Sunteți pe pagina 1din 23

ENZIME

n organismele vii, mii de reacii chimice se desfoar foarte rapid n condiiile de presiune i temperatur ale acestuia. Toate aceste transformri sunt mediate de enzime (denumite iniial fermeni sau diastaze), proteine specializate s catalizeze reaciile metabolice. Substanele transformate n aceste reacii se caracterizeaz printr-o tendin limitat de reacie in vitro n aceleai condiii cu cele din organism. De exemplu, oxidarea glucozei n celule se realizeaz rapid, glucoza fiind un compus ce nmagazineaz o mare cantitate de energie prezentnd un anumit potenial termodinamic, dei n laborator, n aceleai condiii ca cele din organism, aceasta este stabil n prezena oxigenului. Astfel de procese, favorabile termodinamic, pot decurge cu viteze crescute datorit aciunii catalitice a enzimelor. Caracteristicile enzimelor Enzimele pot fi definite biocatalizatori care prezint urmtoarele trsturi caracteristice: 1. Enzimele au o putere catalitic enorm accelernd viteza reaciilor cu pn la 1016 fa de viteza reaciei necatalizate. Aceast capacitate depete puterea oricrui catalizator folosit n sinteza organic. Enzimele au aceast imens putere catalitic n soluii diluate, n condiii moderate de pH i temperatur. Puterea catalitic poate fi definit ca raportul ntre viteza reaciei catalizate i viteza reaciei necatalizate enzimatic. 2. Enzimele nu se consum i nu se transform n reaciile catalizate. 3. Enzimele se caracterizeaz printr-o mare specificitate. Orice enzim este foarte selectiv att n ceea ce privete substana pe care o transform (substrat) ct i din punctul de vedere al reaciei catalizate. E (enzim) Transformarea S P (produi) se desfoar fr reacii secundare, astfel c rezult numai compuii dorii. Prin aceast aciune enzimele se deosebesc de catalizatorii din chimia organic, reaciile desfurate n absena enzimelor avnd randamente mai sczute i fiind nsoite de reacii secundare. 4. Enzimele scad energia de activare a moleculelor de substrat pe care le transform accelernd astfel viteza reaciei biochimice. 5. Capacitate de reglare. Reglarea activitii enzimatice se realizeaz n moduri diferite ce variaz de la controlul cantitii de enzim sintetizate de celul pn la modularea activitii sale prin interaciuni reversibile cu activatori i inhibitori metabolici. Activitatea variat a enzimelor poate fi pus pe seama capacitii de adaptare structural i funcional a proteinelor. Enzimele contribuie astfel la coordonarea i reglarea proceselor metabolice. 7. Enzimele se gsesc n celule i acioneaz n cantitate foarte mic dar cu efect semnificativ. 8. Enzimele pot cataliza reaciile n condiiile organismului, la temperatura de aproximativ 37oC, n condiii de n general neutru i la presiune atmosferic. Nomenclatura i clasificarea enzimelor La nceputurile enzimologiei au fost caracterizate n special enzime ce catalizau reacii de hidroliz a legturilor covalente din diverse substraturi i, de aceea, erau denumite prin adugarea sufixului az la numele substratului asupra cruia acionau. De exemplu: ureaz (enzima care hidrolizeaz ureea), lipaz (hidrolizeaz lipidele), fosfataz (hidrolizeaz legturile fosfat din compuii organici cu grupe fosfat), amilaz (care hidrolizeaz amidonul), proteaze (enzime care scindeaz proteinele), etc. Altele erau denumite cu numele uzuale mai vechi: pepsin, tripsin, etc. Aceast nomenclatur a condus la o serie de confuzii i, din acest motiv, Comisia pentru Enzime a Uniunii Internaionale de Biochimie a introdus n 1956 o baz sistematic pentru denumirea enzimelor. n prezent fiecrei enzime i este atribuit un numr de cod i un nume sistematic.

Numrul de cod are 4 cifre precedate de prescurtarea EC (Enzyme Comission) ce indica: prima cifr - clasa de enzime (n funcie de reacia catalizat); a doua cifr subclasa (d indicaii asupra donorului din reacie); a treia cifr subsubclasa (face referire la natura acceptorului din reacie); a patra cifr indic enzima individual. n funcie de reacia pe care o catalizeaz, miile de enzime sunt repartizate n 6 clase: 1. Oxidoreductaze; 2. Transferaze; 3. Hidrolaze;4. Liaze; 5. Izomeraze; 6. Ligaze Numele sistematic conine informaii referitoare la : a.natura donorului; b.natura acceptorului; c.tipul reaciei catalizate. 1. Oxidoreductazele catalizeaz reacii de oxidoreducere, prin care se transfer hidrogen sau electroni ntre dou substraturi. Cifra subclasei indic donorii echivalenilor de reducere: 1.1-alcool; 1.2-aldehide sau cetone;1.3-catene hidrocarbonate;1.4-amin primar; 1.6-formele reduse NADH (NADPH), H+. Cifra a treia se refer la acceptorul de hidrogen sau electroni: 1.1.1.- NAD+(NADP+) etc. Oxidoreductazele din subclase diferite au i nume uzuale: oxidaze, peroxidaze, dehidrogenaze, monoxigenaze. Coenzimele oxidoreductazelor sunt diferite: NAD+, NADP+, FAD, FMN, citocromii etc. Exemplu: EC 1.1.1.27 L-lactat: NAD+oxidoreductaza (uzual lactat dehidrogenaza). L-lactat + NAD+ = piruvat + NADH + H+ 2. Transferazele sunt enzime care catalizeaz transferul unor grupe variate ntre dou substraturi. Numele acestora este n funcie de natura grupei transferate: metiltransferaze, aminotransferaze, formiltransferaze, fosfotransferaze. A doua cifr indic tipul de grup transferat: 2.1- grup cu un atom de carbon; 2.2-grupe aldehidice sau cetonice; 2.6-grupe ce conin azot etc. A treia cifr descrie exact grupa care este transferat n cazul n care subclasa presupune mai multe grupe: 2.1.1-metil transferaze, 2.1.2-hidroximetil transferaze, 2.6.1-amino transferaze. Coenzimele transferazelor sunt numeroase: piridoxal fosfatul, tiamin pirofosfatul, coenzima A, acizii folici, coenzimele B12, biotina, S-adenozil metionina, ATP etc. Exemplu: EC 2.7.1.2 ATP:D-glucozo-6-fosfotransferaz (glucokinaz) D-glucoz + ATP = D-glucozo-6-fosfat + ADP Pentru fosfotransferazele ce necesit ATP ca donor de grupe fosfat se mai utilizeaz denumirea uzual kinaz. 3. Hidrolazele sunt enzime care particip la hidroliza unor legturi diverse, fiind subclasificate (a doua cifr) n funcie de natura acestora: 3.1-legtur esteric (esteraze); 3.2-legtur glicozidic (glicozidaze); 3.3-legtur fosfat (fosfataze); 3.4-legtur peptidic (peptidaze) etc. A treia cifr indic mai exact tipul de legtur hidrolizat. Exemplu: EC 3.1.3.9 D-glucozo-6-fosfat-fosfohidrolaza (glucozo-6-fosfataza) D-glucozo-6-fosfat + H2O = D-glucoz + Pi 4. Liazele sunt enzime care particip la formarea unor legturi duble C-C, C-N, C-O, prin ndeprtarea nehidrolitic a unor grupe din substrat. A doua cifr indic tipul legturii: 4.1-C-C, 4.2-C-O, 4.3-C-N, 4.4-C-S. A treia cifr face referire la natura grupei ndeprtate: 1carboxil, 2-aldehid etc. Se poate face referire la acestea i folosind denumirile uzuale: aldolaze, hidrataze, sintaze, decarboxilaze. Exemplu: EC 4.1.1.22 L-histidin-carboxi-liaz (histidin decarboxilaza) Histidin = Histamin + CO2 5. Izomerazele sunt enzime care permit desfurarea reaciilor de izomerizare fiind subclasificate n funcie de tipul reaciei catalizate: 5.1-racemaze i epimeraze; 5.2-izomeraze cistrans; 5.4-mutaze. A treia cifr indic tipul de molecul ce este supus izomerizrii. Exemplu: EC 5.1.1.1 Alaninracemaza transform L-alanina n D-alanin. 2

6. Ligazele sunt enzime care intervin n formarea unor noi legturi C-C, C-O, C-N, C-S folosind ATP-ul ca surs de energie. A doua cifr indic legtura format:6.1-C-O, 6.2-C-S, 6.3-C-N, 6.4-C-C. A treia cifr descrie mai exact legtura ce se formeaz: 6.3.1-amidosintetaze, 6.3.2-peptidsintetaze, 6.4.1- carboxilaze. Exemplu: EC 6.3.1.2 L-glutamat:amoniac ligaza (glutamin sintetaza) L-glutamat + ATP + NH3 = L-glutamin + ADP + Pi EC 6.4.1.1 piruvat carboxilaza L-piruvat + CO2 = L-oxalilacetat Localizarea intracelular a enzimelor n celul, enzimele sunt localizate specific n anumite compartimente fie n organite celulare, fie n citoplasm. Separarea organitelor celulare prin ultracentrifugare urmat de identificarea specific a enzimelor prin tehnici imunohistochimice a reprezentat modalitatea prin care s-a stabilit exact localizarea intracelular a enzimelor. Unele procese au loc n toate tipurile de celule, enzimele respective fiind rspndite ubicuitar, cum ar fi de exemplu, enzimele implicate n biosinteza proteinelor i acizilor nucleici, enzimele glicolitice. Alte procese au loc numai n anumite celule, ca urmare numai acestea posed echipamentele enzimatice specifice. De exemplu, enzimele implicate n sinteza hormonilor tiroidieni sunt numai n tiroid, enzimele implicate n biosinteza ureei se gsesc numai n celulele hepatice. Fiecare organ se caracterizeaz printr-un profil enzimatic reprezentat de enzimele care acioneaz n diferitele compartimente din celul. Membrana celular conine enzime implicate n transportul substanelor. Mitocondriile prezint enzime ce catalizeaz procese generatoare de energie: membranele extern i intern conin enzimele implicate n lanul respirator, sinteza fosfolipidelor, elongarea i desaturarea acizilor grai, iar matricea mitocondrial conine enzimele ciclului Krebs, enzimele implicate n decarboxilarea oxidativ a cetoacizilor catabolismul acizilor grai, dezaminarea aminoacizilor, biosinteza ureei. Nucleul conine enzimele implicate n metabolismul acizilor nucleici. Ribozomii abund n enzime implicate n diferitele faze ale biosintezei proteinelor. Ribozomii liberi sintetizeaz proteinele celulare, iar cei fixai de reticulul endoplasmatic, proteinele de export. Citoplasma conine enzimele glicolitice, ale cii pentozofosfailor, enzimele din biosinteza acizilor grai, a nucleotidelor etc. Lizozomii abundeni n ficat, rinichi, globule albe conin hidrolaze: enzime proteolitice, ribonucleaze, enzime care hidrolizeaz proteoglicanii, sfingolipidele. Complexul Golgi conine enzime implicate n exportarea proteinelor sintetizate n reticulul endoplasmatic i maturarea glicoproteinelor i proteoglicanilor. Unele enzime au localizare mixt, citoplasmatic i mitocondrial, cum sunt transaminaza glutamic oxalilacetic, malat dehidrogenaza, izocitrat dehidrogenaza. Structura enzimelor Enzimele sunt proteine globulare putnd avea o structur: a. unitar enzime monocomponente, alctuite numai din aminoacizi: tripsina, chimotripsina, pepsina, lipaza, ribonucleaza; b. binar enzime alctuite dintr-o parte proteic (apoenzima) i o grup neproteic, definite de Euler astfel: Holoenzima = Apoenzima + Cofactor Studiul structurii enzimelor s-a realizat prin tehnici exacte: difracie de raze X, dicroism circular, fluorescen, analize n UV i IR, RMN, spectrometrie Raman etc. Caracteristicile componentei proteice Apoenzima fiind protein globular are toate nivelurile structurale. Ca orice protein, enzimele se pot denatura ca urmare a unor modificri la nivelul structurilor secundar i teriar. Componenta proteic a enzimelor se caracterizeaz prin urmtoarele: 3

este nedializabil i termolabil; confer specificitatea de substrat pentru activitatea unei enzime; conine situsul catalitic i pe cel la care se leag efectorii n cazul enzimelor allosterice; determin legarea substratului la situsul catalitic i a efectorilor la alt situs. Caracteristicile cofactorilor Cofactorii sunt compui cu structur chimic variat derivai de la vitamine sau ioni metalici, legai mai labil de partea proteic (coenzime) sau asociai intim cu aceasta prin legturi covalente (grupe prostetice) (Tabel 1). Acetia se caracterizeaz prin urmtoarele: sunt termostabili i dializabili; sunt indispensabili pentru desfurarea activitii enzimei; confer specificitatea de reacie pentru o enzim; intervin n reacie inducnd conformaia optim a enzimei, favoriznd aranjamentul adecvat reaciei sau transfernd electroni sau grupe chimice. Sisteme multienzimatice Exist ci metabolice n care toate enzimele ce catalizeaz reacii individuale sunt asociate sub forma unor sisteme multienzimatice (enzime polifuncionale). Acestea sunt sisteme proteice complexe capabile s foloseasc mai multe coenzime diferite. Enzimele sunt legate prin legturi slabe, n ordinea corespunztoare intrrii n aciune, pe o protein central, ce poate fi chiar una dintre enzime. Tabel 1 Exemple de cofactori enzimatici Ioni Enzima Coenzim Grupa Enzima metalici transferat Cu2+ Citocrom oxidaza NAD+ H+ Lactat dehidrogenaza 2+ + Zn Alcool dehidrogenaza FAD H Succinat dehidrogenaza Mg2+ Hexokinaza PALPO NH2 Aspartat aminotransferaza 2+ Mn Arginaza Biotina CO2 PropionilCoA carboxilaza K+ Piruvat kinaza FH4 -CHO Timidilat sintaza 2+ 3+ Fe , Fe Catalaza -CH3 Exemplul cel mai elocvent este reprezentat de complexele implicate n decarboxilarea oxidativ a -cetoacizilor: piruvat dehidrogenaza, -cetoglutarat dehidrogenaza formate dintr-un ansamblu proteic, patru coenzime (TPP, NAD+, acid lipoic, coenzima A) , ionul Mg2+, cu participarea final a NAD+. Izoenzime vezi LP Centrul activ al enzimelor Procesul enzimatic nu se desfoar oriunde n molecula enzimei, ci numai n anumite zone care au o dispoziie spaial corespunztoare, alctuite din 2 4 aminoacizi. Aceste zone se numesc centri activi i reprezint aranjamentul spaial adecvat prinderii substratului. Legarea substratului la centrul activ al enzimei i imprim o stare de tensiune molecular care faciliteaz reacia biochimic. La formarea centrului activ particip numai aminoacizi care prezint grupe -OH, - SH, - COOH, -NH2 (de exemplu, serin, histidin, acid aspartic, lisin). n cazul enzimelor cu structur binar, n centrul activ se poate distinge un situs de fixare care se combin cu substratul prin legturi labile (la formarea cruia particip aminoacizi auxiliari) i un situs catalitic (format din aminoacizii colaboratori care acioneaz asupra substratului), important pentru aceast interaciune fiind prezena cofactorilor. Aminoacizii care nu sunt implicai n reacia enzimatic sunt aminoacizi necolaboratori. Funcionalitatea situsului catalitic este consecina structurii spaiale a proteinei care prin dispoziia sa n spaiu aduce anumii aminoacizi distanai n structura primar ntr-o poziie optim pentru legarea substratului (Fig.1).

Fig.1. Organizarea centrului activ (dup Louisot P, 1982) Enzimele allosterice prezint dou situsuri: situsul catalitic la care se leag substratul i situsul allosteric la care se leag efectorul allosteric, activator sau inhibitor (Fig.2).

Fig. 2 Organizarea centrului activ la enzimele allosterice Specificitatea enzimelor Specificitatea de aciune a enzimelor este o caracteristic esenial a acestora conferit de componente. Aceasta este unul dintre cele mai remarcabile atribute biologice care stau la baza coordonrii proceselor biochimice. Diversele forme de manifestare a specificitii enzimelor pot fi ncadrate n dou categorii: 1. specificitatea de reacie; 2. specificitatea de substrat. Specificitatea de reacie Enzimele catalizeaz un anumit tip de reacie, n funcie de modul de aciune asupra substratului. Acest tip de specificitate st la baza clasificrii enzimelor i este datorat cofactorului care guverneaz tipul de reacie n care se va angaja substratul. De exemplu, un anumit -aminoacid poate fi substrat pentru mai multe enzime care au cofactori diferii.
R-CH2-NH2 Decarboxilaz R-CH-COOH OH Oxidaz R-CH-COOH NH2 Transaminaz R-C-COOH O

Dezaminaz R-C-COOH + NH3 O

Specificitatea de substrat Enzimele difer n ceea ce privete specificitatea de substrat n funcie de mecanismul de reacie i de natura substratului. Enzimele acioneaz asupra anumitor: substraturi, grupe funcionale, legturi chimice. Exist trei tipuri de specificitate determinat de substrat: a. specificitatea stereochimic; b. specificitatea relativ; c. specificitatea absolut. Specificitatea stereochimic. Existena unor compui biologici sub form de izomeri determin posibilitatea aciunii selective a unor enzime asupra unuia dintre ei. Enzima leag substratul pe baza complementaritii ntre centrul activ i un fragment din molecul, respectat numai n cazul unuia dintre izomeri (Fig. 3). Cellalt izomer avnd o dispoziie spaial diferit nu se poate lega de enzim. Enzimele pot s determine: a. transformarea unui anumit izomer geometric (cis sau trans); b. formarea unui anumit izomer geometric sau optic; c. transformarea unui substrat aparinnd unei anumite serii sterice D sau L.

Fig. 3 Reprezentare schematic a stereospecificitii: a - situs catalitic; b,c situsuri de fixare specifice Exemple: Lactat dehidrogenaza (LDH) este o enzim care determin transformarea acidului L-lactic dar nu i pe cea a acidului D-lactic. CH3 HO C H
NADH,H + + NAD + NAD + NADH,H

CH3 C O

COOH acid L-lactic

COOH acid piruvic

De asemenea, determin transformarea unui compus optic inactiv, acidul piruvic, ntr-un compus optic activ, acidul L-lactic, realiznd o sintez asimetric. L-aminoacid oxidaza care catalizeaz reaciile de dezaminare a L-aminoacizilor; Succinat dehidrogenaza (SDH) catalizeaz preferenial dehidrogenarea acidului succinic cu formarea acidului fumaric (izomerul trans).

COOH CH2 CH2 COOH

FAD

FADH 2

COOH H C H C COOH

SDH

Maltaza hidrolizeaz legturile glicozidice ale -glucozei nu i pe cele ale -glucozei, avnd astfel specificitate anomeric. Specificitatea relativ de grup. Enzimele din aceast categorie manifest un spectru mai larg de activitate, acionnd asupra unui grup de substraturi ce prezint structur asemntoare. Exemple: Alcool dehidrogenaza (ADH) transform toi alcoolii cu numr mic de atomi de carbon: R CH 2 OH
NAD

ADH

R
+

CHO

NADH,H

Glicozidazele acioneaz numai asupra legturii glicozidice; Hexokinaza catalizeaz fosforilarea mai multor hexoze (glucoz, fructoz, manoz, galactoz) n prezena ATP: Hexoz + ATP
HK

Hexozo-6-fosfat + ADP

Fosfatazele catalizeaz numai hidroliza esterilor fosforici; Peptidazele acioneaz numai asupra legturilor din peptide i proteine; Lipazele hidrolizeaz legtura esteric dintre glicerol i acizii grai; Specificitatea absolut. Enzimele din aceast categorie acioneaz strict asupra unui anumit tip de substrat nerecunoscnd nici o modificare a substratului respectiv. Ele nu sunt specifice pentru o anumit legtur sau grupare din structura substratului i recunosc doar substratul n totalitate. Exemple: Arginaza acioneaz numai asupra argininei: arginaza H2N-C-NH-(CH2)3-CH-COOH H2N-C-NH2 + H2N-CH2)3-CH-COOH
O NH2 O NH2

Anhidraza carbonic catalizeaz sinteza acidului carbonic: H2CO3 CO2 + H2O Cinetica enzimatic Prin studiul cineticii enzimatice este explicat modul n care enzimele acioneaz, permind determinarea vitezei maxime de reacie a unei enzime i a afinitii sale pentru substrat sau pentru unii efectori. Determinarea vitezei de reacie nu relev stoechiometria reaciei sau mecanismul acesteia, deci este necesar o ecuaie care s fac legtura ntre viteza iniial a reaciei (determinat experimental) i concentraia reactanilor. Dei cazul enzimelor monomerice cu un singur substrat este relativ rar, cinetica clasic a enzimelor monomerice n faz staionar cu un singur substrat (prezentat n continuare) este modul cel mai simplu de a trata i a nelege cinetica enzimatic. Cele mai multe enzime au ns mai multe substaturi dnd natere la produi diferii nerespectnd comportamentul clasic. n reacia S --------> P, pe msur ce reacia avanseaz, crete concentraia produsului de reacie i scade cea a substratului.

d[S ] d [ P] = = k[S]n, unde k este constanta de vitez i dt dt n reprezint ordinul de reacie. Viteza iniial depinde de concentraia iniial a substratului la puterea n, multiplicat cu constanta de vitez. Reaciile de ordin zero sunt caracterizate de faptul c sunt independente de concentraia reactanilor, viteza de reacie fiind v = k0. Reaciile de ordin 1 sunt cele mai frecvente, viteza de reacie fiind dat de ecuaia: v = k[S]. Viteza de reacie este reprezentat de cantitatea de substrat degradat n unitatea de timp sau cantitatea de produs format. Ecuaia Michaelis-Menten n reaciile cu un singur substrat, meninnd constant concentraia enzimei, creterea concentraiei de substrat determin mrirea vitezei de reacie pn cnd se atinge o valoare maxim peste care orict ar crete concentraia substratului viteza reaciei enzimatice rmne nemodificat (Fig.4). La concentraii mici de substrat, viteza de reacie este proporional cu concentraia substratului (reacii de ordin 1). La concentraii mari de substrat, viteza de reacie devine independent de concentraia substratului (reacii de ordin 0), enzima saturndu-se cu substrat. L. Michaelis i M. Menten au propus o teorie general de aciune a enzimelor bazat pe ideea c enzima i substratul se asociaz reversibil pentru a forma complexul enzim-substrat. k1 k3 ES E+ P E +S k2 v1 = k1[E][S] (1) v2 = k2[E][S] (2) Se stabilete un echilibru rapid asociere-disociere, la echilibru v1=v2 i prin urmare: k1[E][S] = k2 k2[E][S], unde ks = este constanta de disociere. k1 Prin scindarea complexului ES se formeaz produsul de reacie. n 1925, Briggs i Haldane au propus c ES atinge rapid o valoare constant n sistem; pe ct de d [ ES ] repede se formeaz, pe att de repede se descompune, deci = 0. dt Se ignor reacia prin care E i P formeaz ES, astfel viteza reaciei globale depinde numai de concentraia substratului i de cea a enzimei. n ecuaia (1), viteza de formare a complexului ES este: v1 = vf = k1[E][S] (3) Viteza de descompunere a complexului ES este dat de ecuaia: vd = v2 + v3 = k2[E][S] + k3[E][S] = (k2 + k3)[ES] (4) d [ ES ] Cum = 0, rezult c viteza de formare a complexului este egal cu viteza de disociere a dt lui, deci vf = vd i (k2 + k3)[ES] = k1[E][S] (5) Dar [E] = [ET] [ES] i introducnd aceast relaie n ecuaia (5), aceasta devine: (k2 + k3)[ES] = k1[ET][S] - k1[ES][S] = k1( [ET] [ES])[S] [ ET ] [ ES ] [ S ] = k 2 + k 3 sau (6) [ ES ] k1 k2 + k3 Raportul este o constant fiind notat cu Km, constanta Michaelis. k1 [ ET ] [ ES ] [ S ] = K Astfel, ecuaia (6) devine m sau ([ET] [ES]) [S] = Km [ES]. [ ES ] Ecuaia de vitez este: v = -

Desfcnd paranteza rotund ecuaia devine: [ET][S] [ES][S] = Km [ES], ceea ce este [ ET ] [ S ] echivalent cu [ET][S] =[ES](Km +[S]), de unde rezult c [ ES ] = (7). Km + [S] d [ P] = k 3 [ ES ] , deci concentraia Viteza de formare a produsului de reacie este: v = dt v complexului ES este [ ES ] = (8) i nlocuind aceast relaie n ecuaia (7) se poate scrie: k3 v [ ET ] [ S ] = (9) k3 K m + [ S ] k 3 [ ET ] [ S ] De aici se scoate viteza de reacie ca fiind: v = i innd cont de faptul c vmax = Km + [S] k3[ET], ecuaia de mai sus devine: v [S] v = max , fiind cunoscut ca i ecuaia Michaelis-Menten. Km + [S] Ecuaia exprim faptul c viteza unei reacii enzimatice este determinat de concentraia de substrat la acel moment i de constantele Km i vmax. Semnificaia Km i vmax. Dac v = vmax/2 , nlocuind n ecuaia Michaelis-Menten se deduce faptul c Km = [S], deci constanta Michaelis poate fi definit drept concentraia de substrat la care viteza de reacie este jumtate din viteza maxim. Constanta Michaelis, Km, este indice al afinitii enzimei pentru substrat, variind invers proporional cu aceasta (de ex. pentru hexokinaz, Km este 0,15 mmol/l, ceea ce indic afinitatea mare a enzimei pentru glucoz. Aspectul curbei descrise de ecuaia Michaelis-Menten este hiperbolic (Fig.4):

Fig.4 Curba de saturare cu substrat a enzimelor Pentru orice enzim se poate defini, alturi de aceste constante, numrul de turn-over al enzimei, ca fiind numrul de molecule de substrat convertite n produs de reacie pe molecula de enzim n unitatea de timp, atunci cnd enzima este saturat cu substrat. Este o msur a activitii catalitice maxime numindu-se i activitate molecular a enzimei, kt (exprimat n s-1). Ecuaia Lineweaver-Burk Deoarece reprezentarea ecuaiei Michaelis Menten este curb a crei interpretare este dificil, s-au realizat reprezentri liniare ale dependenei vitezei de reacie de concentraia substratului, folosite la interpretarea datelor experimentale: reprezentarea Lineweaver-Burk, reprezentarea Hanes-Woolf, etc. Reciproca ecuaiei Michaelis-Menten este: 1 K m + [S ] = (1) v v max [ S ] 9

Separnd componentele numrtorului din partea dreapt a ecuaiei se obine: Km 1 [S ] = + (2) , v v max [ S ] v max [ S ] Km 1 1 = + care simplificat devine: , denumit ecuaia Lineweaver Burk. v v max [ S ] v max Reprezentnd grafic 1/v = f(1/[S]) se obine o dreapt, panta dreptei fiind K m/v max, intersecia cu axa 1/v n 1/vmax, iar cea cu axa 1/[S] este 1/Km (Fig.5).

Fig. 5 Reprezentarea ecuaiei Lineweaver-Burk Factorii care influeneaz activitatea enzimelor Fiind proteine, enzimele sunt sensibile la aciunea unor factori externi care pot s influeneze disocierea grupelor implicate n cataliz, legarea substratului la situsul catalitic sau structura n ansamblu a prii proteice. Astfel de factori sunt: temperatura, pH-ul, efectorii enzimatici (activatori sau inhibitori). Influena temperaturii Efectul temperaturii asupra activitii enzimelor este rezultanta aciunii a doi factori opui, creterea vitezei de reacie cu temperatura i denaturarea termic a enzimelor. Activitatea oricrei enzime variaz cu temperatura, graficul fiind descris n Fig.6.

Fig.6 Influena temperaturii asupra activitii enzimelor Creterea temperaturii peste temperatura optim determin scderea vitezei de reacie, datorit denaturrii prii proteice a enzimei. Temperatura optim pentru enzimele din organismul uman este 37-400C, la plante 50-600C, iar pentru cele din microorganismele din apele termale este 80-1000C. Determinarea activitii unei enzime trebuie s se fac la o temperatur ntre 25-370C. Influena pH-ului 10

Pentru enzimele din organismul uman, pH-ul optim de aciune este pH-ul normal al mediului n care ele i manifest aciunea catalitic (Fig.7). Centrul activ al enzimelor conine grupe ionizabile, acide sau bazice, deci modificarea pH-ului are ca efect modificarea gradului de disociere i, implicit, modificarea vitezei de reacie. Pentru enzimele din organismul uman pH-ul optim este ntre 5-9, dar exist enzime ce acioneaz i n afara acestui interval. De exemplu, pepsina acioneaz la pH 1,5-2, fosfatazele alcaline la pH 9-10, iar fosfatazele acide la pH 4,5-5.

Fig.7 pH-ul optim de actiune a unor enzime Influena efectorilor enzimatici Efectorii enzimatici sunt substane cu structuri chimice variate care aduse n mediul de reacie pot influena activitatea enzimei care catalizeaz reacia. Efectorii enzimatici pot fi activatori sau inhibitori. Activatorii enzimatici. Sunt compui care stimuleaz activitatea enzimelor. Acetia pot fi: Activatori ai unor proenzime. Forma inactiv a enzimei se numete proenzim sau zimogen, n care centrul activ al enzimei este mascat. Prin eliminarea unei pri din molecul, centrul activ este demascat, enzima devenind activ (Tabel 2). Tabel 2 Proenzime i zimogeni Proenzim (Zimogen) Enzim Pepsinogen Pepsin (proteaz digestiv) Tripsinogen Tripsin (proteaz digestiv) Chimotripsinogen Chimotripsin (proteaz digestiv) Proelastaz Elastaz (degradeaz elastina) Protrombin Trombin (factor de coagulare) Proaccelerin Accelerin (factor de coagulare) Proinsulin Insulin (hormon hipoglicemiant) Activatori propriu-zii. Acetia acioneaz stimulnd activitatea catalitic a enzimelor sau legarea substratului de enzim. Pot fi dai ca exemplu ionii Mg2+ pentru fosfataze, ionii Mn2+ pentru peptidaze, ionii Zn2+ ce activeaz alcool dehidrogenaza, Cl- pentru amilaz, etc. Activatori ce acioneaz asupra subunitilor reglatoare, elibernd subunitile catalitice. Se poate da ca exemplu AMPc, activator al proteinkinazei A. Prin legarea acestuia de subunitile reglatoare sunt eliberate subunitile catalitice, enzima devenind activ (Fig.8). Activatori prin antiinhibiie. Sunt compui care acioneaz asupra enzimelor protejndu-le de aciunea unor inhibitori. De ex., vitaminele E, C, K protejeaz enzimele de aciunea peroxizilor. Substane cu caracter reductor. n acest caz activarea are loc prin protejarea grupelor SH din centrul activ al enzimei, aceste grupe fiind necesare pentru activitatea enzimatic. Astfel de activatori sunt: glutationul, cisteina.

11

Activarea prin modificri covalente. Sunt numeroase procesele n care acioneaz enzime ce pot exista sub dou forme activ i inactiv ce se deosebesc prin prezena unor grupe chimice, frecvent grupe fosfat ce fosforileaz resturi de serin. Exemplu: glicogen fosforilaza b se activeaz prin fosforilare transformndu-se n glicogen fosforilaz a. Inhibitorii enzimatici sunt compui care influeneaz negativ activitatea enzimelor pe care o pot anula definitiv sau temporar. Ei pot afecta situsul catalitic al enzimei sau orice alt regiune a moleculei, astfel influennd legarea substratului de enzim. Aciunea inhibitorilor enzimatici este important pentru controlul proceselor biochimice, pentru a nelege mecanismele de aciune a unor medicamente, droguri, otrvuri, pentru a urmri etape dintr-un proces metabolic.

Fig.8 Activarea proteinkinazei A Mecanismul de aciune a enzimelor ntr-o reacie S P, la un moment dat un anumit numr de molecule de substrat au energia necesar s ating o stare reactiv, denumit stare de tranziie, intermediar ntre S i P i instabil. Aceasta poate fie s se transforme n produsul P fie s reformeze substratul i se situeaz la punctul maxim al diagramei energetice ce caracterizeaz relaia ntre S i P (Fig.9). Reacia se desfoar cu o vitez proporional cu concentraia moleculelor de substrat ce au energia necesar pentru a realiza tranziia. Cu ct este mai mare aceast energie fa de energia medie cu att sunt mai puine molecule capabile s realizeze tranziia i reacia se desfoar mai greu. Bariera de energie dintre energia strii de tranziie i energia liber medie a lui S se numete energie de activare. Enzimele acioneaz prin scderea energiei de activare i nu prin creterea energiei reactanilor, combinndu-se cu substratul astfel nct s permit trecerea acestuia n starea de tranziie. Complexele formate ES i EP sunt intermediari avnd energia punctelor minime n diagrama variaiei energiei dintre S i P. Energia de activare este o barier energetic pentru reaciile chimice, moleculele cu o energie de activare mare fiind mai stabile. Fr aceast barier energetic complexele macromoleculare ar reveni spontan la moleculele simple ce le compun i nu ar putea s existe procesele metabolice i structurile ordonate.

12

Fig.9 Diagrama energetic n cazul reaciilor necatalizate i catalizate Enzimele sunt implicate n reducerea energiei de activare selectiv i specific pentru reaciile necesare pentru supravieuirea celulei. Oricare ar fi modalitatea de interaciune dintre enzim i substrat, enzimele pot mri viteza reaciei catalizate de 109 1020 ori. Relaia de structur enzim substrat n modularea activitii enzimei. Situsul activ al enzimei reprezint doar o mic parte din structura acesteia, dispus astfel nct s creeze un buzunar care s prezinte complementaritate cu substratul. Cele dou componente se ataeaz prin legturi slabe: interaciuni ionice, fore Van der Waals, legturi de hidrogen ntre grupe de atomi complementare. Exist mai multe ipoteze referitoare la recunoaterea molecular dintre substrat i enzim: Ipoteza lact cheie; Ipoteza ajustrii induse; Ipoteza ajustrii induse i a intermediarului strii de tranziie. Ipoteza lact cheie propus de E. Fischer postuleaz asemnarea enzimei cu un lact, iar a substratului cu cheia corespunztoare acestuia, legtura dintre ele fcndu-se pe baza complementaritii ntre segmente prestabilite (Fig.10). Dezavantajul acestei ipoteze este acela c se consider enzima o structur rigid.

Fig.10 Ipoteza lact-cheie Ipoteza ajustrii induse propus de D. Koshland postuleaz c enzimele sunt molecule dinamice, foarte flexibile ceea ce influeneaz printre altele legarea substratului de enzim. Se consider c forma situsului activ al enzimei se modific dup legarea substratului, recunoaterea celor dou fiind considerat o ajustare indus (Fig.11). Procesul este interactiv, modificndu-se simultan i starea substratului, ceea ce explic puterea catalitic crescut a enzimelor.

Fig.11 Ipoteza ajustrii induse Ipoteza strii de tranziie postuleaz existena complexului ES ca o structur interactiv n care enzimele determin substratul s adopte o form ce imit structura strii de tranziie (Fig.12). Conformaia activ a enzimei este relativ instabil n absena substratului, enzima revenind la conformaia iniial.

13

Fig.12 Ipoteza strii de tranziie Mecanismele prin care se realizeaz desfacerea unei legturi sau refacerea altei legturi dup ataarea substratului sunt diferite: cataliza acido-bazic; cataliza prin ioni metalici; cataliza covalent. Cataliza acido-bazic Multe reacii biochimice se desfoar cu transfer de protoni. n aceste reacii, roluri importante au acizii i bazele slab ionizate la pH fiziologic. Acest tip de mecanism const n capacitatea enzimelor ca, prin anumite grupe chimice (carboxil, amino, hidroxil, imidazol) s funcioneze ca acizi sau ca baze prin cedare sau acceptare de protoni. n chimotripsin, aminoacizii Asp 102 i His 57(prin restul imidazol) funcioneaz ca grupe cu caracter acid i, respectiv caracter bazic. Cataliza prin ioni metalici Multe enzime necesit prezena metalelor pentru a-i manifesta aciunea, fiind din acest punct de vedere metaloenzime (conin ionii integrai n structuri intim legate de enzim) sau enzime ce necesit metalele ca activatori ( metalul este legat de enzim prin legturi mai slabe). Interaciunile ionice dintre un metal legat la enzim i substrat pot ajuta la orientarea substratului pentru reacie sau pentru a stabiliza starea de tranziie. De ex., pentru enolaz, enzima ce catalizeaz reacia de transformare a acidului 2,3difosfogliceric n acid fosfoenolpiruvic n glicoliz, ionii de Mg2+ sunt implicai n interaciunea cu substratul (Fig.13). n cazul acesteia, Lys 345 funcioneaz ca baz extrgnd H+, iar Glu 211 ca acid cednd H+ grupei -OH. Prin interaciunea acidului 2,3-difosfogliceric cu Mg2+ devine mai reactiv H+ de la C2.

Fig.13 Cataliza prin ioni metalici - enolaza Cataliza covalent n acest tip de cataliz, atacul unei grupe electrofile (cu afinitate pentru e-) sau nucleofile (cu afinitate pentru zone cu deficit de e-) din situsul activ al enzimei asupra substratului determin ataarea acestuia prin legturi covalente la enzim. Multe enzime formeaz legturi covalente cu substratul, labilizndu-l fa forma nelegat. Multe dintre enzimele care acioneaz prin cataliz covalent prezint cinetica mecanismului de tip ping14

pong. n cazul transaminazelor, enzima leag prin legtur covalent mai nti coenzima, piridoxal fosfatul, i apoi se realizeaz schimbul cu substratul (Fig.14).
H R C COO + CH=NH-Lys-E OH + N H CH3 + R-CH-COO NH3 +

OH O < P~ O H C 2 OH

OH O< P~ O H2C E-Lys-NH3 + OH

CH=N-H + OH + CH3 N H

OH O< P ~ O H2C H + OH

R CH=NH-C-COO .. + OH + CH3 N H

OH O< P ~ O H2C OH

R + CH-NH=C-COO OH CH3

N H

OH O< P ~ O H2C OH

R + CH2-NH=C-COO + N H OH CH3

H2O

OH O< P ~ O H2C OH

CH2-NH2 OH + N H + R-CH-COO CH3 O

Fig. 14 Cataliz covalent prin mecanism de tip ping-pong - transaminaze Serin proteazele (tripsin, chimotripsin, trombin) acioneaz dup acest mecanism (Fig.15).

15

A 102 sp CH2 C O O H N N H O Ser 195 CH2 R In ediar 1 term O A 102 sp CH2 C O O H N NH His 57 CH2 O Ser 195 CH2 O R His 57 CH2

atac n cleof u il R' H N C

.. C HN R'

A 102 sp CH2 C O O H N NH A 102 sp CH2 C O O H N N H His 57 CH2 .. . O. H Ser 195 CH2 O C O HO R A 102 sp CH2 C O O H N NH O His 57 CH2 Ser 195 CH2 C OR His 57 CH2 Ser 195 CH2 O C O R + R'-NH2 H2 O

Asp 102 CH2 C O O H N N enzima activ H O capt C-terminal His 57 CH2 Ser195 CH2 + RCOOH

Fig. 15 Mecansimul de aciune a chimotripsinei cataliz covalent Inhibiia enzimatic Inhibiia enzimatic a fost clasificat n moduri diferite: inhibiie reversibil, fiind determinat de compuii care interacioneaz cu enzima prin interacii necovalente care este mai ales competitiv i, mai rar, necompetitiv; inhibiie ireversibil, ce se manifest prin alterarea de durat a structurii enzimei ca urmare a unor legturi mai puternice. Efectul net al inhibiiei ireversibile este scderea concentraiei enzimei active. Inhibiia ireversibil este de tip incompetitiv. Inhibiia competitiv Inhibitorul competitiv prezint analogie structural cu substratul, avnd astfel afinitate pentru situsul catalitic al enzimei i deci apare o competiie ntre enzim i substrat pentru ocuparea situsului catalitic. Legtura prin care se leag inhibitorul este de aceeai natur cu cea prin care se leag substratul. Reaciile care au loc n acest caz sunt urmtoarele: k1 k3 ES E+ P E +S k2 ki E+I EI k-i 16

Este o inhibiie reversibil, deoarece prin creterea concentraiei de substrat se ndeprteaz inhibitorul competitiv de la situsul catalitic, legarea inhibitorului competitiv la enzim fiind reversibil (Fig.16).

Fig.16 Efectul inhibitorului competitiv asupra cineticii reaciei enzimatice a) Reprezentarea Michaelis-Menten b) Reprezentarea Lineweaver-Burk Exemple de inhibiie competitiv: succinat dehidrogenaza enzima ce transform acidul succinic n acid fumaric, este inhibat competitiv de acizii dicarboxilici: acid malonic, acid oxalic, asemntori structural cu substratul acestei enzime; aciunea unor medicamente se datoreaz faptului c sunt inhibitori competitivi (Tabel 3). De exemplu, sulfanilaminda i exercit aciunea bacteriostatic prin inhibiie competitiv. Sulfanilamida este asemntoare structural cu acidul p-aminobenzoic, pe care l poate nlocui n timpul sintezei acidului folic de ctre bacterii pentru care este factor de cretere. n lipsa acidului folic bacteriile mor. n terapia cancerului se utilizeaz analogi structurali ai bazelor purinice i pirimidinice, ce inhib sinteza acizilor nucleici, mpiedicnd diviziunea celular care este mult mai rapid la celulele tumorale. De ex., metotrexatul antagonist FH2 al dihidrofolat reductazei. Inhibiia necompetitiv Inhibitorul necompetitiv nu se leag la acelai situs cu substratul, nu prezint asemnare structural cu acesta, deci efectul acestuia nu poate fi nlturat prin creterea concentraiei de substrat. Inhibitorul necompetitiv interacioneaz cu complexul ES sau i cu complexul ES i cu enzima. Reaciile care au loc n acest caz sunt urmtoarele: k1 k3 ES E+ P E +S k2 ki E+I EI k-i

ES + I ESI Inhibiia necompetitiv poate fi: pur, dac legarea inhibitorului la enzim nu are efect asupra legrii substratului la enzim (Fig.17); mixt, cnd legarea inhibitorului la enzim afecteaz legarea substratului la enzim.
Tabel 3 Medicamente inhibitori competitivi Medicament inhibitor Afeciune Captopril Hipertensiune Norfloxacin Lovastatin Acid clavulanic Infecii urinare Hipercolesterolemie Rezistena bacterian 17 Enzim int Enzima de conversie angiotensinei ADN-giraza HMGCoA reductaza beta-Lactamaza

Aciclovir Zidovudina Omeprazol Alopurinol Trimetoprim Metotrexat Fluorouracil Acetazolamid Zileuton

Herpes SIDA Ulcer peptic Gut Infecii bacteriene Cancer Cancer Glaucom Alergii

ADN polimeraza viral Revers transcriptaza viral Pompa de H+ Xantin oxidaza Dihidrofolat reductaza Dihidrofolat reductaza Timidilat sintaza Anhidraza carbonic Lipoxigenaza

Fig.17 Efectul inhibitorului necompetitiv asupra cineticii reaciei enzimatice a) Reprezentarea Michaelis-Menten b) Reprezentarea Lineweaver-Burk Tipuri de inhibitori necompetitivi: ioni sau molecule ce acioneaz al nivelul cofactorilor: CN-,CO; inhibitori ai grupelor SH libere ale enzimei: acid iod acetic, p-clormercuribenzoat; metale grele: argint, mercur, plumb, ce acioneaz la nivelul grupelor SH ale enzimei; ageni de chelatare: EDTA. Enzime allosterice Exist enzime a cror activitate poate fi modulat de liganzi care acioneaz altfel dect inhibitorii competitivi sau necompetitivi. Termenul de ligand definete orice molecul care se poate lega de o macromolecul. Include i molecule mici, precum ATP-ul, dar i proteine mici. Liganzii care modific activitatea enzimelor dar rmn nemodificai ca rezultat al aciunii enzimei se numesc efectori sau modulatori. Ei pot fi activatori sau inhibitori. Enzimele care rspund la aciunea unor modulatori se numesc enzime allosterice i acioneaz n etapele determinante de vitez ale cilor metabolice, intervenind n reglarea proceselor metabolice. Enzimele allosterice au, pe lng situsul catalitic, i situs allosteric. Liganzii care se pot lega la situsul alosteric se numesc efectori allosterici sau modulatori allosterici. Legarea unui efector allosteric determin o modificare conformaional a enzimei astfel c afinitatea sa pentru substrat sau pentru ali liganzi se modific (Fig.18). Efectorii allosterici pozitivi se leag la un situs activator i cresc afinitatea enzimei pentru substrat, iar cei negativi se leag la un situs inhibitor i scad afinitatea enzimei pentru substrat.

18

Fig.18 Modificarea allosteric a unei enzime Enzimele allosterice pot fi: monomerice - sunt doar dou: oligomerice - alctuite din protomeri. Legarea ligandului la un protomer poate influena legarea aceluiai tip de ligand la ceilali protomeri, aceasta fiind o interaciune homotrop care este ntotdeauna pozitiv i, de asemenea, ea poate influena i legarea altor liganzi sau a substratului, fiind o interaciune heterotrop care poate fi pozitiv sau negativ. Ca o consecin a interaciunilor dintre situsul catalitic, situsul activator i inhibitor, la reprezentarea grafic a vitezei de reacie n funcie de concentraia de substrat, se obine o curb sigmoid (Fig.19). Efectorii negativi deplaseaz curba spre concentraii mari de substrat, n timp ce, cei pozitivi deplaseaz curba spre concentraii ai mici de substrat. Aceast comportare este foarte important pentru reglarea proceselor biochimice. De exemplu, la o concentraie dat de substrat, viteza de reacie scade n prezena unui modulator negativ. Interaciunea ntre situsuri este explicat prin fenomenul de cooperativitate. Nu trebuie fcut confuzie ntre cooperativitate i allosterism. Efectul allosteric este reprezentat de modificrile conformaionale ce apar ntr-un protomer ca rspuns la legarea ligandului la un situs allosteric. Cooperativitatea implic modificarea conformaiei unui protomer ce determin modificarea protomerului adiacent pentru a-i modifica afinitatea pentru un efector sau substrat. Efectul allosteric poate aprea i independent de cooperativitate. De exemplu, la alcool dehidrogenaz, modificrile conformaionale apar independent la fiecare protomer, odat cu legarea efectorilor allosterici.

Fig. 19 Curba de saturare cu substrat a enzimelor allosterice 19

Modele de cooperativitate n modularea activitii enzimelor allosterice Pentru a explica comportarea diferit fa de enzimele clasice a enzimelor allosterice, s-au propus mai multe modele ntre care cele mai importante sunt: modelul concertat (Monod, Wyman, Changeux); modelul secvenial (Koshland, Nemethy, Filmer). Modelul concertat propune existena a dou stri pentru enzim: starea tensionat T i starea relaxat R, care sunt n echilibru (Fig.20).

Fig. 20 Strile T i R ale enzimelor allosterice Activatorii i substratul favorizeaz starea relaxat i deplaseaz echilibrul spre starea R, n timp ce inhibitorii favorizeaz starea tensionat T. O modificare conformaional a unui protomer determin modificrile corespunztoare ale tuturor celorlali protomeri. Modelul secvenial presupune c legarea ligandului determin modificri conformaionale ntrun protomer. Aceasta induce modificri ale protomerului adiacent aflat n continuitate cu primul. Efectul ligandului este transmis secvenial oligomerului, determinnd creterea sau scderea afinitii pentru ligand. Apar forme hibride (Fig.21).

Fig.21 Modelul secvenial Acest model explic cooperativitatea pozitiv i negativ. Un modulator pozitiv induce o conformaie a protomerului care are ca efect creterea afinitii pentru substrat, iar cel negativ induce o conformaie diferit, cu afinitate redus pentru substrat. Retroinhibiia Este un caz special al inhibiiei allosterice n care inhibitorul este chiar produsul final al cii metabolice (inhibiie feed-back). n cazul unei succesiuni de reacii de tipul prezentat, o acumulare excesiv de produs final n celule determin, prin mecanism allosteric, inhibiia enzimei E1 ce acioneaz n prima etap. Procesul este oprit la restabilirea concentraiei normale de produs final.
A E1 B E2 E C 3 D E 4 E E5 F

Inhibiia allosteric are rol important n procesele de reglare metabolic. Reglarea activitii enzimatice Reglarea activitii enzimatice se poate face prin: Modificarea cantitii de enzim. Cantitatea de enzim este determinat de echilibrul dintre rata de sintez i rata de degradare a enzimei codificate genetic (turnover-ul enzimei). Cele dou 20

procese implic factori de control diferii. Sinteza se face n prezena unor inductori, iar represia implic factori care limiteaz sinteza favorizeaz degradarea enzimei (represor). ks Enzim (Proteina) Aminoacizi kd Dac ks>kd enzim este inductibil, iar dac ks<kd, enzim este represibil. Alterarea rezervei de reactani. Concentraia intracelular medie a substratului, coenzimei, are importan mai mic asupra activitii enzimei. Este important concentraia unor metabolii intermediari n vecintatea centrului activ al enzimei. Alterarea eficienei catalitice a enzimei mediat de aciunea unor inhibitori enzimatici. Reglara allosteric. Este determinat de aciunea enzimelor allosterice. Modificarea covalent explicat de Fisher i Krebs (Premiul Nobel pentru medicin n 1992). Fosforilarea-defosforilarea unor resturi de serin, tirozin din structura enzimelor activeaz sau dezactiveaz enzimele. Reglarea activitii enzimelor este foarte important pentru celule, n cursul dezvoltrii dobndindu-se i alte opiuni de reglare cum ar fi: Sinteza sub form de zimogeni, inactivi, care adopt conformaia specific numai n anumite condiii de pH, activatori, procesul fiind reversibil; Sinteza sub form de izoenzime care se sintetizeaz n structurile ce au condiiile conforme cu necesarul pentru o aciune optim. De exemplu, lactat dehidrogenaza. Prezena unor proteine modulatoare. Este vorba despre subunitile reglatoare ce suprim activitatea subunitilor catalitice dac sunt ataate de acestea (vezi Fig.8). Aplicaii practice ale enzimelor A. Principiile enzimologiei sunt aplicate n laborator la msurarea activitii enzimatice n scop diagnostic i a concentraiei de substrat. Pentru diagnosticarea unor afeciuni specifice unui anumit organ este ideal cunoaterea unor enzime specifice organului respectiv, numite enzime marker. Gsirea unor markeri exclusivi este extrem de dificil totui se poate considera c unele dintre enzimele a cror activitate se determin n laborator au aceast calitate. De exemplu, amilaza este marker pentru pancreas, fosfataza acid pentru prostat, OCT pentru ficat, izoenzimele LDH1 i CK-MB sunt markeri n afeciunile miocardului, izoenzimele LDH4 i LDH5 sunt markeri pentru ficat i muchi. n laborator, enzimele se folosesc i ca reactivi pentru dozarea unor componente plasmatice prin metode enzimatice, cum ar fi glucoza, colesterolul, ureea, creatinina, etc. Tehnicile moderne de imunologie (EIA, ELISA) folosesc enzimele ca indicatori. Anticorpii specifici pentru un antigen sunt cuplai cu enzime indicatoare (peroxidaza din hrean, fosfataza alcalin). Acestea, dup transformarea unui substrat specific, genereaz produi colorai a cror concentraie este proporional cu cea de antigen (Fig.22).

1. Fig.22 Schema reaciei de formare a complexului biotin-avidin in tehnica ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 21

Molecula int Antigene Anticorpi Glicoconjugai Enzime Receptori Acizi nucleici Virusuri, bacterii, celule, organite subcelulare

Ligand biotinilat Anticorpi Antigene Lectine Substraturi, inhibitori Hormoni, toxine Probe ADN/ARN Toate

Proba Enzime Markeri radioactivi Compui fluoresceni Cromofori

B. Enzimele imobilizate sunt enzimele legate chimic de un suport diferit ca structur: gel de silice, alumin, crbune activ, rini schimbtoare de ioni, polizaharide modificate (DEAE Sephadex, carboximetil celuloz). Suportul trebuie s ndeplineasc anumite caracteristici: s permit atacul enzimei fr pierdere de activitate enzimatic, nu trebuie s fie inactivat de snge, nu trebuie s provoace hemoliza sau s reacioneze cu plachetele sanguine, nu trebuie s prezinte toxicitate sau s genereze rspuns imun, s elibereze produi toxici (n cazul n care enzimele imobilizate pe acesta vin n contact cu organismul uman). 1. Enzimele imobilizate se folosesc ca reactivi n analizoarele de chimie uscat. Ele sunt imobilizate ntr-un suport de dimensiuni reduse cu tamponul adecvat, cofactorii, cosubstratul i indicatorul de culoare. Plasma furnizeaz substratul i apa necesar activrii sistemului. Enzimele sunt stabile prin legarea de o matrice i pstrarea ntr-un loc uscat. 2. Enzimele imobilizate pe o matrice insolubil se folosesc i n reactoarele chimice din industria farmaceutic, ca reactivi specifici. De exemlu, la obinerea aspartamului trebuie separai izomerii L ai amestecului precursor care au gust dulce i se folosete termolizina care permite doar interaciunea acestor izomeri. 3. Enzimele utilizate n industria alimentar. Se folosesc n scopul ameliorrii gustului alimentelor, eliminrii compuilor ce nu pot fi tolerai de organism, facilitrii unei mai bune digerri a alimentului. Enzimele cele mai utilizate sunt prezentate n tabelul 4. C. Enzimele ca ageni terapeutici. Utilitatea este limitat de structura proteic, fiind hidrolizate de enzimele digestive sau provocnd reacii imunologice. 1. Enzimele n medicaia vascular Streptokinaza, amestec enzimatic obinut din streptococ, e util pentru hidroliza cheagului n infarct miocardic. Activatorul plasminogenului (tPA) este folosit pentru dizolvarea cheagului sanguin. Heparinaza microbian imobilizat poate fi folosit pentru ndeprtarea heparinei folosite n tratament ca anticoagulant. Meninerea ei provoac hemoragie intern. 2. Enzimele folosite n terapia antitumoral Asparaginaza este folosit de pacienii cu leucemie deoarece celulele tumorale au afinitate mare pentru asparagin i scznd nivelul acesteia nu mai este posibil dezvoltarea lor. Fenilalaninamonioliaza este utilizat la scaderea fenilalaninei in cancer sau fenilcetonurie. Tabel 4 Principalele enzime utilizate n industria alimentar autorizate de Comunitatea European (1995) Enzima Origine Utilizare Amilaza Bacillus subtilis Obinerea berii, panificaie, Aspergillus obinerea siropului de glucoz Celulaza Aspergillus Sucuri de fructe, arome, oligomeri de fructoz Glucozoxidaza Aspergillus niger ndeprtarea oxigenului Beta galactozidaza Aspergillus niger Tratamentul laptelui Lipaza Aspergillus, Rhizopus Obinerea brnzeturilor, untului de cacao, uleiului de msline Papaina (proteaza) Carica papaya Frgezirea crnii 22

3. Enzimele folosite n tulburrile digestive Exist preparate ce conin enzime deficitare n tulburrile digestive (pepsina, chimiotripsina, tripsina, amilaza, lipaza) asociate cu substane utile digestiei (bil, hemicelulaze). De ex., Trifermentul (Zimogen), conine tripsin, lipaz, amilaz, Festalul are lipaz, amilaz, proteaze, bil. Pot s conin i substane care s stimuleze secreia enzimelor digestive, de exemplu, pancreozimina (Try Enzymes). n coma hepatic se poate folosi un sistem bioenzimatic constituit din lactat dehidrogenaz i L-alanin dehidrogenaz ce pot capta amoniacul din snge. 4. Enzimele n afeciuni dermatologice nsoite de reacii inflamatorii Sunt diferite endopeptidaze i enzime ce acioneaz asupra proteoglicanilor care degradeaz esuturile alterate de la suprafaa unor leziuni facilitnd penetrarea medicamentelor (se asociaz n medicaia dermatologic, ORL, oftalmic): hialuronidaz, tripsin, chimotripsin, papain (de exemplu, Lasonilul conine hialuronidaz i heparin).

23