Terapia celular en trasplante

COORDINADOR: C. REGIDOR. Madrid

Resumen del simposio

La terapia celular se utiliza como parte del tratamiento de diversas enfermedades malignas o no, mediante el empleo de determinadas poblaciones que pueden servir como agentes inmunoterpicos o reparadores tisulares. En el trasplante hematopoytico el injerto se utiliz inicialmente como un rescate autlogo o alognico tras los tratamientos mieloablativos. La evaluacin cuidadosa de los benecios y complicaciones derivados del mismo ha dado lugar al concepto actual del trasplante como una plataforma de inmunoterapia celular. Las caractersticas del injerto, junto a otros factores, juegan un papel muy importante en los resultados obtenidos. Como ejemplo bien conocido, la deplecin de clulas T en trasplantes alognicos para disminuir la incidencia de la EICH se puede acompaar de un incremento de recidiva, rechazo y complicaciones infecciosas, entre otras. Sin embargo, en determinadas circunstancias da lugar a la obtencin de resultados equiparables a los de situaciones de pronstico ms favorable. En los ltimos aos, la investigacin bsica en biologa celular y molecular ha permitido un conocimiento ms profundo de diferentes componentes del sistema inmune y de la capacidad inmunomoduladora de otras clulas. De forma paralela, el desarrollo tecnolgico va permitiendo obtener poblaciones celulares en condiciones de uso clnico que pueden proporcionar efectos inmunoterpicos, con un balance positivo respecto a posibles efectos secundarios. En este simposio hemos dirigido la atencin hacia la terapia celular en relacin con las complicaciones principales del trasplante, EICH, recidiva e infecciones. En primer lugar he revisado la situacin actual en cuanto a la prolaxis y tratamiento de la EICH mediante el empleo de clulas mesenquimales estromales y T reguladoras. En el caso de las primeras, adems de los aspectos biolgicos y tcnicos, he resumido la mayora de los resultados publicados, entre los que se encuentran los obtenidos por nuestro equipo en el Hospital Universitario Puerta de Hierro de Madrid, y que son de probada ecacia en el caso de la EICH aguda refractaria. La Dra. Ruggeri que pertenece al Departamento de Hematologa e Inmunologa Clnica del Policlinico Monteluce de Perugia (Italia) presenta su amplia experiencia en el estudio de la alorreactividad NK desde la biologa humana, los resultados de los trasplantes haploidnticos en ratn que han permitido conocer la actuacin de las clulas NK, la evidencia de mejores resultados de los trasplantes realizados a partir de donantes NK alorreactivos en los 112 trasplantes haploidnticos de pacientes con LMA de alto riesgo realizados por su grupo y la revisin en trasplantes no emparentados. Por ltimo, el Dr. Einsele del Departamento de Medicina Interna II de Wrzburg presentar su amplia experiencia en la obtencin y utilizacin clnica de clulas T especcas como inmunoterapia adoptiva para complicaciones infecciosas, como la producida por CMV. Los trabajos elegidos para presentacin oral corresponden, en el caso del Dr. Snchez Garca del Hospital Reina Sofa de Crdoba, un estudio prospectivo sobre el anlisis de poblaciones T inmunorreguladoras derivadas del donante en 61 trasplantes, la inuencia de la prolaxis de la EICH sobre su cuanticacin y la relacin con la existencia de EICH aguda y crnica. El Dr. Gallardo presenta por parte del Subcomit de EICH/Inmunoterapia del GETH el anlisis comparativo retrospectivo de 410 trasplantes de sangre perifrica con 410 trasplantes de mdula sea respecto a la supervivencia global, incidencia de EICH aguda y crnica y calidad de vida.

haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1) | 275 |

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

PROFILAXIS Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DEL INJERTO CONTRA EL HUSPED: CLULAS MESENQUIMALES Y CLULAS T REGULADORAS C. Regidor, R. Gonzalo-Daganzo, G. Bautista, T. Martn-Donaire, R. Cabrera, M. Nicols Fernndez
Servicio de Hematologa y Hemoterapia. Hospital Universitario Puerta de Hierro. Madrid

LFA-3 y L-selectina3,4. Se han intentado aislar poblaciones puras de CME a partir de algunos antgenos como CD105, CD73, CD166, STRO-1, anticuerpos antirreceptores para platelet derived growth factor y epitelial growth factor (PDGF y EGF) y recientemente con antiCD271 y anti-ZUC3.

Expansin, capacidad de diferenciacin y migracin

Las CME adultas se pueden aislar por adherencia al plstico y expandirse con facilidad in vitro, dando lugar a colonias (CFU-F) con clulas de aspecto fusiforme. La poblacin que se obtiene es heterognea. En el caso de la MO hay al menos tres tipos de clulas con morfologa, fenotipo y potencial proliferativo diferentes. La adherencia o la proliferacin pueden inducir cambios, por lo que se desconoce si las CME in vivo dieren de las expandidas. Las CME humanas proliferan mejor sembradas a baja densidad. Una vez que se alcanza la conuencia de las reas de crecimiento, las clulas se tripsinizan y resiembran hasta alcanzar la cifra deseada, lo que en los protocolos para uso en trasplante suele ocurrir en unas 4 semanas. Despus de la expansin retienen la capacidad de diferenciacin a hueso, cartlago y grasa, denitorias de CME, aunque hay diferencias entre clulas de distintos orgenes y de especies diferentes. Tambin se mantiene la capacidad de proliferacin y diferenciacin despus de la criopreservacin. Factores potenciadores del crecimiento seran PDFG, broblast growth factor (FGF-2), EGF, heparin binding epidermal growth factor (HB-EGF) y factores inhibidores IFN- e IL-4. La permanencia de la CME indiferenciada multipotente en estado quiescente o su diferenciacin parecen reguladas por genes de la familia Wnt y por sus inhibidores, aunque pueden estar implicados otros sistemas5. En respuesta a estmulos, las CME pueden abandonar el nicho, anidar en otro lugar y diferenciarse o permanecer en los tejidos daados durante la reparacin, favoreciendo el desarrollo de las clulas preexistentes. Relacionados con la capacidad de migracin y el homing estn el CXCR4, receptor de SDF-1, y factores como el PDGF-BB. En modelos animales y en humanos se ha demostrado su capacidad de prendimiento en diferentes tejidos, ya sea implantadas o infundidas. En ratn neonato las CME infundidas estn al 7. da por todo el organismo, a los 18 das en pulmones e hgado, y a los 35 en hueso4. En el trasplante hematopoytico se han detectado en MO en pacientes peditricos y en adultos con acondicionamientos reducidos.

La enfermedad del injerto contra el husped (EICH) es una de las complicaciones ms severas del trasplante hematopoytico. Para su prevencin y tratamiento se utilizan frmacos inmunosupresores, modicaciones en la composicin del injerto, anticuerpos monoclonales, terapia fotodinmica y clulas con potencial inmunosupresor como las clulas mesenquimales, y en un nivel incipiente de aplicacin clnica, las clulas T reguladoras.

Clulas mesenquimales estromales

Las clulas mesenquimales estromales (CME), caracterizadas por Friedenstein en la mdula sea (MO) adulta, se han aislado de diferentes tejidos: adiposo, sangre de cordn umbilical (SCU) e hgado fetal, pulmn, lquido amnitico y tejido periodontal. Son clulas multipotentes con capacidad de migracin, diferenciacin y regeneracin de tejidos de origen mesenquimal y de otras capas embrionarias1,2. En MO su frecuencia es pequea (0,001-0,01%) y disminuye con la edad. Se encuentran en fase quiescente, formando parte del nicho hematopoytico, donde juegan un papel crucial en el desarrollo y la diferenciacin del sistema linfo-hematopoytico a travs de la secrecin de factores de crecimiento como GM-CSF, SCF, HGF (hepatic growth factor), citoquinas, entre las que se encuentran IL-1, IL-6, IL-7, IL-15, SDF-1 y por la promocin de interacciones clula-clula. Al carecer de marcadores especcos, se denen por una combinacin de caractersticas fenotpicas y funcionales.

Caractersticas fenotpicas
Las CME son negativas para marcadores tpicos hematopoyticos y endoteliales tales como CD34, CD45, CD14, CD11b, CD31, CD33, CD133 y HLA-DR, y positivas para un gran nmero de molculas de adhesin, receptores de componentes de la matriz extracelular, citoquinas y factores de crecimiento: CD73, CD90, CD105, CD106, CD166, CD29, CD117, ICAM 1 y 2,
| 276 | haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1)

Caractersticas inmunolgicas
Las CME poseen propiedades inmunosupresoras y antiinamatorias y poca capacidad inmunognica, que

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

se han revisado recientemente4,6. Comparten marcadores con el epitelio tmico, y las adultas expresan niveles intermedios de MHC de clase I y no expresan molculas MHC de clase II, aunque pueden aumentar o detectarse por la accin del IFN-. No expresan molculas coestimuladoras CD80 y CD86, ni siquiera despus de la estimulacin con IFN-. Ni las CME inmaduras o estimuladas, ni las diferenciadas activan las clulas T in vitro en presencia de clulas presentadoras de antgeno (CPA). En la estimulacin con mitgenos disminuyen la expresin de marcadores linfocitarios de activacin como CD25 (receptor de IL-2 cadena ), CD38 y CD69. Escapan a la lisis por linfocitos citotxicos (CTL) CD8 y tambin a la de las clulas NK, aunque pueden ser lisadas por clulas NK activadas por IL-2. Son bien toleradas en humanos cuando se infunden a travs de las barreras de histocompatibilidad, aunque se ha detectado rechazo de CME humanas en ratas inmunocompetentes. Las CME inhiben la alorreactividad de clulas T nave y de memoria en cultivo mixto linfocitario (CML) y en respuesta a mitgenos como la tohemaglutinina (PHA) con un efecto dosis-dependiente. Un nmero elevado de CME respecto a los linfocitos (proporcin 1:10) produce una marcada inhibicin de la proliferacin linfocitaria y, por el contrario, una menor proporcin (1:100 o 1:10.000) a menudo aumenta la proliferacin en CML y en activacin con mitgenos. Este mecanismo es HLA-independiente y posiblemente diferente en CML y en estimulacin por PHA. El efecto supresor se mantiene despus de la diferenciacin y aumenta por el IFN-. Al actuar sobre las clulas T helper, disminuye la produccin de IFN- e IL-12 y aumenta la de IL-4. Las CME suprimen la lisis mediada por CD8+ en CML, pero slo inhiben la fase aferente y no tienen efecto en la fase citotxica. En comparacin con el efecto sobre las clulas T alorreactivas, el efecto inmunosupresor sobre la respuesta T-especca frente a CMV, EBV, adenovirus y otros agentes infecciosos es mucho menor. Las CME murinas requieren contacto clula-clula, mientras que las humanas funcionan en presencia de membranas permeables y no inducen tolerancia, anergia o apoptosis, por lo que los linfocitos pueden ser reestimulados si las CME se retiran del cultivo. El efecto sobre la proliferacin se produce por inhibicin de la divisin celular. Como inductores de la supresin de las clulas T in vitro se han sugerido varios factores solubles como el HGF, TGF-1, IL-2, indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), que induce el catabolismo del triptfano, factor esencial para la proliferacin linfocitaria, xido ntrico, prostaglandina E2 (PGE2) e IL-10. Algunos datos se han obtenido con cantidades elevadas de CME y no se puede descartar por completo un mecanismo de contacto. En CML, con una proporcin CME:clula respondedora de 1:1, aumenta la poblacin de clulas T reguladoras CD4+CD25+ y re-

cientemente se han generado clulas CD4+ y CD8+ con fenotipo diferente al de las ya descritas, con una capacidad supresora 100 veces mayor. Las CME reducen la secrecin de IFN- de las clulas NK estimuladas por IL-2, pero no inhiben la lisis de clulas K562 mediada por NK. Para inhibir la actividad citotxica de CTL y NK habra que utilizar grandes proporciones (1:10) y son dosis celulares que no se pueden emplear in vivo. Las CME inhiben la formacin, diferenciacin y funcin de las clulas dendrticas, alterando el patrn de secrecin de citoquinas. Respecto las clulas B, hay datos contradictorios, aunque parece que inhiben la proliferacin.

Seguridad biolgica
La posibilidad de transformacin tumoral de las CME en cultivo se ha descrito para las clulas de MO murinas, clulas humanas de tejido adiposo, de MO en cultivos de larga duracin y de SCU. Es importante la deteccin de posibles anomalas, dado que se utilizan en muchas ocasiones en pacientes inmunodeprimidos. Recientemente se ha investigado exhaustivamente la posibilidad de transformacin de CME de MO con varias tcnicas en diferentes momentos, hasta 12 semanas despus de que el cultivo alcanzara la senescencia, sin detectar anomalas. En cualquier caso, es recomendable utilizar clulas generadas en periodos cortos de cultivo y realizar los controles pertinentes3. Normalmente las CME se cultivan con suero bovino fetal (SBF), que se considera crucial para la expansin y que debe seleccionarse para garantizar el crecimiento ptimo y la seguridad biolgica del producto. Aun as, adems del riesgo de la transmisin de zoonosis, existe el problema de la captacin por las CME de protenas y pptidos bovinos que pueden causar reacciones alrgicas, en especial tras administraciones repetidas. Recientemente se ha demostrado que la sustitucin del SBF por suero humano AB, o por lisado plaquetario, genera clulas comparables a las obtenidas con SBF en cuanto a su capacidad de inmunosupresin y de diferenciacin, con mayor grado de expansin7. Las CME son susceptibles de infeccin in vitro por CMV y HSV-1 pero no por EBV, aunque no se ha obtenido ADN viral en las clulas de donantes con serologa positiva para CMV. Por otro lado, aunque las CME produzcan poca supresin de la proliferacin linfocitaria frente a patgenos, habra que contemplar la posibilidad de que las clulas se infecten en pacientes con CMV y el posible compromiso de la respuesta frente a infecciones a la hora de la indicacin teraputica. La repuesta anti-CMV no se ha visto afectada en pacientes tratados por EICH8. Las CME expresan el antgeno P y se pueden infectar por parvovirus B19 y transmitir la
haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1) | 277 |

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

Tabla 1. Uso clnico de CME. Prendimiento y prevencin de EICH

Diagnstico LMA Hemopatas malignas

Tipo de trasplante HLA-haplo HLA-id MO, SP

N. casos 1 31

CME (origen, dosis/kg) HLA-haplo MO HLA-id MO 1-2 106

Resultado Buen prendimiento, no EICH Respecto a controles histricos < EICHa grado II-IV < EICHc > supervivencia no recidiva EICHa grado II-IV 28% EICHc 61% EICHa grado II2, uno desarroll EICHc Pocas infecciones bacterianas y CMV Respecto a controles histricos EICHa I-II: 14% vs. 26% EICHa III-IV: 0% vs. 4% EICHc: 7% vs. 13% No recidiva, > supervivencia Prendimiento igual EICHa II-IV: 11,1% vs. 53,3% Recada: 60% vs. 20% No diferencia en EICHa respecto a controles histricos No EICHa II-IV

Referencia Lee Br Jour Hematol 2002; 118: 1128 Frassoni EBMT 2002 (Abst 75)

Hemopatas malignas LA, SCID, AA Hemopatas malignas11 y otras

HLA-id MO, SP

46 (adultos)

HLA-id MO 1-5 106 HLA-haplo MO 1 106 HLA-haplo MO 1-5 106

Lazarus Biol Blood Marrow Transplant 2005; 11: 389 Le Blanc Leukemia 2007; 21: 1733 Ball Blood 2007; 110: 2764

HLA-id, NE, SCU HLA-haplo SP

7 (adultos y nios) 14 (nios)

Hemopatas malignas Aleatorizado -talasemia Hemopatas malignas

HLA-id MO, SP

10 + CME 15 sin CME (adultos) 10 8

HLA-id MO 0,03-1,53 106 HLA-id, MO 1-2,24 106 Donante y origen no especicado (MO?) (Trans-Technology) 2 106 HLA-haplo 1-3,3 106

Ning Leukemia 2008; 22: 593 Ghavamzadeh EBMT 2008 (Abst 657) Stankevich EBMT 2008 (Abst 1029)

Hla-id MO, SP HLA-id, HLA-haplo NE, MO, SP SCU

Hemopatas malignas5 y otros Hemopatas malignas

9 (nios)

Respecto a controles, no mejor prendimiento No EICHa II-IV vs. 30% No EICHc vs. 5% Respecto a controles, no mejor prendimiento de la SCU ni < incidencia de EICHa

Bernardo EBMT 2008 (comunicacin oral)

SCU + c. CD34+ de donante auxiliar (trasplante dual)

9 (adultos)

Donante auxiliar HLA-haplo o incompatible MO 1-2,15 106

Gonzalo-Daganzo EBMT 2008 (Abst 1009)

AA: anemia aplsica; LA: leucemia aguda; NE: no emparentados; SCID: sndrome de inmunodeciencia severa combinada

infeccin al constituir un reservorio natural. Dos pacientes trasplantados y severamente inmunodeprimidos que recibieron clulas B19 positivas no desarrollaron viremia ni sntomas de infeccin. Por ltimo, y debido a su capacidad inmunosupresora, sera importante constatar la ausencia de efectos negativos sobre el efecto antileucemia.

Uso clnico en el trasplante hematopoytico

Prendimiento y prevencin de la EICH Los resultados de varias series se resumen en la Tabla 1. Los primeros ensayos exploraron la seguridad
| 278 | haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1)

de la administracin de CME autlogas expandidas y los efectos sobre el prendimiento hematopoytico. Actualmente las CME autlogas se utilizan en algunos trasplantes realizados con dosis bajas de progenitores. En un trasplante haploidntico deplecionado de clulas T se infundieron CME alognicas del donante. El prendimiento fue rpido, con buena reconstitucin inmune, sin desarrollo de EICH. En 31 trasplantes alognicos HLA idnticos, 1-2 106 CME/kg de sus donantes acortaron el prendimiento, con baja incidencia de EICH y mejora de la supervivencia sin aumento de recidivas. La seguridad de la infusin de dosis progresivas de 1 a 5 106 CME/kg se explor en 46 trasplantes de MO y SP. La recuperacin hematopoytica fue temprana, sin efectos secundarios, y hubo EICHa mo-

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

derada severo en un 28%. Se han utilizado CME haploidnticas en 4 de 7 trasplantes familiares y no emparentados (NE) con diagnsticos diversos, con buen prendimiento y poca incidencia de EICH e infecciones, y en una serie peditrica de 14 trasplantes haploidnticos deplecionados de clulas T, con una media de 1,6 106 CME/kg generadas con los protocolos desarrollados por el consorcio para la expansin clnica de las CME (Developmental Committee, EBMT). La recuperacin leucocitaria fue rpida, sin fallos de prendimiento, frente al 15% en los controles, y sin aumento de la incidencia de infecciones ni efectos adversos, aunque con un seguimiento corto9. En trasplantes de SCU, con los protocolos desarrollados por el consorcio, en 9 pacientes peditricos con 1,9 106 CME haploidnticas/kg, no hubo efecto sobre el prendimiento ni EICHa de grado II-IV, frente al 30% en los controles, y no aumentaron el rechazo ni las infecciones fatales en el periodo postrasplante precoz. Utilizando tambin estos protocolos en 9 pacientes adultos, en nuestro modelo de trasplante de SCU dual con progenitores hematopoyticos seleccionados de un donante auxiliar, 1-2 106 CME/kg de estos donantes no han tenido repercusin sobre el prendimiento granulocitario ni plaquetario de la SCU, ni sobre la incidencia de EICHa, sin diferencias en recidiva, supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global con 46 controles. De especial relevancia por sus resultados es la reciente publicacin de un ensayo aleatorizado en hemopatas malignas. Diez pacientes recibieron dosis de CME HLA-idnticas, inferiores a las utilizadas en otros estudios (0,3-15,3 105/kg), y 15 no. La incidencia de EICHa de grado II-IV fue del 11,8 y el 53,3% en cada grupo, y la de EICHc, del 14,3 y el 28,6%, respectivamente. El hallazgo ms destacable fue la recada en el 60% de los pacientes en el grupo tratado con CME y en un 20% en los otros pacientes, hecho que oblig a la suspensin del ensayo10. Tratamiento de la EICH Desde el caso publicado por Le Blanc et al. de un paciente peditrico con EICH aguda intestinal y heptica, refractario a diversas lneas de tratamiento, que se resolvi con la administracin de dos dosis de CME haploidnticas, hay datos de diversas series, con un nmero variable de pacientes tratados por EICHa de grado II-IV refractario, con buenos resultados y que se resumen en la Tabla 2. En 8 pacientes con EICHa de grado III-IV y un EICHc, 0,9-9 106 CME/kg de donantes familiares y no relacionados produjeron remisin completa en 6 EICHa, de los que viven 5, y el EICHc mejor transitoriamente, pero desarroll un linfoma asociado a EBV. Un paciente con afectacin intestinal que falleci 9 das despus de la ltima in-

fusin tena ADN de sus dos donantes de CME en un ganglio linftico y en el intestino. De 32 pacientes con EICHa resistente a esteroides de grado II-IV, aleatorizados para recibir 2 dosis diferentes de 2 y 8 106 CME/kg de un pool de donantes no relacionados, obtuvieron respuesta 28 (90%), completa en 21, sin efectos adversos. CME de estas caractersticas se han utilizado en 12 nios, con un 50% de respuestas completas. Los datos de 55 pacientes del ensayo interinstitucional en fase II del consorcio del EBMT, tratados con una mediana de 1,4 106 CME/kg obtenidas de 23 donantes familiares idnticos o haploidnticos y de 69 no relacionados HLA-incompatibles, con 1 dosis en 27 casos, 2 en 22, y el resto con 3-5 dosis, han dado 30 respuestas completas y 8 parciales. La respuesta total fue del 69% (80% en nios y 60% en adultos). Hay 3 recidivas y 1 leucemia de novo. En las respuestas completas, la tasa de mortalidad al ao fue del 37% frente a un 72% en los casos sin respuesta, y la supervivencia global a los 2 aos, del 52% frente al 16%. Viven 21 pacientes, 9 con EICHc. Utilizando estos mismos protocolos de generacin de CME hemos tratado 4 casos de EICH agudo refractario de grado II-III, 3 en trasplantes no emparentados, 2 SCU y 1 adulto, y 1 trasplante de familiar deplecionado de clulas T con infusin posterior de una dosis de linfocitos, con respuesta completa en todos los casos con 1-4 dosis y un total de 1,1-4,3 106 CME/kg. Tambin se han obtenido buenos resultados con CME de MO generadas con lisado plaquetario y con CME de tejido adiposo (Tabla 2). Las CME se han empleado para tratar toxicidad tisular desarrollada durante el acondicionamiento, cistitis hemorrgica, neumomediastino y perforacin intestinal, con resolucin o mejora de los sntomas en todos los casos4.

Clulas T reguladoras
Las clulas T reguladoras (Treg) producen inhibicin de la respuesta inmune, con un papel importante en la induccin y el mantenimiento de tolerancia hacia antgenos propios y extraos, incluidos los aloantgenos, mientras que se mantiene una respuesta ecaz frente a infecciones y tumores. Se han caracterizado diversos tipos. Las ms relevantes y sobre las que existe ms informacin son las CD4+, denominadas Treg naturales o nTreg, y las Tr1, que forman parte de la respuesta adaptativa inmune. Otras clulas Treg son las CD4+ Th3, CD8+, dobles negativas CD4 y CD8, y T.

Clulas nTreg
Expresan constitutivamente CD25+ y la mayora se desarrollan en el timo en respuesta a autoantgehaematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1) | 279 |

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

Tabla 2. Uso clnico de CME. Tratamiento de la EICH

Diagnstico LLA Hemopatas malignas y Ca prstata

Tipo de trasplante/Afectacin HLA donante, NE, EICHa IV, intestino, heptico HLA-id, NE compatible; SP y SCU EICHa II-IV, 2 post-ILD y 1 EICHc Donantes familiares y NE; ILD EICHa II-IV intestinal 13, piel 11, ambos 4, hgado e intestino 2 HLA-id familiar y NE EICHa III-IV SCU y donantes NE EICHa III-IV todos piel, 6 intestinal + hgado

N casos 1 (nio) 9 (adultos y nios)

CME (origen, dosis/kg) HLA-haplo MO 1 y 2 106 HLA-id y donantes auxiliares incompatibles, MO 0,7-9 106 CME de donantes auxiliares NE, MO (Prochymal, Osiris) Aleatorizado 2 y 8 106; 2 infusiones CME de tejido adiposo, donantes HLA-haplo y NE 1 106 CME de donantes auxiliares NE, MO (Prochymal, Osiris) 2 y 8 106 3-21 dosis HLA-id, haplo y donante auxiliar incompatible 0,4-9 106 CME generadas con lisado plaquetario 0,55-1,1 106 2-5 infusiones Donante y origen no especicado (MO?) (Trans-Technology) 2 106 1-3 dosis

Resultado Respuesta completa EICHa respuesta completa 6/8 > supervivencia respecto a controles histricos EICHc respuesta transitoria (linfoma EBV) Respuesta global 90%, completa 21 pacientes, parcial en 7 1 recidiva Respuesta completa 5/6 4 pacientes vivos 1 recidiva Respuesta global 100%; completa 6 pacientes nico efecto secundario lesiones ectpicas sin ADN de CME en 1 caso de osteopetrosis Respuesta completa 55% Respuesta global 69%, adultos 60%, nios 80% 3 recidivas y una LMA nueva (receptor) Respuesta 7/10 5/7 con afectacin heptica 4/9 con afectacin intestinal Respuesta global 85%, completa 3, parcial 3 EICHa, 1 EICHc No efectos adversos

Referencia Le Blanc Lancet 2004; 363: 1439 Ringdn Transplantation 2006; 81: 1390

Ensayo multicntrico

30 (adultos)

Kebriaei ASH 2006 (Abst 3231)

Hemopatas malignas Ensayo multicntrico

6 (adultos)

Fang Transplantation Proceedings 2007; 39: 3358 Vinod ASH 2007 (Abst 2971)

12 (nios)

Ensayo multicntrico Consorcio EBMT

EICHa II-IV (III y IV: 50 casos)

55 (adultos y nios)

Le Blanc EBMT 2008 (Abst 750)

Hemopatas malignas

EICHa III-IV

10

von Bonin EBMT 2008 (Abst 797)

Hemopatas malignas

HLA-id, haplo y NE MO y SP EICHa y EICHc

Stankevich EBMT 2008 (Abst 1029)

ILD: infusin de linfocitos de donante; LLA: leucemia aguda linfoblstica; NE: no emparentados

nos. Tambin se pueden generar perifricamente a partir de clulas CD4+CD25. Ejercen un mecanismo activo o dominante de tolerancia perifrica11. En humanos, las nTreg estn preferentemente en la fraccin CD25high, mientras que en la poblacin con expresin intermedia de CD25 hay adems clulas de memoria y clulas activadas recientemente. El 96% de las clulas CD4+CD25+high humanas expresan el factor de transcripcin especco de la familia Forkhead FOXP3, que se ha relacionado con su desarrollo y funcin supresora y que tambin se expresa en el 42% de las CD4+CD25+dim 12. En humanos se puede inducir la expresin de FOXP3 en clulas CD4+CD25 y CD8+CD25 por activacin del receptor T, aunque estas clulas no son
| 280 | haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1)

anrgicas ni supresoras in vitro. El receptor de IL-7, CD127, tiene una expresin baja o ausente en las nTreg, al igual que en la fase temprana de activacin de las clulas T. En situacin de normalidad representan menos del 5% del pool CD4, y los resultados de la cuanticacin dependen del tipo de medicin (citometra, PCR, etc.) y de la poblacin analizada (linfocitos, CD4). En pacientes con EICH suele detectarse un balance positivo para las clulas efectoras respecto a las Treg, en comparacin con los pacientes sin enfermedad, con actividad funcional normal. La EICH crnica podra relacionarse con una prdida progresiva de Treg, que se inicia en el EICHa, dando lugar a la expansin de clulas con fenotipo Th1 y Th17

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

secretoras de citoquinas. La reduccin en la actividad tmica se acompaa de EICHc por reconstitucin inadecuada de Treg12. Hay muchos trabajos en modelos murinos en los que, adems de constatar la relacin entre la eliminacin de las Treg del injerto y la EICH, se han obtenido resultados variables sobre el control de la misma y datos que pueden ser importantes para su aplicacin futura. Las Treg del donante no expandidas previenen la EICH cuando se usan en la misma proporcin que las clulas T del inculo y en otros casos slo hay control con la subpoblacin CD62L+. Se ha atribuido a las Treg expandidas un efecto supresor mayor, y a las Treg antgeno-especcas, ventajas sobre las policlonales, en la intensidad y duracin de la supresin y, al producir menor supresin generalizada, en la reconstitucin inmune y el efecto antileucemia. No obstante, en la fase de activacin son antgeno-dependientes, pero en la fase efectora-supresora actuaran de forma antgeno-independiente y podran comprometer algunas respuestas inmunes. Se ha demostrado en ratones que el efecto supresor sobre la EICH respeta el efecto antileucemia y antilinfoma, aunque no en otros modelos de tumor slido. El momento idneo de la infusin vara segn el modelo experimental. La prevencin se ha conseguido con clulas preactivadas e infundidas en los primeros 2 das postrasplante13,14. Las nTreg actuaran suprimiendo la proliferacin de CD4 y CD8, despus de estimulacin policlonal y alognica, de forma contacto-dependiente citoquina-independiente. Tambin suprimen respuestas de clulas B y dendrticas. No se conocen bien los mecanismos moleculares de la actividad supresora que, in vitro, no se modica con el uso de anti-IL-10 o anti-TGF-. Sin embargo, se han descrito resultados en modelos animales a favor del mecanismo mediado por citoquinas, as como una posible destruccin directa va perforina de clulas T, monocitos y clulas dendrticas. Hay datos a favor y en contra de la cooperacin de estas ltimas15,16. En modelos sin linfopenia, las clulas Treg autoespeccas proliferan en los rganos linfoides secundarios en interaccin con clulas presentadoras de autoantgenos derivados de tejidos y, una vez activadas, inhiben linfocitos T autoespeccos de forma antgeno-especca, por mecanismos mediados, al menos en parte, por la unin de CD80 o CD86 y CTLA4 expresado por las Treg. Esta interaccin produce IDO con el efecto ya comentado sobre la proliferacin de clulas T. Se han descrito diferencias en la supresin de clulas CD4 y CD8 que favoreceran la eliminacin de lneas leucmicas y una mejor reconstitucin inmune si las Treg preactivadas con APC receptoras se inyectaran con el injerto11.

Aislamiento y expansin A partir de los resultados experimentales se ha sugerido la posibilidad de realizar inmunoterapia adoptiva con Treg para prolaxis y tratamiento de EICH. Tericamente se podran aislar clulas antgeno-especcas y expandirlas, o realizar una activacin policlonal ex vivo, asumiendo la presencia de dichas clulas en la poblacin basal. En general, las Treg son clulas anrgicas que necesitan 3 o 4 das de cultivo antes de entrar en fase S y no secretan IL-2, factor esencial para su crecimiento y quiz para su supervivencia. Dada su frecuencia, si la ecacia depende de la utilizacin de tantas Treg como T efectoras, sera necesario expandirlas, lo que se ha conseguido en algunos sistemas experimentales hasta 3-4 log, siendo importantes las caractersticas de la poblacin inicial15,17. La deplecin B inmunomagntica de SP humana seguida de seleccin CD25 bajo normas GMP (good manufacturing practices) enriquece 25 veces la fraccin CD25+high, con una recuperacin del 46,5% y valores absolutos de 3 a 262 106 clulas, que expresan intensamente FOXP3 y CTLA-418. La expansin policlonal de los nTreg murinos y humanos se ha realizado con anti-CD3 e IL-2 o con microesferas recubiertas de anti-CD3/CD28 y altas dosis de IL-2 (reactivos de calicacin GMP) a partir de una poblacin inicial CD4+CD25+ y a veces CD62L+. Partiendo de clulas humanas CD4+CD25+high, se ha visto que slo la subpoblacin CD45RA+ da lugar a clulas con expresin homognea de CD62L, CTLA-4, CCR7 y FOXP3, que no producen citoquinas inamatorias y mantienen una fuerte actividad supresora. En este trabajo se detectan en la SP de donantes un 42% de clulas nave dentro de la poblacin CD4+CD25+high 19. Si se expanden clulas CD4+CD25+highCD127, slo la poblacin CD45RA+CD127 tiene un comportamiento similar al descrito. Por lo tanto, la expansin de clulas CD45RA+ podra dar lugar a clulas Treg con caractersticas adecuadas para la aplicacin clnica, como ya se ha sugerido respecto a la posibilidad de utilizar SCU donde las Treg son en su mayora de fenotipo nave 20. Tambin se ha realizado expansin policlonal utilizando clulas dendrticas15 y con IL-4 o IL-15. La estimulacin de clulas CD4+ en presencia de rapamicina enriquece la poblacin CD4+CD25+ FOXP3+ por bloqueo de la expansin de las clulas efectoras16. A pesar de su baja frecuencia, se ha conseguido la expansin de Treg antgeno-especcas a partir de poblaciones policlonales, reemplazando el anti-CD3 por pptidos MHC de clase II, con anti-CD28 e IL-2 y con CPA alognicas irradiadas e IL-2. Si las CPA son del receptor, las Treg seran alorreactivas especcas, y el efecto supresor afectara a las clulas alorreactihaematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1) | 281 |

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

vas del donante. A partir de clulas CD4+CD25 estimuladas con anti-CD3 en presencia de CPA pulsadas con pptido se han obtenido clulas CD4+CD25+ FOXP3+, de las que se pueden aislar Treg especcas mediante tetrmeros HLA de clase II15. Otras posibilidades de expansin, que incluyen modicaciones genticas, se han revisado en detalle17, as como posibles estrategias de modulacin in vivo, que pueden aumentar o disminuir la cifra de Treg12.

10 y utilizando CD tolerognicas mieloides obtenidas por tratamiento con citoquinas inmunomoduladoras (IL-10, TGF-, TNF-, IFN-) en presencia de IL-2 y tambin empleando CD plasmocitoides. En modelos murinos se pueden inducir in vivo por la administracin conjunta de IL-10 y rapamicina16.

Protocolos clnicos
Los datos publicados sobre protocolos clnicos con clulas Treg son aislados. En un ensayo en fase I del que no se han publicado resultados, se estn utilizando nTreg frescas no expandidas para la prevencin de EICH, siguiendo los sistemas de seleccin inmunomagntica mencionados. Otro ensayo en trasplantes haploidnticos emplea clulas Tr1 del donante tolerizadas tras incubacin con clulas de SP del receptor irradiadas en presencia de IL-10. Se infunden 15 das despus de alcanzar el prendimiento, comenzando por dosis de 1 105/kg. Los resultados preliminares no han mostrado efectos adversos; de 6 pacientes slo 2 desarrollaron EICH de grado > II, los cuales respondieron al tratamiento inmunosupresor. El mismo grupo tiene otros protocolos en fase de diseo para generar Tr1 con clulas del donante incubadas con clulas dendrticas del receptor tolerizadas con IL-10 o para generar nTreg con anti-CD3/CD28, rapamicina e IL-2 y utilizarlas tambin en trasplante haploidntico16,18.

Clulas Tr1
Estas clulas son inducidas a partir de clulas nave en la periferia in vivo y tambin in vitro por un proceso IL10 dependiente. Tienen un patrn nico de secrecin de citoquinas, niveles altos de IL-10, TGF- e IL-5, bajo nivel de IFN- e IL-2 y no secretan IL-4, aunque el perl puede variar con las condiciones experimentales. Constitutivamente no expresan CD25 ni FOX P3, y tampoco los expresan en niveles altos las generadas in vitro16. Hay trabajos que relacionan una menor incidencia de EICH con niveles altos de IL-10 en el plasma de pacientes con donantes HLA incompatibles y detectan clulas T del donante especcas para antgenos del receptor secretoras de IL-10. Las clulas Tr1 regulan la respuesta inmune mediante la secrecin de citoquinas inmunosupresoras IL-10 y TGF- y suprimen las clulas T nave y de memoria in vivo e in vitro, as como las clulas dendrticas, disminuyendo la expresin de molculas coestimuladoras y la produccin de citoquinas. Al igual que las clulas nTreg, las clulas Tr1 especcas activadas va TRC pueden ejercer su accin frente a otros antgenos. Tambin se han descrito mecanismos de actuacin va granzima B/perforina para clulas Tr1 generadas in vitro16. Lo ms probable es que in vivo existan diversas formas de actuacin, que dependeran de si se trata de controlar el inicio de una respuesta o a clulas T ya activadas, de las citoquinas ambientales o de la patologa de base. Tambin puede ser que el momento de actuacin sea precoz para las clulas nTreg y ms tardo para las Tr1. Expansin y generacin Se han descrito diferentes mtodos de diferenciacin y generacin in vitro de clulas Tr1 especcas mediante la estimulacin del TCR en presencia de altas dosis de IL-10, con vitamina D3 y dexametasona, que induciran produccin autocrina de IL-10, en CML en presencia de IL-10 y TGF- y CPA articiales con expresin de CD58 y CD80 en presencia de TNF-, entre otros. Se han generado clulas Tr1 aloantgeno-especcas estimulando con CD inmaduras, con monocitos alognicos irradiados en presencia de IL| 282 | haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1)

Conclusiones
Los resultados de la inmunoterapia celular para prevenir y tratar la EICH son esperanzadores, sobre todo en el tratamiento de la EICHa refractaria. Sin embargo, an quedan por resolver muchas cuestiones de orden tcnico y prctico para lograr poblaciones celulares ecaces y biolgicamente seguras. Un aspecto muy importante y pendiente de aclaracin es si existe repercusin sobre la respuesta inmune antileucmica y antiinfecciosa. Para ello es necesario trabajar con protocolos estandarizados y dentro de ensayos diseados por los grupos de trabajo de organizaciones e instituciones cientcas, teniendo en cuenta los datos que aporta la investigacin bsica y el rigor que debe caracterizar a la investigacin y a la prctica clnicas.

Bibliografa
1. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143-7. 2. Giordano A, Galderisi U, Marino IR. From the laboratory bench to the patients bedside: an update on clinical trials

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

3.

4. 5. 6. 7.

8.

9.

10.

11. 12. 13. 14.

15. 16.

17. 18.

19.

20.

with mesenchymal stem cells. J Cell Physiol 2007; 211: 2735. Locatelli F, Maccario R, Frassoni F. Mesenchymal stromal cells, from indifferent spectators to principal actors. Are we going to witness a revolution in the scenario of allograft and immunemediated disorders? Haematologica 2007; 92: 872-7. Le Blanc K, Ringdn O. Immunomodulation by mesenchymal stem cells and clinical experience. J Int Med 2007; 262: 509-25. Satija NK, Gurudutta GU, Sharma S, Afrin F, Gupta P, Verma YK, et al. Mesenchymal stem cells: molecular targets for tissue engineering. Stem Cells Dev 2007; 16: 7-23. Barry FP, Murphy JM, English K, Mahon BP. Immunogenicity of adult mesenchymal stem cells: lessons from the fetal allograft. Stem Cells Dev 2005; 14: 252-65. Bernardo ME, Avanzini MA, Perotti C, Cometa AM, Moretta, Lenta E, et al. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol 2007; 211: 121-30. Sundin M, rvell C, Rasmusson I, Sundberg B, Ringdn O, Le Blanc K. Mesenchymal stem cells are susceptible to human herpesviruses, but viral DNA cannot be detected in the healthy seropositive individual. Bone Marrow Transplant 2006; 37: 1051-9. Ball LM, Bernardo ME, Roelofs H, Lankester A, Cometa A, Egeler RM, et al. Cotransplantation of ex vivo-expanded mesenchymal stem cells accelerates lymphocyte recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2007; 110: 2764-7. Ning H, Yang F, Jiang M, Hu L, Feng K, Zhang J, et al. The correlation between cotransplantation of mesenchymal stem cells and higher recurrence rate in hematologic malignancy patients: outcome of a pilot clinical study. Leukemia 2008; 22: 593-9. Joffre O, van Meerwijk JPM. CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes in bone marrow transplantation. Sem Immunol 2006; 18: 128-35. Zorn E. CD4+CD25+ regulatory T cells in human hematopoietic cell transplantation. Sem Cancer Biol 2006; 16: 1509. Salomon BL, Sudres M, Cohen JL. Regulatory T cells in graftversus host disease. Springer Semin Immun 2006; 28: 25-9. Edinger M, Hoffmann P, Ermann J, Drago K, Fathman CG, Strober S, et al. CD4+CD25+ regulatory T cells preserve graft-versus-tumor activity while inhibiting graft-versushost disease after bone marrow transplantation. Nat Med 2003; 9: 1144-50. Masteller EL, Tang Q, Bluestone A. Antigen specic regulatory T cells ex vivo expansion and therapeutic potential. Sem Immunol 2006; 18: 103-10. Roncarolo MG, Gregori S, Battaglia M, Bachetta R, Fleischhauer K, Levings MK. Interleukin-10-secreting type 1 regulatory T cells in rodents and humans. Immunol Rev 2006; 212: 28-50. June CH, Blazar BR. Clinical application of expanded CD4+CD25+ cell. Sem Immunol 2006; 18: 78-88. Hoffmann P, Boeld TJ, Eder R, Albrecht J, Doser K, Piseshka B, et al. Isolation of CD4+CD25+ regulatory T cells for clinical trials. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: 26774. Hoffmann P, Eder R, Boeld TJ, Doser K, Piseshka B, Andreesen R, et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high cells gives rise to homogeneuous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood 2006; 108: 4260-7. Fritzsching B, Oberle N, Pauly E, Geffers R, Buer J, Poschi J, et al. Naive regulatory T cells: a novel subpopulation dened by resistance toward CD95L-mediated cell death. Blood 2006; 108: 3371-8.

DONOR NATURAL KILLER CELL ALLORECOGNITION OF MISSING SELF IN MISMATCHED HEMATOPOIETIC TRANSPLANTATION: FROM EXPERIMENTAL MODELS TO CLINICAL TRANSPLANTS L. Ruggeri, A. Mancusi, M. Capanni, E. Burchielli, E. Urbani, F. Aversa, M.F. Martelli, A. Velardi
Hematology and Clinical Immunology. Department of Clinical and Experimental Medicine. University of Perugia, Italy

Abstract
Although transplantation from HLA-identical siblings is the treatment of choice for patients with acute leukemia, 75% of patients do not have such a brother or sister. Consequently, other sources of hematopoietic stem cells today include matched unrelated volunteers, unrelated umbilical cord blood units and full-haplotype mismatched (haploidentical) family members. Until the early 1990s, transplantation across the HLA barrier was unsuccessful because T cell mediated alloreactions in the host-versus-graft (HvG) direction caused rejection and in the graft-versus-host (GvH) direction caused fatal GvHD because alloreactive donor T cells recognize HLA antigens on recipient. In acute leukemia patients, rejection and lethal GvHD after haploidentical transplantation were successfully overcome by means of a highly immunosuppressive and myeloablative conditioning regimen and a megadose of extensively T cell depleted granulocyte-colony stimulating factor mobilized peripheral blood progenitor cells. Since haploidentical transplants relies for its success on extensive T cell depletion, T cell alloreactivity plays a minimal role for engraftment and the graft versus leukaemia (GVL) effect, but natural killer cell alloreactivity is triggered and has been associated with benecial effects. Recent studies using pre-clinical murine models of haploidentical transplantation demonstrated infusion of alloreactive NK cells as part of the conditioning regimen ablates the recipient immune system and leukemia cells. In the clinical setting of mismatched haematopoietic stem cell transplantation, donor-vs-recipient NK cell alloreactivity has been associated with reduction of leukemia relapse and improvement of survival, particularly in patients with acute myeloid leukemia who are transplanted in remission.
haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1) | 283 |

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

Introduction
Allogeneic HLA-matched haematopoietic cell transplantation cures leukemia through alloreactions mediated by donor T cells in the graft which result in rapid engraftment, a relatively low risk of fatal GVHD, and successful development of immune tolerance and immune reconstitution1. Although transplantation from HLA-identical siblings is treatment of choice, 75% of patients do not have such a brother or sister. Consequently, other sources of hematopoietic stem cells today include matched unrelated volunteers, unrelated umbilical cord blood units and full-haplotype mismatched (haploidentical) family members2. Haploidentical transplants, which have been developed in the past decade, exploit the principle that nearly every patient has a family member (parent, child, sibling, cousin, aunt, uncle), who is identical for one HLA haplotype (haploidentical) and fully mismatched for the other, and who could immediately serve as donor. The major obstacles to haploidentical transplantation are T cell mediated alloreactions in the host-versus-graft (HvG) direction, which cause rejection, and in the graft-versus-host (GvH) direction, which cause GvHD. Until the early 1990s, transplantation across the HLA barrier was unsuccessful because alloreactive donor T cells recognizing HLA antigens on recipient cells caused a high incidence of fatal GvHD. However, in patients with severe combined immunodeciency (SCID) who received transplants from haploidentical family members several clinical trials demonstrated that extensive ex vivo T cell depletion of bone marrow to a maximum of 2-4 104 T cells/kg body weight prevents acute and chronic GVHD without any post-transplant immunosuppressive prophylaxis3. Unfortunately, when tested in leukemia patients, haploidentical T cell-depleted bone marrow transplantation was associated with a high incidence of rejection because the balance between competing recipient and donor T cells shifted in favor of the unopposed host vs graft reaction. In acute leukemia patients a highly immunosuppressive and myeloablative conditioning regimen and a megadose of extensively T cell depleted GCSF mobilized peripheral blood progenitor cells successfully overcame the obstacles of rejection and lethal GvHD. Already in the earliest series primary sustained engraftment was achieved in > 90% of end-stage patients and acute (> grade I) GVHD occurred in < 10%4-6. These excellent results were subsequently conrmed in later reports7. Since T cells must be removed from the graft, haploidentical transplants do not rely on T cell alloreactivity for engraftment and the graft vs leukaemia
| 284 | haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1)

(GVL) effect. Mismatched transplantation triggers alloreactivity mediated by NK cells which has been associated with benecial effects8. In haploidentical transplants that are KIR ligand mismatched in the GvH direction, donor NK cells that express, as their sole inhibitory receptor, a KIR for the self HLA class I group which is absent in the recipient, sense the missing expression of the self class I ligand and mediate alloreactions (missing self recognition)9. This paper will explore NK cell alloreactivity in murine transplant models and in clinical stem cell transplantation for acute leukaemia.

Biology of human NK cell alloreactivity

Signals delivered through several different activating receptors prime natural killer cells to kill10,11. However, autologous killing is prevented because each natural killer cell co-expresses at least one inhibitory receptor for self-HLA class I molecules. Several years ago an inverse correlation between expression of surface HLA class I molecules on target cells and susceptibility to natural killer cell-mediated lysis suggested HLA molecules protect self cells from natural killer cell-mediated lysis. Lack of expression of self HLA molecules on target cells results in susceptibility to natural killer cell-mediated lysis (missing self recognition). Human NK cells discriminate between allelic forms of HLA molecules via inhibitory Killer cell Ig-like Receptors (KIRs). KIRS are specic for epitopes that are shared by HLA class I alleles, i.e. group 1 and group 2 HLA-C alleles, and HLA-Bw4 alleles (Table 1)10-11. Although HLA and KIR genes are inherited independently, most individuals possess KIR genes for receptors that inhibit NK killing when they recognize the 3 major class I ligands12. In the 198 individuals screened for KIR genotyping in Perugia Centre, 97% bore KIR2DL1, which is the receptor for HLA-C group 2 alleles; 100% expressed KIR2DL2/3 receptors, which are specic for HLA-C group 1 alleles, and 90% bore KIR3DL1, which is the receptor for HLA-Bw4 alleles12, and A. Mancusi (unpublished observations). During development of the NK-cell receptor repertoire the HLA class I genotype imposes selection by dictating which KIRs are to be used as inhibitory receptors for self HLA class I. The HLA class I genotype on the NK-cell KIR repertoire also determines the frequencies of cells expressing a given KIR13. NK cells that do not express an inhibitory KIR for self HLA class I express the CD94-NKG2A inhibitory receptor complex, which lls the gaps in the KIR repertoire. Alloreactive NK cells are not found among CD94-NKG2A positive NK cells because HLA-E, the

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

Table 1. Inhibitory KIRs and their ligands

KIR KIR2DL1 KIR2DL2/3 KIR3DL1

KIR ligands HLA-C group 2 (Cw2, Cw4, Cw5, Cw6, etc.) (Lys80) HLA-C group 1 (Cw1, Cw3, Cw7, Cw8, etc.) (Asn80) HLA-Bw4 alleles

ligand for this receptor, is expressed on cells from all individuals10-11. Thus, in every individual NK cell gene expression of CD94/NKG2 receptors and KIRs generates the NK cell repertoire. As KIRs are clonally distributed, each cell in the repertoire bears a different receptor or, less frequently, two or more receptors, and every functional NK cell expresses at least one receptor that is specic for self HLA class I molecules (because the individuals HLA selects the self-tolerant repertoire). Consequently, when faced with mismatched allogeneic targets, NK cells in the repertoire sense the missing expression of self HLA class I alleles and mediate alloreactions. In haploidentical transplants that are killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) ligand mismatched in the GvH direction, donor natural killer cells that express, as their sole inhibitory receptor, a KIR for the self HLA class I group which is absent in the recipient, sense the missing expression of the self class I ligand and mediate alloreactions (missing self recognition). Triggering of NK cell effector functions depends upon engagement of activating receptors, NKG2D and natural cytotoxicity receptors (NCRs)14-17. Finally, NK cell activation can be mediated by activating KIR variants18.

the graft versus host direction8. In F1 H-2d/bparent H-2b transplants, donor T cells are tolerant of recipient MHC. Donor NK cells that do not express the H2b-specic Ly49C/I inhibitory receptor but bear H2d-specic Ly49A/G2 receptors, are activated to kill recipient targets. In haploidentical transplant mouse models after host immune suppression, pre-transplant infusion of donor-vs-recipient alloreactive NK cells home to all lympho-hematopoietic sites and ablate recipienttype lympho-hematopoietic cells within 48 hours8. Lack of NK-mediated attack on normal tissues indicates that healthy organ tissues, unlike lympho-hematopoietic cells, do not express ligands at a sufcient level to engage activating NK cell receptors and so alloreactive NK cells do not cause GvHD. Alloreactive NK cells kill recipient T cells which mediate rejection, improving engraftment with low-intensity conditioning regimen, they eliminate recipient dendritic cells, which initiate GvHD by presenting host alloantigens to donor T cells24 and prevent T cell-mediated GvHD8,25 and, in fact, these mice can be given mismatched bone marrow grafts containing up to 30 times the lethal dose of allogeneic T cells without clinical or histological evidence of GvHD8. Transfer of NK cells into non-obese diabetic (NOD/ SCID) mice eradicated transplanted human AML provided that the NK cells were alloreactive8 (Figure 1).

Clinical data: donor-vs-recipient NK cell alloreactivity in haploidentical transplants

In HLA (KIR ligand) mismatches donor NK cell clones killed cryopreserved hematopoietic recipient cells, including leukemic cells and in blood samples from transplant recipients engrafted stem cells from NK alloreactive donors gave rise to an NK cell repertoire which included donor-vs-recipient alloreactive NK clones. These killed cryopreserved leukemic cells from the recipient24. In 57 acute myeloid leukemia (AML) patients at high risk of relapse, donor-vs-recipient NK cell alloreactivity reduced the risk of leukemia relapse, improved engraftment and protected against GvHD8. An updated analysis of 112 haploidentical transplants for high-risk AML performed at the Perugia Bone Marrow Transplant Centre provided denitive evidence that transplantation from NK alloreactive donors controlled acute myeloid leukemia relapse and improved event-free survival. It was associated with a signicantly lower relapse rate in patients transplanted in complete remission (3% vs 47%) (p > 0.003), better event-free survival in patients transplanted in relapse (34% vs 6%; p = 0.04) and in remission (67% vs 18%; p = 0.02) (Figure 2)26.
haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1) | 285 |

Pre-clinical data: NK cell alloreactivity and haploidentical transplantation

In mice also a ne balance between inhibitory and activating signals regulates NK cell killing. The hybrid resistance transplant model illustrated that NK cell alloreactions in the HvG direction use inhibitory Ly49 molecules which bind primarily MHC class I ligands19 to mediate rejection of bone marrow grafts and to recognize allogeneic lympho-hematopoietic cells in vivo. As the hybrid recipient mouse tolerates skin and organ allografts, NK cell alloreactivity appears to be restricted to lymphohematopoietic targets20-23. When the hybrid resistance partners are reversed the in vivo effects of NK cell alloreactivity hold true in

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

Figure 1. Mouse models: in vivo immune-ablation due to pre-transplant infusion of donor-vsrecipient alloreactive NK cells after host immune suppression. Alloreactive NK cells home to all lympho-hematopoietic sites in the recipient mouse and quickly ablate lympho-hematopoietic cells: residual leukemic cells, recipient T and antigen presenting cells.

In multivariate analyses, transplantation from an NK alloreactive donor was a strong independent factor predicting survival (transplantation from NK alloreactive versus non-NK alloreactive donor: hazard ratio = 0.44; 95% condence interval = 0.25-0.77; p = 0.004)26. One consequence of the haploidentical transplant studies is revision of current criteria for donor selection to include the candidate who is able to mount donor-vs-recipient NK cell alloreactivity. The search for NK alloreactive donors raises the random 30% chance of nding an NK alloreactive donor to > 60%, which is practically the maximum as about

30% of the population are resistant to alloreactive NK killing27.

Clinical data: donor-vs-recipient NK cell alloreactivity in unrelated-donor transplants

NK cell alloreactivity may occur in unrelated-donor transplants because approximately 50% have one or more HLA allele-level mismatches. Although several retrospective studies show controversial results about transplantation from donors with potential to exert NK cell alloreactivity28-32 differences in pro-

Figure 2. Clinical haploidentical transplantation: highrisk patients with AML were transplanted in remission from haploidentical donors who were able (allo NK) or unable (non-allo NK) to generate donor-vsrecipient NK alloreactions. Probability of relapse (panel A) and of event-free survival (panel B) were signicantly better in the allo-NK group.

| 286 | haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1)

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

tocols, patient populations, underlying diseases (including ALL which is resistant to alloreactive NK killing), conditioning regimens, graft composition, and post-transplant immunosuppressive regimens probably account for the discrepancies. Furthermore, none of these reports assessed donor-vs-recipient NK cell alloreactivity in cytotoxicity assays or KIR genotyped the donors. Unrelated-donor transplants generally use heterogeneous transplant protocols, which differ from the haploidentical. Unmanipulated bone marrow harvests (or, less frequently, peripheral blood progenitors) often contain ~4 log more than T cells and up to 1 log fewer stem cells than haploidentical grafts. As unrelated donor transplants are not usually T-depleted, they depend on post-transplant immune suppression to help prevent and/or control GvHD. The relatively few transplanted stem cells combined with posttransplant immune suppression adversely affect NK cell maturation from their bone marrow precursors. Interestingly, an NK alloreactivity-related survival advantage was observed in patients who received ATG pre-transplant (which provided in vivo T cell depletion) and a graft containing 2-3-fold more nucleated cells than usual in unrelated-donor transplants33.

cipient of a Leukemia and Lymphoma Society Special Fellowship in Clinical Research. The authors would like to thank Dr. Geraldine A. Boyd for help in editing the manuscript.

References
1. Blume KG, Forman SJ, Appelbaum FR. Hematopoietic cell transplantation. 3rd ed. Malden, MA: Blackwell Science; 2004. 2. Atkinson K, Fibbe W, Champlin R, Ritz J, Ljungman P, Brenner MK (eds.). Clinical bone marrow and blood stem cell transplantation. 3rd ed. Cambridge University Press; 2004. 3. Buckley RH, Schiff SE, Schiff RI, Markert L, Williams LW, Roberts JL, et al. Hematopoietic stem-cell transplantation for the treatment of severe combined immunodeciency. New Engl J Med 1999; 340: 508-16. [This paper summarizes results in haploidentical transplants.] 4. Aversa F, Tabilio A, Terenzi A, Velardi A, Falzetti F, Giannoni C, et al. Successful engraftment of T-cell-depleted haploidentical three-loci incompatible transplants in leukemia patients by addition of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor-mobilized peripheral blood progenitor cells to bone marrow inoculum. Blood 1994; 84: 394855. 5. Aversa F, Tabilio A, Velardi A, Cunningham I, Terenzi A, Falzetti F, et al. Treatment of high-risk acute leukemia with Tcell-depleted stem cells from related donors with one fully mismatched HLA haplotype. New Engl J Med 1998; 339: 1186-93. 6. Anasetti C, Velardi A. Hematopoietic cell transplantation from HLA partially matched related donors. In: Blume KG, Forman SJ, Appelbaum FR (eds.). Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Malden, MA: Blackwell Science; 2004. 7. Aversa F, Terenzi A, Tabilio A, Falzetti F, Carotti A, Ballanti S, et al. Full haplotype-mismatched hematopoietic stem-cell transplantation: a phase II study in patients with acute leukemia at high risk of relapse. J Clin Oncol 2005; 23: 3447-54. 8. Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, Perruccio K, Shlomchik WD, Tosti A, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science 2002; 295: 2097-100. 9. Ljunggren HG, Krre K. In search of the missing self: MHC molecules and NK cell recognition. Immunol Today 1990; 11: 237-44. 10. Farag SS, Fehniger TA, Ruggeri L, Velardi A, Caligiuri MA. Natural killer cell receptors: new biology and insights into the graft-versus-leukemia effect. Blood 2002; 100: 1935-47. 11. Velardi A, Ruggeri L, Moretta A, Moretta L. NK-cells: a lesson from mismatched haematopoietic transplantation. Trends Immunol 2002; 23: 438-44. 12. Ruggeri L, Capanni M, Mancusi A, et al. Impact of NK cell alloreactivity on mismatched haematopoietic transplantation: an update on donor selection criteria and on transplantation outcomes. Bone Marrow Transpl 2004; 33: S68. 13. Shilling HG, Young N, Guethlein LA, Cheng NW, Gardiner CM, Tyan D, Parham P. Genetic control of human NK cell repertoire. J Immunol 2002; 169: 239-47. 14. Moretta A, Biassoni R, Bottino C, Mingari MC, Moretta L. Natural cytotoxicity receptors that trigger human NK cellmediated cytolysis. Immunol Today 2000; 21: 228-34. 15. Wu J, Song Y, Bakker AB, Bauer S, Spies T, Lanier LL, Phillips JH. An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP10. Science 1999; 285: 730-2. 16. Jamieson AM, Diefenbach A, McMahon CW, Xiong N, Carlyle JR, Raulet DH. The role of the NKG2D immunoreceptor in immune cell activation and natural killing. Immunity 2002; 17: 19-29.
haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1) | 287 |

Conclusions
The role of NK cell alloreactivity is being explored in vivo in the haploidentical transplant setting where it has already been associated with a strong GvL effect, no increase in the incidence of GvHD and better survival. As donors who are able to exert NK alloreactions in the GvH direction can be found for over half of the patients requiring haploidentical transplantation, it is expected that the benets of NK cell alloreactivity will encourage greater use of haploidentical transplants for the large numbers of leukemia patients without matched donors. Findings about NK cell alloreactivity in haploidentical transplants have already encouraged applying it beyond the eld of transplantation and preliminary studies indicate donor alloreactive NK cells may successfully be given as adoptive immunotherapy for cancer.

Aknowledgements
This presentation is based on studies supported by grants from the Italian Association for Cancer Research, the Italian Ministry of Further Education and the Italian Ministry of Health, by a Translational Research Grant from the Leukemia and Lymphoma Society, by the European Community Allostem Project (Contract number: 503319) and by the National Institutes for Health of the USA (Project Number 1 PO1 CA 100265-01A1). L.R. is the re-

L Reunin Nacional de la AEHH y XXIV Congreso Nacional de la SETH. Simposios

17. Moretta A, Bottino C, Vitale M, Pende D, Cantoni C, Mingari MC, et al. Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell-mediated cytolysis. Annu Rev Immunol 2001; 19: 197-223. 18. Moretta A, Sivori S, Vitale M, Pende D, Morelli L, Augugliaro R, et al. Existence of both inhibitory (p58) and activatory (p50) receptors for HLA-C molecules in human natural killer cells. J Exp Med 1995; 182: 875-84. 19. Dimasi N, Moretta L, Biassoni R. Structure of the Ly49 family of natural killer (NK) cell receptors and their interaction with MHC class I molecules. Immunol Res 2004; 30 (1): 95104. 20. Cudkowicz G, Bennett M. Peculiar immunobiology of bonemarrow allografts. II. Rejection of parental grafts by resistant F1 hybrid mice. J Exp Med 1972; 135: 1028-36. 21. Murphy WJ, Kumar V, Bennett M. Rejection of bone marrow allografts by mice with severe combined immune deciency (SCID). Evidence that natural killer cells can mediate the specicity of marrow graft rejection. J Exp Med 1987; 165: 1212-7. 22. Yu YY, George T, Dorfman JR, Roland J, Kumar V, Bennett M. The role of Ly49A and 5E6(Ly49C) molecules in hybrid resistance mediated by murine natural killer cells against normal T cell blasts. Immunity 1996; 4: 67-76. 23. Ogasawara K, Benjamin J, Takaki R, Phillips JH, Lanier LL. Function of NKG2D in natural killer cell-mediated rejection of mouse bone marrow grafts. Nature Immunol 2005; 6: 938-45. 24. Shlomchik WD, Couzens MS, Tang CB, McNiff J, Robert ME, Liu J, et al. Prevention of graft versus host disease by inactivation of host antigen-presenting cells. Science 1999; 285: 412-5. 25. Mackall CL, Hakim FT, Velardi A. The immune system in graft-vs.-host disease: target and effector organ. In: Ferrara JLM, Cooke KR, Deeg J (eds.). Graft vs. Host Disease. 3rd ed. Marcel Dekker; 2004: 195-227. 26. Ruggeri L, Capanni M, Casucci M, Volpi I, Tosti A, Perruccio K, et al. Role of natural killer cell alloreactivity in HLAmismatched hematopoietic stem cell transplantation. Blood 1999; 94: 333-9. 27. Caligiuri MA, Velardi A, Scheinberg DA, Borrello IM. Immunotherapeutic approaches for haematological malignancies. In: Hematology 2004, ASH Education Program Book.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

Washington, WA: American Society of Hematology; 2004. p. 337-53. Davies SM, Ruggieri L, DeFor T, Wagner JE, Weisdorf DJ, Miller JS, et al. Evaluation of KIR ligand incompatibility in mismatched unrelated donor hematopoietic transplants. Killer immunoglobulin-like receptor. Blood 2002; 100: 3825-7. Lowe EJ, Turner V, Handgretinger R, Horwitz EM, Benaim E, Hale GA, et al. T-cell alloreactivity dominates natural killer cell alloreactivity in minimally T-cell-depleted HLA-nonidentical paediatric bone marrow transplantation. Br J Haematol 2003; 123: 323-6. Morishima Y, Yabe T, Inoko H. Clinical signicance of killer Ig-like receptor (KIR) on acute GvHD, rejection and leukemia relapse in patients transplanted non-T cell depleted marrow from unrelated donors; roles of inhibitory KIR epitope matching and activating KIR genotype. Blood 2003; 102: 526a. Elmaagacli AH, Ottinger H, Koldehoff M. Reduced risk of molecular and haematological relapse in patients with CML after KIR-mismatched hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 2004; 33: S59. Bornhuser M, Schwerdtfeger R, Martin H, Frank KH, Theuser C, Ehninger G. Role of KIR ligand incompatibility in hematopoietic stem cell transplantation using unrelated donors. Blood 2004; 103: 2860-1. Giebel S, Locatelli F, Lamparelli T, Velardi A, Davies S, Frumento G, et al. Survival advantage with KIR ligand incompatibility in hematopoietic stem cell transplantation from unrelated donors. Blood 2003; 102: 814-9.

ADOPTIVE IMMUNOTHERAPY AFTER ALLO-SCT H. Einsele

Wrzburg, Germany

MANUSCRITO NO RECIBIDO

| 288 | haematologica/edicin espaola | 2008; 93 (Extra 1)