu, N.: Chimia extraciei cu solveni i aplicaii, Ed. Academiei, Bucureti, 1985 Wang, J., Langemann, H.: Unsteady two-film model for mass transfer accompanied by chemical reaction, Chemical Engineering Science, 1994, 49(20), 3457 3463 Lewis, W.K., Whitman, W.G.: Principles of gas absorption, Industrial Engineering Chemistry, 1924, 16, 1215 Bart, H.-J., Stevens, G.W.: Reactive Solvent Extraction in: Ion Exchange and Solvent Extraction (Marcus, Y., SenGupta, A.K., Marinski, J.A. eds.), 17, Marcel Dekker, New York, 2004 Schfer, J.P., Sluyts, D.: VDI-Jahrbuch; VDI/GVC, VDI-Verlag, Dsseldorf, 1996, 285 295 Ritcey, G.M.: in Value Adding Through Solvent Extraction (Shallcross, D.C., Paimin, R., Prvcic, L.M. eds.), The University of Melbourne, Melbourne, 1996, 17 24 Cox, M.: Solvent Extraction in Hydrometallurgy in: Solvent Extraction Principles and Practice (Rydberg, J., Cox, M., Musicas, C., Choppin, G.R. eds.), 2nd ed., Marcel Dekker, New York, 2004 Jercan, E.: Metode de separare n chimia analitic, Ed. Tehnic, Bucureti, 1983 Gavril, L.: Elaborarea unor tehnologii de recuperare a nichelului sub form de sulfat de nichel, clorur de nichel sau nichel metalic, din soluiile provenite de la dezagregarea catalizatorilor uzai referat n cadrul tezei de doctorat, Universitatea Tehnic Gh. Asachi Iai, 1994 Pedersen, C.J.: The Discovery of Crown Ethers, Nobel lecture, December 8, 1987, disponibil la: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1987/pedersen-lecture.pdf Gutsche, D.: Calixarenes: a personal history, in: Calixarenes in the nanoworld (Vicens, J., Harrowfield, J., Baklouti, L. eds.), Springer, Doordrecht, 2007, 1 20 * * * Crown ether, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Crown_ethers * * * Valinomycin, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Valinomycin Gamse, T.: Liquid Liquid Extraction and Solid Liquid Extraction, Graz University of Technology, 2002, disponibil la: www.iq.uva.es/separacion/archivos/SkriptumExtraction.pdf Halwachs, W.: Reaktivextraktion, Habilitationsschrift, Universitt Hannover, 1981, disponibil la: www.halwachs.de/solvent-extraction.htm Sattler, K., Feindt, H.J.: Thermal Separation Processes: Principles and Design, VCH, Weinheim, 1995

Bibliografie
292. 293. 294. 295. 296. 297. 298. Hano, T., Matsumoto, M., Ohtake, T., Sasaki, K., Hare, F., Kawano, Y.: Extraction equilibria of organic acids with tri-n-octylphosphineoxide, J. Chem. Eng. Jpn., 1990, 23(6), 734 738 Pagel, H.A., McLafferty, F.W.: Anal. Chem., 1948, 20, 272 Pagel, H.A., Schwab, K.D.: Anal. Chem., 1950, 22, 1207 Marcus, Y., Kertes, A.S.: Ion Exchange and Solvent Extraction of Metal Complexes, Wiley-Interscience, London, 1969 Putemans, M., Dryon, L., Massart, D.C.: Analytica Chimica Acta, 1984, 161, 221 Lukhezo, M., Dunne, L.J., Reuben, B.G., Verrall, M.S.: Statistical mechanical treatment of reactive solvent extraction, Chemical Physics, 1997, 220, 53 61 Kumar, S., Babu, B.V., Wasewar, K.L.: Recovery of Propionic Acid using Reactive Extraction, Indian Chemical Engineering Congress, CHEMCON 2006, 27 30 dec. 2006, Ankleshwar, India, disponibil la: http://discovery.bits-pilani.ac.in/discipline/chemical/BVb/ RE_SK_BVB_KLW_ Chemcon2006_FullPaper.pdf Yang, S.-T., White, S.A., Hsu, S.-T.: Extraction of carboxylic acids with tertiary and quaternary amines: effect of pH, Ind. Eng. Chem. Res., 1991, 30(6), 1331 1335 Castiblanco, D.A., Martnez, M., Serrato, J.C., Bejarano, P.J.: Estudio de la extraccin reactiva de cido lctico con el sistema trioctilamina-isodecanol, XXII Interamerican Congress of Chemical Engineering, 1 4 oct. 2006, Buenos Aires, Argentina, disponibil la: http://dpi.eq.ufrj.br/ciaiq_22/CD/formCrCongreso/papers/13a/13a_383.pdf Schgerl, K.: Extraction of Primary and Secondary Metabolites, Advanced in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 2005, 92, 1 48 Oniscu, C., Mereu, A., Cacaval, D., Duca, G.: Selective Separation of Organic Oxyacids from Aqueous Phase by Reactive Extraction, Romanian Biotechnological Letters, 2002, 7(5), ediie electronic, disponibil la: http://www.unibuc.ro/eBooks/biologie/RBL/Archive/2002/nr5/art8.htm Mereu, A.: Optimizarea tehnologiei de obinere a unor oxiacizi din deeurile oenologice, Tez de doctorat, Universitatea de Stat din Moldova, Chiinu, 2004 von Frieling, P., Schgerl, K.: Recovery of lactic acid from aqueous model solutions and fermentation broths, Process Biochemistry, 1999, 34(6-7), 685 696 Hong, Y.K., Hong, W.H., Chang, H.N.: Selective extraction of succinic acid from binary mixture of succinic acid and acetic acid, Biotechnological Leters, 2000, 22, 871 874 Hong, Y.K., Hong, W.H.: Removal of acetic acid from aqueous solutions containing succinic acid and acetic acid by tri-n-octylamine, Separation and Purification Technology, 2005, 42, 151 157 Song, H., Lee, S.Y.: Production of succinic acid by bacterial fermentation, Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39, 352 361 Huh, Y.S., Jun, Y.-S., Hong, Y.K., Song, H., Lee, S.Y., Hong, W.H.: Effective purification of succinic acid from fermentation broth produced by Mannheimia succiniciproducens, Process Biochemistry, 2006, 41, 1461 1465 Baniel, A.M., European Patent, no. EP 49429, 1982; Chem. Abs., 97, 109557, 1982 Nelson, D.L., Cox, M.M.: Lehninger Principles of Biochemistry, 4th ed., W.H. Freeman, 2004 Itoh, M., Thien, M.P., Hatton, T.A., Wang, D.I.C.: A liquid emulsion membrane process for the separation of amino acids, Biotechnol. Bioeng., 1990, 35(9), 853 - 860 Shinkai, S., Inuzuka, K., Hara, K., Stone, T., Manabe, O.: Bull. Chem. Soc. Jpn., 1984, 57, 2150 Shinkai, S., Minami, T., Araragi, Y., Manabe, O.: J. Chem. Perkin Trans. II, 1985, 503 Mutihac, L., Mutihac, R., Constantinescu, T., Luca, C.: The transport of amino acids by 18-crown-6 through liquid membranes, Journal of inclusion phenomena and molecular recognition in chemistry, 1994, 17(1), 45 51 Hermann, T.: Industrial production of amino acids by coryneform bacteria, Journal of Biotechnology, 2003, 104, 155 172 Cacaval, D., Oniscu, C., Galaction, A.-I.: Selective separation of amino acids by reactive extraction, Biochemical Engineering Journal, 2001, 7(3), 171 176 Kelly, N.A., Lukhezo, M., Reuben, B.G., Dunne, L.J., Verrall, M.S.: Reactive solvent extraction of amino acids with cationic extractants, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1998, 72(4), 347 355 Eyal, A.M., Kogan, L., Bressler, E.: Extraction of metal salts by mixtures of water-immiscible amines and organic acids (acid-base couple extractants). I: A review of distribution and spectroscopic data and of proposed extraction mechanisms, Industrial & Engineering Chemistry Research, 1994, 33(5), 1067 1075 Eyal, A.M., Kogan, L., Bressler, E.: Extraction of metal salts by mixtures of water-immiscible amines and organic acids (acid-base couple extractants). II: Theoretical treatment and analysis, Industrial & Engineering Chemistry Research, 1994, 33(5), 1076 1085 Eyal, A.M.: Acid extraction by acid-base coupled extractants, Solvent Extraction and Ion Exchange,1995, 13, 31 93 Syzova, N., Eyal, A.M., Vitner, A., Hazan, B.: Extraction of dicarboxylic acids by ABC extractants, Solvent Extraction and Ion Exchange, 2004, 22(1), 51 67

299. 300.

301. 302. 303. 304. 305. 306. 307. 308. 309. 310. 311. 312. 313. 314. 315. 316. 317. 318. 319. 320. 321.

10

TEHNICI DE SEPARARE I CONCENTRARE N BIOTEHNOLOGII

322. 323. 324. 325. 326. 327. 328. 329. 330. 331. 332. 333. 334. 335. 336. 337. 338. 339. 340. 341. 342. 343. 344. 345. 346. 347. 348. 349. 350. 351. 352. 353. 354. 355. 356. Eyal, A.M., Cohen-Sydov, N.: Process for the separation of amino acids and their salts from an aqueous solution, US Patent 6171501, 2001 Smirnova, S., Torocheshnikova, I., Formanovsky, A., Pletnev, I.: Solvent extraction of amino acids into a room temperature ionic liquid with dicyclohexano-18-crown-6, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004, 378(5), 1369 1375 Metzger, A., Gloe, K., Stephan, H., Schmidtchen, F.P.: Molecular recognition and phase transfer of underivatized amino acids by a foldable artificial host, J. Org. Chem., 1996, 61(6), 2051 2055 Jeong, K.-S., Park, T.-Y.: Complexation and transport of zwitterionic amino acids by an artificial receptor, Bull. Korean Chem. Soc., 1999, 20(2), 129 131 Tsukube, H., Wada, M., Shinoda, S., Tamiaki, H.: Porphyrinatoerbiumcrown ether conjugate for synergistic binding and chirality sensing of zwitterionic amino acids, Chem. Commun., 1999, 1007 1008 Oshima, T., Goto, M., Furusaki, S.: Extraction behavior of amino acids by calix[6]arene carboxylic acid derivatives, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2002, 43(1-2), 77 86 Oshima, T., Inoue, K., Uezu, K., Goto, M.: Dominant factors affecting extraction behavior of amino compounds by a calix[6]arene carboxylic acid derivative, Analytica Chimica Acta, 2004, 509(2), 137 144 Tabakci, M., Tabakci, B., Yilmaz, M.: Design and synthesis of new chiral calix[4]arenes as liquid phase extraction agents for -amino acid methylesters and chiral -amines, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2005, 53(1-2), 51 56 Puttemans, M., Dryon, L., Massart, D.C.: Anal. Chim. Acta, 1984, 161, 221 Likidis, Z., Schgerl, K.: Bioprocess Engineering, 1988, 3(2), 79 Likidis, Z., Schgerl, K.: Chemical Engineering Science, 1988, 43(1), 27 Wei, L.S.: Reactive extraction of antibiotics: equilibrium and kinetic study, Thesis, Faculty of Chemical and Natural Resource Engineering, University of Technology, Malaysia, 2005 Bora, M.M., Dutta, N.N., Bhattacharya, K.G.: Extraction equilibria of Cephalosporin antibiotics with Aliquat 336, Journal of Chemical and Engineering Data, 2000, 45(2), 399 403 Hano, T., Matsumoto, M., Ohtake, T., Hori, F.: Reactive extraction of Cephalosporin C, Journal of Chemical Engineering of Japan, 1992, 25(3), 293 297 Harris, T.A.J., Khan, S., Reuben, B.G., Shokaya, T.: Sep. Biotechnol., 2, Elsevier, London, 1990, 172 Bora, M.M., Ghosh, A.C., Dutta, N.N., Mathur, R.K.M.: Reactive extraction of 6-aminopenicillanic acid with Aliquat-366: Equilibrium and kinetics, Canadian Journal of Chemical Engineering, 1997, 75(3), 520 526 Cacaval, D., Oniscu, C., Galaction A.-I.: Separation of 6-Aminopenicillanic Acid by Reactive Extraction, Romanian Biotechnological Letters, 2002, 7(5), 917 924 * * * Gluconic acid, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Gluconic_acid Inci, I.: Extraction of gluconic acid with organic solutions of Alamine 336, Chem. Biochem. Eng. Q., 2002, 16(4), 185 189 * * * Cinnamic acid, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Cinnamic_acid Cmru, M., Galaction, A.-I., Cacaval, D.: Separation of trans-cinnamic acid by reactive extraction with Amberlite LA-2 in low-polar solvent. 1. Mechanism of separation process, Romanian Biotechnological Letters, 2006, 11(5), 2897 2903 Garbe, D.: Cinnamic Acid in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th ed., electronic release, Wiley Interscience, New York, 2002 Folkers, K.: Int. J. Vitam. Nutr. Res., 1969, 39, 334 Galaction, A.-I., Cacaval, D.: Metabolii secundari cu aplicaii farmaceutice, cosmetice i alimentare, Casa de Editur Venus, Iai, 2006 Blum, R.: Niacin (Nicotinic Acid, Nicotinamide) in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th ed., electronic release, Wiley Interscience, New York, 2002 Kumar, S., Wasewar, K.L.: Intensification of recovery of nicotinic acid using reactive extraction: Equilibrium study, 59th Indian Chemical Engineering Congress, Chemcon 2006, 27 30 Dec. 2006, BharuchAnkhleshwar, Gujarat, India *** Folic Acid, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Folic_acid Brody, T., Shane, B.: Folic Acid in: Handbook of Vitamins, 3rd ed. (Rucker, R.B., Suttie, J.W., McCormick, D.B., Machlin, L.G. eds.), Marcel Dekker, New York, 2001 Weimann, B.J., Hengartner, U., de Saizieu, A., Wehrli, C.: Folic Acid in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th ed., electronic release, Wiley Interscience, New York, 2002 Galaction, A.-I., Blaga, A.-C., Cacaval, D.: Kinetic study of folic acid reactive extraction, Romanian Biotechnological Letters, 2005, 10(4), 2283 2290 * * * Vitamin C, disponibil la: http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C Harris, R.J.: Ascorbic Acid: Subcellular Biochemistry, Springer, Berlin, 1996 Oster, B., Fechtel, U.: Vitamin C (L- Ascorbic Acid) in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th ed., electronic release, Wiley Interscience, New York, 2002 * * * BASF, Annual Report, 2003, Appendix 4.2, 5.1. Blaga, A.-C., Galaction, A.-I., Folescu, E., Cacaval, D.: Separation of vitamin C by reactive extraction 1. Mechanism and influencing factors, Romanian Biotechnological Letters, 2004, 9(6), 1917 1924

11

Bibliografie
357. 358. 359. 360. 361. 362. 363. 364. 365. 366. 367. 368. 369. 370. 371. 372. 373. 374. 375. 376. Blaga, A.-C., Galaction, A.-I., Cacaval, D.: Kinetic study of vitamin C reactive extraction with Amberlite LA-2, Bull. Inst. Pol. Iai, 2005, 50(3-4), Blaga, A.-C., Galaction, A.-I., Cacaval, D.: Separation of vitamin C by reactive extraction 2. Mathematical modeling of extraction process, Romanian Biotechnological Letters, 2004, 9(6), 1939 1946 Steensma, M.: Chiral separation of amino-alcohols and amines by fractional reactive extraction, PhD Thesis, University of Twente, 2005 Schmidt, K.F.: Mirror-image molecules: new techniques promise more potent drugs and pesticides controlling the "handedness" of enantiomers, Science News, 29 Mai, 1993 Guiu Rozas, E.: Tunable chiral ligands for Ir and Rh hydrogenation processes. Synthesis of enantioamerically enriched amines, PhD Thesis, Universitat Rovira i Virgili, 2003 Takeuchi, T., Horikawa, R., Tanimura, T., Kabasawa, Y.: Resolution of DL-valine by countercurrent solvent extraction with continuous sample feeding, Separation Science and Technology, 1990, 25(7-8), 941 951 Sheldon, R.A.: Chirotechnology, Industrial synthesis of optically active compounds, Marcel Dekker Inc., New York, 1993 Takeuchi, T., Horikawa, R., Tanimura, T.: Enantioselective solvent extraction of neutral DL-amino acids in two-phase systems containing N-n-alkyl-L-proline derivatives and copper(II) ion, Analytical Chemistry, 1984, 56, 1152 1155 Pickering, P.J., Chaudhuri, J.B.: Equilibrium and kinetic studies of the enantioselective complexation of (D/L)-phenylalanine with copper (II) N-decyl-(L)-hydroxiproline, Chemical Engineering Science, 1997, 52(3), 377 386 Nishizawa, H., Tahara, K., Hayashida, A., Abe, Y.: Continuous separation method with liquid particle extractor: enantioseparation of ()-mandelic acid, Anal. Sci., 1993, 9(5), 611 615 Jiao, F., Huang, K., Yuan, X., Zhao, X., Yu, J.: Extraction and separation of racemic -cyclohexyl-mandelic acid using chiral ligand as selector, Pakistan Journal of Biological Sciences, 2006, 9(6), 1149 1153 Steensma, M., Kuipers, N.J.M., de Haan, A.B., Kwant, G.: Identification of enantioselective extractants for chiral separation of amines and aminoalcohols, Chirality, 2006, 18(5), 314 328 Steensma, M., Kuipers, N.J.M., de Haan, A.B., Kwant, G.: Modelling and experimental evaluation of reaction kinetics in reactive extraction for chiral separation of amines, amino acids and amino-alcohols, Chemical Engineering Science, 2007, 62(5), 1395 1407 Tang, K.-W., Chen, G.-B., Yi, J.-M., Zhang W.-Z.: Enantioselective separation of ofloxacin enantiomers by chiral ligand exchange, Huaxue xuebao, 2004, 62(17), 1621 1625 Abe, Y., Shoji, T., Kobayashi, M., Qing, W., Asai, N., Nishizawa, H.: Enantioselective distribution of aminoalcohols in a liquid-liquid two-phase system containing dialkyl L-tartrate and boric acid, Chem. Pharm. Bull., 1995, 43(2), 262 265 Abe, Y., Shoji, T., Fukui, S., Sasamoto, M., Nishizawa, H.: Enantioseparation by dual-flow countercurrent extraction: its application to the enantioseparation of (6)propanolol, Chem. Pharm. Bull., 1996, 44(8), 1521 1524 Prelog, V., Stojanac, Z., Kovacevic, K.: ber die Enantiomerentrennung durch Verteilung zwischen flssigen Phasen, Helv. Chim. Acta., 1982, 65(1), 377 384 Prelog, V., Mutak, S., Kovacevic, K.: ber die Enantiomerentrennung durch Verteilung zwischen flssigen Phasen, 3. Mitteilung, Selektivitt der lipophilen Weinsareester fr chirale Ammonium-Salze verschiedener Konstitution und Konfiguration, Helv. Chim. Acta., 1983, 66(7), 2279 2284 Prelog, V., Kovacevic, M., Egli, M.: Lipophilic tartaric acid esters as enantioselective ionophores, Angew. Chem. Int. Ed., 1989, 28, 1147 1152 Ogasahara, K., Hirose, K., Tobe, Y., Naemura, K.: Preparation of optically active azophenolic crown ethers containing 1-phenylethane-1,2-diol and 2,4-dimethyl-3-oxapentane-1,5-diol as a chiral subunit: temperaturedependent enantiomer selectivity in the complexation with chiral amines, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 3227 3236 Hirose, K., Nakamura, T., Nishioka, R., Ueshige, T., Tobe, Y.: Preparation and evaluation of novel chiral stationary phases covalently bound with chiral pseudo-18-crown-6 ethers, Tetrahedron Letters, 2003, 44, 1549 1551 Naemura, K., Nishikawa, Y., Fuji, J., Hirose, K., Tobe, Y.: Tetrahedron: Asymmetry, 1997, 8, 873 Kim, J., Song, S., Kim, J., Kim, T.H., Kim, H., Suh, H.: Synthesis of chiral azophenolic pyridino-18-crown-6 ether and its enantiomeric recognition toward chiral primary amines, Bull. Korean Chem. Soc., 2006, 27(10), 1577 1580 Steensma, M., Kuipers, N.J.M., de Haan, A.B., Kwant, G.: Influence of process parameters on extraction equilibria for the chiral separation of amines and amino-alcohols with a chiral crown ether, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2006, 81(4), 588 597 Kuipers, N.J.M., Steensma, M., de Haan, A.B., Kwant, G.: Chiral separation of amines and aminoalcohols by fractional reactive extraction, Chemie Ingenieur Technik, 2006, 78(9), 1378

377. 378. 379. 380. 381. 382.

12